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Phosphoinositides et contrôle de la polarité cellulaire : régulations croisées entre la PIP5K Skittles et les protéines de polarité PAR1 et PAR3

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Academic year: 2021

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Phosphoinositides et contrôle de la polarité cellulaire :

régulations croisées entre la PIP5K Skittles et les

protéines de polarité PAR1 et PAR3

Julie Jouette

To cite this version:

Julie Jouette. Phosphoinositides et contrôle de la polarité cellulaire : régulations croisées entre la PIP5K Skittles et les protéines de polarité PAR1 et PAR3. Biologie cellulaire. Université Sorbonne Paris Cité, 2017. Français. �NNT : 2017USPCC118�. �tel-02951815�

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Phosphoinositides et contrôle de la polarité cellulaire : Régulations croisées entre la PIP5K Skittles et les protéines de polarité PAR1 et PAR3

Résumé :

La polarité cellulaire est un processus fondamental qui contrôle les spécificités fonctionnelle et physiologique de la plupart des cellules eucaryotes. Cette asymétrie intracellulaire repose sur l’existence de compartiments membranaires distincts, à la fois dans leur composition en protéines mais également en phosphatidyl-inositols (PIs). Ainsi, la mise en place et le maintien de la localisation asymétrique de modules multi-protéiques associés notamment aux protéines PAR sont essentiels pour l’élaboration des domaines de polarité cellulaire. Durant ma thèse, j’ai étudié les relations entre les protéines de polarité et les PIs dans le contrôle de la polarité cellulaire. Plus particulièrement, en utilisant la chambre ovarienne de Drosophile, j’ai cherché à caractériser la suite d’évènements qui en amont régule l’activité de la PIP5K, Skittles (SKTL), qui produit le PI(4,5)P2 et à caractériser les mécanismes moléculaires qui lient le PI(4,5)P2, SKTL et les protéines PAR dans le contrôle et le maintien de la polarité cellulaire. J’ai contribué à caractériser l’importance de PI(4,5)P2 majoritairement produit par SKTL, dans le maintien de la polarité apico-basale et lors de la morphogenèse des cellules folli<culaires de la chambre ovarienne. Le PI(4,5)P2 assure la localisation apicale de PAR3 et le maintien des jonctions adhérentes, sans affecter la localisation de PAR1. Par une méthode de quantification précise, j’ai ensuite démontré dans l’ovocyte que SKTL et le PI(4,5)P2, probablement grâce au trafic vésiculaire, étaient requis pour à la fois l’accumulation à l’antérieur de PAR3 et son exclusion au postérieur qui se fait à partir du stade 9B. L’accumulation antérieure de PAR3 est également dépendante d’un transport Dynéine dépendant et de la kinase IKKε tandis que son exclusion postérieure dépendant des phosphorylations par PAR1. Enfin, j’ai également étudié les modifications post traductionnelles de SKTL et leur importance dans la polarité cellulaire. J’ai identifié la présence de palmitoylation et de phosphorylations dont certaines impliquent la kinase PAR1 et la phosphatase PP1. Ces phosphorylations pourraient avoir un lien avec le rôle de SKTL dans le trafic vésiculaire. Ces résultats permettent donc d’élucider certains mécanismes cellulaires qui contrôlent la mise en place et le maintien de la polarité des cellules en liant les PIs et les protéines PAR.

Mots clefs : Polarité ; Protéines PAR ; Morphogenèse ; Phosphatidyl-inositols ; Trafic vésiculaire ; Modifications post-traductionnelles ; Drosophile

Phosphoinositides and cell polarity control : Interplay between the PIP5K Skittles and the polarity proteins PAR1 and PAR3

Abstract :

Cell polarity is a fundamental process that controls cell’s functional and physiological specificities. This process relies on membranous compartments differently composed both on proteins and on phosphatidyl-inositols (PIs). Indeed, through their asymmetric localization, polarity proteins, such as the PAR proteins, are essentials to establish and maintain polarity of the cells. During my PhD, I studied the interplay between the polarity proteins and the PIs. Using the Drosophila egg chamber, as a model, I aimed to characterized the upstream events that regulate the PI(4,5)P2 producing kinase (PIP5K), Skittles (SKTL), activity and localization. I also studied the downstream molecular process that link the PI(4,5)P2, SKTL and the PAR proteins in cell polarity. I contributed to the characterization of the importance of PI(4,5)P2, mainly produced by SKTL in maintaining the apical-basal polarity and during the morphogenesis of the follicle cells. The PI(4,5)P2 is ensuring PAR3 and adherens junctions but not PAR1 proper localizations. Next, through a precise quantification method, I showed that SKTL and the PI(4,5)P2, probably via vesicular traffic, were also ensuring PAR3 proper localizations (anterior accumulation and stage 9B posterior exclusion) in the oocyte. PAR3 accumulation also relies on a Dynein mediated transport and the IKKε kinase while its posterior exclusion relies on PAR1 phosphorylation. Finally, I studied SKTL post translational modifications and their relevance on cell polarity. I identified palmitoylation and phosphorylations that are regulated by the kinase PAR1 and the phosphatase PP1. SKTL phosphorylations seem to be related to its role on the vesicular traffic. Altogether these results clarify some mechanisms involving both PIs and PAR proteins in cell polarity maintaining and establishment.

Keywords : Polarity ; PAR proteins ; Morphogenesis ; Phosphatidyl-inositols ; Vésicular trafic ; Post-translational modification ; Drosophila

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Remerciements

Tout d’abord, je tiens à remercier les membres de mon jury, Anne Plessis, Arnaud Echard,

Vincent Mirouse, Cathy Jackson et François Schweisguth, pour avoir accepté d’évaluer

mon travail de thèse.

Je tiens également à remercier Antoine et Sandra pour m’avoir encadré pendant cette thèse. Merci Antoine de m’avoir permis de passer ces 5 années dans ton équipe et merci pour ta gentillesse et ton enthousiasme, pour tes conseils, la confiance et la liberté que tu nous as donné à Sandra et à moi. Sandra, merci est un mot bien trop petit pour témoigner la gratitude que je souhaiterais t’exprimer pour ces 5 années passées à travailler à tes côtés. Merci pour ton écoute et tes conseils instructifs, parfois hors sujets (mais c’était les meilleurs !) et toujours rassurants face à mon stress et mes angoisses. Ces longues après-midi de casses têtes à essayer de donner sens à toutes ces boulettes et ces bandes de Skittles, resteront pour moi des moments mémorables et d’échanges passionnants (même ceux qui se concluaient par plusieurs cachets d’aspirine !). Merci pour cette confiance et cette autonomie que tu m’as donné tout en restant toujours impliquée et présente dans les moments compliqués (comme me prêter main forte quand je lançais beaucoup trop de choses en même temps). Ton enrichissant encadrement restera pour moi un modèle que j’espère pouvoir un jour reproduire.

Merci également à toutes les personnes que j’ai rencontré dans l’équipe. Merci à tous pour vos conseils et votre bonne humeur. Merci à Pierre-Marie d’avoir partagé avec moi ton enthousiasme sans limites et quelques galéjades à la paillasse. Merci Nico pour ton aide toujours pédagogique avec les microscopes, le live et la macro. Merci Catherine pour ton franc parler et ta joie de vivre sans faille ! Merci pour tout ton aide à la paillasse (en m’engueulant presque pas :D) et pour toutes les séances de repiquages bénévoles. Merci

Kevin pour ton humour (notamment en pièce à mouche !), pour les grands débats de

sériephile et pour ta rigueur et tes conseils en particulier sur comment sauver mes stocks ! Tu en auras sauvé des vies ! Merci Véro pour ton implication et ton organisation notamment dans la gestion du milieu à mouches et des boîtes de ponte, qui m’ont souvent évité de me retrouver sans boite de ponte ! Merci Jean-Antoine pour tes conseils et tes remarques toujours pleins de sagesses. Merci Alain d’avoir été mon voisin de dos ! Merci pour tes blagues toujours de très bon gout et toutes ces photos de la Crête qui nous ont fait voyager du bureau ! Bon voyage en Australie et j’espère que tu vas rapporter pleins de fourmis… mais pas au labo !! Merci Fred pour ton dynamisme, tes idées, tes conseils et avis francs et justes et pour tes relectures (même si tu as quand même trop souvent réussit à repérer LE graphe qui n’était pas aligné ! ). Merci aussi de m’avoir permis de partager ma passion de la pizza (Sandra aussi, mais tu assumais moins … Surtout la pizza carrée ! ). Enfin, merci à tous les stagiaires du labo d’avoir rapporté votre fraicheur et votre enthousiasme et plus particulièrement, merci Thibault, Weize et Nina pour votre aide, votre curiosité et votre implication.

Merci à Anaëlle, Charlène, Cynthia, France et Karen pour ces soirées ou pauses détente et décompression avec un café, un sandwich ou une petite Kasteel (paix à son âme) et des frites. Karen, merci pour tes blagues très recherchées et les karaokés. Anaëlle, merci pour ta

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compagnie (parfois tardives) pendant les beer sessions, tes débats sur la dérive des continents m’ont toujours épatés, et merci pour le cours de guitare. Cynthia, merci pour toutes les IP, les western (parfois slim fast), les galères de l’anti-PAR3 et les sessions papotages à la paillasse (toujours à propos des manips bien entendu) ! Merci de m’avoir fait découvrir les plateaux télé et de nous avoir si bien guidé à Amsterdam ! France, merci pour ces délires et cette entraide avec Dany D. surtout pendant les révisions et les TP, à la fac. Merci pour ta pédagogie et ton efficacité à toute épreuve qui « sévissent » encore maintenant ! Charlène, merci pour ton super coaching de FRAP et merci d’avoir été en soutient pendant ces 2 dernières années mais aussi et surtout pendant la rédaction. Merci pour ces pauses balcon 7j/7 qui étaient parfaites juste pour se recharger, s’aérer, se plaindre et rigoler. Sans toi la rédaction aurait vraiment été très compliquée et je pense que la secrétaire de l’ED aurait fini par me donner une attaque et que je serais probablement morte de faim sans la généreuse contribution culinaire de Marc certains week-end.

Merci à tous les compagnons de pièce à mouches Alexis, Camilla, les 2 Isas, Marie (ce fut un plaisir de tester tes limites humoristiques avec Kevin), Michael, et Olga pour avoir participé à créer cet environnement chaleureux et plaisant, à la fois sérieux et divertissant. Je tiens également à remercier toutes les personnes croisées dans les couloirs de l’institut Jacques Monod et aux beer sessions qui permettent d’y créer un environnement enrichissant, agréable et positif. Cette liste est non exhaustive mais merci : Antonin, Benoit,

Chrystelle, Djihad, Hugo, Jeremy, Kim, Lisa, Lucia, Matthieu, Michael, Simon, Shreyansh, Théo, Valeria …

Merci à tous ceux qui font tourner cet institut : Norry et Jonathan au magasin ; les secrétaires, notamment Martine Malet pour ton efficacité et ta gentillesse. Et merci aux plateformes pour votre disponibilité et vos conseils : à la plateforme de protéomique, Thibaut et Camille et à la plateforme d’imagerie, Rémi et Jean-Marc pour votre avec la microscopie électronique, Xavier pour ton aide avec le FRAP et Orestis, Vincent, Chloé,

Sophie, Olivier et France.

Cindy et Audrey, merci les filles pour tous ces moments GE-NIAUX passés avec vous.

Merci de toujours avoir été là dans les moments compliqués, ou pour délirer et pour m’avoir hébergé tous ces week-ends qui m’ont permis de décompresser “tranquillement“ à la campagne. Cindy, merci pour cette décennie d’humour débile qui a à peu près débuté par ton “bruit“ de T. Rex. DD merci de nous supporter et merci pour toutes ces séances

obsesións parfois violentes (les meilleures) partagées avec toi.

Enfin, je tiens à remercier infiniment ma famille pour leur soutient sans faille et leurs encouragements. Merci à tous les HAUT-savoyards, de m’avoir fournis la dose de fromage nécessaire à ma survie et de m’avoir accueilli pour aller m’aérer en respirant l’air des Montagnes et parfois manger la neige. Je remercie également mon PETIT frère pour son soutien et son écoute (surtout nos grands débats pendant les longs trajets). Jérèm’ je sais que quoi tu entreprennes pour ta vie future, ce sera forcément une réussite. Je remercie enfin mes parents pour tout ce qu’ils m’ont apporté. Merci pour votre soutient et vos encouragements sans limites et merci de m’avoir toujours aidé et supporté même dans mes périodes de stress et de doute.

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Sommaire

INTRODUCTION ... 1

I.LA POLARITE CELLULAIRE ... 2

1. Généralités ... 2

2. Les acteurs de la polarité cellulaire ... 2

A. Les protéines de polarité : historique et généralités ... 2

B. Le cytosquelette ... 4

a. Le réseau de microtubules ... 4

i. Structure et dynamique du réseau de microtubules ... 5

ii. Nucléation et polarité du réseau de microtubules ... 5

iii. Les moteurs associés aux microtubules ... 6

• La Dynéine ... 6

• Les Kinésines ... 7

b. Les microfilaments d’actine ... 7

i. Structure et nucléation des microfilaments d’actine ... 7

ii. Les protéines liées à l’actine ... 8

C. Relations entre les protéines PAR et le cytosquelette ... 10

3. La chambre ovarienne de Drosophile pour étudier la polarité cellulaire ... 11

A. L’ovogenèse chez Drosophila melanogaster ... 11

a. Le germarium ... 12

b. Développement de la chambre ovarienne ... 13

B. Polarité apico-basale des cellules épithéliales ... 15

a. Le domaine baso-latéral ... 16

b. Le domaine apical ... 17

c. Le domaine sub-apical : la Zonula Adherens ... 19

d. Le cytosquelette dans les cellules folliculaires ... 21

e. Les processus de morphogenèse dans les cellules folliculaires ... 21

C. Polarité de l’ovocyte de Drosophile ... 23

a. Polarité précoce de l’ovocyte ... 24

b. Etablissement des axes A/P et D/V ... 24

c. Les protéines de polarité ... 25

d. Le cytosquelette ... 28

II.DOMAINES MEMBRANAIRES ... 30

1. Biosynthèse des phosphatidyl-inositols ... 31

A. Biosynthèse du PI(4,5)P2 ... 32

B. Biosynthèse du PI(3,4,5)P3 ... 34

2. Les phosphatidyl-inositol et spécificité des membranes ... 35

A. Localisation des phosphatidyl-inositol ... 35

B. Interactions des phosphatidyl-inositols avec leurs effecteurs ... 36

C. Régulations des kinases et phosphatases ... 37

a. Localisation et régulation des PI3K ... 37

b. Localisation et régulations de l’INPP3 PTEN ... 37

c. Localisation sub-cellulaire des PIP5K ... 38

d. Régulation de l’activité des PIP5K ... 39

i. Protéines régulatrices ... 39

ii. Modifications post-traductionnelles ... 41

3. Les phosphatidyl-inositols et la polarité cellulaire ... 42

A. PI(4,5)P2 et PI(3,4,5)P3 dans la migration cellulaire ... 42

B. PI(4,5)P2 et PI(3,4,5)P3 dans la polarité apico-basale ... 43

C. Les phosphatidyl-inositols et la polarité de l’ovocyte de Drosophile ... 45

D. Relations entre phosphatidyl-inositols et protéines de polarité ... 46

4. Le trafic vésiculaire ... 47

A. Formation de vésicules et endocytose ... 48

a. Le PI(4,5)P2 et les premières étapes d’internalisation de la vésicule ... 50

b. RAB5 et la maturation des vésicules internalisées ... 50

B. Transport et ciblage des vésicules du trafic ... 51

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D. Trafic vésiculaire et polarité cellulaire ... 54

a. Relations avec les protéines de polarité ... 54

i. Régulation de la localisation des protéines de polarité ... 54

ii. Les protéines de polarité sur le trafic vésiculaire ... 56

b. Le trafic vésiculaire durant l’ovogenèse de Drosophile ... 57

RESULTATS ... 59

I.PRESENTATION DES RESULTATS ... 60

II.SKTL ET LE PI(4,5)P2 DANS LA POLARITE CELLULAIRE DE LA CHAMBRE OVARIENNE ... 62

1. Contrôle de la polarité apico-basale des cellules épithéliales ... 62

A. Introduction ... 62

B. Article n°1 : PI(4,5)P2 produced by the PI4P5K SKTL controls apical size by tethering PAR-3 in Drosophila epithelial cells ... 64

C. Conclusions et discussion de l’article n°1 ... 65

2. Contrôle de la polarité antéro-postérieure de l’ovocyte ... 67

A. Introduction ... 67

B. Article n°2 : Dynein-mediated transport and membrane trafficking control PAR3 polarised distribution ... 68

C. Résultats complémentaires et préliminaires ... 69

a. Rôle de l’endosome de recyclage dans la polarité de PAR3 ... 69

b. Interdépendance de PAR1 et SKTL au postérieur ? ... 69

c. Caractéristiques de PAR3 en fonction des membranes ... 71

d. Transport de PAR3 du postérieur vers l’antérieur, microtubules dépendant ? ... 71

D. Conclusions et discussion ... 73

a. Exclure PAR3 du postérieur ... 73

b. Transporter et accumuler PAR3 à l’antérieur ... 75

III.REGULATIONS DE L’ACTIVITE ET DE LA LOCALISATION DE LA PIP5KSKTL ... 79

1. Introduction ... 79

2. Phosphorylations et activités et/ou localisation de SKTL ... 79

A. Caractérisation de Myc-SKTL dans la chambre ovarienne de Drosophile ... 80

a. Surexpression et fonctionnalité ... 80

b. Localisation sub-cellulaire de Myc-SKTL dans l’ovocyte ... 82

B. Caractérisation des phosphorylations de SKTL ... 83

C. Recherche de kinases et de phosphatases de SKTL ... 85

a. Crible dans l’ovogenèse ... 85

b. Effets sur SKTL ... 87

i. Profil en Western Blot ... 87

ii. Localisation sub-cellulaire de SKTL ... 89

D. Recherche de mutants de phosphorylation de SKTL ... 91

a. Analyses de séquences et mutations ... 91

b. Etat de phosphorylation des mutants ... 92

c. Recherche d’éventuels rôles sur la polarité de l’ovocyte ... 94

d. Localisations sub-cellulaires des mutants de phosphorylations ... 95

e. Sites de phosphorylations de PAR1 et PP1-87B ? ... 96

E. Rôle fonctionnel des phosphorylations de SKTL ? ... 97

a. Identifier les compartiments vésiculaires où se localise SKTL ... 97

b. Tester l’activité de SKTL ... 98

i. Tester la production de PI(4,5)P2 ... 99

ii. Tester l’endocytose ... 100

F. Conclusions et discussion ... 101

a. Poursuivre la caractérisation des phosphorylations sur SKTL ... 101

b. Comprendre le rôle des phosphorylations de SKTL ... 102

c. PAR1 et l’endocytose ? ... 104

3. Palmitoylation et activité ... 104

A. Identification de la palmitoylation de SKTL ... 104

B. Recherche de palmitoyl-transferases ... 107

C. Recherche du site de palmitoylation de SKTL ... 109

D. Conclusions et discussion ... 110

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DISCUSSION GENERALE ... 114

I.SKTL ET LA LOCALISATION DE PAR3 ... 115

II.REGULATIONS DE SKTL DANS LES CELLULES FOLLICULAIRES ? ... 117

III.RELATIONS SKTL,PAR1 ET ENDOCYTOSE … ... 119

ANNEXES ... 122

I.ARTICLE N°3(REVUE) :PHOSPHOINOSITIDES AND CELL POLARITY IN THE DROSOPHILA EGG CHAMBER ... 123

II.PROTOCOLES ... 124

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Introduction

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I. La polarité cellulaire

1. Généralités

La cellule est l’unité de base de tous les êtres vivants. Que ce soit au sein d’un organisme unicellulaire ou pluricellulaire, chaque cellule doit avoir une ou plusieurs fonctions spécifiques. Pour remplir ses fonctions, la cellule doit alors avoir une forme ou une distribution de son matériel cytoplasmique (protéines, lipides, organelles …) précise et spécifique. L’établissement et le maintien de la polarité cellulaire permettent d’établir ces fonctions. La grande majorité des cellules présente, à un moment, une polarité. Ainsi, la polarité cellulaire est requise dans de nombreux processus extrêmement variés : de la cellule procaryote (Bowman et al., 2010; Dworkin, 2009) ou de la levure (Pruyne et al., 2004) qui se divisent en distribuant de manière particulière leur contenu cytoplasmique, en passant par la mise en place de la polarité du neurone ou de la cellule épithéliale, à la migration du fibroblaste, ou l’établissement des axes de polarité du future embryon. Ce processus fondamental repose sur une organisation asymétrique de certains composants cellulaires tels que ceux de la membrane plasmique, du cytosquelette, de certains organelles ou des protéines (Goldstein and Macara, 2007). De nombreux acteurs sont impliqués dans l’établissement et le maintien de cette asymétrie.

2. Les acteurs de la polarité cellulaire

A. Les protéines de polarité : historique et généralités

Durant les années 1980, il avait déjà été observé, au sein de certaines cellules œufs, qu’il était nécessaire d’avoir une localisation asymétrique de certains déterminants cytoplasmiques avant la division cellulaire pour induire, plus tard, la différenciation spécifique des nombreux types cellulaires au sein de l’embryon (Whittaker, 1980). Pour mieux comprendre ce processus, Ken Kemphues et Jim Priess ont alors cherché à identifier des gènes impliqués dans le développement précoce de l’embryon de C.elegans. Au total, sept gènes furent identifiés. La perte de leur expression induit une division symétrique de l’œuf alors que normalement le premier clivage se fait de manière asymétrique (Hung and Kemphues, 1999; Kemphues et al., 1988; Morton et al., 2002; Tabuse et al., 1998). Les premiers mutants par (partitioning-defective), furent ainsi identifiés. Ces gènes codent pour des protéines, les protéines PAR, extrêmement conservées chez les Métazoaires, et sont impliqués dans de nombreux mécanismes de polarités divers et variés tels que la polarité apico-basale, de migration ou encore neuronale. Les fonctions de ces protéines sont

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Figure 1: Localisations et exclusions mutuelles des protéines PAR

Adapté de Goldstein et Macara, Development Cell review 2007

Les localisations du module PAR3/PAR6/aPKC sont en orange. Les localisations du module PAR1 sont en bleu. Les barres noires indiquent les inhibitions qui permettent les exclusions entre ces modules.

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3 variées : PAR1, PAR4 (ou LKB1 chez les Mammifères et la Drosophile) et aPKC (atypical protein kinase C, PKC3 chez C.elegans) sont des sérine thréonine kinases ; PAR2 est une protéine à domaine Ring finger potentiellement impliquée dans la voie d’ubiquitination ; PAR3 (Bazooka chez la Drosophile) et PAR6 sont des protéines à domaines PDZ (postsynaptic density 95, Disk large, Zonula occludens), domaines impliqués dans les interactions avec d’autres domaines protéiques ; PAR5 est une protéine 14.3.3 qui se lie aux sérines et thréonines phosphorylées d’autres protéines (Kemphues, 2000).

Le point commun de ces protéines est celui de leur localisation particulière, nécessaire à l’établissement et au maintien de la polarité cellulaire (Figure 1). Les protéines PAR sont, pour la plupart, localisées à proximité du cortex de la cellule avec, une localisation asymétrique (Kemphues, 2000) nécessaire à la polarité de la cellule (Goldstein and Macara, 2007). Au niveau des différents domaines qu’elles définissent, ces protéines forment des complexes ou modules qui leur permettent de se localiser dans le bon domaine et/ou d’exclure les protéines PAR qui définissent un autre domaine (Johnston and Ahringer, 2010) (Figure 1). Ainsi, dans l’ovocyte de C.elegans, avant fécondation, PAR3, PAR6 et aPKC sont localisés uniformément à la membrane plasmique tandis que PAR1 et PAR2 sont localisés dans le cytoplasme. L’entrée du spermatozoïde et de son centrosome, est le signal de polarisation. PAR6 puis PAR3 et aPKC quittent le domaine dans lequel se place le centrosome et se localisent à l’opposé, au niveau du pôle antérieur. En parallèle, PAR1 et PAR2 s’accumulent dans le domaine par lequel le spermatozoïde est entré et définissent le pôle postérieur (Figure 1). Chaque complexe/module ainsi créé empêche alors l’autre de se localiser dans son domaine. En effet, aPKC, en phosphorylant PAR2 et PAR1, les exclut du domaine antérieur (Hao et al., 2006). En parallèle, PAR2 empêche l’accumulation de PAR3, PAR6 et aPKC par un mécanisme qui reste encore peu connu. Toutefois, il a été proposé que PAR2 permettrait de recruter PAR1 au niveau du cortex postérieur où cette kinase phosphorylerait PAR3 et empêcherait ainsi son interaction avec le cortex postérieur (Motegi et al., 2011).

Hormis le zygote de C.elegans, il existe de nombreux types de cellules polarisées dans tous les organismes vivants (Figure 1). Dans ces cellules, les modules protéiques que forment les protéines PAR sont également impliqués dans le contrôle des processus de polarité. Ainsi, par exemple, le module formé autour de la protéine PAR3 établit à la fois le domaine antérieur de l’embryon de C.elegans mais également celui de l’ovocyte de Drosophile. Il forme également le domaine sous apical des cellules épithéliales, le front de migration d’un fibroblaste ou encore le domaine apical des neuroblastes ou la spécification axonale des neurones (Goldstein and Macara, 2007). Le module constitué par PAR1, établit également la

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4 polarité épithéliale en établissant le domaine baso-latéral mais également les domaines postérieurs de l’embryon de C.elegans et de l’ovocyte de Drosophile (Campanale et al., 2017).

Enfin, pour contrôler la polarité cellulaire, ces complexes protéiques interagissent avec d’autres protéines, mais également les membranes et/ou le cytosquelette, également acteurs fondamentaux de la polarité cellulaire.

B. Le cytosquelette

Le cytosquelette est essentiel pour l’organisation de la cellule. Il est présent dans le cytoplasme et est constitué de protéines qui forment un réseau dynamique composé de structures filamenteuses. Ce réseau assure de nombreuses fonctions au sein de la cellule, notamment en définissant la forme de la cellule et de certaines structures cellulaires, comme par exemple le flagelle. Il lui confère des propriétés mécaniques pour se déplacer ou se diviser tout en permettant l’ancrage et le transport de nombreuses protéines. Trois types de fibres composent le cytosquelette : les microtubules (MTs), les microfilaments (MFs) d’actine et les filaments intermédiaires. Les deux premiers, grâce à leur organisation polarisée et dynamique, ont un rôle majeur dans la polarité cellulaire. Les MFs sont, en général, organisé différemment et asymétriquement au sein de la cellule pour lui conférer une polarité. Les MTs sont, quant à eux, en majorité requis pour stabiliser et diriger, via un transport asymétrique, cette polarité (Li and Gundersen, 2008). Notons cependant, que les filaments intermédiaires, et notamment les kératines, en participant à l’organisation des MTs, semblent impliqués dans la polarité épithéliale (Oriolo et al., 2007). Seuls les MTs et les MFs seront décrits, car chez la Drosophile, le modèle d’étude utilisé durant cette thèse, les filaments intermédiaires ont été décrits comme présents uniquement dans le noyau et seulement un potentiel filament intermédiaire cytoplasmique a récemment été décrit (Cho et al., 2016).

a. Le réseau de microtubules

Les MTs sont des constituants essentiels du cytosquelette. Ils sont impliqués dans de nombreux processus fondamentaux pour la cellule tels que sa migration, sa polarisation, sa division ou encore le transport intracellulaire.

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Figure 2 : Structure et instabilité dynamique des MTs

Adapté de Akhmanova et Steinmetz, Nature reviews. Molecular cell biology, 2008

(a) Les MTs sont composés d’hétérodimères d’α- (bleu) et de β-tubuline (violet ou rose) organisés de manière tête bêche pour former un protofilament. (b) Les MTs sont composés de 13 protofilaments organisés de manière cylindrique et polarisé. L’extrémité (-), stable, est composée d’α-tubuline tandis que l’extrémité (+), dynamique, est composée de β-tubuline. (c) Les MTs oscillent entre une phase de polymérisation (sauvetage) et de dépolymérisation (catastrophe). La β-tubuline hydrolyse le GTP (rose) en GDP (violet) rendant la fibre moins stable.

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5

i.

Structure et dynamique du réseau de microtubules

Les MTs forment des structures tubulaires creuses d’environ 25nm de diamètre et majoritairement composées de 13 protofilaments disposés côte à côte (Wade, 2009). Chaque protofilament est constitué de la répétition d’un hétérodimère d’α-tubuline et de β-tubuline organisés de manière tête-bêche. Cette organisation confère aux MTs une polarité intrinsèque (Figure 2). Une des extrémités des MTs est ainsi composée que d’α-tubuline, l’extrémité (-), l’autre extrémité est, quant à elle, constituée que de β-tubuline, l’extrémité (+). Cette polarité induit alors une différence de propriétés entre ces deux extrémités, notamment au niveau de leur vitesse de polymérisation. Ainsi, l’extrémité (+) est dynamique tandis que l’extrémité (-) est stable. Cette polarité est indispensable pour certaines protéines, comme les moteurs moléculaires, qui se lient ou se dirigent préférentiellement vers l’une de ces 2 extrémités.

Les MTs passent régulièrement d’une phase de polymérisation dynamique à une phase de dépolymérisation (catastrophe) puis repolymérisation (sauvetage) (Figure 2). C’est l’instabilité dynamique, lié à l’hydrolyse du GTP. En effet, chaque dimère de tubuline peut lier deux molécules de GTP. Les tubulines liées au GTP sont dites stables et cette liaison est nécessaire à la polymérisation des hétérodimères. Cependant, après incorporation du dimère dans un protofilament, une des deux molécules de GTP peut être hydrolysée en GDP, celle liée à la β-tubuline. Les β-tubulines liées aux GDP sont quant à elles, moins stables. Ainsi, le corps du MT est composé de dimères de tubuline contenant du GDP et l’extrémité (+) est composée de dimères de tubuline en cours de polymérisation contenant que du GTP, appelée coiffe. La perte de cette coiffe induit alors une phase de catastrophe (Howard and Hyman, 2003).

ii.

Nucléation et polarité du réseau de microtubules

La nucléation des MTs se fait au niveau du centre organisateur des MTs, le MTOC (Microtubules organizing center). Les extrémités (-) des MTs sont ancrées autour du MTOC tandis que les extrémités (+) polymérisent vers la périphérie. Dans la plupart des cellules, le centrosome, composé de deux centrioles entourés d’une matrice péricentriolaire (PCM), constitue le MTOC (Bornens, 2002). Cependant, dans certain type cellulaire, comme les neurones, les cellules épithéliales ou l’ovocyte de Drosophile, le centrosome n’est pas le seul MTOC (Sanchez and Feldman, 2017). La nature des MTOC non centrosomaux (ncMTOC) varie selon les types cellulaires et, dans certains cas, n’a pas encore été complétement identifiée (Figure 3). Néanmoins, ces ncMTOC doivent contenir à la fois des protéines qui

(25)

Figure 3 : Variabilité de l’organisation de MTOC ou ncMTOC dans différents types cellulaires

Adapté de Sanchez et Feldman, Current Opinion in Cell Biology, 2017

Les MTOC ou ncMTOC (en vert) nucléent et organisent les MTs (en rouge). Les extrémités (-) des MTs sont ancrées au niveau des MTOC ou ncMTOC ce qui participe à la polarité des cellules.

(26)

6 interagissent avec les extrémités (-) des MTs et d’autres qui lient ces protéines à des régions cellulaires spécifiques.

Au niveau du MTOC, un autre type de tubuline est primordial pour nucléer la fibre de MTs, c’est la γ-tubuline. Cette dernière fait partie d’une structure appelée γ-TuRC (γ-Tubuline Ring Complex) qui permet d’initier la nucléation des MTs en servant de matrice pour les 13 protofilaments (Wiese and Zheng, 2006).

Grâce au MTOC, les MTs s’organisent de manière polarisée. Cette organisation leur confère alors un rôle primordial pour contrôler la polarité des cellules. Ainsi, dans les cellules épithéliales, les extrémités (-) des MTs sont ancrées en apical de la cellule, et les MTs traversent la cellule le long de l’axe apico-basal. Leurs extrémités (+) sont donc accumulées au niveau du pôle basal (Nashchekin et al., 2016; Toya and Takeichi, 2016). Cette polarité des MTs participe alors à l’établissement de la polarité apico-basale de ces cellules en permettant de recruter des protéines ou organelles au niveau d’un domaine particulier de la cellule (Le Droguen et al., 2015). Ce processus est de plus, dépendant des moteurs moléculaires.

iii.

Les moteurs associés aux microtubules

Deux types de moteurs moléculaires s’associent aux MTs : la Dynéine et la Kinésine. Ces derniers se servent de la polarité intrinsèque des MTs pour se diriger. Grâce à l’hydrolyse de l’ATP, la Dynéine, se dirige vers les extrémités (-) des MTs, tandis que la Kinésine se déplace en majorité vers les extrémités (+) (Amos and Cross, 1997) (Figure 4). Il prennent en charge divers de types cargos, tels que des vésicules, le noyau, l’appareil de Golgi ou des ARNm, et les distribuent de manière asymétrique au sein de la cellule. Les mécanismes régulant la prise en charge ou le déchargement spécifique d’un cargo donné sont cependant encore peu caractérisés. Des cofacteurs associés aux moteurs et/ou aux cargos ont toutefois déjà été identifiés et impliqués dans ces processus.

• La Dynéine

La Dynéine est un complexe multimérique de 1,5 MDa. Elle est composée de deux chaines lourdes (DHC), liées à deux chaines intermédiaires (DIC), elles même liées à trois chaines légères (DLC) (Figure 4). Deux chaines légères intermédiaires (DLIC) sont également liées aux DHC. Les DHC sont les chaînes qui s’associent aux MTs et qui contiennent un domaine ATPase, nécessaire pour générer le mouvement de ce moteur le long des MTs. Les DIC sont quant à elles requises pour lier la Dynéine avec son cargo. De plus, la Dynéine interagit

(27)

Figure 4 : Structure des moteurs moléculaires Dynéine et Kinésine-1

Adapté de Vale, Cell, 2003

(A) La Dynéine est composée de 2 chaines lourdes (DHC), 2 chaines intermédiaires (DIC), 2 chaines intermédiaires légères (DLIC) et 3 chaines légères (DLC). (B) La Kinésine-1 est composée de 2 chaines lourdes (KHC) et 2 chaines légères (KLC). (C) La Kinésine-1 se dirige vers les extrémités (+) des MTs tandis que la Dynéine se dirige vers les extrémités (-).

(28)

7 avec de nombreux cofacteurs tels que le complexe Dynactine (composé entre autre de la Dynamitine et de p150glued) qui influencent son déplacement et sa liaison avec les cargos (Allan, 2011).

• Les Kinésines

Le groupe des Kinésines est vaste. En effet, par exemple, chez les Mammifères, le génome code pour plus de 40 protéines Kinésines, classées en 14 familles différentes et dénommées de Kinésine-1 à Kinésine-14. Chaque Kinésine présente des variations structurelles. La première identifiée, la Kinésine-1, dite conventionnelle, est composée de deux chaînes lourdes (KHC), et de deux chaines légères (KLC) (Figure 4). Les KHC sont les chaînes motrices de la Kinésine car elles s’associent aux MTs et possèdent une activité ATPase. Les KLC lient, quant à elles, le moteur aux cargos. Cependant, il a été montré, chez la

Drosophile, lors de la mise en place de la polarité de l’ovocyte, que certains cargos

pouvaient être pris en charge par les KHC sans les KLC (Palacios and St Johnston, 2002; Williams et al., 2014). La Kinésine-1 se déplace vers les extrémités (+) des MTs mais d’autres Kinésines telles que la Kinésine-14 se déplacent vers les extrémités (-) des MTs (Hepperla et al., 2014).

b. Les microfilaments d’actine

Les MFs sont un autre type de fibres composant le cytosquelette. Ils peuvent à la fois former un réseau dense sous la membrane plasmique de la cellule, et également former des sous réseaux ancrés à la membrane plasmique, ayant différentes propriétés notamment mécaniques. Les MFs sont impliqués dans de nombreux processus tels que le contrôle de la forme des cellules, la motilité des cellules, la contraction musculaire, la cytokinèse ou encore l’endocytose.

i.

Structure et nucléation des microfilaments d’actine

Les MFs forment une structure filamenteuse d’environ 7 nm de diamètre et composée de deux polymères entrelacés en hélice. Chacun de ces polymères est composé de monomères d’actine. L’actine peut être présente sous deux formes : une forme globulaire, actine-G, libre et une forme filamenteuse, actine-F, lorsqu’elle compose un MF (Figure 5). L’actine-F provient donc de la polymérisation de l’actine-G. Pour polymériser, l’actine-G doit être liée à l’ATP. De plus, son domaine liant l’ATP confère une polarité à la molécule (Otterbein, 2001). Ainsi, lorsque les monomères d’actine-G se polymérisent, ils s’orientent de manière tête bêche pour former les MFs. Leurs domaines ATP pointent alors tous vers l’une

(29)

Figure 5 : Nucléation spontanée de l’actine

Adapté de Krause et Gautreau, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2014

L’actine-G va constituer le MF d’actine. Un noyau d’actine-F est tout d’abord formé à partir de 3 monomères d’actine qui s’assemblent ensuite pour former une double hélice polarisée. L’extrémité (+) est appelée extrémité barbue tandis que l’extrémité (-) est appelée extrémité pointue.

Figure 6 : Dynamique de polymérisation des MFs : le « treadmiling »

Adapté de Cooper, The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition, 2000

La polymérisation des MFs se fait de manière différente au niveau des deux extrémités. L’ajout des monomères liés à l’ATP se fait plus facilement au niveau de l’extrémité (+). Une fois au sein du MF, l’actine-F hydrolyse l’ATP en ADP. L’extrémité (-), contient alors plus d’actine lié à l’ADP, qui est moins stable, ce qui induit une plus forte dépolymérisation de l’actine au niveau de cette extrémité.

Figure 7 : Exemple de l’action de quelques protéines liées à l’acine

Adapté de Taylor et al., Nature Review Microbiology, 2011

Le complexe ARP2/3 permet la polymérisation de l’actine et de créer des réseaux branchés. La Profiline permet également de stimuler la polymérisation de l’actine. La Cofiline interagit avec les dimères d’actine pour stimuler le désassemblage du MF. La Gelsoline, quant à elle permet de couper les MFs.

(30)

8 des extrémités du MF, l’extrémité (-), également appelée extrémité pointue. L’autre extrémité est, quant à elle, appelée extrémité barbue ou extrémité (+) (Figure 6). Le MF d’actine est donc, comme les MTs, polarisé ce qui peut également permettre de diriger des moteurs. Cette polarité à également son importance lors de la polymérisation des MFs.

La nucléation des MFs d’actine se fait à partir d’un noyau d’actine, composé de trois monomères d’actine, qui s’assemblent pour ensuite former une double hélice (Krause and Gautreau, 2014) (Figure 5). L’élongation se fait alors par l’ajout de monomères d’actine préférentiellement au niveau de l’extrémité (+). La polymérisation de l’actine se fait donc de manière différente au niveau de ses deux extrémités à cause de la polarité des MFs. En effet, pour s’associer à l’extrémité (-), l’actine-G doit modifier sa conformation, ce qui n’est pas le cas à l’extrémité (+). Une fois incorporée à la fibre, l’actine-F hydrolyse l’ATP en ADP. Ainsi à cause du biais de polymérisation entre les deux extrémités, au niveau de l’extrémité (-), l’actine est majoritairement liée à l’ADP. L’actine liée à l’ADP étant moins stable au niveau du MF, il y a donc une plus forte dépolymérisation à l’extrémité (-) qu’à l’extrémité (+). Les différences de polymérisation et de dépolymérisation aux deux extrémités confèrent alors aux MFs, comme aux MTs, une dynamique. Cependant, contrairement aux MTs, cette dynamique n’induit pas d’instabilité dynamique au niveau de la fibre des MFs, mais plutôt une dynamique continue dans un mouvement appelé tapis roulant ou “treadmiling“ (Nosworthy et al., 2003) (Figure 6). Néanmoins, l’assemblage et le désassemblage des MFs ainsi que leur organisation restent des processus très contrôlés, grâce à l’interaction avec certaines protéines.

ii.

Les protéines liées à l’actine

Les protéines de liaison à l’actine, appelée, ABP, sont impliquées dans de nombreux processus liés à l’organisation de l’actine, tels que sa nucléation, sa polymérisation, sa dépolymérisation, sa stabilisation, ou encore son organisation en réseau (actine branchée) (Figure 7). Ainsi, le complexe ARP2/3 avec la protéine WASP (Wiskott–Aldrich Syndrome protein), de même que la Formine, sont importants pour la nucléation et la polymérisation de l’actine (Pollard, 2016). La Tropomyosine permet, en se fixant aux MFs, de les stabiliser. A l’inverse, des protéines comme la Profiline ou la Cofiline induisent respectivement l’inhibition de la polymérisation ou la dépolymérisation du MF (Pollard, 2016). D’autres protéines telles que les protéines appartenant à la famille des protéines ERM (Ezrin, Radixin, Moesin) permettent de lier l’actine à la membrane plasmique. Il existe également des protéines qui permettent de créer des réseaux particuliers d’actine. C’est ainsi le cas des protéines telles

(31)

Figure 8 : Organisation de différents réseaux d’actine dans une cellule en migration

Adaptée de Blanchoin et al., Physiological Review, 2014

i) Le cortex d’actine est ancré à la membrane plasmique grâce aux protéines ERM et est contractile grâce à la Myosine. ii) Les fibres de stress sont contractiles grâce à l’action de la Myosine et organisées parallèlement par rapport au mouvement de la cellule. Elles sont attachées aux adhésions focales et sont organisées notamment grâce à la Formines, les protéines ENA/VASP et l’α-actinine. iii) Les arcs transversaux sont organisés perpendiculairement par rapport au mouvement de migration et sont contractiles grâce à la Myosine. iv) Le lamellipode est une zone de forte polymérisation de l’actine où les MFs sont organisés en réseau branché ce qui permet la motilité de la cellule. Le complexe ARP2/3, la Profiline et les protéines de la famille WAVE sont impliqués dans ce processus. V) Le filopode est composé de MFs parallèles grâce aux polymérases Formines et Ena/VASP. Ils permettent à la cellule son mouvement et de sentir l’environnement.

(32)

9 que la Fascine qui permet de créer des réseaux parallèles d’actine ou encore la Spectrine qui permet, quand à elle, de créer des réseaux branchés.

Il existe également des protéines motrices qui utilisent l’actine. Les seuls moteurs associés à l’actine sont les Myosines qui se déplacent grâce à l’ATP et peuvent transporter notamment des vésicules. La plupart des Myosines se déplacent vers les extrémités (+), bien que certaines peuvent se déplacer vers les deux extrémités. La Myosine peut être requise pour délivrer certains déterminants de manière polarisée dans la cellule, ce qui peut, comme pour la Dynéine et la Kinésine, être importante pour établir la polarité cellulaire. Ainsi, par exemple, lors du bourgeonnement de la levure, le transport dirigé vers le site de bourgeonnement, via la Myosine V de vésicules contenant des ARNm, des organelles mais également des Rho-GTPases telles que CDC42 (Cell Division Control protein 42), induit leur localisation asymétrique (Pruyne et al., 2004; Wedlich-Soldner, 2003). Les Rho GTPases permettent d’activer des Formines, au niveau du site de bourgeonnement, qui induisent alors la formation d’un réseau polarisé et parallèle de MFs. La Myosine permet également de créer des forces mécaniques au sein de la cellule en s’associant particulièrement avec l’actine-F et en formant ainsi le réseau d’actomyosine. Ce processus, particulièrement bien décrit lors de la contraction des fibres musculaires, peut toutefois être également présent dans des cellules non musculaires et ainsi établir la polarité de certaines cellules comme l’embryon de C.elegans ou des cellules en migration (Murrell et al., 2015). Pour cela, plusieurs Myosines (Myosines II) s’assemblent à la fois entres elles de manière tête bêche, et entre deux MFs anti-parallèles. Les Myosines II se déplacent alors toutes vers les extrémités (+) des MFs permettant ainsi leurs contractions, si elles sont en contact avec leurs extrémités (-) ou leurs extensions, si elles sont en contact avec leurs extrémités (+). Ainsi par exemple, lors de la division asymétrique de l’embryon de C.elegans, après l’entrée du spermatozoïde, le réseau d’actomyosine qui était jusque là, présent tout autour de la cellule, se désassemble au niveau de ce point d’entrée. Cela induit alors la contraction du reste du réseau d’actomyosine cortical qui conduit à un flux du matériel cortical et d’actine vers le domaine opposé au point d’entrée du spermatozoïde (Gönczy, 2005).

Enfin, l’action de toutes ces protéines sur l’actine au sein d’une même cellule, va donc permettre de créer plusieurs réseaux d’actine avec différentes caractéristiques physiques et dynamiques. Ces réseaux vont alors pouvoir induire au niveau de la cellule, de nombreuses modifications qui seront importantes pour sa polarité. Ainsi, par exemple, dans les cellules en migration, il est important de créer plusieurs types de réseaux d’actine : un réseau contractile, à l’arrière du front de migration et un réseau protrusif et branché à l’avant du front de migration (Vicente-Manzanares et al., 2009) (Figure 8). La formation de ces différents

(33)
(34)

10 réseaux repose donc sur l’action des protéines du complexe ARP2/3 (Actin-Related Proteins) à l’avant du front qui permettent de former des lamellipodes et des filopodes qui induisent l’extension vers l’avant de la cellule. A l’arrière du front, le réseau d’actomyosine permet d’induire la contraction des fibres qui font avancer la cellule tandis que la Tropomyosine permet d’organiser et de stabiliser les MFs en structures parallèles le long de la cellule (Figure 8) (Pollard and Cooper, 2009).

C. Relations entre les protéines PAR et le cytosquelette

Le cytosquelette et les protéines PAR sont donc des acteurs primordiaux pour établir et maintenir la polarité cellulaire. La localisation asymétrique des protéines PAR est une des principales caractéristiques de ces protéines pour établir la polarité des cellules. Comme nous l’avons vu précédemment, les MTs et les MFs pouvant être impliqués dans le transport asymétrique de protéines, le cytosquelette est donc important pour la localisation asymétrique des protéines PAR et d’autres protéines impliquées dans la polarité cellulaire. Ainsi, dans l’embryon précoce de Drosophile, les MTs, via un transport Dynéine dépendant, sont requis pour la localisation apicale de PAR3 (Harris and Peifer, 2005). Une interaction physique entre PAR3 et la Dynéine a de plus été mise en évidence dans les fibroblastes de

Mammifères pour permettre l’orientation du centrosome durant la migration (Schmoranzer et

al., 2009). De même l’actine est requise pour la localisation apicale de PAR3 (Harris and Peifer, 2005), mais également pour sa polarité planaire (Harris and Peifer, 2007) et sa localisation corticale (Simões et al., 2010) dans l’embryon de Drosophile. Dans l’ovocyte de

Drosophile, la localisation postérieure de PAR1 est dépendante de l’actine mais pas des

MTs (Doerflinger et al., 2006).

Les protéines PAR interagissent avec de nombreuses autres protéines, en majorité au cortex. En interagissant avec des protéines importantes pour l’organisation du cytosquelette, elles permettent d’établir des sous réseaux particuliers de ce dernier. Ainsi, PAR3, PAR6 et aPKC sont requis pour réguler la contraction de l’actomyosine lors de la constriction apicale permettant la fermeture dorsale de l’embryon de Drosophile (David et al., 2010). PAR3 participe également à l’organisation de l’actine dans les cellules épithéliales de l’embryon de

Drosophile. Avec le phosphatidyl-inositol PI(4,5)P2, PAR3 permet de recruter au niveau du

domaine apical, la Moésine et la Synaptotagmine Bitesize (BTSZ) qui recrutent alors, au niveau du domaine sub-apical, l’actine nécessaire à la formation des jonctions entre les cellules épithéliales (Pilot et al., 2006). De même lors de la cellularisation de l’embryon de

Drosophile, aPKC facilite le relargage des extrémités (-) des MTs du centrosome. Les

(35)
(36)

11 réorganisation est également critique pour former les jonctions entre les cellules (Harris and Peifer, 2007).

Durant la division asymétrique des neuroblastes de Drosophile, le module PAR3, PAR6 et aPKC est requis avec Inscutable et PIns (Partner of Inscutable) pour réguler l’organisation des MTs au niveau du fuseau mitotique (Prehoda, 2009; Siller and Doe, 2009). Cela est fait notamment grâce à l’interaction avec la protéine Mud/Numa et les moteurs Dynéine et Kinésine. Une étude a de plus mis en évidence que les protéines 14-3-3ζ et 14-3-3ε (PAR5) permettaient de former un complexe entre les deux moteurs Dynéine et Kinésine lors de la formation du fuseau mitotique dans des cellules S2, de Drosophile (Lu and Prehoda, 2013). Enfin, PAR3, PAR1 et PAR5 sont également importants pour organiser le réseau de MTs polarisé dans l’ovocyte de Drosophile (Becalska and Gavis, 2010; Benton et al., 2002; Cox et al., 2001a). La localisation polarisée des protéines PAR est donc régulée par le cytosquelette et inversement, ce qui complexifie grandement les interprétations.

3. La chambre ovarienne de Drosophile pour étudier la

polarité cellulaire

Il existe un très grand nombre de cellules polarisées. Leur polarité est, la plupart du temps, établie grâce à un rôle précis des protéines PAR. Comprendre comment la polarité des cellules est établie et maintenue requiert donc de comprendre le rôle des protéines PAR et comment ces dernières régulent la polarité spécifiquement dans certains types cellulaires. Leur rôle, et notamment leur interaction avec le cytosquelette, peut donc être différent en fonction des types de cellules. La chambre ovarienne de Drosophile est une structure biologique intéressante car elle est constituée de nombreux types de cellules polarisées qui interagissent entre elles, faisant ainsi de celle-ci un excellent modèle pour étudier la polarité cellulaire.

A. L’ovogenèse chez Drosophila melanogaster

La femelle Drosophile adulte possède une paire d'ovaires, contenant chacun entre 16 à 20 ovarioles (Figure 9). Dans ces ovarioles, des chambres ovariennes sont organisées chronologiquement (la plus jeune en antérieur de l’ovariole et la plus mature en postérieur), de manière linéaire (Figure 10). Chaque chambre ovarienne est composée de seize cellules d’origine germinale (l’ovocyte et quinze cellules nourricières) et entourée de cellules d’origine somatique, les cellules folliculaires, qui forment un épithélium simple (de Cuevas, 2015; Spradling, 1993).

(37)
(38)

12

a. Le germarium

Les chambres ovariennes sont mises en place dans l'extrémité la plus antérieure de l'ovariole au niveau d’une structure appelée germarium (Figure 10) (Huynh and St Johnston, 2004). Le germarium se subdivise en plusieurs régions caractérisées par les différents stades de développement et de morphologie du cyste germinal (Figure 11). La région 1, la plus antérieure, forme une niche de cellules souches. Deux à trois cellules souches germinales (CSG) y sont maintenues à l’état de cellules indifférenciées et à l’antérieur, grâce à leur contact avec des clusters de cellules somatiques, appelées cellules de la coiffe. De plus, grâce à leur contact avec les cellules somatiques, les CSG se divisent de manière asymétrique. En effet, après division, selon l’axe antéro-posterieur, la cellule fille la plus antérieure reste en contact avec les cellules de la coiffe et conserve ainsi les caractéristiques de CSG. La seconde cellule fille, plus postérieure, devient quant à elle, une cellule appelée cystoblaste. Le cystoblaste subit alors quatre divisions mitotiques séparées par des étapes de cytokinèse incomplète. Cette étape permet d’aboutir à la formation d'un cyste germinal composé de 16 cellules germinales interconnectées par des ponts cytoplasmiques appelés canaux annulaires. Cependant, parmi les cellules qui composent le cyste, toutes ne contiennent pas le même nombre de canaux annulaires : deux cellules ont trois canaux ; quatre cellules en ont deux ; huit en ont qu’un seul et enfin deux cellules en ont quatre. Ces deux dernières cellules sont appelées pro-ovocytes car elles entrent toutes deux en prophase I de méiose.

Ainsi, dans la région 2a, le cyste est composé de seize cellules dont deux pro-ovocytes. C’est dans cette région que l’une de ces deux cellules se différencie en ovocyte. Cette cellule reste en méiose, ses chromosomes se condensent pour former le karyosome et elle devient transcriptionellement inactive. Le second pro-ovocyte, quant à lui, sort de méiose et initie un programme d’endoréplication tout comme les quatorze autres cellules. Ces cellules répliquent donc leur ADN sans effectuer de division cellulaire, devenant alors des cellules polyploïdes. Elles se différencient en cellules nourricières. De plus, dans cette région, à la surface du germarium, se trouvent deux cellules souches somatiques. Ces dernières se divisent pour produire les cellules folliculaires.

Lorsqu’il entre en région 2b, le cyste change de forme. Il s’élargit sur toute la largeur du germarium pour former un disque dans lequel l’ovocyte se retrouve au centre du cyste. En parallèle, les cellules folliculaires, produites par les deux cellules souches somatiques en 2a, migrent pour rejoindre le cyste et l’entourer.

(39)

Figure 12 : Caractéristiques des 14 stades de développement de la chambre ovarienne de

Drosophile

Adaptée de Jia et al., Scientific Reports, 2016

(40)

13 A son entrée dans la région 3, le cyste change à nouveau de forme. Il s’arrondit pour former une sphère dans laquelle l’ovocyte se positionne au postérieur du cyste germinal où il restera jusqu’à la fin de l’ovogenèse. De plus, les cellules folliculaires entourent complètement le cyste, formant ainsi un épithélium. La chambre ovarienne de stade 1 est alors formée. La formation de la chambre ovarienne de stade 1 à travers le germarium, à partir de la CGS prend environ trois jours et demi.

b. Développement de la chambre ovarienne

Une fois la chambre ovarienne de stade 1 formée, cette dernière quitte le germarium et se retrouve dans une région plus postérieure de l’ovariole appelée le vitellarium pour poursuivre son développement. L’ovogenèse, depuis la formation de la chambre ovarienne de stade 1 dans la germarium, jusqu’à la formation de l’œuf, dure environ 5 jours et a été caractérisée en 14 stades selon des critères morphologiques tels que la taille de l’ovocyte ou encore le statut de migration des cellule folliculaires autour des cellules nourricières et de l’ovocyte (Jia et al., 2016; King, 1970) (Figure 12). Au cours de cette ovogenèse, l’ovocyte devra acquérir les nombreuses ressources nécessaires au développement du futur embryon telles que des réserves énergétiques mais également des ARNm qui devront avoir une localisation polarisée pour définir les axes antéro/postérieur et dorso/ventral du futur embryon (Lasko, 2012). Toutes ces ressources lui seront fournies par les cellules nourricières mais également par les cellules folliculaires. Les cellules folliculaires vont également s’organiser en différents groupes de cellules qui seront primordiaux pour l’organisation de l’ovariole et former les différentes structures de l’œuf (Xiaodong et al., 2008). Ainsi, à la sortie du germarium, les cellules folliculaires se sont différenciées en trois sous populations : les cellules folliculaires polaires composées de 3 à 5 cellules et localisées aux extrémités antérieures et postérieures de la chambre ; les cellules folliculaires composant le pédoncule, qui relient entre elles les chambres ovariennes ; et les cellules folliculaires principales qui entourent l’ovocyte et les cellules nourricières.

Entre le stade 2 et le stade 6, l’ovocyte et les cellules nourricières continuent de croitre à la même vitesse. Cependant, l’ovocyte reste bloqué en prophase I de méiose au stade pachytène et est génétiquement inactif (Lake and Hawley, 2012). Ce sont donc les cellules nourricières, alors polyploïdes qui produisent un grand nombre d’ARNm et de protéines nécessaires au développement de l’ovocyte. Ces ressources lui sont délivrées au travers des canaux annulaires. Enfin, les cellules folliculaires continuent de se diviser pour pouvoir continuer d’entourer l’ovocyte et les cellules nourricières en croissance, jusqu’au stade 6, stade à partir duquel elles arrêtent de se diviser et deviennent elles aussi polyploïdes.

(41)
(42)

14 Entre les stades 7 et 10A, la croissance de l’ovocyte devient beaucoup plus importante que celle des nourricières. En effet, durant ces stades, appelés stades vitellogeniques, l’ovocyte accumule une grande quantité de réserves, le vitellus, provenant du corps gras et des cellules folliculaires, qui sera utilisé par le futur embryon. Au stade 10, ce dernier occupe alors la moitié de la chambre ovarienne. De plus, à ces stades, grâce à des déterminants cytoplasmiques sous forme d’ARNm qui se localisent asymétriquement, l’ovocyte acquiert une polarité antéro/dorsale et dorso/ventrale primordiale pour le développement du futur embryon (Voir chapitre I.3.C.b). Enfin, à partir du stade 9, les cellules folliculaires, qui formaient un épithélium cubique simple entourant à la fois les cellules nourricières et l’ovocyte vont subir différents changements morphogénétiques (Xiaodong et al., 2008). Les cellules polaires à l’antérieur de la chambre vont recruter des cellules folliculaires adjacentes qui vont devenir une population de cellules appelées cellules de bordure. Ces cellules vont alors quitter l’épithélium, entourer les cellules polaires et migrer, au travers des cellules nourricières, pour atteindre la membrane antérieure de l’ovocyte. En parallèle, à l’antérieur de la chambre, une partie des autres cellules folliculaires principales vont migrer vers le postérieur pour entourer l’ovocyte. Pour cela, elles vont se réorganiser en deux populations. Les cellules folliculaires à l’antérieure vont se réorganiser en cellules squameuses pour s’étendre et s’aplatir le long des cellules nourricières. Les autres cellules folliculaires vont se réorganiser en épithélium columnaire ou prismatique pour s’étirer selon l’axe apico-basal. Au stade 10, environ cinquante cellules squameuses entourent toutes les cellules nourricières alors que les cellules columnaires n’entourent plus que l’ovocyte.

Depuis le stade 10B, jusqu’au stade 12, la taille de l’ovocyte augmente de manière encore plus importante. Les cellules nourricières déversent massivement leur contenu cytoplasmique dans l’ovocyte. En fin de stade 12, ce dernier représente alors quasiment la totalité de la chambre ovarienne. Les cellules folliculaires columnaires quant à elles, migrent au stade 10B, entre l’ovocyte et les cellules nourricières. Ces dernières sont appelées cellules centripètes et formeront l’operculum du chorion. De plus, au niveau de l’axe antéro/dorsal, une partie de ces cellules se réorganise pour former un épithélium tubulaire en 3 dimensions qui produira les appendices respiratoires dorsaux de l’œuf.

Entre les stades 13 et 14, les cellules nourricières ainsi que les cellules folliculaires qui ont finies de secréter la membrane vitelline et le chorion, constituant de la coquille de l’œuf, entrent en apoptose et dégénèrent. Dans l’ovocyte, la méiose reprend, puis se bloque à nouveau en métaphase I. La méiose reprendra ensuite une fois l’œuf expulsé dans l’oviducte pour être fécondé.

(43)

Figure 13 : L’œuf de Drosophile

(A) Vue latérale de l’œuf de Drosophile et de ses différentes structures. L’aéropyle au postérieur et les appendices dorsaux en antérieur sont des structures respiratoires. Le Micropyle, en antérieur permet l’entrée du spermatozoïde dans l’œuf. (B) Vue dorsale de l’œuf de Drosophile.

Figure 14 : Différents types de cellules polarisées dans la chambre ovarienne de Drosophile Dans une chambre ovarienne de stade 9 : (A) l’ovocyte qui présente une polarité antéro/postérieure et dorso/ventrale, (C) les cellules de bordure une polarité de migration, (D) les cellules folliculaires une polarité apico-basale (B) et elles subissent des processus de morphogenèse en antéro/dorsal pour former les appendices dorsaux de l’œuf (E).

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