Haut PDF Caractérisation de la régulation de la transcription par l'ARN polymérase III chez Saccharomyces cerevisiae

Caractérisation de la régulation de la transcription par l'ARN polymérase III chez Saccharomyces cerevisiae

Caractérisation de la régulation de la transcription par l'ARN polymérase III chez Saccharomyces cerevisiae

Plus en aval, TORC1 affecte l’activité de la phosphatase 2A (PP2A). TORC1 phosphoryle la protéine Tap42 qui se fixe alors aux sous-unités catalytiques Pph21 et Pph22 de la PP2A, et Sit4 de la phosphatase « PP2A-like » (Di Como et al., 1996 ; Jiang et Broach, 1999 ; Düvel et Broach, 2004). Lorsque la protéine Tap42 est liée à ces sous-unités, les autres sous-unités des phosphatases ne peuvent plus s’assembler. Suite à un traitement à la rapamycine ou à une carence en azote, l’activité de TORC1 est réduite et Tap42 est déphosphorylée : Tap42 libère les sous-unités catalytiques des phosphatases qui vont médier l’inhibition de la croissance (Di Como et al., 1996 ; Jiang et Broach, 1999). Une fois libérée, Sit4 déphosphoryle le facteur de transcription Gln3 qui induit la transcription des gènes en réponse à une carence nutritionnelle (Beck et Hall, 1999 ; Düvel et al., 2003). De même, lorsque la PP2A est activée, les facteurs de transcription Msn2 et Msn4 s’accumulent dans le noyau et induisent l’expression des gènes STRE en réponse à un stress (Görner et al., 2002 ; Santhanam et al., 2004). Parallèlement, la PP2A régule la transcription par l’ARN Pol III. En effet, l’inactivation par mutation de la sous-unité régulatrice Tpd3 de la PP2A résulte en une inhibition de la synthèse des ARNt in vivo et in vitro, à partir d’extraits cellulaires, chez Saccharomyces cerevisiae (van Zyl et al., 1992). Cette inhibition de la transcription fait également intervenir le répresseur Maf1. Lorsque Maf1 est déphosphorylé par la PP2A, il est activé et réprime la transcription par l’ARN Pol III. Des mutations altérant l’activité de la PP2A empêchent la déphosphorylation de Maf1 qui devient incapable de réprimer la transcription en présence de rapamycine (Oficjalska-Pham et al., 2006).
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Etude de la régulation de la transcription par l'ARN polymérase III chez Saccharomyces cerevisiae. Rôle des domaines conservés au cours de l'évolution de la protéine Maf1, un répresseur de l'ARN polymérase III

Etude de la régulation de la transcription par l'ARN polymérase III chez Saccharomyces cerevisiae. Rôle des domaines conservés au cours de l'évolution de la protéine Maf1, un répresseur de l'ARN polymérase III

BC chez la levure S. cerevisiae, un organisme modèle très pratique pour étudier les relations entre la structure et la fonction d’une protéine. Nous avons utilisé dans un premier temps la technique du double hybride afin de vérifier si une interaction entre les domaines A et BC existe chez cette levure. Le domaine putatif BC (aa 196-349) a été fusionné au domaine de liaison à l’ADN de Gal4 (plasmide pAS2) et co-exprimé avec diverses constructions du domaine A fusionné avec le domaine d’activation de la transcription de Gal4 (plasmide pACT2) dans la souche de levure Y190 dont l'activité β-galactosidase est mesurée. En effet, l’interaction entre les protéines de fusion devrait entraîner l’expression du gène exprimant la β-galactosidase. En utilisant cette approche, nous avons observé une interaction physique entre les domaines BC de Maf1 codé par le plasmide pAS2- Maf1-BC(196-349) et des fragments du domaines A de Maf1 codés par les plasmides pACT2-Maf1-A(1-42), pACT2-Maf1-A(1-39) et pACT2-Maf1-A(1-34) (Figure 3). Nous n’avons pas pu mettre en évidence d’interaction entre le domaine BC avec des fragments plus réduits du domaine A et codés par les plasmides pACT2-Maf1-A(1-12), pACT2-Maf1-A(1-16) ou pACT2-Maf1-A(1-23). Les cellules contenant les plasmides pAS2-Maf1-BC et pACT2 vide ne permettent pas de détecter d’activité β -galactosidase. Ces résultats démontrent la spécificité de l’interaction révélée par la technique du double-hybride et définissent les acides aminés 1-34 comme étant le plus petit fragment du domaine A de ScMaf1 encore capable de se lier au domaine BC. Les interactions réciproques n’ont pas pu être étudiées car la présence d’un plasmide pAS-Maf1-A même en absence d’un plasmide pACT2 active la transcription du gène testeur. Enfin, nous avons aussi vérifié que le plasmide pAS2-Maf1-BC en combinaison avec des plasmides pACT2 codant pour des fusions de la plupart des gènes de la machinerie de transcription de la Pol III donnent des résultats négatifs.
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Conséquence physiologiques et mécanistiques de l'intéraction covalente du facteur Rm3 avec l'ARN polymérase I chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Conséquence physiologiques et mécanistiques de l'intéraction covalente du facteur Rm3 avec l'ARN polymérase I chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Une analyse précise de ces vitesses nécessiterait un système où la matrice transcrite serait modifiée d’une façon telle qu’après purification des complexes ternaires bloqués en position +22, l’on puisse mesurer les vitesses d’incorporation de 1, puis de 2 et enfin de 3 XTP (étude par « marche sur l’ADN » ou « DNA walking »). Pour les raisons explicitées précédemment, une telle étude est pour l’instant inenvisageable. Nous sommes donc contraints de faire une approximation et de considérer qu’elle est équivalente à la vitesse de disparition du 22 mer quand le GTP est ajouté. Cette vitesse n’est cependant pas accessible dans les conditions expérimentales utilisées jusqu’à présent puisque le 22 mer disparaît beaucoup trop rapidement pour pouvoir mesurer une constante de vitesse apparente (dès 10 secondes de cinétique après ajout des nucléotides froids, le 22 mer a totalement disparu). Il fallait donc trouver un moyen pour ralentir la réaction. Une problématique similaire relative à l’analyse mécanistique de la transcription Pol III avait été résolue au laboratoire en diminuant la température à laquelle l’expérience était réalisée de 25°C à 16°C (Alic et al., 2007).
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Les étapes précoces de la biogenèse du ribosome chez Saccharomyces cerevisiae

Les étapes précoces de la biogenèse du ribosome chez Saccharomyces cerevisiae

2010). Cela confirme les récents travaux qui montrent l’existence d’une conformation spécifique du pré-ARNr naissant avant le clivage au site A2 qui permettrait le recrutement des facteurs nécessaires à sa maturation (Strunk et al., 2011). iii. Intérêt de la maturation co-transcriptionnelle du transcrit primaire. Il a été montré que la biogenèse du ribosome est affectée lorsque la cellule présente un défaut d’élongation de la transcription par l’ARN Pol. I (Schneider et al., 2007). Lors de l’élongation de la transcription, l’avancée de la polymérase créé des super-enroulements négatifs en amont et des super-enroulements positifs en aval (Cook, 1999). L’accumulation de super-enroulements positifs empêche l’ouverture de l’ADNr, ralentissant l’élongation de la transcription (Zhang et al, 1988). Les super-enroulements négatifs gardent l’ADNr en position ouverte, facilitant son hybridation avec le précurseur d’ARNr naissant donnant une structure appelée R-loop (Drolet, 2006). Ce sont les topoisomérases Top1p et Top2p qui sont responsables du relâchement de ces super-enroulements. Un marquage métabolique montre qu’en l’absence de Top1p les clivages précoces sont retardés (El Hage et al., 2010). Il semble que l’absence de Top1p réduirait l’accumulation de super-enroulements positifs qui empêcheraient l’élongation de la transcription et entraînerait la formation de R-loops. Les facteurs requis pour la maturation du pré-ARNr ne pourraient alors pas être recruté ce qui retarderait les clivages précoces. La répartition des ARN Pol. I sur l’ADNr a été obtenue par immunoprécipitation de chromatine. La quantité d’ARN Pol. I au niveau de la séquence codant pour la région 5’ de l’ARNr de 18S suggère l’existence d’un point de contrôle de l’assemblage du SSU Processome. A ce niveau, le ralentissement de l’élongation de la transcription permettrait le repli du pré-ARNr naissant et l’assemblage de protéines ribosomiques (Schneider et al., 2007 ; El Hage et al., 2010). Ainsi, la synchronisation de l’élongation de la transcription et de l’assemblage du SSU processome faciliterait le repliement du transcrit naissant. Cela permettrait de réduire l’exposition d’ARNs nus non repliés et empêcherait la formation de R-loops.
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Caractérisation de la fonction moléculaire du petit ARN nucléolaire H/ACA, snR30, dans la biogenèse des ribosomes chez Saccharomyces cerevisiae

Caractérisation de la fonction moléculaire du petit ARN nucléolaire H/ACA, snR30, dans la biogenèse des ribosomes chez Saccharomyces cerevisiae

Figure 1 : Les RNP impliquées dans l’expression génique. Ce shéma représente les différents rôles des RNP participant à l’expression génique chez les eucaryotes. Après la transcription par l’ARN polymérase II (RNA Pol II), les pré-ARNm sont reconnus par diverses protéines comme les hnRNP et les protéines SR (sérine-arginine riche). Les pré-ARNm contenant des exons (en rouge) et des introns (en rose) sont sujets à plusieurs étapes de maturation réalisées par différentes RNP qui incluent les petites RNP nucléaires riches en uridine (U snRNPs) formant le complexe d’épissage ou « spliceosome ». Certains ARN tels que les pré-ARN de transfert (pré-tRNA) ou les ARN codant les histones sont aussi maturés par des RNP spécifiques (respectivement la RNase P et la snRNP U7). Les petites RNP nucléolaires (snoRNP) et les petites RNP des corpuscules de Cajal (scaRNP) sont elles impliquées dans la maturation des composants ARN d’autres RNP telles que les ARN ribosomiques et les snARN, respectivement. De petits ARN peuvent aussi former des microRNPs qui régulent la traduction. Dans certains organismes, d’autres ARN forment des complexes (RITS) qui régulent la formation et la maintenance de l’hétérochromatine. La télomérase est une scaRNP à boîtes H/ACA particulière qui est responsable du maintien des répétitions télomériques essentielles à la stabilité du génome. Dans le cytoplasme, les ribosomes sont des RNP clés responsables de la traduction des ARNm en protéines. Ils fonctionnent en coordination avec la particule de reconnaissance du signal (SRP) afin de permettre la translocation des protéines dans le réticulum endoplasmique (ER). Enfin, les ARNt forment aussi des complexes en association avec l’aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) synthétase dans le cytoplasme permettant de charger les ARNt avec l’acide aminé correspondant et le facteur d’élongation de la transcription eEF1A.
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Organisation du génome par le complexe cohésine chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Organisation du génome par le complexe cohésine chez la levure Saccharomyces cerevisiae

par l’ARN polymérase III (Pol III) étaient préférentiellement recrutés à l’interface entre le nucléole et le nucléoplasme lors de leur transcription (Belagal et al., 2016). iv. L’enveloppe et les pores nucléaires En plus des trois éléments cités ci-dessus, l’enveloppe et les pores nucléaires influencent également le positionnement des chromosomes au sein du noyau. L’enveloppe nucléaire est constituée d’une double bicouche lipidique. Sa membrane externe, en continuité avec le réticulum endoplasmique, est en contact avec le cytoplasme alors que sa membrane interne fait face à l’intérieur du noyau. Les deux membranes sont séparées par un espace inter-membranaire mais fusionnent localement au niveau des pores nucléaires (pour revue (Taddei and Gasser, 2012)). Les pores nucléaires ou NPC (pour « Nuclear Pore Complexes ») sont des complexes protéiques de 50 MDa composés de 30 protéines différentes (les nucléoporines), toutes présentes dans le complexe selon un multiple de 8 (Kim et al., 2018; Rout et al., 2000). Chaque NPC est composé d’un anneau central et de deux anneaux, un externe et un interne d’où émanent des filaments protéiques flexibles, en direction du cytoplasme et du noyau respectivement (Alber et al., 2007). La fonction première des NPCs est de permettre le transport et l’échange entre le cytoplasme et le noyau des ARNs et des protéines. La face nucléaire des NPCs peut également s’associer avec la chromatine active en transcription ((Casolari et al., 2004), Figure 39 encart orange). Cette association stimulerait la transcription des gènes et permettrait de faciliter l’export des ARN messagers produits vers le cytoplasme ((Blobel, 1985) pour revue (Dieppois and Stutz, 2010)). Ce type d’interaction a notamment été observé lors de l’activation des gènes Gal : l’ajout de galactose dans le milieu a provoqué l’activation de la transcription de ces gènes et leur relocalisation à proximité des NPCs (Cabal et al., 2006; Taddei et al., 2006). Cependant la relocalisation des gènes aux NPCs n’est pas requise pour leur transcription et tous les gènes n’y sont pas recrutés lors de leur activation (Cabal et al., 2006).
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Etude de l'ARN polymérase I et du rôle de ses sous-unités spécifiques chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Etude de l'ARN polymérase I et du rôle de ses sous-unités spécifiques chez la levure Saccharomyces cerevisiae

ABSTRACT In eukaryotes cells, there are 3 nuclear RNA Polymerases (Pol I, II and III), each having a particular RNA synthesis function. The RNA Polymerase I (Pol I) produces a single transcript: the precursor of the large ribosomal RNA (rRNA), which correspond to a massive transcription activity in the cell. Structural data of this 14-subunits enzyme is now available. This allows a better understanding of its operating mode, and confirmed that the Pol I has 3 specific subunits, also called "Built-in transcription factors", capable of regulatory activities. Two of them, Rpa49/Rpa34, are forming a heterodimer structurally related to the Pol II transcription factors TFIIF and TFIIE, implicated in both initiation and elongation of the transcription. The last one, Rpa12, is known to have a role in Pol I stability and the cleavage activity of the paused Pol I (via its C-terminus part), like its homologous TFIIS in the Pol II. We performed extensive genetic studies of Pol I mutants lacking one of these subunits: Rpa49 (rpa49Δ). This depletion is viable, but results in initiation and elongation problems. Here, we report the cloning and characterization of extragenic suppressors mapping point mutations in three subunits of Pol I restoring efficient Pol I activities in absence of Rpa49. All suppressor mutations identified were structurally mapped firstly in the two largest subunits Rpa190 and Rpa135 very closed to Rpa12, and then in Rpa12 itself, indicating a possible interplay between the Rpa49 and Rpa12 subunits, and the area around. Notably, a RNA pol I specific element in Rpa190, called "DNA Mimicking Loop", is structurally very closed to the region in which we find all of our suppressor mutations. The genetic, structural but also biochemical and functional characterizations of these suppressors allow us to propose roles of these Rpa49 and Rpa12 subunits, but also of the small area of Rpa190, which has never been highlighted before.
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Caractérisation du domaine C-terminal de l'ARN polymérase II et de la phosphatase Glc7 dans la terminaison transcriptionnelle chez Saccharomyces cerevisiae

Caractérisation du domaine C-terminal de l'ARN polymérase II et de la phosphatase Glc7 dans la terminaison transcriptionnelle chez Saccharomyces cerevisiae

the presence of ectopic alleles carrying otherwise lethal mutations. The endogenous and ectopic alleles are tagged with Myc and Flag respectively, allowing for their analysis by antibody-based assays such as western blotting, ChIP or NET-Seq. We introduced mutations in phosphorylatable residues in all 26 CTD repeats, turning them into non-phosphorylatable or sometimes phosphomimetic residues (see Figure 2.1A). For example, the Y1F mutant expresses an rpb1 where all tyrosines are turned into phenylalanines. Note that all mutants were constructed within a WT CTD context, that is, in a natural repeat context (hence containing consensus and non-consensus repeats) rather than in an “all-consensus repeats” background. Importantly, all alleles were expressed at physiological levels and no sign of truncation or degradation was observed (Figures S2.1A and S2.1B). All mutations tested were viable in that context, although some, such as the Y1F mutant, exhibited slightly slower growth (Figure S2.1C). Chromatin immunoprecipitation (ChIP) experiments coupled to high- resolution tiling arrays (ChIP-chip) using anti-Myc and anti-Flag antibodies were used to monitor the genomic distribution of each mutant (Flag) together with its respective WT (Myc), both from the same chromatin extract. The genomic distribution of the different WTs (each expressed in the presence of a different mutant) were all very similar, highlighting no major dominant negative effect of the mutants on the WT enzyme (Figure S2.1D). Each mutant, however, showed noticeable differences when compared to their respective WT, indicating transcriptional defects. For example, at the 5’ end of genes, a notable difference was observed with the S5A mutant (Figure 2.1B), which has a profile consistent with the role of Ser5 phosphorylation in promoter escape (Jeronimo and Robert, 2014; Wong et al., 2014). In this report, we focused on the 3’ end of genes, investigating the role of the CTD in transcription termination.
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La régulation de l’expression génique peut passer par un mécanisme de terminaison prémature de la transcription dépendant de la RNase III chez Saccharomyces cerevisiae

La régulation de l’expression génique peut passer par un mécanisme de terminaison prémature de la transcription dépendant de la RNase III chez Saccharomyces cerevisiae

(Figure 3E). Ces résultats provenant de la tige-boucle semblaient donc proportionnellement beaucoup plus importants et influents que ceux provenant du changement de promoteur. Après courte réflexion, ces résultats peuvent quand même être logiques lorsque l’on regarde comment Rnt1p s’associe à la chromatine. Lorsqu’on regarde le profil d’association de Rnt1p à la chromatine de la souche avec la modification du promoteur, il est possible de remarquer une accumulation progressive de l’enzyme tout au long de la transcription comme celle de la souche sauvage (Figure 5B). Cela nous permet donc de supposer que le recrutement de Rnt1p à la région promotrice serait promoteur indépendant car le changement de promoteur n’a pas influencé le niveau d’association ou son profil. Cependant, même si le recrutement semble se faire de manière indépendante, Rnt1p est capable d’avoir un effet ARN dépendant et promoteur dépendant sur l’expression de certains gènes in-vivo (Lavoie M et al, 2012). Si ce n’est pas par la liaison de l’enzyme, il se pourrait que notre mécanisme soit régulé par la présence d’un cofacteur potentiellement lié au décrochage de Rnt1p. Par double-hybride, nous savons que Rnt1p est apte à lier différents facteurs de transcription, élément qui renforcissait notre théorie initiale du rôle du promoteur. Cependant, Rnt1p est apte à lier un grand nombre de protéines et nous ignorons toujours si sa liaison potentielle avec les facteurs de transcription est directe ou le simple fruit d’un hasard indirect. Nos résultats semblent suggérer que ces interactions sont beaucoup plus indirectes qu’estimées initialement et ont un effet moindre sur la capacité de Rnt1p à induire une terminaison dans les séquences codantes.
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Remodelage de la chromatine et transcription : Étude d'un mutant du complexe RSC chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Remodelage de la chromatine et transcription : Étude d'un mutant du complexe RSC chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Étude de la fonction de l'interaction entre la sous-unité commune ABC27 et la grande sous-unité de l'ARN polymérase III. Les trois ARN polymérases de S. cerevisiae. partagent 5 sous-unités parmi lesquelles ABC27 dont la fonction n'est pas encore bien établie. Des cribles double-hybride sur les sous-unités d'ARN polymérases ont été réalisés au laboratoire dans le cadre du projet TAPIR (Two-hybrid Analysis of Proteins Involved in RNA metabolism) dans le but de chercher un réseau d'interaction et d'intégrer la transcription dans le métabolisme nucléaire (Flores et al., 1999). La technique du double-hybride permet de détecter des interactions protéiques. Elle est fondée sur la reconstitution d'un activateur transcriptionnel chimérique. De nombreux activateurs transcriptionnels, comme par exemple la protéine Gal4, peuvent être séparés en deux domaines distincts : un domaine de liaison à l'ADN et un domaine activateur de la transcription. Ces deux domaines séparés ne sont pas capables d'interagir et de d'activer la transcription. Les protéines "appâts" sont fusionnées au domaine de liaison à l'ADN de Gal4 et les protéines "proies" au domaine activateur de Gal4. Si les protéines "appâts" et "proies" interagissent, l'interaction permet de rapprocher les deux domaines de la protéine Gal4 et de reconstituer un activateur transcriptionnel fonctionnel. L'interaction est testée dans la souche de levure Y190 dans laquelle le gène GAL4 est inactivé. Le gène bactérien LacZ encodant la β-galactosidase, utilisé comme gène rapporteur, est placé sous le contrôle d'éléments promoteurs dépendants de l'activateur Gal4 (Fields and Song, 1989). La transcription du gène rapporteur est activée s'il y a interaction entre l'appât et la proie. Le X-gal est un substrat chromogène de la β-galactosidase qui permet de détecter la présence de l'enzyme par coloration en bleu des colonies.
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Contrôle de l'homéostasie redox et détection des oxydants. Régulation du facteur de transcription Yap1 chez S. cerevisiae

Contrôle de l'homéostasie redox et détection des oxydants. Régulation du facteur de transcription Yap1 chez S. cerevisiae

B. La concentration des IRO doit être contrôlée 1) Pourquoi les IRO sont-ils toxiques ? In vivo, l’exposition des cellules aux IRO, et en particulier au peroxyde d’hydrogène, peut, à de faibles doses, induire une inhibition de la croissance et à des doses plus fortes, entraîner la mort. Les bases moléculaires de tels phénomènes sont encore étonnamment mal connues. L’une des hypothèses avancées est que la présence de ces IRO endommage de façon non spécifique l’ensemble des composants cellulaires, en particulier via la production de radical hydroxyle. La moindre réactivité des peroxydes et de l’ion superoxyde suggère par ailleurs que cette toxicité peut être associée à l’inactivation de cibles plus spécifiques [9, 10]. Une autre hypothèse, non exclusive, peut cependant être proposée : la concentration des IRO doit être régulée car elle participe au maintien d’une homéostasie redox. Le maintien d’un état redox intracellulaire déterminé (défini par la somme des états dans lesquels se trouvent chaques couples redox présents), est une condition essentielle au bon fonctionnement des activités cellulaires [11, 12], définissant ainsi la notion d’homéostasie redox. L’ensemble des composants de la cellule participe à l’établissement de cette homéostasie. Cependant, certains sont plus importants que d’autres. Ainsi, le contrôle de l’état redox des métaux et des thiols constitue un paramètre essentiel de la régulation homéostatique. En quoi les IRO participent- ils à cette homéostasie ? Le peroxyde d’hydrogène et l’ion superoxyde sont des molécules redox, dont la présence modifie vraisemblablement l’équilibre homéostatique, en particulier grâce à leur réactivité respective vis-à-vis des thiols et des métaux. Il est donc probable que ces molécules contribuent à l’établissement de ce potentiel redox intracellulaire. Lorsque leur concentration n’est pas ou est insuffisamment régulée, le potentiel redox intracellulaire varie et peut devenir incompatible avec le fonctionnement de certaines activités, créant alors un stress oxydant. Une telle hypothèse pose la question suivante : la concentration en IRO, et en particulier la concentration en H 2 O 2 est-elle elle-même sujette à une régulation
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en
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en fr Epigenetic regulation of polymerase III RNA transcription machinery by histone deacetylase SIRT1 Régulation épigénétique de la machinerie de transcription de l'ARN polymérase III par l'histone désacétylase SIRT1

sur un gel SDS coloré au bleu de Coomassie, ainsi qu'une analyse par Western Blot avec les anticorps correspondants aux trois partenaires nous permettra de conclure sur le type de liaison les unissant. Si cette liaison s'avère être directe, il serait alors interessant de mapper les domaines d'interaction de SIRT1 avec Ki67 et TFIIIC90. Nous avons quelques informations concernant la structure de ces protéines, nous permettant de suggérer une stratégie d’analyse de ces interactions. Les analyses détaillées de la structure de Ki67 nous ont amené à la découverte de deux domaines principaux, un domaine FHA et un domaine composé de séquences répétées (Li et al., 2004). Nous ciblons le domaine FHA qui est impliqué dans la reconnaissance d'épitopes contenant des phosphoprotéines (pT) des procaryotes aux eucaryotes. On le retrouve dans plus de 200 protéines de fonctions variées comme la transduction du signal, la transcription lorsqu'il est associé à des facteurs de transcription ou le transport de protéines lorsqu'il est associé à la kinésine. Son rôle parait multiple car il possède de multiples cibles, spécifiques à chaque protéine qui le contient. Trois facteurs majeurs contrôlent l'interaction de FHA avec ses protéines cibles: un résidu pT, les résidus +1 à +3, et une surface de liaison étendue. La variation de ces trois facteurs est probablement la cause de la grande diversité dans la fonction et la spécificité des domaines FHA (Li et al., 2004). La sous-unité TFIIIC90, quant à elle, contient deux motifs en doigts de zinc, dans sa région C- terminale, pouvant être impliqués dans des interactions protéines-ADN et/ou dans des interactions protéines-protéines. De plus, TFIIIC90 a une propriété particulière, puisqu'elle a une activité HAT intrinsèque pour l'histone H3 nucléosomale et acétyle préférentiellement la lysine 14 de l'histone H3 (Hsieh et al., 1999). En utilisant le même type de stratégie qu'auparavant, nous pourrons construire différentes fusions GST-Ki67 et His-TFIIIC90 mutantes délétées de ces domaines potentielles d'interaction, les co-exprimer dans des cellules bactériennes et les immunoprécipiter afin de déterminer les acides aminés nécessaires à ces différentes interactions.
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Caractérisation des complexes cycline-Cdc28 impliqués dans la résection des télomères déprotégés chez Saccharomyces cerevisiae

Caractérisation des complexes cycline-Cdc28 impliqués dans la résection des télomères déprotégés chez Saccharomyces cerevisiae

130 2009 ; Paschini et al., 2010). De plus, les homologues des membres du complexe CST chez les eucaryotes supérieurs ont été impliqués dans la réplication générale du génome (Dewar et Lydall, 2012 et les références là-dedans). Les résultats présentés ici démontrent que la délétion des gènes des cyclines S conduit à une réduction supplémentaire de la croissance des cellules cdc13-1 qui n’est pas nécessairement liée à l’accumulation plus importante d’ADN sb aux télomères (figures 3.1B et D, 3.6A et B, 3.7A, B et C). Sachant que la délétion de multiples cyclines affecterait négativement la réplication d’ADN durant la phase S, la croissance réduite des cellules peut être expliquée par le ralentissement des fourches de réplication et l’accumulation de structures aberrantes qui demandent l’activation des mécanismes de réparation d’ADN. Lorsque la fonction de la protéine Cdc13 est compromise partiellement à 28°C, les télomères deviennent probablement un obstacle encore plus important pour la réplication. La difficulté de la fourche réplicative de traverser les régions télomériques a été documentée chez différentes espèces de levure (Ivessa et al., 2002 ; Miller et al., 2006). Les problèmes de réplication déjà présents dans les mutantes de cyclines sont probablement renforcés par l’inactivation partielle de la fonction de Cdc13, ainsi activant la DDR et freinant la croissance. Cette hypothèse est soutenue par nos analyses de l’activation de la protéine Rad53 qui semble plus fortement phosphorylée dans les souches cdc13-1 avec triple délétion de cyclines que dans la souche contrôle cdc13-1, et ce, notamment, à température de 28°C, mais pas à 23°C (figure 3.8A).
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Étude des mécanismes de dégradation sélective de l’ARN par la RNase III de Saccharomyces cerevisiae

Étude des mécanismes de dégradation sélective de l’ARN par la RNase III de Saccharomyces cerevisiae

regions were assigned to annotated features in the SGD genome of August 10th, 2007 (http://www.yeastgenome.org). Isolation and parallel sequencing of Rnt1p cleavage products (SALI) Hundred µg of RNA cleaved with Rnt1p were purified using the mirVana™ miRNA Isolation Kit (Ambion, Life Technologies, Burlington, ON) to isolate RNA shorter than ~150 nucleotides. The enrichment of short RNAs was confirmed using the Agilent 2100 Bioanalyzer Small RNA kit (Agilent technologies, Santa Clara, CA). The cDNA libraries were generated from 500 ng of size selected RNA using the Ion Total RNA-Seq Kit v2. The IonTorrent sequencing data were generated using Ion 318™ Chip Kit and acquired using Ion PGM System and Torrent Suite 2.2 software. 5' adapter sequences were trimmed using cutadapt 1.2rc2 [67]. Sequences shorter than 16 nucleotides were removed and the remaining reads aligned to S. cerevisiae reference genome sequence R64-1-1 using subread 1.3.5p4 [68]. Sequences with multiple matching positions were removed and reads ranging between 32 and 38 nucleotides were considered for further analysis. Read clusters consisting of 14 or more identical reads found in the cleaved and not the control samples were considered enriched. Enriched clusters of identical reads with over 50% overlap were merged and the resulting clusters were assigned to the transcripts with corresponding sequence. The RNA secondary structure for the longest merged cluster was predicted using Vienna RNA tools version 1.8.5. Wobble base pairs and non-canonical A-C base pairs were permitted in the predicted structures.
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Identification et caractérisation de nouveaux facteurs d'assemblage du protéasome 26S chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Identification et caractérisation de nouveaux facteurs d'assemblage du protéasome 26S chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Introduction / La protéine kinase Rad53 et les checkpoints de l’ADN chez S. cerevisiae 1.2 Les checkpoints 1.2.1 Du chekpoint mitotique… L’horloge centrale cyclines-CDK tourne rond. S succède à G1, G2 à S, M à G2… et on recommence (à condition, toutefois, que les conditions de croissance soient satisfaisantes). Une vraie horloge suisse ! Un programme autonome, constitutif, qui assure la multiplication des cellules. Mais tout ne va pas toujours pour le mieux dans le meilleur des mondes. Au contraire, la cellule est perpétuellement soumise à des stress, tant exogènes qu’endogènes, qui sont susceptibles de perturber cette belle machinerie. Hartwell avait ainsi remarqué que l’irradiation aux rayons X des levures ou l’ajout d’agents mutagènes provoquent un arrêt du cycle cellulaire (Hartwell et al, 1974). Il semblait donc exister a priori un mécanisme de contrôle qui tiendrait la cellule informée du bon déroulement du cycle et qui, en cas de problème, arrêterait l’horloge. Suite aux observations de Hartwell, Ted Weinert a testé les conséquences d’une irradiation aux rayons X sur le cycle cellulaire de différents mutants radiosensibles. Il a alors montré que l’inactivation du gène RAD9 (Radiation sensitive 9), en particulier, élimine la régulation du cycle par les radiations : les mutants rad9! continuent un temps de se diviser, donnant naissance à des microcolonies de cellules non-viables du fait des lésions au sein de leur génome (Weinert & Hartwell, 1988). En d’autres termes, Rad9 contrôle l’intégrité de l’ADN et arrête le cycle avant la mitose tant que les dommages ne sont pas réparés. Les checkpoints étaient nés… enfin, pas tout à fait. Reprenons. Le cycle cellulaire renvoie l’image d’une progression unidirectionnelle : la réplication de l’ADN est complétée avant la mitose, la condensation
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Caractérisation biomoléculaire et biotechnologique des souches de « Saccharomyces cerevisiae » issues des cépages Algériens

Caractérisation biomoléculaire et biotechnologique des souches de « Saccharomyces cerevisiae » issues des cépages Algériens

Les levures sont des acteurs essentiels intervenant dans divers domaines et l’intérêt qu’elles suscitent aujourd’hui est dû à leur grande diversité. Un grand nombre de levures communément utilisées en biotechnologie a été obtenu à partir d’habitats naturels où elles ont développé une faculté d’adaptation à un grand nombre de niches écologiques grâce à leurs propriétés physiologiques très caractéristiques. Par ailleurs, de nombreuses espèces de levures produisent un métabolite primaire très important à savoir l’éthanol, utilisé à la fois comme breuvage, carburant ou à d’autres fins industrielles. Une deuxième contribution majeure des levures dans les progrès de l’humanité a été leur utilité dans l’élucidation des processus biochimiques et génétiques fondamentaux chez les cellules. Ces micro-organismes ouvrent des voies de recherche pour l’avenir. Constamment améliorés, les systèmes de production permettent d’envisager la production de protéines très diverses, pour la pharmacie humaine ou vétérinaire, mais aussi pour d’autres applications dans les domaines de l’agro-alimentaire ou de la dépollution. Á l’heure actuelle, seule Saccharomyces cerevisaie et ses espèces apparentées ont une importance industrielle majeure. Différents micro-organismes possèdent de bonnes performances de production d’éthanol en métabolisant des hexoses, parmi eux les souches de levures
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Etude de la voie du coenzyme Q¦ chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Etude de la voie du coenzyme Q¦ chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Introduction Bibliographique I. Structure, distribution, propriétés redox et fonctions du coenzyme Q I.1. Structure Les quinones isoprénoides sont des composés lipidiques associés aux membranes et sont présentes quasiment chez tous les organismes vivants. Elles sont composées d’une tête polaire et d’une chaine latérale hydrophobe. Cette chaine isoprénoïde apolaire confère à ces molécules leur caractère liposoluble facilitant ainsi leur ancrage dans les bicouches lipidiques membranaires alors que la tête hydrophile (noyau quinone) permet l'interaction avec les parties hydrophiles des protéines. La grande majorité des quinones isoprénoïdes biologiques appartient à la famille des naphtoquinones et benzoquinones. Les deux groupes les plus répandus de benzoquinones sont les ubiquinones et les plastoquinones qui diffèrent entre eux par les substituants des noyaux quinones.
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Gènes impliqués dans le "shedding" des protéines GPI chez Saccharomyces cerevisiae

Gènes impliqués dans le "shedding" des protéines GPI chez Saccharomyces cerevisiae

5 Des évidences suggèrent toutefois que les voies de signalisation propres à l’UPR peuvent aussi être déclenchées à la suite d’un défaut dans la composition membranaire, même en absence de protéines mal repliées. En effet, une version mutée d e la protéine Ire1 ne possédant pas de domaine de liaison pour les protéines mal repliées, peut, dans certaines conditions, activer l’UPR presque aussi efficacement que lorsque ce domaine est présent. Il est alors possible de séparer nettement certains gènes déclenchant l’UPR selon l’intensité de la réponse en présence et en absence de ce domaine. Cette séparation permet de remarquer que les mutants déclenchant l’UPR indépendamment du domaine de Ire1p sont des gènes ayant un rôle pouvant mener à un déséquilibre dans l’homéostasie des lipides (Promlek et al., 2011). Chez la levure, seul Ire1p peut déclencher l’UPR, tandis que chez l’homme, il existe deux autres protéines senseurs connues, ATF6 et PERK (Harding et
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Étude de la chromatine télomérique et sous-télomérique chez "Saccharomyces cerevisiae"

Étude de la chromatine télomérique et sous-télomérique chez "Saccharomyces cerevisiae"

l’addition de répétitions télomériques par la télomérase (ou des évènements de recombinaison) va faire varier les séquences de la partie distale de télomères individuels. Les événements d’additions de répétitions télomériques par la télomérase (et/ou de recombinaisons) peuvent être déterminés par séquençage de télomères individuels. Ces expériences ont notamment révélé que l’action de la télomérase n’avait pas lieu sur tous les télomères d’une cellule après chaque passage de la fourche de réplication mais aussi qu’elle était préférentielle au niveau des télomères courts (Teixeira et al., 2004). L’élongation différentielle par la télomérase en fonction de la longueur des télomères avait été décrite précédemment à l’échelle de population de cellules. Via un système impliquant une recombinase site-spécifique, développé par Marcand et ses collaborateurs afin de générer un seul télomère court chez S. cerevisiae, une inhibition de l’élongation par la télomérase était observée plus les télomères étaient longs (Marcand et al., 1999). Cette élongation préférentielle des télomères courts est dépendante de Tel1, une des deux kinases clé de la DDR qui est recrutée aux télomères via la sous-unité Xrs2 du complexe MRX (Mre11, Rad50, Xrs2) (Chang et al., 2007). En absence de Tel1, en plus de la perte d’élongation préférentielle des télomères courts, une diminution de l’association de protéines de la télomérase aux télomères est observée (Goudsouzian et al., 2006 ; Hector et al., 2007 ; Sabourin et al., 2007) impliquant Tel1 aussi dans le recrutement et/ou l’activation de la télomérase à un télomère donné.
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Dynamique de la traduction de l'ARNm ASHI chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Dynamique de la traduction de l'ARNm ASHI chez la levure Saccharomyces cerevisiae

En effet, pour t’ARNm de type sauvage, le maximum de protéine obtenue est de 0,23 ± 0,04 de densité relative tandis que, lorsque tes éLéments de localisation sont mutés (construction A$H[r]

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