3.2 Étude de composés ioniques correspondants
Il existe deux voies possibles pour passer d'un composé soluble en milieu organique en un composé soluble dans un milieu aqueux.
La première technique consiste à combiner les composés précédemment décrits avec des chaînes PEG (polyéthylène glycol) [87]
La deuxième méthode consiste à la mise en ÷uvre de composés ioniques [88]. Cette dernière technique a été utilisée pour modi er les triphénylamines.
A partir des dérivés précédemment évoqués, les composés suivants ont plus particulièrement été synthétisés [86]. Ceux-ci s'avèrent bien solubles en milieu aqueux.
Figure 58 Molécules TP-2Py et TP-3Py chargées.
En présence d'ADN, il a été observé que ces composés triphenylamine présentaient une uores- cence fortement exacerbée (voir graphique A sur la gure 59). Lorsque l'on compare l'exaltation de uorescence des composés bis et triphenylamine, on remarque que selon le nombre de branches, l'exaltation de uorescence est plus ou moins importante. Ainsi, le facteur d'exaltation de la uo- rescence pour la TP-2Py est de 120 alors que pour la TP-3Py, il n'est que de 20. Contrairement aux résultats mesurés avec les composés neutres en milieu organique, ainsi on voit qu'en milieu biolo- gique, les dérivés ioniques correspondants qui possèdent les meilleures propriétés sont les composés à deux branches.
Figure 59 Exaltation de uorescence de la TP-2Py en présence d'ADN (à gauche). A droite, Titra- tion des TP-Py à une concentration de 1µM dans un tampon de cacodylate de sodium pH 7.2 10mM, 100mM NaCl par de l'ADN de testicule de hareng (l'exaltation de uorescence relative correspond au rap- port entre l'intensité de uorescence du complexe marqueur/ADN à saturation et l'intensité de uorescence du marqueur à l'état libre dans la solution tampon) [?].
Ces uorophores semblent être de bons marqueurs du double brin d'ADN. Les images de mi- croscopie, présentées gure 60, con rment le marquage de l'ADN dans le noyau de la cellule (étude
en cellule xée). Les uorophores pénètrent donc dans le noyau, ils parviennent a priori à passer à travers la barrière plasmique et la bicouche lipidique entourant le noyau.
Figure 60 Images de microscopie à deux photons sur des cellules xées de roblastes pulmonaires d'embryons humains MRC-5 xées par les TP-2Py (2µM, λexc= 820nm, λem = 520 − 750nm), couleurs
dé nies selon la longueur d'onde d'émission.
Précédemment, on a vu que les molécules de trinaphtylamines disposaient d'une forte section e cace d'absorption à deux photons dans le dichloromethane et que le produit σ2pφf était large-
ment en faveur des TN (voir tableau 4). Ces mesures nous ont conduit à évaluer les propriétés des dérivés chargés de TN. Comme pour les triphenylamines, les trinaphtylamines ont été modi és de façon à obtenir des dérivés ioniques. Malheureusement, malgré les modi cations de leurs charges, les composés Bzt et Bzo qui possédaient la meilleure section e cace d'absorption à deux photons en milieu organique sont instables en présence d'eau. Ainsi, nous nous sommes principalement concentrés sur les dérivés TN ayant le pyridinium comme groupement accepteur. On ne remarque cependant aucune exaltation de la uorescence en présence d'ADN (∼ 2.7) pour ces composés. Par ailleurs, comme le montre la gure 61, la uorescence est principalement issue des uorophores présents dans le cytoplasme. Visiblement, les dérivés TN ne pénètrent pas dans le noyau.
3.2 - Étude de composés ioniques correspondants 81
Ces mesures mettent en lumière un élément important du marquage de l'ADN par des uoro- phores qui est l'interaction spéci que uorophore/ADN. On a vu que les TP-Py possédaient une forte exaltation en présence d'ADN. Nous avons réalisé diérentes mesures a n de déterminer le type d'interaction entre les TP et l'ADN. On a notamment étudié l'intensité de uorescence en fonction de la nature des brins d'ADN. Lorsque les brins d'ADN sont riches en paires de bases AT, l'exaltation de uorescence de la TP-2Py est encore plus importante que dans le cas de brins CG (voir graphique A de la gure 62). A l'inverse de la TP-2Py, la TP-3Py ne possède pas de spéci cité.
Figure 62 (A) : Exaltation de uorescence (F/F0) des TP-Py à saturation en présence de diérentes
séquences d'ADN (B) : Exaltation de uorescence (F/F0) des TP-Py à saturation en présence d'ADN
et d'ARN de veau par rapport à leurs uorescence libre, tampon de cacodylate de sodium pH 7.2 10mM, 100mM NaCl.
En plus d'une sélectivité pour les paires de bases riches en AT, la spéci cité du marquage, entre l'ADN et l'ARN a été testée. L'exaltation de uorescence est importante pour la TP-2Py dans l'ADN et extrêmement faible dans l'ARN. Pour la TP-3Py, on constate une absence de marquage spéci que. Cette expérience montre que la TP-2Py marque spéci quement l'ADN. Ce signal im- portant en présence d'une séquence spéci que d'ADN peut être le signe d'une insertion dans le petit sillon de la double hélice d'ADN. Des calculs d'optimisation de la structure du complexe TPs- Py/double brin d'ADN montrent qu'eectivement les dérivés à deux branches peuvent parfaitement s'insérer dans le petit sillon (voir gure 63).
Ces calculs montrent par contre que le dérivé à trois branches ne s'insère que partiellement dans le petit sillon ce qui peut expliquer les diérences de propriétés précédemment décrites.
De la série des TP-Py, la molécule à deux branches est le uorophore le plus intéressant pour le marquage de l'ADN. Ce uorophore semble marquer spéci quement l'ADN par insertion dans le petit sillon de la double hélice d'ADN. Ce uorophore répond à tous les critères précédemment décrits. Malheureusement, cette molécule ne dispose pas d'un rendement quantique de uorescence et d'une section e cace d'absorption à deux photons assez importants pour l'observation in vivo. Nous avons donc cherché à optimiser les propriétés de ces dérivés. Mais avant ceci, nous allons faire un rappel des deux modes de xation non covalent de molécules dans la double hélice d'ADN.
Figure 63 Modélisation de l'insertion des TP-Py dans l'ADN [16].
4 Voies d'interactions uorophore/ADN pour le marquage
non-covalent
4.1 Généralités
Les marqueurs non covalents les plus performants sont généralement peu uorescents à l'état libre mais présentent une forte exaltation de uorescence lorsqu'ils sont liés à l'ADN. Il existe deux grands modes de xation, non covalente, dans la double hélice d'ADN.
l'intercalation (voir gure 64),
la xation dans les sillons (petit ou grand sillon).
On notera qu'à forte concentration, certains ligands peuvent cependant avoir des modes de xation multiples.
Figure 64 Modes d'interactions des ligands d'ADN et structures de conjugués ligand-ADN : A, Inter- calant (ellipticine) ; B, Ligand de petits sillons (Dystamicine 2) [89].
Dans le cas de l'intercalation, la molécule s'insère entre deux paires de bases, là où l'arrange- ment de l'ADN est le plus propice à l'interaction avec la molécule. Ce mode d'interaction souvent observé pour les molécules planes aromatiques s'eectue via recouvrement des orbitales π [90].
4.1 - Généralités 83
A l'inverse du marquage de sillon d'ADN, cette méthode de marquage peut modi er fortement la structure de l'ADN, car la macromolécule se déforme suite aux forces qu'exerce l'intercalant. Ainsi, il arrive que l'hélice d'ADN s'agrandisse d'un facteur 1.5 jusqu'à 5.1 nm Å [91], et que son potentiel électrostatique soit modi é. Les intercalants ont généralement une spéci cité de séquence peu marquée.
On a vu que la molécule d'ADN disposait de deux sillons, un grand et un petit (voir introduc- tion). On peut utiliser ces deux sites pour le marquage de l'ADN, les grosses molécules de type protéines vont préférentiellement se xer au grand sillon [92]. Typiquement, les marqueurs de sillons disposent d'une sélectivité pour les séquences riches en AT [93] (meilleure exibilité de l'ADN) ; mais il existe quelques marqueurs qui préfèrent les sillons riches en GC [94]. L'interaction entre la molécule marquante et le sillon se fait via des interactions électrostatiques entre les phosphates du squelette ainsi que par les liaisons hydrogènes avec les bases. Ce type de xation permet une meilleure homogénéité du marquage de l'ADN.
Dans le cas des dérivés TP-2Py, toutes les expériences réalisées auparavant nous permettent de supposer que la TP-2Py interagit avec le petit sillon de la double hélice de l'ADN (exaltation préférentielles en milieu AT, dichroïsme circulaire [85]).