Élection du Bureau de l'université (article 14 des statuts de l'université)

3.5.2.1 Micronúcleo

Micronúcleos são pequenas estruturas compostas de cromatina resultante de mitoses aberrantes, delimitada por membrana e separada do núcleo principal. Estas estruturas se formam devido à lise na molécula de DNA, dias ou semanas após a ação de carcinógenos, a partir da extrusão de cromossomos inteiros ou fragmentos destes durante o processo de divisão celular das células da camada basal. Eles se apresentam em forma ovalada ou redonda, localizados em proximidade ao núcleo da célula (figura 5) (STICH E ROSIN, 1983; STICH et al, 1984; JOKSIÉ, 2004; REIS et al., 2004).

Figura 5: Células de origem epitelial de cólon que apresenta múltiplos micronúcleos.

Fonte: BERNSTEIN et al, 2011.

Na maioria das vezes, os micronúcleos constituem-se de cromossomos inteiros ou fragmentos cromossômicos acêntricos que se desligam e perdem-se durante a mitose, mais precisamente na anáfase, e consequentemente acabam não compondo o núcleo principal das células filhas. No entanto, a formação dos micronúcleos está totalmente associada à perda de material genético como resposta a um dano cromossômico ou no aparelho mitótico (D’AGOSTINI, 1998; BONASSI et al., 2003; SALVADORI et al, 2003).

O processo de formação dos micronúcleos pode decorrer de cinco principais mecanismos (figura 6). O primeiro mecanismo seria a ação de agentes aneugênicos que interrompem a formação

do aparelho mitótico, causando problemas durante a anáfase. Isso resulta em micronúcleos constituídos de cromossomos inteiros até o final da mitose, passando essa característica para as células filhas. O segundo mecanismo corresponde à ação de agentes clastogênicos que atuam diretamente na dupla fita de DNA, formando fragmentos acêntricos que não se ligam às fibras do fuso, nem permitem a integração com o núcleo das células filhas. Tais fragmentos são deixados para trás durante a mitose. O terceiro mecanismo envolve sequências genéticas altamente amplificadas, derivadas de ―double minuts‖ extracromossômicos que podem estar contidos dentro dos micronúcleos. O quarto mecanismo corresponde a uma torção que ocorre entre dois centrômeros de um cromossomo dicêntrico que dá origem a ponte de anáfase que se rompe e resulta na formação de fragmentos acêntricos que são excluídos dos núcleos das células filhas e formam um ou mais micronúcleos no final da mitose. O último mecanismo ainda pode ser decorrente da ponte de anáfase, onde ao invés de se romper, os cromossomos dicêntricos são separados dos dois centrossômos, esquecidos durante a anáfase e retido em micronúcleos (TERRADAS et al, 2010).

Os primeiros relatos sobre a utilização da metodologia baseada na análise de micronúcelos sugiram em meados da década de 1950. Evans et al. (1959) utilizaram a freqüência de micronúcleos para mensurar as alterações cromossômicas em plantas irradiadas (EVANS et al., 1959).

O ―Teste do micronúceo‖ é realizado tanto in vivo quanto in vitro, par a determinação da capacidade de mutagenicidade de substâncias que possam ser capazes de causar danos nos cromossomos, chamadas de substâncias clastrogênicas ou daquelas substâncias que possam interferir na formação e funcionamento do aparelho mitótico, resultando em uma distribuição desigual dos cromossomos no processo de divisão celular (REIS et al, 2004). Diante a grande capacidade de o Teste de micronúcleo identificar células com alterações em nível cromossomal ele configura-se como um importante marcador biológico da exposição à carcinógenos (MAJER et al, 2001). Para a execução deste teste, diferentes tipos de células podem ser empregadas, como células animais de modo geral e vegetais, desde que possuam a capacidade de se dividir ou que possa ter esse processo induzido, que este processo seja conhecido e de possível manipulação (FENECH, 2000).

Figura 6: Mecanismos de formação de micronúcleos (MNs). (A) Formação de MNs por exposição a agente aneugênicos; (B) Formação de MNs por exposição a agente clastogênicos; (C) Formação de MNs derivadas de ―double minuts‖ extracromossômicos; (D(I)) Formação de MNs pela quebra da ponte de anáfase, que torce os cetrômeros de um cromossômo; (D(II)) Formação de MNs pela separação dos dois centrosomos.

Fonte: TERRADAS et al, 2010.

O método ―teste do micronúcleo‖ ganhou muito reconhecimento na esfera científica, sendo bastante recomendado para estudos de biomonitoramento ambiental, principalmente por permitir a detecção de alterações como quebra de cromossomos, causadas por agentes clastogênicos, e segregação cromossômica anormal (agentes aneugênicos) (FENECH, 2000; RIBEIRO et al., 2003). O método também garante várias vantagens. Os micronúcleos podem ser detectados em células em intérfase, são facilmente distinguíveis, rapidez (pois, para detectar os micronúcleos é necessário que a célula passe por algumas divisões), é um procedimento simples e sua interpretação é menos

trabalhosa quando comparado a outros testes de avaliação a nível cromossomal e permite a detecção da ação de agentes clastogênicos e aneugênicos(HEDDLE et al, 1983). Além disso, o baixo custo e a alta confiabilidade desta técnica são fatores que contribuíram para o sucesso internacional e a sua adesão como biomarcador em estudos in vitro e in vivo do dano genômico (BONASSI et al., 2003).

3.5.2.2 Ensaio cometa

O ensaio cometa é um teste que permite a identificação de compostos genotóxicos, ou seja, aqueles que causam danos ao DNA, através da visualização de células danificadas por microscopia de fluorescência. Os primeiros ensaios foram relatados por Östling e Johanson, em 1984, quando estes pesquisadores desenvolveram o teste de avaliação genotóxica com células individualizadas, tratadas, aplicadas em um gel de agarose de baixo ponto de fusão sobre lâminas de microscopia, previamente preparadas, submetidas a um processo de ruptura de membrana e a um campo elétrico utilizando um tampão alcalino (CANTALICE, 2014; GONTIJO E TICE, 2003).

A utilização de substâncias alcalinas neste método garante a observação de rupturas duplas e simples na estrutura helicoidal do DNA. Em sítios lábeis alcalinos, a cadeia polinucleotídica pode sofrer rupturas quando o DNA encontra-se incubado em pH elevado, e as ligações cruzadas em posições diferentes no DNA (crosslinks), resultantes da ação de compostos genotóxicos, podem alterar a estrutura do DNA das células (COOK E BRAZELL, 1976; RAZIN et al, 1995; ERIKSSON et al, 2002). Essa alteração inclui o relaxamento em partes da molécula do DNA, que no compo elétrico, migram em direção ao cátion. O uso de corantes de ácidos nucleicos fluorescentes específicos no ensaio cometa permite a visualização de células com característica diferenciada, devido à migração do DNA que semelhante a um cometa, que pode ser visualizado por microscópio de fluorescência (SINGH et al, 1988; TICE et al., 2000).

O ensaio cometa segundo Mota et al., (2011) correlaciona a epifluorescência das células analisadas em 5 possíveis níveis de danificação genômica (Figura 7): nenhuma lesão ou dano visível no DNA, com ausência de fragmentação nuclear ou que esta seja menor que 5% (dano 0); leve danificação no DNA e leve fragmentação nuclear com discreta formação de halo, com níveis de dano correspondendo de 5 a 20% (dano 1); danificação de leve a moderada no DNA, com fragmentação nuclear visível e formação de um halo mediano. Níveis de dano correspondendo de 20 a 40% (dano 2); danificação de moderada a forte no DNA, com fragmentação nuclear visível e formação de um halo longo. Níveis de dano correspondendo de 40 a 95% (dano 3) e danificação

intensa no DNA e observação de um halo bastante extenso, ao redor, do pouco material nuclear e a formação de uma cauda semelhante a de um cometa, sendo este último, a forma mais grave de danificação, com níveis de dano superior a 95% (dano 4).

Figura 7: Padrão de escores utilizados para determinação do índice de dano no teste do cometa segundo Mota et al (2011).

Fonte: Imagens do autor.

Ensaio do Cometa traz consigo inúmeras vantagens que incluem o seu rápido desempenho,a sua simplicidade e sua alta sensibilidade para vários tipos de danos no DNA, além do baixo custo e por grande aplicabilidade em estudos tanto in vivo como in vitro ou no monitoramento da exposição humana a agentes tóxicos, podendo ser utilizado em qualquer tipo de tecido sem a limitação da proliferação celular para a análise (DA SILVA et al., 2002; GONÇALVES et al., 2003; DEHON et al., 2008). Nas últimas décadas, esta metodologia tem sido bastante empregada no estudo de células sanguíneas humanas desde o conhecimento da ação de substâncias químicas mutagênicas até avaliação de suscetibilidade à radiação (CORONAS et al., 2008; FAUST et al., 2004).

O Ensaio Cometa não requer como condição, que as células utilizadas para o estudo estejam em constante divisão para observação da viabilidade celular em cultura, ao contrário de outros tipos de ensaios de genotoxicidade. Contudo, o teste pode ser realizado com células normais, como os linfócitos que são obtidos facilmente por meio de coleta de sangue e até mesmo em células

provenientes de diversos tecidos, como o fígado, mama, pulmão e os rins, também têm sido testados. A avaliação de diversos tipos celulares permite determinar os efeitos de genotoxicidade das substâncias tóxicas que são muitas vezes peculiares para cada tipo de tecido do organismo (MITCHELMORE E CHIPMAN, 1998).