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Spectroscopie de fluorescence résolue en temps

Spectroscopie de fluorescence résolue en temps

L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignemen[r]

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Microscopie de fluorescence résolue en temps et en polarisation pour le suivi d’interactions protéiques en neurobiologie

Microscopie de fluorescence résolue en temps et en polarisation pour le suivi d’interactions protéiques en neurobiologie

6 Projet Mon travail répond à la nécessité de développer des outils instrumentaux originaux en microscopie de fluorescence qui soient réellement adaptés à des problématiques biologiques spécifiques. Ici, notre objectif a été de réaliser un suivi dynamique de l’interaction entre deux protéines impliquées dans la maladie d’Alzheimer, de la membrane plasmique jusqu’au cytoplasme des cellules. Comme nous l’avons vu précédemment, l’imagerie de FRET associée à la mesure de durée de vie de fluorescence est un outil puissant pour suivre des interactions entre protéines. De plus la microscopie TIRF s’avère être une technique de choix dans l’observation de processus membranaires. Ces différentes techniques avaient déjà été associées au cours de la thèse de Pierre Blandin et avaient abouti au développement d’un microscope de fluorescence résolue en temps et en réflexion totale interne (TIRFLIM). Ce montage original associait l’imagerie en plein champ avec une résolution axiale sub-longueur d’onde grâce à la microscopie TIRF et une mesure rapide de la durée de vie de fluorescence grâce à une source impulsionnelle accordable et un intensificateur à déclenchement périodique. Des premiers résultats encourageants en cellule avaient été obtenus. Nous avons donc conservé cette approche, mais repensé le montage afin que des expériences sur des échantillons biologiques puissent être réalisées de façon reproductible dans les conditions physiologiques des cellules. En particulier, j’ai mis en place un dispositif pour passer d’une excitation sous onde évanescente à une excitation en épifluorescence et évaluer les performances de notre dispositif en terme de résolution. Les caractéristiques du montage ainsi que les différentes techniques destinées au contrôle de l’onde évanescente, seront décrites dans le chapitre II. Nous aborderons dans ce cadre l’association de ce dispositif avec des surfaces plasmoniques (SPETIRF Surface Plasmon
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Mise au point chez le rat d'un capteur à fibre optique pour la mesure de la fluorescence résolue en temps induite par laser et émise par le cerveau.

Mise au point chez le rat d'un capteur à fibre optique pour la mesure de la fluorescence résolue en temps induite par laser et émise par le cerveau.

La recherche développée concerne la mise au point d'un capteur chimique à fibre optique (FOCS) pennettant la mesure résolue en temps et en longueur d'onde, de la fluorescence indui[r]

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Structures auto-assemblées de guanines étudiées par spectroscopie optique résolue en temps

Structures auto-assemblées de guanines étudiées par spectroscopie optique résolue en temps

En effet, les nano-fils sont formés par le repliement d’un seul brin de poly(dG) alors que les structures d(TG 4 T) 4 sont formées par quatre brins parallèles. 11, 75, 86 De ce fait, l’orientation des quartets qui est déterminée par les conformations des groupements glycosidiques, n’est pas la même pour les deux systèmes. 76, 87 Une telle différence structurale peut induire des modifications dans le couplage électronique entre les guanines situées dans des plans différents. 33, 48-50 Par conséquent, les propriétés des états collectifs impliquant des guanines dans des plans différents peuvent changer. Afin d’étudier l’effet de taille en s’affranchissant de l’effet de la conformation, nous avons choisi de comparer les propriétés de fluorescence de structures quadruplexes parallèles comprenant trois, quatre ou cinq quartets. Celles-ci sont formées par l’association de quatre simples brins de séquence d(TG n T) (n=3, 4, 5) et ont été étudiées en présence de K + .
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Spectroscopie d'absorption X résolue en temps pour l'étude de la matière dense et tiède

Spectroscopie d'absorption X résolue en temps pour l'étude de la matière dense et tiède

- Chauffage par protons La profondeur de pénétration des protons dans la matière est plus importante que celle d’un laser ce qui permet de chauffer la matière en volume. Elle est par exemple d’environ 5 µm pour un proton de 0.5 MeV pénétrant dans de l’aluminium solide. Des faisceaux de protons, intenses et d’énergie élevée, peuvent être produits en face arrière en focalisant une impulsion laser ultra intense (> 10 18 W/cm 2 ) sur une feuille solide. L’ensemble de ce phénomène de production et d’accélération a été décrit et modélisé [12]. Les faisceaux de protons créés sont caractérisés par une forte intensité (∼ 10 13 protons [12]) et une gamme d’énergie très large (de quelques centaines d’eV à plusieurs MeV [13, 14]). Ils sont directionnels (des protons de 20 MeV ont été observés émis dans une demi-angle de 30° [15]) et ils se comportent comme s’ils venaient d’une même « source ponctuelle » (quasi- laminarité [16]). La divergence d’un faisceau de proton peut être ajustable en utilisant des cibles planes ou courbes [12, 17] La durée de l’impulsion de protons est de l’ordre de la picoseconde juste au niveau de la face arrière de la cible de génération [17]. Par la suite, les protons d’énergies différentes se dispersent en temps : après un déplacement de 300 µm, la dispersion temporelle entre des protons de 0.5 MeV et 5 MeV est de ∼ 20 ps. De tels faisceaux de protons peuvent être utilisés pour chauffer un échantillon. Le dépôt d’énergie des protons est caractérisé par un plateau suivi d’un pic de Bragg où toute l’énergie résiduelle du proton est déposée localement. Les protons ont la particularité de déposer leur énergie en profondeur dans la matière ce qui permet en théorie d’atteindre des températures de chauffage plus importantes avant que la matière ne se détende trop : la température d’un échantillon de 2 µm d’épaisseur, associé à un temps de chauffage de ∼ 30 ps (limité par une impulsion de protons de ∼ 20 ps), permet d’envisager des températures allant jusqu’à ∼ 100 eV pour pouvoir considérer ce chauffage comme isochore (cf. équation 4 et 5).
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Spectroscopie infrarouge résolue en temps pour l'étude de la dynamique femtoseconde du proton en phase liquide.

Spectroscopie infrarouge résolue en temps pour l'étude de la dynamique femtoseconde du proton en phase liquide.

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Spectroscopie résolue en temps de la femtoseconde à la milliseconde

Spectroscopie résolue en temps de la femtoseconde à la milliseconde

Résumé : L’objet de ce travail a été le développement d’un système de mesure pompe-sonde résolue en temps permettant d’atteindre des fenêtres temporelles allant de la centaine de femtosecondes jusqu’à la milliseconde. Une méthode de balayage optique asynchrone originale, appelée AD-ASOPS, a été développée et a donné lieu à un dépôt de brevet avec valorisation industrielle. La méthode peut être appliquée avec deux lasers ayant des fréquences de répétition arbitraires, ce qui est une nouveauté et ouvre de nombreuses possibilités d’expérimentation. Une mise en œuvre spécifique a été réalisée selon que les systèmes lasers utilisés pour l’expérience soient deux oscillateurs (AD-ASOPS MHz) ou bien deux lasers amplifiés (AD-ASOPS kHz). Une étude de faisabilité de la méthode a été faite pour confirmer ses larges possibilités d’applications. Une caractérisation complète a été menée avec plusieurs tests qui ont démontré une résolution sub-picoseconde d’environ 400 fs pour des balayages temporels réalisés sur des fenêtres temporelles uniquement limitées par la période du laser pompe. Pour avoir un cadre expérimental le plus complet possible, cinq lasers différents ont été utilisés et ont mis en évidence l’applicabilité de la méthode selon les différentes exigences expérimentales par un simple choix des paramètres de mesure. Grâce notamment à la flexibilité d’utilisation introduite par l’AD-ASOPS une expérience pompe-sonde sur échantillon biologique (centre réactionnel de Rhodobacter Sphaeroides) a été réalisée en utilisant comme laser sonde un oscillateur Ti:Saphire conventionnel à 74.5 MHz et comme laser sonde un oscillateur CPO à 5.1 MHz. La dynamique de retour à l’état fondamental, se développant sur plusieurs ordres de grandeur, de la picoseconde à la cinquantaine de nanosecondes, a pu être enregistrée en seulement quelques minutes d’acquisitions sur un banc de test unique. Les résultats obtenus sont en accord avec les résultats de la littérature. Enfin une expérience de démonstration de la variante AD-ASOPS kHz a été effectuée sur deux systèmes laser amplifiés, par comparaison avec la méthode d’interférométrie spectrale par transformée de Fourier. Une résolution sub-picoseconde a été confirmée sur une fenêtre de balayage d’une milliseconde.
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Estimation dans le modèle d'empilement avec application aux mesures de la fluorescence résolue en temps

Estimation dans le modèle d'empilement avec application aux mesures de la fluorescence résolue en temps

d’un photon de fluorescence, la molécule est conduite vers un niveau vibrationnel élevé de l’état fondamental. Ensuite, elle retourne au niveau vibrationnel le plus bas par relaxation vibrationnelle invisible. En raison de la perte d’énergie lors de la conversion interne et des relaxations vibrationnelles, la longueur d’onde du photon de fluorescence est typiquement moins énergétique, et donc plus longue, que celle de la lumière excitante. La différence d’énergie entre le photon absorbé et le photon émis est transformée en rotation moléculaire, vibration ou chaleur. Ceci explique le phénomène que Stokes à observé en 1852 : la fluorine émet de la lumière bleue visible après ex- citation par des rayons ultraviolets plus énergétiques et invisibles. En pratique, cette différence de longueurs d’onde permet de séparer les photons de fluorescence de la lumière incidente excitatrice. La différence de longueurs d’onde est particulièrement visible dans les données spectrales de la fluorescence, où on constate un déplacement du spectre d’émission vers le rouge comparé au spectre d’absorption. Un spectre d’émission de fluorescence est un diagramme qui représente l’intensité de fluorescence par rapport à la longueur d’onde d’émission. Le spectre d’absorption montre la part de photons incidents absorbés par la molécule par rapport à la longueur d’onde de la lumière incidente. A titre d’illustration la Figure 1.2 montre le spectre d’absorption et d’émission de la quinine. L’écart entre le maximum du spectre d’absorption et le maximum du spectre d’émission est appelé le déplacement de Stokes. Il représente l’énergie qui est perdue pendant l’excitation et la désexcitation de la molécule.
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Étude par spectroscopie résolue en temps des mécanismes de séparation de charges dans des mélanges photovoltaïques

Étude par spectroscopie résolue en temps des mécanismes de séparation de charges dans des mélanges photovoltaïques

Le principe de Frank-Condon permet d'expliquer la dynamique excitonique dans les semi-conducteurs organiques [37, 38]. La figure 2.3 A) présente un schéma du processus d'absorption et[r]

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Développement instrumental pour la microscopie de fluorescence résolue en temps: applications biomédicales

Développement instrumental pour la microscopie de fluorescence résolue en temps: applications biomédicales

Chapitre II : Etude et développement d’un dispositif d’excitation de la fluorescence De plus leur spectre d’émission est étroit (quelques nm) : toute la puissance est concentrée sur une plage de longueurs d’onde réduite. Si cette plage correspond aux pics d’absorption du matériau laser qui nous intéresse, une efficacité accrue est obtenue avec moins de problèmes thermiques. Mais il y a également des inconvénients : tout d’abord les diodes doivent être stabilisées en température, ce qui pratiquement nécessite un refroidissement, par exemple à l’aide d’un module à effet Peltier dans nos expériences. De plus, le choix des diodes de puissance est limité : comme on l’a vu précédemment, ces diodes ont une faible largeur spectrale : le choix en longueur d’onde est imposé par la nature du semi-conducteur (AlGaAs à 808 nm, soit InGaAs à 940/980 nm). Or actuellement, le marché des diodes de puissance est centré sur 808 nm pour les matériaux dopés Nd et 940-980 nm pour les matériaux dopés Yb. Ce point est important car cela est un frein à l’utilisation en pompage par diode direct de certains matériaux laser performants mais ayant des longueurs d’onde d’absorption différentes de 808 et 900-940 nm (comme le saphir dopé au titane par exemple qui nécessiterait des diodes de puissance émettant dans le bleu/vert et qui n’existent malheureusement pas actuellement). Pour le développement de la source que nous proposons, le pompage par diode apporte une avancée importante, puisque les sources lasers impulsionnelles à ces longueurs d’onde déjà développées utilisent jusqu’à présent un pompage par laser Ti :Saphir, avec un rendement global plus faible et un encombrement bien supérieur [Schlatter 2005].
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Pépite | Étude photodynamique de nanoparticules de BODIPY et développements méthodologiques pour l’imagerie de fluorescence super-résolue

Pépite | Étude photodynamique de nanoparticules de BODIPY et développements méthodologiques pour l’imagerie de fluorescence super-résolue

Dans la littérature, il a été montré que le phénomène de clignotement d’une nanoparticule organique par transfert d’énergie interne dépend de la puissance de l’excitation lumineuse, et donc du nombre de molécules excitées par nanoparticule. Nous avons cherché à rationaliser cet effet en réalisant des expériences de spectroscopie d’absorption transitoire femtoseconde, faisant varier la puissance laser à longueur d’onde d’excitation donnée, pour obtenir en moyenne 10, 70, 150, 400 ou 1500 molécules excitées par nanoparticule et par impulsion. Les résultats ont permis de caractériser le transfert d’énergie par annihilation singulet-singulet avec un temps de 1,5 ps (pour la plus forte énergie), un rayon de Förster de 8,9 nm avec une distance de 2,7 nm entre les molécules. Ils confirment également que l’efficacité de ces transferts augmente avec la concentration de molécules BODIPY excitées au sein d’une nanoparticule, ce qui coïncide avec le fait que ces transferts surviennent entre deux molécules excitées. Enfin, nous avons développé une expérience de microscopie confocale de fluorescence de particule unique résolue en temps (réponse instrumentale de 50 picosecondes), afin d’étudier les nanoparticules individuellement (Chapitre III). Le but de cette expérience a été d’observer les variations temporelles de l’intensité de fluorescence émise par les nanoparticules. Pour cela, nous avons également fait varier la puissance d’excitation pour obtenir en moyenne 1, 10, 130 ou 1300 molécules par nanoparticule et par impulsion. Les résultats montrent l’apparition de de clignotements rapides de l’intensité et des temps de vie très courts (sous les 100 picosecondes) avec l’augmentation de la puissance d’excitation. Ces temps de vie sont attribués aux transferts d’énergie caractérisés précédemment (« hopping » et annihilation singulet-singulet). Pour la puissance correspondant à environ 130 molécules excitées par nanoparticule et par impulsion, une variation importante de l’intensité de fluorescence est observable, laissant envisager leur potentiel d’utilisation pour de l’imagerie de fluorescence en super-résolution, sous réserve d’utiliser des méthodes de traitement adaptées aux données d’imagerie de haute-densité.
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Application de la spectroscopie de fluorescence a l'étude du pétrole : le défi de la complexité

Application de la spectroscopie de fluorescence a l'étude du pétrole : le défi de la complexité

INTRODUCTION Le pétrole provient de la dégradation thermique d’une matière organique fossile, d’origine animale ou végétale, qui a été enfouie lors des temps géologiques. La composition de ce fluide dépend à la fois de la nature de la matière première organique et de l’évolu- tion subie dans les diverses conditions de température et de pression [1] et [2]. Du point de vue chimique, la matrice de base des pétroles est constituée d’hydrocar- bures saturés, cyclisés ou non, allant du plus simple au plus ramifié, ce qui donne lieu à un grand nombre d’isomères structuraux. Dans cette matrice sont dissous de nombreux hydrocarbures aromatiques et des molé- cules polaires incluant des atomes de soufre, d’azote et d’oxygène. On trouve aussi des macromolécules très complexes comme les résines ou les asphaltènes. Enfin, de nombreux métaux à l’état de traces (essentiellement le vanadium et le nickel) souvent complexés aux por- phyrines, sont présents dans les fractions lourdes des huiles.
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Utilisation de la spectroscopie de fluorescence pour la vérification du nettoyage d'un ingrédient pharmaceutique actif sur les surfaces des équipements de production

Utilisation de la spectroscopie de fluorescence pour la vérification du nettoyage d'un ingrédient pharmaceutique actif sur les surfaces des équipements de production

Le détecteur sert à déterminer la concentration d’un analyte en fonction de sa réponse qui est, la plupart du temps, calculée par l’aire sous la courbe d’un pic ou la hauteur du pic pour le composant à l’étude (Hansen et al., 2012). Il existe deux types de détecteurs, soient ceux qui permettent de voir des changements dans la phase mobile ou ceux qui sont spécifiques à des composés selon leurs propriétés (Hansen et al., 2012). Le détecteur le plus utilisé dans le domaine pharmaceutique est le détecteur utilisant l’ultraviolet (UV) (Hansen et al., 2012). L’utilisation d’un détecteur UV consiste en l’absorption de la lumière à une longueur d’onde précise par les chromophores d’une molécule, donc ce type de détecteur ne peut pas être appliqué pour toutes les molécules (Hansen et al., 2012). Parmi les autres types de détecteur, on retrouve ceux qui utilisent la fluorescence, l’indice de réfraction, l’électrochimie, etc. (Hansen et al., 2012). Il est également possible de combiner différents détecteurs, mais il faut qu’un certain ordre soit suivi (Hansen et al., 2012). L’avantage d’avoir un détecteur sélectif est qu’il n’est pas toujours nécessaire de séparer préalablement tous les analytes puisque le détecteur identifie uniquement la substance ciblée (Ohannesian & Streeter, 2001).
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Étude d’interactions biologiques à l’aide de la résonance des plasmons de surface et de la spectroscopie de fluorescence

Étude d’interactions biologiques à l’aide de la résonance des plasmons de surface et de la spectroscopie de fluorescence

39 spectrophotomètre Ocean Optics USB4000. Une carte électronique permet le contrôle de l’instrument à l’aide d’une interface LabView. Le prisme est inséré dans un porte-échantillon au travers duquel la lumière des LEDs est illuminée et la lumière réfléchie passe au travers du polariseur et est collectée par les fibres optiques afin d’être analysée par le spectrophotomètre. Les 4 LEDs permettent d’illuminer 4 zones distinctes de la surface du prisme, donc chaque essai permet l’obtention de 3 mesures (canaux A, B et C) et d’un signal de référence (canal D). Une cellule fluidique en PDMS permettant d’injecter des solutions au-dessus des zones sondées par les DELs est déposée sur le prisme et un levier vient écraser la cellule fluidique sur le prisme. Ce levier permet d’assurer l’étanchéité de la cellule fluidique et permet d’enligner des tubes d’entrée et de sortie sur la cellule fluidique. Les DELs sont illuminées successivement pour balayer les quatre canaux et 10 mesures d’un temps d’intégration de 35ms sont réalisées pour chacun des canaux. L’interface LabView permet d’observer le signal brut pour chacun des canaux en temps réel, mais également d’obtenir le sensorgramme, c’est-à-dire le déplacement de la bande SPR au fil de l’expérience. Les sensorgrammes sont finalement sauvegardés en fichier texte à la fin de l’essai. Les sensorgrammes des canaux A, B et C peuvent ensuite être corrigés avec le canal de référence D et moyennés à l’aide du logiciel MatLab. Les volumes d’injections sont d’environ 350µL, ce volume permettant de remplacer complètement les solutions précédentes.
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Spectroscopie du thulium pompé à 1070 nm dans une fibre alumino-silicate. Fluorescence, photo-noircissement et simulation.

Spectroscopie du thulium pompé à 1070 nm dans une fibre alumino-silicate. Fluorescence, photo-noircissement et simulation.

Lors des mesures de fluorescence, du photo- noircissement a été observé. Cela se traduit par une décroissance de la puissance de fluorescence, sur des temps longs (~10 minutes), à pompe fixe. L'augmentation de l'atténuation avec la concentration en Tm 3+ est reportée sur la figure 4. Il est probable qu’un échange d’énergie Tm 3+ -Tm 3+ soit à la base du mécanisme de dégradation de la fluorescence. Nous émettons l'hypothèse suivante : la pompe permet d’atteindre le niveau 1 G4, puis un échange d’énergie Tm 3+ -Tm 3+ fait passer un ion Tm 3+ de 1 G4 vers 1 D2 enfin la pompe amène vers les états 3 P0,1,2. Un transfert d’énergie avec un défaut de la silice peut avoir lieu et causerait le photo- noircissement.
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Étude de l'oligomérisation et de la fonction de canaux ioniques par spectroscopie de fluorescence et fluorométrie en voltage imposé

Étude de l'oligomérisation et de la fonction de canaux ioniques par spectroscopie de fluorescence et fluorométrie en voltage imposé

Mis à part ces méthodes, un algorithme exploitant les modèles de Markov cachés (Hidden Markov Model : HMM) pourrait techniquement servir à l’analyse des traces de fluorescence. Selon ce principe, chaque donnée formant la trace appartient à un état du modèle défini selon l’intensité et le bruit de fluorescence. Les paramètres de chacun des états du modèle et la trajectoire des transitions entre ces états sont déterminés en optimisant la probabilité que la trace observée puisse être représentée par le modèle. Des algorithmes d’optimisation tel que celui de Baum-Welch permettent de trouver une solution à ce problème, bien qu’elle ne corresponde pas nécessairement à la solution optimale globale. Cette utilisation des HMMs est largement représentée dans l’analyse de mesures électrophysiologiques en canal unitaire (25,26). Cette approche a également été adaptée à l’analyse de mesures de FRET à l’échelle de la molécule unique (27). L’algorithme correspondant a d’ailleurs été testé dans le contexte de décompte de sous-unités par mesures de photoblanchiment (28). Les auteurs de cette étude spécifient cependant que la précision du décompte obtenu avec l’algorithme n’était pas suffisante. Pour ce type de mesures, il semble que les états ne soient pas nécessairement bien identifiés. Dans le contexte des HMMs, des imperfections de la trace peuvent être faussement perçues comme un état. De plus, puisqu’il n’existe généralement qu’une seule transition dans chacun des états, il peut devenir difficile d’identifier un état dont le temps de résidence est court alors que le signal-sur-bruit est petit. Les données de certains états peuvent ainsi être classées dans autre état existant dont le bruit est important.
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Étude de l’interaction rayonnement-matière en champ proche de nanostructures par microscopie de fluorescence super-résolue.

Étude de l’interaction rayonnement-matière en champ proche de nanostructures par microscopie de fluorescence super-résolue.

Le format des données provenant du module TCSPC a nécessité une refonte profonde des algorithmes d’acquisition et d’analyse. En effet, contrairement aux systèmes SPAD et TCSPC commerciaux qui ont été utilisés jusqu’à présent à l’Institut Langevin, le temps d’arrivée ab- solu des photons ne peut pas être connu. Ce dispositif ne donne accès qu’aux histogrammes de déclin de fluorescence. Ceci induit une limitation expérimentale forte. Les échelles de temps d’acquisition accessibles ne permettent pas de connaître précisément le temps effectif pendant lequel la molécule émet des photons avant de photo-blanchir. Il est donc impossible de mesurer précisément l’intensité de l’émission de fluorescence. Néanmoins, nos collabo- rateurs de l’Institut Polytechnique de Milan sont en train de développer un module TCSPC de nouvelle génération pour le mettre à notre disposition. Il permettra d’avoir accès direc- tement aux temps d’arrivée absolus de chaque photon détecté sur chacun des 8 SPADs. De cette manière, il sera possible de réaliser une mesure précise de l’intensité de fluorescence et également d’extraire le temps de photo-blanchiment d’un évènement unique. La combinai- son de ces deux informations ouvre la voie vers une caractérisation plus fine et encore plus riche de l’interaction rayonnement-matière en donnant par exemple accès à la mesure de la composante radiative du taux de déclin. De plus, la connaissance des temps absolus d’arrivée des photons sur chaque SPAD ouvre la possibilité de mesurer les corrélations des temps d’ar- rivée entre plusieurs SPADs. Ces nouvelles fonctionnalités laissent présager des applications intéressantes pour les thématiques de couplage entre émetteur et récepteur décrites dans le chapitre 5 .
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Identification et validation de marqueurs métaboliques pour le suivi de la croissance de cellules végétales en suspension par spectroscopie de fluorescence

Identification et validation de marqueurs métaboliques pour le suivi de la croissance de cellules végétales en suspension par spectroscopie de fluorescence

Ce projet a permis de prouver que l'autofluorescence d'une culture de cellules vegetales indifferenciees peut etre utilisee pour le suivi en temps reel des variables de culture critiqu[r]

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Etude d'un continuum de lumière en régime femtoseconde. Applications au domaine biologique : microscopies et spectroscopie en temps résolu.

Etude d'un continuum de lumière en régime femtoseconde. Applications au domaine biologique : microscopies et spectroscopie en temps résolu.

Microscopie confocale de fluorescence Le principe du microscope confocal a été proposé en 1957 [61], puis utilisé expérimen- talement à partir de 1980 suite au développement de sources laser adaptées et aux progrès en instrumentation électronique et informatique. Il s’agit d’une détection point à point du signal en transmission ou du signal de fluorescence émis par l’objet observé. Avec l’apparition des pre- miers modèles commerciaux en 1987, cette technique s’est très vite imposée en routine dans les industries pour le contrôle de pièces comme les circuits semi-conducteurs par exemple, et comme l’outil indispensable en biologie, en permettant l’observation tridimensionnelle de struc- tures microscopiques dans des échantillons biologiques transparents épais tels que des cultures cellulaires ou de tissus [62]. Un microscope confocal fournit en effet des images plus nettes et plus contrastées qu’un microscope conventionnel, sa particularité étant d’éliminer la lumière in- désirable issue des points situés hors du plan focal. En plus de faire apparaître un plus grand nombres de détails, chaque image représente un et un seul plan de l’objet : il s’agit d’une coupe très fine, transverse à l’axe optique, dans le volume du spécimen. L’ensemble de ces sections op- tiques sont enregistrées pour reconstruire une image tridimensionnelle de l’objet. Le biologiste, ou autre utilisateur, a ainsi accès à des informations qui nécessitaient conventionnellement des coupes réelles invasives de l’échantillon. Même si un tel microscope est parfois utilisé en mode de transmission, la plupart des scientifiques l’emploient dans le but de réaliser de l’imagerie de fluorescence. Cette technique permet en effet de mettre facilement en valeur les zones d’intérêt de l’échantillon, telles que l’ADN, des protéines, des virus, etc...
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Développement d’un système de spectroscopie infrarouge résolue temporellement pour la quantification des concentrations d’hémoglobine cérébrale

Développement d’un système de spectroscopie infrarouge résolue temporellement pour la quantification des concentrations d’hémoglobine cérébrale

comme elles le font sur la peau. Ceci n’a cependant pas été concluant puisque le fantôme en silicone s’effrite en l’utilisant. De plus, la conception de fantômes optiques est très longue à cause du temps de solidification du silicone. Des fantômes optiques liquides qui utilisent une solution d’intra-lipide 10% ainsi que de l’encre de Chine ont aussi été testés. Les fantômes optiques liquides s’avèrent une solution plus simple et efficace pour tester différentes concentrations d’encre en augmentant celles-ci entre deux acquisitions. Cependant, l’utilisation de fantômes optiques liquides s’est avérée très fastidieuse puisqu’à la fin, les fibres et le casque optique étaient mouillés. De plus, il s’est avéré très difficile d’obtenir des coefficients de diffusion suffisamment élevés pour obtenir un coefficient s’approchant de ceux des tissus humains. Bref, la recette initiale utilisant la résine de polyesther s’est finalement avérée la plus appropriée. Ainsi, sept fantômes optiques homogènes ont été conçus avant d’obtenir un fantôme avec les propriétés voulues, c'est-à- dire μ a = 0.01 mm -1 et μ s ’ = 1 mm -1 . La majorité des fantômes optiques développés dans la
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