Haut PDF Caractérisation du système inductible au cumate pour la production de protéines thérapeutiques en cellules CHO

Caractérisation du système inductible au cumate pour la production de protéines thérapeutiques en cellules CHO

Caractérisation du système inductible au cumate pour la production de protéines thérapeutiques en cellules CHO

12 2.2.1 Les systèmes procaryotes La bactérie Escherichia coli est l’un des systèmes bactériens les plus couramment utilisés pour la production de protéines recombinantes [27]. Dans l’histoire de la biotechnologie, cette bactérie tient une place importante puisqu’au début des années 1980, la première protéine recombinante approuvée et mise sur le marché par la compagnie Eli Lilly (l’insuline sous le nom d’Humuline) a été produite à partir d’une souche atténuée d’E. coli [28]. Ce système d’expression très bien documenté présente de nombreux avantages pour le processus de production tels qu’une croissance rapide dans des milieux simples et peu coûteux (temps de doublement de l’ordre de 20 minutes), des rendements de production élevés pouvant atteindre plusieurs g/L et une facilité de mise à l’échelle en bioréacteur. De plus, le génome de la bactérie étant relativement simple et ayant été entièrement séquencé depuis 1997, il est facile de le modifier afin d’améliorer les caractéristiques de la bactérie et d’augmenter ses performances [29]. Cependant, dans un contexte où la demande en protéines recombinantes complexes n’a fait qu’augmenter, la production de protéines recombinantes dans E. coli a montré certaines limites. Tout d’abord, les protéines recombinantes produites dans E. coli sont rarement sécrétées. En effet, une fois exprimées, celles-ci résident plus couramment dans le périplasme ou peuvent être dirigées vers des compartiments cellulaires [30]. La surexpression de protéines dans le cytoplasme amène alors à la formation de protéines mal repliées qui s’agrègent entre elles pour former des corps d’inclusion. Les étapes de purification et d’extraction se voient donc complexifier, pouvant ainsi mener à une diminution des rendements et à une augmentation du risque de contamination du produit. Une autre des principales limitations de l’utilisation de ce système est liée à son incapacité à réaliser l’ensemble des MPT présentes chez l’humain et nécessaires à l’activité et à la stabilité de nombreuses protéines.
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Optimisation du promoteur CR5 inductible au cumate

Optimisation du promoteur CR5 inductible au cumate

Résumé Les produits biologiques représentent une avenue thérapeutique très prometteuse pour diverses maladies actuellement sans traitement, dont le cancer. La demande pour ces produits est donc très forte et des bioprocédés industriels efficaces et fiables doivent être mis en place pour y répondre. Le système inductible au cumate (CR5) développé par le groupe de Bernard Massie permet d’exprimer des protéines d’intérêt de façon finement régulable et à haut niveau dans les cellules CHO. Un travail d’optimisation est toutefois nécessaire afin de maximiser l’expression tout en améliorant l’étanchéité du système. Dans cette optique, diverses constructions du promoteur comportant des configurations différentes d’espacement entre ses constituants, des transactivateurs comportant des domaines d’activation différents, et une séquence opératrice synthétique ont été testées pour évaluer leur capacité à améliorer le rendement et l’étanchéité du CR5. Ainsi, un protomoteur comportant trois séquences opératrices avec six paires de bases entre chacune de ces dernières s’est montré plus efficace en termes de rendement et d’étanchéité que la configuration actuelle du CR5. De plus, une nouvelle configuration du CR5 où le transactivateur est régulé par le système inductible à la coumermycine a été étudiée et a montré une régulation très fine. Le travail d’optimisation effectué dans ce projet s’applique seulement dans le but d’optimiser un procédé dans des conditions spécifiques. Son application à d’autres lignées cellulaires et d’autres promoteurs reste à démontrer.
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Procédés de culture cellulaire pour un système CHO inductible : cuvée-alimentée et perfusion

Procédés de culture cellulaire pour un système CHO inductible : cuvée-alimentée et perfusion

générer la très grande majorité des protéines recombinantes se trouvant sur le marché (Jayapal, Wlaschin, Hu, & Yap, 2007). En 2016, la moitié des bioproduits approuvés par la FDA étaient issu de lignées CHO (FDA, 2016). Isolées dans les années 1950 (Hansen, Pristovšek, Kildegaard, & Lee, 2017; Puck, Cieciura, & Robinson, 1958), ces cellules se sont révélées robustes en culture . De plus, leur habilité à croitre en suspension dans un milieu de culture sans sérum fait de ces cellules un système hôte de choix pour la production industrielle à grande échelle (J. Y. Kim, Kim, & Lee, 2012; Soo Min Noh et al., 2013). Elles ont une bonne résistance aux forces de cisaillement, sont tolérantes aux changements de conditions de culture, et présentent des temps de génération relativement courts. D’autre part, elles possèdent une bonne capacité à synthétiser des protéines complexes et à croitre à haute densité dans les bioréacteurs. La faculté à produire des glycoprotéines avec des modifications post-traductionnelles proches des cellules humaines ainsi que la sensibilité réduite aux nombreux gènes viraux minimisent les risques de biosécurité lors des productions commerciales (Lalonde & Durocher, 2017). De plus, ce sont des candidates intéressantes pour les diverses manipulations génétiques, comme la transfection (Cacciatore, Chasin, & Leonard, 2010). Par ailleurs, chaque production nécessite la sélection d’un clone présentant les propriétés phénotypiques adéquates, y compris la qualité de la protéine produite, le temps de dédoublement et la viabilité à long terme face aux conditions de culture. De ce fait, même lorsqu’un clone de production a été identifié, la dérive phénotypique n’est pas rare (Bandaranayake & Almo, 2014). Aussi, les cellules CHO sont incapables d’exprimer certaines formes de glycosylation (Patnaik & Stanley, 2006) et/ou tout au contraire, elles synthétisent des glycans qui n’existent pas chez les humains, et qui même à de très faibles niveaux, peuvent provoquer dans certains cas une réaction immunitaire (Bosques et al., 2010). Plusieurs anticorps monoclonaux commercialisés sont produits à partir des CHO. On cite; SYLVANT Ò , PERJETA Ò et le RITUXAN Ò (Lalonde & Durocher, 2017).
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Pep-1 transporte des protéines dans les cellules de mammifères

Pep-1 transporte des protéines dans les cellules de mammifères

> Au cours des dix dernières années, la recherche dans le domaine de la thérapie génique a été principalement focalisée sur l’amélioration des vecteurs viraux et non viraux pour le transfert de gènes. Toutefois, les formulations proposées pour l’intro- duction de « transgènes » restent encore limitées en raison de difficultés liées à leur pouvoir immunogène, à leur toxicité et à leur faible efficacité in vivo. Face à ces limitations, l’alternative était d’imaginer de nouvelles stratégies qui permettraient le transfert direct de la protéine d’intérêt dans un grand nombre de cellules [1] . Le développement de peptides ou pro-
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Modélisation dynamique de cultures de cellules CHO produisant un anticorps monoclonal en mode cuvée-alimentée

Modélisation dynamique de cultures de cellules CHO produisant un anticorps monoclonal en mode cuvée-alimentée

Cette méthode comporte toutefois quelques limitations. Tout d'abord, il est impératif d'identifier les nutriments limitants à la culture. La méthode la plus courante est l'utilisation de plans d'expérience fractionnels pour identifier les nutriments ayant un impact sur la croissance et la productivité (Sandadi et al., 2006). La composition des milieux étant très complexe, une large variété de nutriments peuvent limiter la croissance. Par exemple, deZengotita et al. (2000) ont pu augmenter la concentration finale d'anticorps en alimentant du phosphate, un ion entrant dans la composition des nucléotides et jouant un rôle très important au niveau de la régulation énergétique. De manière générale, à très haute densité cellulaire, il est possible de mesurer une diminution des concentrations de certains ions dans le milieu de culture même si ceux-ci ne sont pas directement consommés (Wlaschin, et al., 2006). Ce phénomène s'applique aux ions tels le magnésium et le potassium dont les concentrations intracellulaires sont plus importantes que les concentrations extracellulaires. De plus, la notion de seuil de concentration au-dessous duquel le nutriment devient limitant peut varier selon le contexte. En effet, le transport transmembranaire des acides aminés est dicté par leur concentration. Pour les acides aminés qui sont en compétition pour le même transporteur, un déséquilibre de concentrations peut causer une diminution du taux de transport de certains acides vers les cellules et donc une limitation même en présence d'une concentration extracellulaire relativement élevée pour certaines acides aminés telles le phénylalanine, la leucine et la glutamine (Wlaschin, et al., 2006) qui compétitionnent pour le même transporteur.
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Une nanoseringue bactérienne pour injecter des protéines dans les cellules eucaryotes

Une nanoseringue bactérienne pour injecter des protéines dans les cellules eucaryotes

[3] . La mise en œuvre de la méthode n’est pas réservée aux spécialistes des infections bactériennes. Elle peut être utilisée dans deux buts : la sécrétion d’une protéine d’intérêt dans le milieu extracellulaire, ou l’injection dans des cellules cibles après leur mise en contact avec les bactéries (Figure 1). Afin de valider le second objectif, nous avons montré que cette méthode permet d’in- jecter une protéine de fusion, étiquetée par l’épitope Myc 2 (YopE 1-138 -Myc), en quelques minutes et de manière uniforme dans l’ensemble de la population cellu- laire ciblée. Cette injection peut s’opérer dans différents types de cellules comme les fibroblastes, les cellules épithéliales et endothéliales ou les lymphocytes T. Ce système est également efficace pour délivrer des effecteurs de type III fonc- tionnels qui proviennent d’autres bac- téries que Y. enterocolitica. Ainsi, nous avons pu observer la déphosphorylation de la MAPK (mitogen-activated protein
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Caractérisation des CC[indice inférieur R]-NB-LRR: protéines uniques et conservées du système immunitaire végétal

Caractérisation des CC[indice inférieur R]-NB-LRR: protéines uniques et conservées du système immunitaire végétal

ii Arabidopsis thaliana et N chez Nicotiana benthamiana. L’absence de l’un des deux représentants NRG1-like d’Arabidopsis thaliana, soit NRG1.1 ou NRG1.2, n’affecte aucune réponse de défense médiée par un TIR-NB-LRR ou un CC-NB-LRR. L’homologie élevée de 73% entre ces deux protéines indique possiblement une fonction redondante. Un double mutant nrg1 a été produit afin de poursuivre l’investigation de la fonction du groupe NRG1-like dans les réponses de défense. Puisque les gènes NRG1.1 et NRG1.2 sont arrangés en tandem dans le génome d’Arabidopsis thaliana, une méthode optimisée permettant de sélectionner un événement de recombinaison méiotique rare entre deux allèles mutantes nrg1.1 et nrg1.2 a été choisie pour produire le double mutant. Avec une méthode indirecte, il a été démontrée que la lignée AB possède un évènement de recombinaison entre ces deux allèles mutantes puisqu’une plante double mutant nrg1 homozygote a été récupérée dans sa progéniture. Les résultats préliminaires obtenus avec cette plante double mutant nrg1 homozygote suggèrent que le groupe NRG1-like serait nécessaire pour la réponse de défense médiée par le TIR-NB-LRR RPS4 et suggèrent également qu’une plante dépourvue de NRG1-like aurait un phénotype de croissance retardée ou ralentie, en plus d’une morphologie foliaire distincte. Il est également connu que le domaine N-terminal CCR des CCR-NB-LRR d’Arabidopsis thaliana peut à lui seul induire une réponse de défense lorsque surexprimé chez N.benthamiana. Afin de trouver des protéines interagissant avec ce domaine et de caractériser sa localisation cellulaire, des plantes d’Arabidopsis thaliana transgéniques surexprimant le domaine CCR de NRG1.1 couplé à la eYFP:HA ont été produites. Le matériel obtenu permettra spécialement de poursuivre la caractérisation du groupe NRG1-like sur lequel peu d’information est disponible à ce jour. Il sera également possible de déterminer le niveau de redondance entre les deux groupes de CCR-NB-LRR quant à leur nécessité pour les réponses de défenses médiées par les NB-LRR suite à la production d’un quintuple mutant adr1/nrg1 d’Arabidopsis ne possédant plus aucun CCR-NB-LRR.
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Caractérisation fonctionnelle des protéines de transition de la spermiogenèse

Caractérisation fonctionnelle des protéines de transition de la spermiogenèse

À notre connaissance. ce travail constitue la première démonstration de l'expression de la protéine de transition TP l chez E.coli. Nous avons aussi réussi à exprimer la protéin[r]

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Validation de la production et de la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses canines dérivées de tissu adipeux

Validation de la production et de la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses canines dérivées de tissu adipeux

63 Dans une expérience préliminaire nous avions testé le marqueur CD90 sur des ASCs P0 dérivées de tissu adipeux sous cutané qui avaient été congelées, et nous n’avions pas d’expression de ce marqueur. Ceci pouvait remettre en question la cross-réactivité du CD 90 entre l’humain et le chien ou être lié à des mauvaises conditions de marquage. Différentes conditions de marquage en faisant varier le temps d’incubation, la température et le tampon de marquage ont été testées sur cette même culture d’ASCs sans avoir de marquage positif. Lors de l’analyse sur la SVF fraiche, le marqueur CD90 a été détecté sur les cellules canines mais le résultat reste difficile à analyser car le pic de cellules positives ne présentait pas un décalage net contrairement au décalage du pic CD90+ observé pour les ASCs humaines. Ceci peut être dû à une cross-réactivité imparfaite des anticorps humains anti-CD90 avec l’espèce canine (bien que cette cross-réactivité soit décrite).
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Immunogénicité de protéines d’intérêt thérapeutique - Les anticorps monoclonaux thérapeutiques

Immunogénicité de protéines d’intérêt thérapeutique - Les anticorps monoclonaux thérapeutiques

Comment identifier les anticorps dirigés contre les protéines thérapeutiques ? Évaluation clinique chez le patient L’immunogénicité d’un produit se définit par la fraction des patients ayant reçu ce produit qui développent des ADA contre celui-ci. Les méthodes prédictives, qui sont appliquées aux étapes successives du développement préclinique d’un Acm thérapeutique (Figure 1) et utili- sent des approches in vitro, in silico, ou in vivo peuvent apprécier le degré potentiel d’immunogénicité, et guider l’optimisation de la fabrication. Toutefois, compte tenu de sa variabilité d’expression, la mesure réelle de cette immunogénicité ne pourra se faire qu’une fois le produit administré au patient. Au cours des dernières années, des mises au point et des recommandations ont été publiées sur ce thème de la mesure des ADA chez les patients et lors des étapes précliniques [3, 9-12] . La Figure 2 décrit les niveaux successifs de mesure et de caractérisation des ADA. Un premier test de criblage identifie les réponses de type ADA dans les échantillons prélevés chez les patients. Puis un test de confirmation aura pour objectif de distin- guer les échantillons positifs des faux positifs. Enfin, des tests seront mis en œuvre pour caractériser la réponse ADA, déterminer si elle est de type neutralisant et dans ce cas identifier l’isotype de l’anticorps neutralisant.
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Production of α2,6-sialylated IgG1 in CHO cells

Production of α2,6-sialylated IgG1 in CHO cells

Our data indicated that the co-transfection of both GT and ST6 was required to obtain a wild-type IgG1 with a glycoprofile dominated by monosialylated G2FS1 glycans, as found in circu- lating human antibodies. Indeed, the expression of ST6 alone resulted in very poor sialylation improvement. Although terminal galactose residues were available in the G1F glycans, they were not efficiently used as substrates by ST6. This could be explained by the selectivity of the human ST6 for the a1,3-branch of the glycan (Fig. 1), while the galactose residue present on the main G1F isomer was found on the opposite arm. 39 More surprising, while TZM co-expression with GT was expected to improve ter- minal sialylation by providing galactose residues for the endoge- nous ST3, G2F was the major glycan, while only traces of G2FS1 could be detected. Thus, the concomitant expression of ST6 with GT was necessary not only to introduce a2,6-linked SA in the CHO cell, but also to allow the sialylation of the addi- tional galactoses provided by GT. By co-expressing GT and ST6, we obtained >40% of sialylated glycans in the wild-type TZM, with >75% of them being G2FS(6)1. About 25% of the com- plex branches were terminated by a sialic acid, and 88% of the sialic acids were of the a2,6 type. Onitsuka et al. reported the development of a stable CHO cell line overexpressing the CHO ST6 (called ST6M). 46 They showed high sialylation level of the Fc portion of a human IgG1-based diabody, with »44% of disia- lylated diantennary glycans (G2S2, G2FS2), and »26% of G2FS1. Strikingly, while diabody Fc galactosylation in the parental cell line was relatively low (15% of digalactosylated G2F
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Problématiques de formulations de protéines thérapeutiques destinées à la voie injectable

Problématiques de formulations de protéines thérapeutiques destinées à la voie injectable

être menée afin d’expliquer cette contradiction. Il est également important de garder à l’esprit que plus les microsphères sont petites, plus leur surface extérieure apparente est importante. Les microsphères étant une matrice dans laquelle est dispersé le PA, celui-ci peut également être présent en surface de la microparticule, à l’instar des microcapsules. Des microsphères de trop petite taille peuvent donc être à l’origine d’un risque élevé de relargage massif des protéines au moment de l’administration (burst effect). Lors de futurs essais de microencapsulation de protéines, il sera essentiel d’évaluer la cinétique de libération de la protéine ou du peptide encapsulé. L’association du PVA et du Montanox® 80 plutôt que du PVA seul dans la PEA est néfaste car elle engendrerait des microsphères plus grosses et plus hétérogènes en taille. Or l’association du PVP avec le Montanox® 80 dans la PEA est quant à elle bénéfique, engendrant des tailles de particules plus petites ainsi qu’une meilleure homogénéité de taille comparée à l’utilisation du PVP seul. Il serait important ici d’analyser les interactions du PVA avec le Montanox® 80 et de comprendre les mécanismes mis en jeu sous ultrasons entre le Montanox 80 et le PVP ou le PVA.
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Le cordon ombilical humain, source de cellules pour le génie tissulaire : isolement, caractérisation et production de substituts humains

Le cordon ombilical humain, source de cellules pour le génie tissulaire : isolement, caractérisation et production de substituts humains

différenciation des kératinocytes étaient aussi présentes, y compris la transglutaminase, la filaggrine, l’involucrine et la K10. Alors, la culture à l’interface air-liquide en combinaison avec la présence des fibroblastes dermiques fut suffisante pour induire cette différenciation chez les cellules épithéliales, et adéquate pour la formation d’une membrane basale complète, tel qui sera discuté plus en détail ci-dessous. En contraste avec ces résultats, lorsque les cellules épithéliales furent ensemencées sur un derme reconstruit de cellules de la gelée de Wharton elles se sont développées seulement dans des conditions immergées. En effet, sur ce type de stroma les deux types épithéliaux ont formé des couches cellulaires plus épaisses et plus régulières que sur les fibroblastes dermiques. Ceci démontre l’influence du derme sur les cellules épithéliales dans un environnement sans exposition à l’air, et alors sans élément qui provoquerait une différenciation vers le phénotype de peau stratifiée. Une fois en culture air-liquide, les substituts composés seulement de cellules du cordon ombilical ont subi une dégénération progressive au fil des jours, les cellules épithéliales n’étant pas capables de répondre aux stimuli externes sans l’appui des fibroblastes dermiques. Ici s’ouvrent deux aspects à approfondir par des études plus poussées: la comparaison des facteurs de croissance et autres facteurs impliqués dans les différentes voies de prolifération et de différenciation; et le devenir des divers types de substituts durant une culture submergée prolongée. Les cellules épithéliales du cordon expriment la K13, kératine typique des épithélia stratifiés muqueux et importante dans la régulation de la différenciation et de l’apoptose de ces tissus (Moll et al., 1982; Moll et al., 2008), alors la production de tissus muqueux reconstruits in vitro avec ces cellules pourrait être envisagée.
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L'utilisation des cellules souches embryonnaires à des fins thérapeutiques

L'utilisation des cellules souches embryonnaires à des fins thérapeutiques

La découverte des cellules souches embryonnaires et de leur immense potentiel thérapeutique a fait naître de grands espoirs. De nouvelles thérapies révolutionnaires pour traiter certaine[r]

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Quand les cellules iNKT partent au charbon : nouvelles pistes thérapeutiques

Quand les cellules iNKT partent au charbon : nouvelles pistes thérapeutiques

Nous avons étudié l’effet de l’injection de l’-GalCer sur la réponse immuni- taire mettant en jeu les cellules iNKT [9] . En utilisant un modèle murin d’an- thrax cutané au niveau de l’oreille, nous avons tout d’abord démontré que l’injec- tion simultanée de l’-GalCer et de B. anthracis bloquait la dissémination de la bactérie dans le ganglion lymphatique (GL) drainant l’oreille infectée. Les souris infectées et n’ayant pas reçu l’-GalCer présentaient une dissémination systé- mique de la bactérie détectable dans la rate dès 24 h après l’infection. Par ailleurs, le traitement par l’-GalCer des souris infectées permettait de contenir Quand les cellules iNKT partent
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Séparation et caractérisation des protéines de lait de chamelle Algérien

Séparation et caractérisation des protéines de lait de chamelle Algérien

Les teneurs en protéines des laits sont illustrées dans le tableau 09 et la figure suivante. Tableau 09 : teneurs protéiques des laits camelins analysés A, b : Comparaison statistique entre les moyennes deux à deux par le test de Newman Les valeurs moyennes relevées pour les échantillons de lait de la chamelle varient entre 2,85 et 3,93 g/l (figure 13), alors que pour le lait bovin nous avons relevé une teneur moyenne en protéines de 3,99 g/l. Malgré la contigüité des moyennes entre les échantillons du lait de chamelle et avec l’échantillon de lait de vache, il ressort que l’échantillon (Wilaya d’ El-Bayad, figure 13), présente une carence en protéines. Cet écart peut s’expliquer, comme pour la matière grasse, par les faibles teneurs en protéines du lait dromadaires lors de la période de collecte (Masle et Morgan, 2001). Le lait camelin renferme cependant plus d'acides aminés libres et d’autres composés azotés non protéiques (NPN) que le lait bovin. Le taux de caséine totale est un peu plus faible dans le lait de dromadaire que dans le lait de vache ; il représente 75 à 79 % de la matière protéique contre 77 à 82 % pour le lait de vache. De plus, l'équilibre entre les
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Les cellules souches bucco-dentaires : prélèvement, culture et possibilités thérapeutiques

Les cellules souches bucco-dentaires : prélèvement, culture et possibilités thérapeutiques

Il existe de nombreuses sources de cellules souches bucco-dentaires : • DPSC : Dental Pulp Stem Cell cellules souches de la pulpe dentaire • SCAP : Stem Cell of Apical Papilla cellules s[r]

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Rôle et potentialités thérapeutiques des cellules T régulatrices dans la physiopathologie de la maladie d'Alzheimer

Rôle et potentialités thérapeutiques des cellules T régulatrices dans la physiopathologie de la maladie d'Alzheimer

64 B. Les réponses immunitaires dans le SNC 1. Les réponses immunitaires innées Les cellules microgliales sont les phagocytes résidents du SNC et y constituent la première ligne de défense contre les intrusions ou les lésions. Dans les conditions physiologiques, elles jouent un rôle clé dans le maintien de l’homéostasie neuronale. Une fois un signal de danger endogène ou exogène détecté, elles modifient leur activité et mettent en place une réponse immunitaire de type innée. Les signaux activateurs peuvent émaner de pathogènes, et être de type Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs), ou provenir de modifications du microenvironnement local, telle qu’une dysfonction cellulaire et métabolique, ou une lésion. On parle alors de Danger-Associated Molecular Patterns (DAMPs). Les PAMPs et les DAMPs sont détectés par des familles de récepteurs les Pattern Recognition Receptor (PRR) présents à la surface ou à l’intérieur des cellules microgliales. Les PAMPs sont un ensemble de molécules microbiennes partageant un certain nombre de caractéristiques biochimiques (peptydoglycane, lipopolysaccharide, flagelline, ADN, parois cellulaires…) dont la présence signale l’intrusion d’un pathogène dans le CNS. Les DAMPS ou alarmines, englobent une classe de molécules très diversifiées comprenant des protéines endogènes, des acides nucléiques et des métabolites comme l’ATP, l’IL1α et l’IL33 [Bianchi 2007]. Il existe plusieurs familles de PRRs, exprimées à la surface ou à l’intérieur des cellules microgliales : les Toll-like receptors (TLRs), les Nod-like receptors (NLRs), les Rig-like receptors (RLRs), les Scavenger receptors (SRs)... L’activation de ces PRRs par liaison aux PAMPs ou DAMPs déclenche l’activation cellulaire et une production de médiateurs inflammatoires [Gadani et al. 2015].
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Caractérisation morphologique, biochimique et physiologique des protéines de jonction lacunaire, les connexines 46 et 50, dans les cellules folliculo-stellaires TtT/GF de l’hypophyse antérieure

Caractérisation morphologique, biochimique et physiologique des protéines de jonction lacunaire, les connexines 46 et 50, dans les cellules folliculo-stellaires TtT/GF de l’hypophyse antérieure

In addition to the hypophysiotrophic hormones, anterior pituitary secretory cells are also strongly influenced by a wide variety of paracrine messengers that are synthesized and secreted directly within the gland. These are present in a variety of chemical forms including: small molecules (Ex: nitric oxide (NO) and adenosine), and an assortment of proteins that include cleavage -subunit of glycoproteins LH, FSH and TSH) and peptides (follistatin and vasoactive intestinal peptide (VIP)). The general effect on hormone secretion of many of these paracrine messengers is similar to that of the hypophysiotrophic hormones, in that secretion is either decreased or increased in response to a particular messenger. For instance, adenosine (secreted by folliculo-stellate cells) has been shown to decrease FSH secretion from gonadotrophs (Yu, Kimura et al. 1998). Furthermore, paracrine messengers exert their effects on hormone secretion by other means including: increasing endocrine cell proliferation (mitogenic effect) (ex: insulin-like growth factor I (IGF-I) and basic fibroblast growth factor (bFGF)), hormone-secreting cell hyperplasia (galanin) and stimulation of endocrine cell differentiation (common -subunit of glycoproteins LH, FSH and TSH). The fact that the production of these factors is assumed by the anterior pituitary hormone-secreting cells or the folliculo-stellate cells (to be discussed in subsequent sections), suggests a local control mechanism amongst adenohypophyseal endocrine cells (Schwartz 2000).
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Ligands biotechnologiques des récepteurs couplés aux protéines G : vers des applications diagnostiques ou thérapeutiques

Ligands biotechnologiques des récepteurs couplés aux protéines G : vers des applications diagnostiques ou thérapeutiques

protéines de fusion pour répondre à deux problématiques, la première avec des applications diagnostiques alors que la seconde a des applications thérapeutiques. La première problématique que j’ai étudiée est la difficulté de détecter les niveaux endogènes de GPCRs. En effet, ce sont des protéines très difficiles à détecter avec les stratégies actuelles, notamment les anticorps. Il y a plusieurs situations où il est impossible de générer des anticorps contre certains antigènes. Par exemple, lorsque l’antigène possède une forte homologie avec une protéine de l’animal immunisé, il sera très difficile de générer un bon anticorps (Chames et al., 2013). C’est un problème pertinent dans le cas des GPCRs, car ces récepteurs sont souvent bien conservés d'une espèce à l'autre. Aussi si l’épitope à reconnaitre est conformationel ou post-traductionnel, l’anticorps résultant risque d’être éliminé lors de l’apprêtement des antigènes (Keefe et al., 2013). Pour détecter des GPCRs sur de cellules intactes, il faut absolument que l’anticorps soit capable de reconnaitre la conformation intacte et tridimensionnelle du récepteur alors que la plupart des anticorps sur le marché reconnaissent les structures dénaturées des protéines. Aussi il est très difficile pour des molécules de très grandes tailles comme les anticorps (>150 kDa) de détecter les GPCRs intacts, car ceux-ci sont enfouis dans la membrane plasmique. De plus, comme mentionné plus haut, les anticorps anti-GPCRs commerciaux ne sont pas validés et sont plus souvent qu’autrement non-spécifiques (Michel et al., 2009). Une autre étude portant sur plus de 20 000 anticorps commerciaux a rapporté que seulement la moitié d’entre eux pouvait détecter leur cible dans l’application recommandée par le fabricant (Berglund et al., 2008). Une approche basée sur les protéines de fusion permettrait la détection spécifique des GPCRs. En effet, cette approche est basée sur le peptide ligand du récepteur qui bénéficie de plusieurs millions d’années de coévolution avec sa cible, résultant en une affinité très élevée. Toutefois, l’approche basée sur les protéines de fusion fluorescentes que j’ai explorée durant ma maîtrise n’est pas compatible avec la détection des populations endogènes de récepteur. En effet, ceux-ci sont trop peu abondants, seulement quelques fentomoles de récepteurs par cm 2 de cellules en culture. Aussi, la
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