La colibactine est une toxine synthétisée par une machinerie complexe, codée par l’îlot génomique pks de 54kb. A l’image des facteurs de virulence, les gènes des îlots génomiques ne sont pas exprimés constitutivement, mais répondent à des signaux environnementaux, grâce à des régulateurs codés par l’îlot génomique ou non.
Le gène clbR, appartenant à l’îlot pks, code pour une protéine comportant un motif de liaison à l’ADN de type hélice-tour-hélice. Cette protéine présente des homologies avec les régulateurs de la famille LuxR, impliqués dans la communication inter-cellulaire, ou Quorum Sensing [139,215,317], et pourrait donc avoir un rôle de régulateur de l’îlot pks. La régulation de l’expression des îlots génomiques doit être finement contrôlée, afin que les facteurs d’adaptation ou de virulence qu’ils codent soient synthétisés dans les conditions qui le nécessitent. Mes travaux de recherche ont pu mettre en évidence que la disponibilité en fer dans le milieu extracellulaire était capable de réguler l’expression du gène clbA, aboutissant à une régulation de la synthèse de la colibactine. Cette régulation se fait notamment via les deux régulateurs principaux de l’homéostasie du fer chez la bactérie, la protéine FUR (Ferric Uptake Regulator) et le petit ARN non-codant RyhB [318]. RyhB et Fur sont connus pour être impliqués dans la régulation d’un nombre important de facteurs de virulence, soit directement, soit indirectement via d’autres régulateurs transcriptionnels ou la modulation de la concentration intracellulaire de fer. Ils participent par exemple à régulation de l’invasion des cellules eucaryotes de bactéries telles que Salmonella et Shigella [255,319,320]. Ainsi, Salmonella Typhimurium envahit les cellules épithéliales grâce au système de sécrétion de type III (T3SS) codé par l’îlot de pathogénicité de Salmonella 1 (SP- 1). Fur active le T3SS via l’induction de l’expression de hilA, un activateur de ce système [255,320]. RyhB favorise la formation de biofilm chez V. cholerae alors que chez S.
typhimurium, le paralogue de RyhB, RyhB2, réprime la motilité [175]. RyhB et Fur sont
[175,175,256]. Ceci permet à la bactérie de s’adapter à des environnements variés en ajustant l’expression de ses facteurs de virulence.
Un autre mécanisme de régulation fer-dépendant impliquant un régulateur supplémentaire, encore inconnu, a été mis en évidence dans mon travail de recherche (Tronnet et al., en révision). Cette régulation de la biosynthèse de colibactine par le fer, et indépendante de RyhB et Fur, pourrait faire intervenir par exemple un système à deux-composants. Ceux-ci répondent à des stimuli extérieurs, et régulent positivement ou négativement un nombre important de gènes en réponse à ces stimuli. Par exemple chez E. coli, une quantité de Fe3+ élevée active le senseur PmrB, qui en retour phosphoryle le régulateur de réponse PmrA. Ce dernier se lie alors sur le promoteur de qseBC (quorum sensing E. coli regulator B and C) et induit l’expression de son opéron [329]. L’analyse in silico de l’îlot pks suggère la présence de deux sites de fixation putatifs de ce régulateur dans la région située en amont du gène clbA. Cependant, aucune donnée n’a été publiée concernant l’implication d’un système à deux composants dans la régulation de la biosynthèse de la colibactine.
D’autres régulateurs de la biosynthèse de la colibactine et codés par le core genome, (c’est à
dire les gènes présents chez toutes les souches d’une même espèce bactérienne) de
E. coli
ont récemment été mis en évidence. En effet, l’implication de la protéine chaperonne Hsp90EC
et la protéase ClpQ, qui agiraient post-traductionnellement, a été démontrée par notre laboratoire [216]. Le mécanisme de régulation aboutissant à la modulation de la production de la colibactine par ces deux protéines reste inconnu. Par ailleurs, des données préliminaires suggèrent que le métabolisme des polyamines jouerait un rôle dans la biosynthèse de la colibactine au niveau de l’expression de certains gènes de l’îlot pks (Garcie et al., communication personnelle).
Mes travaux de thèse se sont penchés plus précisément sur la régulation de la transcription du gène codant pour la PPTase ClbA. Si nous avons démontré qu’une quantité élevée de fer extracellulaire inhibait la transcription de clbA, aboutissant à une diminution de la synthèse de la colibactine, l’ajout d’un chélateur de fer a pour effet l’induction de ce gène. Cette induction est néanmoins associée à une diminution de la biosynthèse de colibactine et à une
augmentation de la production de sidérophores ClbA-dépendants. Ces résultats montrent que la biosynthèse de la colibactine s’effectue dans des conditions très spécifiques, notamment vis-à-vis de la quantité de fer (voir schéma-bilan Figure 31). Figure 31 : Modèle général de la production de colibactine en fonction du fer
Nous privilégions l’hypothèse que ClbA pourrait être redirigée vers la synthèse des sidérophores lors d’une carence en fer. En effet, dans des conditions de carence en fer l’acquisition du fer est essentielle à la survie de la bactérie, qui va déployer un arsenal de mécanismes permettant l’acquisition du fer. La redirection de ClbA vers la synthèse des sidérophores pourrait permettre une meilleure efficacité dans l’acquisition du fer, et donc une meilleure adaptation à l’environnement, et donc une meilleure colonisation. Peu d’études relatent l’existence de PPTases pléiotropes permettant la synthèse de plusieurs molécules fonctionnellement différentes. Une PPTase chez Streptomyces ambofaciens a été identifiée comme jouant un rôle multiple, puisqu’elle est impliquée dans la biosynthèse à la fois des Iron concentration Biosynthèse de la colibactine Biosynthèse des sidérophores ++ (+++) Sidérophores (-) Colibactine (+++) Acquisition du fer Fer -- Fur-Box clbA ClbA ClbA ClbA ClbA 68 « Conditions parfaites » de
biosynthèse de la colibactine + ClbA ClbA ClbA (-) Sidérophores (++) Colibactine (-) Acquisition du fer Virulence Adaptation Colonisation Fur-Box clbA -- (---) Sidérophores (---) Acquisition du fer (--) Colibactine Fer ++ ClbA Fur-Box clbA
assurent des fonctions pléiotropes, alors que d’autres restent spécifiques à la synthèse d’un seul composé, n’est pas encore connue.
Le mécanisme par lequel ClbA serait redirigée vers les sidérophores reste inconnu. Cependant, certaines PPTases possédant plusieurs sites actifs peuvent subir une régulation allostérique, comme cela a été suggéré pour la PPTase AcpS de Bacillus subtilis [331]. Une autre possibilité serait que les domaines porteurs (carrier protein ou CP) des sidérophores et/ou de la colibactine subissent un changement conformationnel en fonction de la quantité de fer dans le milieu, qui entraînerait une activation/diminution de l’interaction avec la PPTase. En effet, il a été montré par exemple que selon le pH, l’ACP de V. harveyi adoptait une confirmation différente [332], qui pourrait aboutir à une modification de l’interaction avec les différentes enzymes avec lesquelles elle interagit. En conclusion, cette étude a permis de mettre en avant que la régulation de la synthèse de colibactine était complexe et multifactorielle. Elle soulève de nombreuses questions auxquelles nous pourrions tenter de répondre par des expériences complémentaires :
1°) Élucidation de l’implication directe ou indirecte de Fur et RyhB. Nous avons identifié la présence de deux Fur-boxes putatives en amont de clbA. La mutation de ces sites de fixation putatifs puis l’analyse de l’expression de clbA ou d’expériences de retard sur gel pourraient permettre l’identification du site de fixation spécifique de Fur sur clbA. Afin d’identifier le mécanisme de régulation de RyhB sur clbA, des expériences permettant de tester la stabilité/dégradation de l’ARN messager de clbA en fonction de la présence ou l’absence de RyhB pourraient être effectuées. 2°) Identification du régulateur fer-dépendant et distinct de Fur et RyhB. Pendant ma thèse, nous avons généré une banque de mutants par insertion aléatoire de transposons dans la souche Nissle 1917 contenant la fusion transcriptionnelle entre clbA et la luciférase (résultats non publiés). Le criblage de ces mutants dans différents milieux supplémentés en fer ou non, pourra permettre l’identification d’autres régulateurs de l’îlot pks relatifs au fer. 3°) Comprendre le mécanisme qui aboutit à une diminution de la biosynthèse de la colibactine
gènes de l’îlot pks lors d’une carence en fer, le suivi de la transcription des gènes de l’îlot pks à l’aide de fusions transcriptionnelles pourra être effectué. Comparer la production spécifique des sidérophores d’une souche sauvage, mutée pour entD ou mutée pour clbA pourrait être informatif. Cela permettrait d’identifier si ClbA est plus spécifiquement impliquée dans la synthèse d’un sidérophore ou de plusieurs sidérophores. Des approches, telles que l’électrophorèses sur gel de polyacrylamide pourraient permettre de tester la stabilité conformationnelle des domaines porteurs de la colibactine en fonction des conditions (milieu carencé en fer ou non).
L’ensemble de ces résultats, venant compléter la seule étude faisant l’objet de la régulation de l’îlot pks [215], indique que la régulation de cet îlot est complexe. En effet, la régulation de la colibactine implique l’intervention de régulateurs n’appartenant pas à l’îlot. De plus, il semblerait que les gènes de l’îlot soient différentiellement régulés en fonction des stimuli [215,216,318]. Par ailleurs, plusieurs études publiées récemment ont identifié de nombreux intermédiaires de synthèse de la colibactine [175,175,196,203,204,208,209], qui semblent en plus différer quantitativement selon les souches de E. coli, suggérant que les systèmes de régulation de la colibactine pourraient ne pas être les mêmes en fonction des souches. La régulation différentielle des gènes de l’îlot pourrait aussi modifier à la fois le type de métabolites synthétisés, ainsi que leurs quantités respectives.
Le fait que la biosynthèse de la colibactine soit régulée par différents signaux tels que la quantité de fer ou la réponse au stress permet une modulation fine de la production de cette toxine, jouant un rôle à la fois dans la virulence et dans la colonisation intestinale.