APPORT DE L’EVALUATION EXTERNE DE LA QUALITE DANS LA VALIDATION ANALYTIQUE EN HEMOSTASE

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A la mémoire de ma chère grande mère RAHMA

Je te dédie ce très modeste travail en regrettant que tu ne puisses être à mes cotes dans cette étape importante de ma vie.

Malheureusement tu nous a quitte trop tôt, mais c’est le destin qui en a décidé ainsi.

Tu m’as fait aimer la médecine, et je ne t’en serais jamais assez reconnaissante.

Même si tu n’es plus avec nous, saches que t’aimons et que tu seras toujours vivant dans nos cœurs.

A ma très cher mère

Tu représentes pour moi le symbole de la bonté par excellence, la source de tendresse et l’exemple du dévouement qui n’a pas cessé de m’encourager et

de prier pour moi.

Ta prière et ta bénédiction m’ont été d’un grand secours pour mener à bien mes études.

Aucune dédicace ne saurait être assez éloquente pour exprimer ce que tu mérites pour tous les sacrifices que tu n’as cessé de me donner depuis ma

naissance, durant mon enfance et même à l’âge adulte.

Tu as fait plus qu’une mère puisse faire pour que ces enfants suivent le bon chemin dans leur vie et leurs études.

Je te dédie ce travail en témoignage de mon profond amour. Puisse Dieu, le tout puissant, te préserver et t’accorder santé, longue vie et bonheur.

A mon cher père

Ce modeste travail est le fruit de tout sacrifices déployés pour notre éducation.

Vous avez toujours souhaité le meilleur pour nous.

Vous avez fournis beaucoup d’efforts aussi bien physiques et moraux à notre égard.

Vous n’avez jamais cessé de nous encourager et de prier pour nous. C’est grâce à vos percepts que nous avions appris à compter sur

A mes chères sœurs, hafsa et hajar

Je ne peux exprimer à travers ces lignes tous mes sentiments d’amour et de tendresse envers vous.

Vous avez été à mes côtés pendant toutes les étapes de ma vie, je vous en suis très reconnaissante.

Que ce travail soit l’expression de ma gratitude pour tout moment de joie partagé ensemble.

J’implore Dieu qu’il vous porte bonheur et vous aide à réaliser tous vos vœux.

A mon cher frère Mohamed Amine

Tu me manques énormément et chaque jour qui passe je ne cesse de remémorer tous les bons moments passés ensemble.

Sois assuré de toute mon affection et ma tendresse, avec tous mes souhaits de réussite dans ta vie privée et professionnelle.

tu étais toujours présent pour m’orienter et me conseiller puisses tu trouver dans ce travail le témoignage de mon amour le plus sincère.

A mon cher frère Abderrahmane

Les mots ne sauraient exprimer l’entendu de l’affection que j’ai pour vous et ma gratitude.

Je vous dédie ce travail avec tous mes vœux de bonheur, de santé et de réussite.

Je vous souhaite une vie pleine de bonheur, de santé et de prospérité. Que ALLAH vous bénisse et vous protège.

A mon chèr oncle Abdel Aziz

A travers ce travail je vous exprime tout mon amour et mon affection. Sans vous ma vie n’aurait pas eu le même goût.

Je vous remercie pour tout ce que vous êtes, et je vous souhaite à tous beaucoup de réussite dans tout le reste.

A mon très cher oncle Mohamed Chrif et à son épouse. A ma chère cousine Amina et à mon cher cousin Mohamed

Votre soutien, votre dévouement et votre amour ont été une grande source de motivation pour moi.

Votre aide m’a toujours été précieux. Je vous souhaite tout le bonheur que vous méritez.

Je vous dédie ce modeste travail en guise de remerciement pour vos conseils et encouragements qui m’ont toujours poussé à donner le meilleur de

moi-même.

A mes cousin Omar et Mohamed Mahdi.

Je vous remercie vivement pour votre soutien, vos encouragements et vos conseils précieux.

Veuillez retrouver en ce travail l’expression de mon amour, ma gratitude et mon grand attachement.

A mon ami Walid,

Aucune dédicace ne pourrait exprimer mon affection. Depuis que je t’ai connu, tu n'as cessé de me soutenir et de m'épauler. Ta présence et ton

aide m’ont procuré que confiance et stabilité.

Je te remercie pour ton soutien inconditionnel durant toute cette période.

En témoignage de toute l'affection que je te porte, ainsi que les souvenirs innombrables que nous avons partagé, je te dédie ce travail. Puisse le bon

dieu te procure santé et longue vie.

A ma meilleure amie Khadija,

Merci pour ton soutien et ton amitié́. J'aurais bien voulu que tu sois avec moi en ce jour mémorable.

Je te remercie d’avoir parcouru avec moi toutes les étapes, nous avons fait ce parcours ensemble, souffert ensemble pour au final gagné ensemble. Je te souhaite une longue vie pleine de bonheur et de prospérité́. Puisse ce travail être le témoignage de ma reconnaissance et de mon grand amour

pour toi.

A tous les internes du CHU promotion 2017 : ALF NIBA W 3NIBA

Merci pour ces deux belles années passées à vos côtés, l’internat ne serait pas le même sans vous.

A notre maître et président de thèse Madame le Professeur Souad Benkirane

Professeur D’hématologie clinique

Vous nous avez accordé un immense honneur et un grand privilège en acceptant la présidence de notre jury de thèse.

Nous vous remercions aussi pour la gentillesse et La spontanéité avec lesquelles vous avez bien voulu diriger Ce travail. Nous vous prions,

cher Maître, D’accepter dans ce travail le témoignage de notre haute considération, de notre profonde reconnaissance Et de notre

Mention Spéciale au maître et rapporteur de thèse Monsieur le professeur Azlarab Masrar

Professeur d’Hématologie Biologique

Chef de service du laboratoire central d’hématologie CHU Ibn Sina Rabat

Je tiens à vous adresser mes plus vifs remerciements. Nous sommes très sensibles à votre gentillesse et vos conseils. Que ce travail soit pour nous l’occasion de vous exprimer notre

admiration ainsi que notre gratitude.

A notre maître et juge de thèse Madame le Professeur Mona NAZIH

Professeur d’Hématologie Biologique

Nous tenons à vous exprimer toute gratitude Pour l’honneur que vous nous faites en vous Intéressant à ce travail et acceptant de le juger.

Nous vous exprimons nos plus vifs Remerciements et nous vous prions de trouver, ici Le témoignage de notre reconnaissance et notre

A notre maître et juge de thèse Monsieur le professeur Anass JEAIDI

Professeur d’Hématologie Biologique

C’est pour nous un grand plaisir de vous compter parmi Le jury de cette thèse.

Nous tenons à vous témoigner notre profonde Reconnaissance pour avoir aimablement accepté de

Juger ce travail

LISTE

Liste des abréviations

ADAMTS13 : A Desintegrin and metalloprotease with thrombospondin type I repeats-13

AVK : Anti Vitamine

BLQS : Bureau of Laboratory Quality Standard CAP : College des Pathoologistes Américains CLSI : Clinical and Laboratory Standard Institue CNE : Comité Européenne de Normalisation CQI : Contrôle de qualité interne

CSD : Comité Scientifique et de normalisation CV : Coefficient de variation

DDU : Unité de D-Dimère

DO : Densité optique

DOACS : Direct Oral Anticoagulants

dRVVT : Dilute Russell’s Viper Venom Time

ECAT : External quality Control of diagnostic Assays and Tests EEQ : Evaluation Externe de la Qualité

EQATH : External Quality Assurance in Thrombosis and Hemostasis

ET : Ecart type

FEU : Unité Equivalent Fibrinogène

GBEA : Guide de bonne exécution des analyses

HERDOO2 : Hyperpigmentation, edema, redness, D-dimer, Obesity, Older age, 2 scores.

ISI : International sensitivity index

ISO : Organisation Internationale de Normalisation

ISTH : International Society of Thrombosis and Hemostasis

M : Moyenne

NASCOLA : North American Specialized Coagulation Laboratory Association

NEQAS : National External Quality Assessment Service OMS : Organisation Mondiale de la Santé

PCa : Protéine C activée

PDF : Produits de dégradation de la fibrine POS : Procédures Opératoires Standardisés

QLIA : Clinical Laboratory Improvement Amendments RPM : Vitesse de Rotation par Minute

SD : Ecart type

TC : Test de Compétence

TCA : Temps de céphaline avec activateur TFPI : Tissue factor pathway inhibitor

TP : Taux de prothrombine

TQ : Temps de Quick

TS : Temps de saignement

VWF : Facteur von Willebrand WHO : World Health Organization

LISTE

DES ILLUSTRATIONS

Listes des figures

Figure 1: les trois phases de l'hémostase. ... 22 Figure 2: Technique d’inclinaison manuelle du tube pour les tests de coagulation. ... 25 Figure 3: la droite d’étalonnage (de Thivolle) : la conversion du temps de Quick (TQ) en taux de prothrombine (TP). ... 26 Figure 4: Diffusion et transmission de la lumière dans une suspension : I0 : intensité incidente, I : Intensité. ... 34 Figure 5: Détection de caillot par la méthode turbidimétrique. ... 35 Figure 6: Détection de caillot par la méthode néphélométrique. ... 36 Figure 7: Méthode électromécanique utilisant un champ électromagnétique. . 38 Figure 8: Dosage de l’activité de facteur VIII par la méthode chromogènique 40 Figure 9: arbre qui représente la relation entre les documents... 58 Figure 10: exemple de graphique de Levey-jennings ... 77 Figure 11: Multi règles de Westgard... 79 Figure 12: caractéristiques d’un programme d’EEQ ... 83 Figure 13: les méthodes d’EEQ ... 85

Liste des tableaux

Tableau I: Facteurs et protéines de la coagulation. ... 22 Tableau II: Analyseurs de coagulation. ... 42 Tableau III: Collecte du plasma normal poolé. ... 53 Tableau IV: Les organismes d’évaluation externe de la qualité (OEEQ) en hémostase ... 101

Introduction ...1 PREMIERE PARTIE : Exigences règlementaires pour l’EEQ de la phase analytique en hémostase ...6

I. Normes d’accréditation analytique des laboratoires de biologie médicale. ...7 A. Normes internationales et Agences de normalisation ...8 B. Normes nationales et lignes de conduite techniques ... 11 C. Certification et Accréditation ... 13 D. Processus d’accréditation ... 17 E. Bénéfices de l’accréditation ... 19 II. Innovation technologique en hémostase ... 21 A. Généralité sur l’hémostase ... 21 B. L’exploration manuelle d’hémostase ... 23 1. Exploration manuelle de l'hémostase primaire ... 23 a. La numération plaquettaire ... 23 b. Le temps de saignement (TS) ... 23 2. Exploration manuelle de la coagulation plasmatique ... 24 1) Temps de Quick TQ ... 25 2) Le temps de céphaline avec activateur TCA ... 27 3) Dosage du fibrinogène ... 28 4) Dosage des facteurs de la coagulation ... 28 C. Automatisation du laboratoire d’hémostase ... 29

1. Historique ... 29 2. automatisation de la phase pré analytique et post analytique ... 31 1. La phase pré-analytique ... 31 2. La phase post-analytique ... 33 3. Automatisation de la phase analytique ... 33 A. Techniques de mesure des automates ... 33 1. La technique chronométrique ... 34 a. Détection photo-optique ... 34 b. Détection électromécanique (Viscosimétrie) ... 37 2. La technique chromogénique ... 38 3. La technique immunologique ... 40 B. Automates en hémostase ... 41 c. La gamme SC-series ... 43 1. La gamme SC-SC-5100 ... 43 2. La gamme SC-2400/2500 ... 43 3. La gamme SC-1600 ... 44 4. Réactifs ... 44 1. Gestion des réactifs en hémostase ... 44 2. Préparation et conservation ... 45 3. Choix des réactifs ... 45 a. Sensibilité à l’héparine et zone thérapeutique ... 47 b. Changement de lot ... 47

5. Les réactifs de sismex : quelques exemples ... 48 a. Temps de Prothrombine (Dosage Chronometrique)... 48 b. Temps de Céphaline Activée (Dosage Chronométrique) ... 49 c. Fibrinogène ... 49 d. Plasmas Immunodéplétés pour dosage chronométrique des facteurs ... 50 e. Plasmas synthétiques pour dosage chronométrique des facteurs .. 50 6. Qualification des instruments ... 51 7. L’étalonnage des instruments ... 52 1. Pool de plasmas normaux ... 52 2. Plasma certifié d’étalonnage d’origine commerciale ... 54 D. Avantages et inconvénients de l’automatisation ... 54 1. Les avantages de l’automatisation ... 54 2. Les inconvénients de l’automatisation ... 57 III. Fiche de postes analytiques en hémostase ... 57 A. Les documents ... 57 1. Une ligne de conduite ... 58 2. Les processus analytiques ... 59 3. Les procédures analytiques : Procédures opératoires standardisées (POS) .... 60 4. Exemple de fiche de poste analytique en hémostase ... 63 B. Choix et validation de la méthode analytique ... 63 IV. La validation analytique en hémostase ... 64

1. Registre d’échantillons ... 64 2. Centrifugation ... 65 a) La température ... 65 b) La vitesse et la durée de la centrifugation ... 65 3. Critères d’acceptation ou de rejet des échantillons d’hémostase... 66 a. Influence de l’hémolyse sur les analyses d’hémostase ... 68 4. Congélation des plasmas... 69 5. Échantillons à acheminer à des laboratoires sous-traitants ... 70

DEUXIEME PARTIE : Le contrôle de la qualité externe en hémostase ... 72

I. Le contrôle de la qualité ... 73 1. Les paramètres de la qualité ... 73 2. Contrôle de qualité interne (CQI) ... 75 3. Evaluation Externe de la Qualité (EEQ) ... 80 II. Le contrôle externe de la qualité ... 80 A. Principe ... 83 B. Types d’EEQ ... 85 1. Test de capacités (PT) ... 86 2. Autres méthodes d’EEQ ... 89 3. Gérer l’EEQ au laboratoire ... 90 C. Méthodes statistiques d’évaluations des contrôles de qualité externe (88) ... 93 1. Buts ... 93 2. Estimation de M et SD(a) ... 93

3. Evaluation des résultats individuels ... 95 a. Méthode du Z-score ... 95 b. Méthode graphique de Tukey ... 95 4. Evaluation globale de la qualité ... 97 a. Méthode du Pz ... 97 b. Distribution des PZ’s ... 98 D. Evaluation externe de la qualité en hémostase ... 99 E. Les organismes d’évaluation externe de la qualité (OEEQ) en hémostase .... 100 III. Apport et limites des programmes d’évaluation externe de la qualité en hémostase ... 104

A. Assurance de la qualité externe en thrombose et hémostase (EQATH) ... 104 B. Apport des programmes d’évaluation externe de la qualité en hémostase ... 104 1. D dimer ... 105 2. L'activité des facteurs et les tests d'inhibiteurs ... 108 3. Les anticoagulants oraux ... 114 C. Manque d’accord de classement entre les programmes internationaux d’EEQ de l’hémostase ... 120

CONCLUSION ... 127 RESUMES ... 129 ANNEXES ... 133 REFERENCE ... 139

La qualité au laboratoire peut être définie comme la justesse, la fiabilité et la pertinence des résultats d’analyses. Les résultats de laboratoire doivent être aussi précis que possible, tous les aspects des activités de laboratoire doivent être fiables et le rendu des résultats doit être correct afin d’être utilisé à des fins cliniques ou de santé publique.

Lorsque des analyses sont pratiquées, il existe toujours un certain degré d’inexactitude. Le défi est de réduire autant que possible le niveau d’inexactitude, en tenant compte des limites de nos systèmes d’analyse.

Les laboratoires produisent des résultats d’analyses qui sont largement utilisés à des fins cliniques ou de santé publique, et les bénéfices pour la santé dépendent de la justesse de ces analyses et du rendu des résultats. Si des résultats inexacts sont rendus, les conséquences peuvent être très graves :

 Traitements inutiles ; complications du traitement  Traitement inapproprié

 Retard dans l’établissement d’un diagnostic correct  Analyses supplémentaires et inutiles

Ces conséquences entraînent une augmentation en coût, en temps, en ressources humaines et n’apportent aucun bénéfice au patient.

Dans le but d’atteindre le plus haut niveau d’exactitude et de fiabilité, il est essentiel d’exécuter tous les processus et les procédures au laboratoire de la meilleure façon possible. Le laboratoire est un système complexe, impliquant beaucoup d’étapes dans la réalisation des activités ainsi qu’un grand nombre de personnes. La complexité du système exige que tous les processus et procédures soient exécutés correctement. (1)

Le laboratoire d’hémostase joue un rôle important dans le diagnostic des patients atteints de troubles de l’hémostase. Il sert d’assise au suivi des thérapies antithrombotiques tant pour les patients traités à l’héparine que ceux traités par des anticoagulants oraux. Son rôle consiste à mettre en place les outils de contrôle nécessaires pour assurer, dans les meilleurs délais, un résultat d’analyse de qualité. La qualité d’un résultat dépend de celle des trois phases du processus de production du résultat, c’est-à-dire les phases préanalytique, analytique et postanalytique. Afin de se conformer aux exigences établies, le laboratoire doit mettre en place un système de gestion de la qualité, ce qui comprend la définition d’un plan organisationnel et d’une structure de gestion de la qualité qui couvrent tout le processus. Ce dernier débute par l’ordonnance médicale de l’analyse et se termine par la production d’un rapport qui aide le médecin lors de sa prise de décision. (2,3)

Le laboratoire d’hémostase doit mettre en œuvre et maintenir un système de contrôle de la qualité des procédures analytiques qui respecte les exigences énoncées ci-dessous.

 Les procédures analytiques doivent être validées, documentées et approuvées. Si des procédures analytiques internes sont utilisées, elles doivent être validées adéquatement afin d’être employées comme il est prévu et documentées convenablement (2,3).

 Toutes les procédures analytiques doivent être associées à une procédure opératoire normalisée.

 Toute modification apportée à une procédure doit être validée, datée, documentée et approuvée.

 Un système de contrôle interne de la qualité doit permettre de s’assurer de l’exactitude des résultats obtenus. (2,3)

 Les étalonnages et la vérification doivent être enregistrés, datés et paraphés dans le cadre du contrôle de la qualité.

 Un système de contrôle externe de la qualité et de comparaison entre laboratoires ou une procédure d’évaluation de la conformité doivent être mis en place. (2,3)

 La préparation des contrôles et des réactifs utilisés pour réaliser les contrôles doit être documentée. Les résultats des contrôles, internes et externes, doivent être enregistrés, datés et paraphés. Ils doivent faire l’objet d’une évaluation et d’un suivi périodiques effectués par le responsable. Cette information doit être transmise au personnel. (3)

 Lorsqu’un résultat du contrôle de la qualité est non conforme, des actions correctives doivent être apportées, documentées et révisées par une personne responsable2.

La qualité des tests de diagnostic représente une cible clé de la médecine de laboratoire, pour laquelle une assurance de la qualité des tests est attendue de tous les participants au processus. Les laboratoires tentent d’assurer la qualité de leurs essais par divers processus, mais surtout par l’exécution de contrôles internes de la qualité (CIQ) et d’évaluations externes de la qualité (EEQ). C’est particulièrement vrai pour les tests d’hémostase et de coagulation. L’EEQ fournit en général des renseignements sur l’exactitude des essais et sur l’évaluation du rendement à long terme des laboratoires. Les fournisseurs d’EEQ appuient le rendement des laboratoires par divers moyens, y compris la

distribution de matériel pour la mise à l’essai des analytes (« tests de compétence »), le soutien éducatif par le biais de conseils d’experts, la distribution de publications ou de séries de cas. La participation à l’EEQ est souvent une exigence d’accréditation de laboratoire. (4)

Ce travail vise à identifier certaines des forces et des faiblesses de l’EEQ, et à cibler les tentatives d’harmonisation des pratiques de l’EEQ afin d’obtenir les meilleurs résultats pour les laboratoires participants ; ainsi, pour les patients et leurs fournisseurs de soins cliniques.

PREMIERE PARTIE :

Exigences règlementaires

pour l’EEQ de la phase

analytique en hémostase

I. Normes d’accréditation analytique des laboratoires de biologie

médicale.

L’évaluation est le moyen de déterminer l’efficacité d’un système de gestion de la qualité au laboratoire. Les normes ainsi que d’autres documents normatifs fournissant des lignes de conduite constituent les bases de l’évaluation. Elles peuvent être développées au niveau international, national ou local.

Les organisations qui établissent ces normes ou standards et qui délivrent les accréditations ou les certifications des laboratoires, jouent un rôle vital dans le processus d’évaluation.

Participer à des évaluations conduites par une organisation crédible et qualifiée est un moyen important pour un laboratoire d’être reconnu comme délivrant des résultats exacts et reproductibles. La réussite à ces évaluations permet de reconnaître que le laboratoire est en conformité avec les normes de qualité utilisées pour l’évaluation. (5,6)

Responsabilités

Les directeurs de laboratoires doivent avoir conscience de l’importance de l’obtention d’une accréditation, une certification et une licence, en mettant en place les normes internationales ou nationales correspondantes au champ d’application des activités du laboratoire et selon la législation nationale. Une des activités importantes comprend la recherche d’information à propos des normes et standards, à propos des processus d’accréditation et certification afin de les mettre en place et obtenir un meilleur service.

Le responsable Qualité doit transmettre et faire comprendre au personnel du laboratoire la nécessité de se conformer aux normes, internationales ou nationales. Il expliquera le processus de réponse aux exigences et organisera et préparera le laboratoire pour les évaluations.

Les techniciens de laboratoire doivent être informés des exigences des normes choisies, contribuer au développement des tâches pour se conformer à ces normes, être informés des processus d’évaluation et apporter leur aide pour que le laboratoire soit prêt pour ces évaluations. (5.6)

A. Normes internationales et Agences de normalisation :

Définitions

Document normatif : document qui donne les règles, les lignes de conduite ou les caractéristiques pour les activités ou leurs résultats. Il comprend les documents tels que les normes, les spécifications techniques, les codes de pratique et les règlements.

Norme/Standard : c'est un document, établi par consensus et approuvé par un organisme reconnu, qui fournit, pour des usages communs et répétés, des lignes directrices ou des caractéristiques pour des activités ou leurs résultats, garantissant un degré optimal d'ordre dans un contexte donné.

Règlement : toute disposition prise par une agence gouvernementale ou une autorité administrative.

Les normes peuvent être développées à un niveau international, national ou local. La conformité à une norme peut être requise par le gouvernement ou une autre autorité ou encore être volontaire.

Les normes développées au niveau international peuvent disposer du plus large consensus ou accord, mais peuvent être moins spécifiques. Les normes développées localement peuvent avoir le plus haut degré d’application, mais ne pas être utiles à d’autres régions ou pays.

Agences de Normalisation Exemples d’organisations internationales :  ISO (Organisation Internationale de Normalisation / International Organization for Standardization)

ISO est la plus grosse organisation de développement et de publication de normes, les normes ISO sont applicables à tout type d’organisation y compris les laboratoires cliniques et de santé publique.

L’ISO constitue un réseau d’instituts de normalisation nationaux de 157 pays, avec un membre par pays, et un secrétariat basé à Genève en Suisse qui coordonne le système. C’est une organisation non gouvernementale, elle constitue un pont entre les secteurs privés et publics. D’une part, de nombreux instituts membres font partie des structures gouvernementales de leur pays ou ont été mandatés par le gouvernement. D’autre part, beaucoup de ses membres viennent du secteur privé, et ont été placés à ces postes via des partenariats entre les associations issues de l’industrie. Par conséquent, l’ISO permet d’obtenir un consensus sur des solutions répondant aux besoins du milieu industriel comme aux besoins de la société.

Le travail de préparation des normes est mené par des comités techniques. Chaque membre a le droit d’être représenté dans les comités. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, prennent aussi part aux activités de ces comités. L’ébauche de normes internationales, adoptée par

le comité technique, est envoyée aux membres pour être votée. Les documents publiés en tant que Normes Internationales requièrent l’approbation d’au moins 75% des votants. (5,6,7)

 CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)

CLSI est une organisation internationale à but non lucratif, développant des normes et promouvant le développement et l’utilisation volontaire de normes et de guidelines par la communauté médicale. Les documents sont développés par des experts travaillant en sous-comités ou en sous-groupe de travail sous la direction et la supervision d’un comité. Le développement des normes est un processus dynamique. Chaque comité, responsable d’un domaine, s’est engagé à produire des documents de consensus relatifs à une discipline particulière, comme décrit dans l’énoncé de sa mission.

 CEN (Comité Européen de Normalisation / European Committee for Standardization)

Le CEN a été fondé en 1961 par les agences nationales de normalisation de l’Espace Economique Européen et des pays associés. Les termes généraux décrivant le CEN comprennent ouverture et transparence, consensus et intégration. L’adoption formelle de Normes Européennes est décidée par une majorité de vote des membres nationaux du CEN et est applicable à tous. Les responsabilités sont partagées entre 30 membres venant de chaque pays, 7 membres associés et 2 conseillers ainsi que le centre de gestion du CEN à Bruxelles.

 OMS/WHO (Organisation Mondiale de la Santé / World Health Organization)

L’OMS a développé plusieurs normes pour le diagnostic au laboratoire de maladies spécifiques. Un exemple typique est celui de la polio, pour laquelle l’accréditation du laboratoire est requise pour qu’il participe au Réseau d’Eradication de la Polio. Sept critères ont été sélectionnés, comprenant parmi d’autres, un minimum d’activité de 150 échantillons par an, une participation réussie au test de PT, et l’exactitude et la régularité des rapports de cas au sein du réseau. (6,8)

B. Normes nationales et lignes de conduite techniques :

Normes spécifiques au pays

Les normes peuvent être développées dans un pays pour être appliquées uniquement au niveau national. Elles peuvent être développées par des organisations gouvernementales ou par une autorité reconnue pour un domaine spécifique d’application.

Dans certaines institutions, des normes nationales ont été développées sur la base des normes internationales telles que l’ISO et adaptées à la culture et aux conditions du pays.

Lignes de conduite/Guidelines

Des lignes de conduites et guidelines sont développés dans de nombreuses situations. En général, les normes ISO nécessitent plus de conseils techniques pour leur mise en place au laboratoire et dans les pays. De nombreuses organisations nationales et internationales ont développé leurs propres lignes de conduite.

Une autre utilisation des lignes de conduite est d’aborder une méthode spécifique d’analyse ou de fournir des conseils pour certaines parties du laboratoire.

Exemples De nombreuses lignes de conduite nationales et de normes ont été développés.

Quelques exemples sont présentés ci-dessous :

 GBEA (Guide de Bonne Exécution des Analyses de biologie médicale), France

La législation française a créé ces lignes de conduites pour assurer la qualité des services offerts par les laboratoires français en 1994. Ces documents ont été révisés en 1999 et 2002. Tous les laboratoires en France doivent être conformes au GBEA.

 BLQS (Bureau des normes de qualité pour le laboratoire/Bureau of Laboratory Quality Standards), Thaïlande

Le BLQS du département des sciences médicales a développé des normes de qualité pour les laboratoires de santé, basées sur les normes ISO17025 ET 15189. Une check-list contenant 110 points a été développée et une approche de mise en place par étape a été conçue. Selon le score obtenu via la check-list, les laboratoires seront accrédités selon les normes nationales, ou peuvent postuler pour une accréditation ISO.

 CLIA (Amendements de 1998 pour l’amélioration des laboratoires cliniques Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988), USA

Le CLIA a été mandaté par la loi en 1998, faisant passer tous les laboratoires d’analyse médicale aux Etats-Unis sous la loi fédérale. Des normes

de qualité ont été définies en se basant sur la complexité de l’analyse réalisée. L’objectif du programme du CLIA est d’assurer la qualité des analyses de laboratoire, quel que soit l’endroit où elles sont réalisées (par exemple, au cabinet du médecin, au laboratoire de l’hôpital, dans une clinique, dans une maison de convalescence). (6,7,8,9)

C. Certification et Accréditation

Les normes sont utilisées lorsqu’un laboratoire cherche une reconnaissance officielle de ses capacités à mettre en place des pratiques de qualité pour réaliser son travail.

La conformité aux normes peut être une exigence légale ou être simplement volontaire. Trois processus peuvent être utilisés pour indiquer que le laboratoire est en conformité avec des normes définies :

 La certification :

Procédure par laquelle un organisme indépendant donne une assurance écrite que le produit, le processus ou le service est conforme à des exigences spécifiées.

Dans le processus de certification, le laboratoire est visité par des représentants d’une agence de certification. Ces représentants recherchent la preuve de conformité aux normes, lignes de conduite, procédures, exigences et règlements. L’équipe d’inspection vérifie en tout premier lieu la présence de textes, procédures et de documents.

 L’accréditation

Procédure par laquelle une autorité donne la reconnaissance formelle qu’un organisme ou une personne est compétente pour réaliser des tâches spécifiques.

Le laboratoire est visité par des représentants d’un organisme d’accréditation qui cherchent la preuve de la conformité aux normes, lignes de conduite, procédures, exigences et règlements et qui observent aussi les opérateurs pour s’assurer qu’ils assurent leurs fonctions et leurs responsabilités correctement et de manière compétente.

L’accréditation fournit un niveau d’assurance plus élevé à ceux qui utilisent les services du laboratoire, et garantit que les analyses sont fiables et justes car l’accréditation comprend une évaluation de la compétence.

 Licence :

L’autorisation d’ouverture ou de pratiquer est généralement fournie par une agence locale gouvernementale. Elle est souvent basée sur un savoir démontré, une formation et des compétences. Généralement quand une licence est utilisée, cela correspond à une exigence légale pour pouvoir exercer. (7,8,9)

Eléments d’accréditation

Le processus d’accréditation requiert :

- Un organisme d’accréditation qui supervise les évaluations et les demandes d’accréditation ; cet organisme peut également fixer les normes utilisées dans le processus d’accréditation ;

- Des normes auxquelles un laboratoire doit se conformer pour obtenir l’accréditation

- Des évaluateurs ou inspecteurs expérimentés qui cherchent à établir la conformité aux normes en conduisant les évaluations ;

- Un laboratoire dont la conformité aux normes est exigée ou recherchée volontairement en étant évalué.

Organismes de certification et d’accréditation

Un organisme d’accréditation ou de certification est une organisation ou une agence qui a le droit et l’autorité d’inspecter une installation et de fournir une preuve écrite de sa conformité (certification) à une norme et/ou de sa compétence (accréditation).

Les organismes de certification et d’accréditation présentent les caractéristiques suivantes :

- Approuvés :

Les organismes d’accréditation et de certification doivent généralement être eux-mêmes accrédités. Cette accréditation est communément réalisée sous l’autorité d’organismes nationaux ou internationaux, telles que les agences nationales de normalisation. Les organismes internationaux d’accréditation sont souvent accrédités ISO17011.

- Bien informés :

Ces organismes doivent être bien informés et compétents sur le contenu et l’interprétation des normes pour lesquelles ils fournissent une accréditation, ainsi que dans la discipline qu’ils accréditent. Une équipe d’accréditation comprend des experts de la discipline et des experts des exigences d’accréditation.

- Basés sur les normes : Les évaluations sont toujours basées sur des normes établies.

- Objective :

L’interprétation des compétences est basée sur des preuves plus que sur des impressions. L’équipe d’inspection n’écrit pas ses propres règles, mais mesure la conformité à des règles ou à des normes données.

- Compétent :

Ces organisations garantissent que tout le personnel est formé et compétent et que les membres des équipes sont bien informés aussi bien au niveau technique que sur la gestion de la qualité. Pour preuve de professionnalisme, mais aussi pour garder leur accréditation, ces agences entretiennent les compétences de leur personnel. (10, 11, 13)

Les normes Utilisées communément pour l’accréditation ou la certification

Les normes peuvent s’appliquer à l’accréditation ou à la certification, ou peuvent être règlementaires. Les normes importantes d’accréditation comprennent par exemple les normes ISO17025 et l’ISO15189, normes internationales très utilisées.

L’ISO15189 est préférée pour les laboratoires car elle s’applique à tout le laboratoire, sans tenir compte des analyses qui y sont faites, à l’opposé de l’ISO17025 qui a été conçue pour et qui a vocation d’être mise en œuvre sur une base individuelle analyse par analyse.

La norme ISO17025 spécifie les exigences générales de compétence pour réaliser les analyses et/ou les calibrations, y compris pour les prélèvements. Elle est applicable aux laboratoires d’analyses et d’essais et peut être utilisée pour développer la qualité et les systèmes techniques et administratifs qui dirigent les opérations.

Elle peut être utilisée par les clients du laboratoire, les autorités réglementaires et les organismes d’accréditation souhaitant confirmer ou reconnaître la compétence des laboratoires. Elle ne couvre pas la conformité aux exigences réglementaires et de sécurité.

L’ISO15189 est spécifique à un secteur, elle est conçue pour les laboratoires médicaux et a vocation d’être utilisée seulement par ceux-ci.

L’ISO15189 spécifie les exigences particulières relatives à la qualité et la compétence des laboratoires médicaux. Elle fournit un guide pour la gestion de la qualité au laboratoire et les processus techniques nécessaires pour assurer la qualité des analyses du laboratoire.

L’ISO15189 est applicable à toutes les disciplines courantes des services de laboratoire et est basée sur l’ISO17025 et l’ISO9001. Elle est utilisée par les laboratoires médicaux pour développer la qualité, les systèmes techniques et administratifs gouvernant les opérations et est aussi utilisée par les organisations souhaitant confirmer ou reconnaître la compétence des laboratoires médicaux. (11,12,13)

D. Processus d’accréditation

La décision d’obtenir une accréditation n’est pas une décision à prendre à la légère ou sans y réfléchir longuement.

Les visites d’accréditation sont couteuses, par conséquent les directeurs de laboratoire et les responsables qualité doivent bien préparer à l’avance les différentes visites pour s’assurer de ne pas gaspiller leurs ressources. L’accréditation peut commencer par une partie du laboratoire et se poursuivre dans les autres sections.

Préparation : Rechercher l’accréditation requiert :  Un engagement

Le chemin pour se conformer aux normes et être reconnu est rarement direct. Lorsque le processus devient difficile, semé d’embûches, et requiert du temps et des efforts, il n’est pas inhabituel de quitter ou de reporter le processus. Une fois stoppé, il devient très difficile de recommencer.

 De planifier

Le chemin vers l’accréditation prendra du temps. Les laboratoires devraient organiser leur temps et leur personnel pour s’assurer que le processus s’achèvera avec un minimum d’obstacle.

 Des connaissances

L’application des normes implique tout d’abord la connaissance des normes et de savoir comment les interpréter. Si le laboratoire ne possède pas de personnes ayant ces connaissances, il devra envisager d’envoyer du personnel en formation ou d’embaucher un consultant.

 Des ressources

Le processus d’accréditation peut entraîner une réorganisation, une restructuration, la formation du personnel ou de l’équipement supplémentaire.

Les coûts potentiels doivent être envisagés dans la phase de planification au début du processus.

Interprétation des termes

Lors de l’utilisation des normes pour préparer l’accréditation, gardez à l’esprit les interprétations suivantes des termes suivants, communément utilisés

dans les normes :

 Consensus : Accord entre des délégations représentant les parties prenantes, fournisseurs concernés, utilisateurs, agences de régulations nationales et autres groupes d’intérêt. Le consensus n’est pas déterminé de façon numérique ou à la majorité. Le consensus représente un accord général en l’absence de forte et irréfutable objection.

 Enoncé normatif : Information inclue dans un document constituant une partie requise et essentielle de la norme. Inclut le mot « doit ».

 Note d’information : Information inclue dans un document uniquement dans un but d’information, souvent sous forme de note. L’information peut être explicative, justificative ou fournir un exemple.

 Conformité : satisfait à la fois au texte et à l’esprit de l’exigence

 Non-conformité : Non satisfaction aux exigences d’un processus, d’une structure ou d’un service spécifié. Peut-être catégorisée comme majeure (complète) ou mineure (partielle).

 Vérification de conformité : Confirmation de conformité par examen des preuves. (13,14)

E. Bénéfices de l’accréditation

Valeur de l’accréditation

C’est grâce à l’accréditation par des évaluateurs tiers que les clients du laboratoire peuvent avoir confiance dans les mesures, calibrations, inspections, analyses et certification, assurant que le travail a été fait de manière compétente.

L’aspect principal de l’accréditation est qu’il promeut la confiance dans les résultats et les services car c’est un moyen valide de vérifier les plaintes portant sur la qualité, les performances et la fiabilité. L’utilisation de normes internationalement reconnues est la clef pour construire cette confiance au-delà des frontières et pour promouvoir les bonnes pratiques dans le monde.

Résultats Les résultats de l’accréditation sont :

- Mesure de la solidité et de l’intégrité du système qualité ; - Contrôle continu du système qualité ;

- Reconnaissance de vos efforts.

Les laboratoires accrédités ont tendance à réaliser de meilleurs tests de compétence et sont plus enclins à avoir un système qualité qui fonctionne.

L’accréditation comme outil

L’accréditation est un outil précieux pour déterminer l’efficacité du système qualité.

Cependant, ce n’est pas le but ultime. Une fois l’accréditation obtenue, le défi important sera de conserver ce statut.

Un laboratoire bien géré saura qu’il atteint ses objectifs. Le laboratoire devrait considérer l’accréditation comme une forme d’audit que le laboratoire met en place pour s’assurer que le système fonctionne proprement.

Le statut d’accréditation doit être renouvelé régulièrement et le laboratoire est chaque fois mis au défi de maintenir et d’améliorer le niveau de qualité. (13,14)

II. Innovation technologique en hémostase

A. Généralité sur l’hémostase :

L’hémostase est un processus physiologique qui permet la prévention et l’arrêt des hémorragies en cas de lésion de la paroi vasculaire. Elle joue aussi un rôle dans le maintien de la fluidité sanguine par la mise en jeu de systèmes inhibiteurs. (18)

Les phénomènes physiologiques de l’hémostase se décomposent en trois parties successives artificiellement distinctes mais en réalité intriquées :

 L’hémostase primaire : Cette étape, appelée parfois temps vasculaire et plaquettaire, correspond à l’ensemble des interactions complexes qui aboutissent à la formation d’un clou plaquettaire obturant la brèche vasculaire (20), et elle aboutit à l’arrêt du saignement essentiellement pour les petits vaisseaux.

 La coagulation : La coagulation est le processus qui permet la consolidation de thrombus, obtenu à la fin de l’hémostase primaire, grâce à la génération de thrombine qui stabilise l’agrégat plaquettaire et transformant le fibrinogène en fibrine (20), succède à l’hémostase primaire et met en jeu, elle aussi, des cellules et des facteurs plasmatiques.

 La fibrinolyse : c’est le processus qui entraîne la solubilisation du thrombus fibrineux formé au niveau de la brèche vasculaire par la plasmine normalement générée à partir du plasminogène lié et adsorbé sur la fibrine. (21)

Figure 1: les trois phases de l'hémostase. [19]

B. L’exploration manuelle d’hémostase :

Les tests d’hémostase sont utilisés pour le diagnostic étiologique d’un syndrome hémorragique ou pour essayer d’évaluer le risque hémorragique avant une intervention chirurgicale. Certains tests sont utilisés dans le cadre de thromboses à répétition, pour déterminer la cause de ses maladies invalidantes et graves puisque certaines peuvent entrainer la mort par embolie pulmonaire.

1. Exploration manuelle de l'hémostase primaire :

Les principaux tests manuels d’exploration de l’hémostase primaire sont la numération plaquettaire et le temps de saignement.

a. La numération plaquettaire :

Après dilution convenable du sang et lyse des hématies. Le sang est déposé dans une cellule de comptage (exemple : cellule de Malassez). On compte les plaquettes au microscope (objectif 40), dans cette cellule, et on calcule leur nombre par litre de sang. (22, 23)

Valeurs normales : 150 000 à 400 000 /microlitre. (24)

b. Le temps de saignement (TS) :

Le temps de saignement est la mesure de la durée de l’hémorragie provoquée par l’incision de la couche superficielle de la peau dans des conditions normalisées .Ce test explore toutes les phases de l'hémostase primaire. Cet examen permet une étude globale du nombre et de la qualité fonctionnelle des plaquettes, il permet aussi d’étudier le rôle du facteur Von Willebrand, le fibrinogène et la qualité du sous-endothélium de la paroi vasculaire. (25,26)

Il en existe plusieurs variantes techniques :  La technique de Duke,

 la technique d'Ivy incision  la technique d'Ivy-3 points.

2. Exploration manuelle de la coagulation plasmatique :

La méthode manuelle d’exploration de coagulation, repose sur la réalisation des tests dans leur totalité à la main : mise en présence du plasma et des réactifs, mélange du plasma et des réactifs, détection de la formation du coagulum à l’aide d’un chronomètre.

Deux méthodes peuvent être utilisées :

 La méthode de KOLLER : la détection de la coagulation formée se fait par l’intermédiaire d’un crochet.

 La méthode de QUICK : l’inclinaison répétée à 45° du tube à hémolyse permet de voir la transformation du plasma liquide en solide.

Dans les deux cas, la lecture doit se faire par un technicien bien expérimenté pour les techniques manuelles de coagulation, en raison de nombreuses variables et sources possibles de contamination liées à ces techniques manuelles, les tests doivent être effectués en double. Dans tous les cas, si les temps de coagulation obtenus lors des tests en double diffèrent de plus de 10 %, le test doit être fait de nouveau.

Figure 2: Technique d’inclinaison manuelle du tube pour les tests de coagulation. (47)

L’exploration manuelle de la coagulation porte surtout sur la détermination du temps de Quick, du temps de céphaline avec activateur, du taux de fibrinogène, et des facteurs de coagulation.

1) Temps de Quick TQ :

Le TQ appelé improprement le taux de prothrombine (TP) est le temps de coagulation à 37°C d’un plasma en présence de thromboplastine tissulaire et de calcium.

Le temps obtenu est transformé en pourcentage d’activité par rapport à la normale. Il s’agit d’un test de la coagulation qui explore les facteurs plasmatiques de la voie extrinsèque de la coagulation (les F II, V, VII, X et le fibrinogène sont concernés).

Figure 3: la droite d’étalonnage (de Thivolle) : la conversion du temps de Quick (TQ) en taux de prothrombine (TP). (29)

International Normalized Ratio (INR):

L’INR ou International Normalized Ratio est outil exclusivement réservé à la surveillance et l’adaptation des traitements anticoagulants par des AVK. C’est le rapport du temps de Quick du patient sur celui du témoin (exprimés tous deux en secondes) élevé à la puissance ISI selon la formule :

INR = (temps de Quick du patient/temps de Quick du témoin) ISI

ISI : Indice de Sensibilité International de la thromboplastine utilisée. L’ISI permet de corriger les différences dues aux variations entre les thromboplastines utilisées (ISI=1).

2) Le temps de céphaline avec activateur TCA :

Le TCA est le temps de coagulation d’un plasma citraté pauvre en plaquettes et recalcifié en présence de céphaline (un phospholipide qui remplace les plaquettes) et d’un activateur de la phase contact de la coagulation (le koalin, la silice micronisée, ou l’acide ellargique), déclenché par l’ajout de calcium.

Ce test explore :

 Les facteurs du système contact (les facteurs XI, XII, Prékallikréine et Kininogène de haut poids moléculaire),

 Le complexe antihémophilique (facteur IX, facteur VIII),  Les facteurs II, V, X et le fibrinogène.

Les résultats sont exprimés en secondes par rapport à celui d’un pool de plasmas normaux appelé témoin. (27,28,29)

Technique :

On mélange le plasma (0,1 ml) avec un activateur et céphaline (0,1 ml). On incube le mélange dans le bain-marie à 37°C pendant 3 min. Ensuite, on recalcifie le mélange en ajoutant de chlorure de calcium (0,1 ml) préchauffé à 37°C et toujours en mélangeant le tout, on déclenche immédiatement le chronomètre. Le temps de coagulation est repéré à l’aide du crochet ou par retournements successifs du tube à réaction, et le temps de formation du caillot est enregistré. (30,31

3) Dosage du fibrinogène :

C’est le temps de coagulation d’un plasma citraté (le plus souvent dilué) après addition de thrombine calcique. Le temps de coagulation mesuré en secondes est reporté sur une courbe d’étalonnage établie à l’aide d’un plasma titré et ainsi convertie en concentration de fibrinogène exprimer en g /L.

Valeurs normales : comprise entre 2 et 4 g/L.

4) Dosage des facteurs de la coagulation :

Elles consistent à mesurer, en présence de l’échantillon à tester convenablement dilué, le temps de coagulation d’un réactif contenant tous les facteurs nécessaires à la coagulation dans le système utilisé, à l’exception du facteur à doser. La vitesse de la coagulation est fonction de la quantité de ce facteur dans l’échantillon testé. Les facteurs II, V, VII et X (complexe prothrombique) sont dosé dans le système extrinsèque en présence d’extraits tissulaires (ou de stypven). Les facteurs VIII, IX, XI et XII sont dosés dans le système intrinsèque, en présence de céphaline et activateur.

Les résultats sont exprimés par rapport à un plasma témoin de référence. La concentration du facteur à doser est exprimée par rapport à ce plasma témoin auquel est assigné par définition un taux de 100%. La variation du temps de coagulation en fonction du taux de facteur à doser est définie par une courbe d’étalonnage établie avec diverses dilutions du plasma témoin.

On doit s’assurer que différentes dilutions de l’échantillon testé donnent également une droite qui a la même pente que la droite de référence. Les dilutions respectives du plasma témoin et de l’échantillon doivent être choisies de telle sorte que se chevauchement les projections respectives des deux droites sur l’axe des ordonnées. (23)

Exploration manuelle de la fibrinolyse : Le temps de lyse des euglobulines (test de Von Kaulla) :

Le temps de Lyse des euglobulines plasmatiques est une méthode sensibilisée permettant de détecter une activité fibrinolytique après précipitation des protéines plasmatiques (les facteurs de la coagulation, le plasminogène et les activateurs du système fibrinolytique) en milieu acide, les inhibiteurs restant dans le surnageant.

Les protéines précipitées sont redissoutes dans un tampon, puis recalcifiées. Le temps de lyse du caillot d’euglobulines ainsi formé est mesuré. Ce temps de lyse est normalement de l’ordre de quelques heures, alors que celui du caillot de sang total peut dépasser deux jours. (32)

Ce test permet la détection d’une hyperfibrinolyse, qui conduit à des hémorragies importantes en empêchant la formation d’un caillot de coagulation. (26)

Valeurs normales : Temps de lyse est supérieur à 3 heures. (33)

C. Automatisation du laboratoire d’hémostase :

1. Historique :

L'automatisation dans le domaine de l'hémostase a évolué au cours de ces dernières années. Ainsi, l’étude de l’hémostase se basant au paravent sur la détection visuelle du caillot, est aujourd’hui automatisée, grâce à l’évolution des technologies dans le secteur de biologie médicale.

L'une des premières procédures de détection de la coagulation du sang était en 1878, développée par Vierordt, qui a fait un grand nombre d’expériences sur le temps de la coagulation du sang. La gouttelette du sang est reçue dans un tube de verre capillaire contenant un crin blanc de cheval bien dégraissé. On remue le crin et on note le moment où il se recouvre d’un dépôt fibrineux. (34)

Parmi les premiers systèmes de détection de la coagulation qui mesure d’une manière indirecte la viscosité, était le coagulomètre développé par Brodie et Russell en 1897. Ce dispositif, si intéressant à l’époque, utilise une goutte suspendue de sang veineux sur une lame de verre dans laquelle les érythrocytes ont été mis en mouvement par un courant d'air soufflé par intermittence sur le bord de la goutte. Le point final est alors déterminé par examen au microscope, au moment où la viscosité de l'échantillon s’est augmentée et le mouvement d'érythrocytes est arrêté. (35)

En 1910, Koffmann a développé le coaguloviscosimètre : c’est un appareil qui détecte la formation du caillot sanguin. Le changement de viscosité du sang, lors de la coagulation, génère un changement de tension, qui est enregistrée par un système de lecture. (35,36)

L’année 1920 a connu le développement du néphélomètre, instrument qui mesure la dispersion de la lumière de 90 degrés dans une suspension colloïdale. En 1936, Baldes et Nygaard avaient développé un coagulomètre fondé sur une technique photoélectrique, constitué d'un bain-marie à 37,5°C, et une cellule photoélectrique. Cet instrument original devrait être utilisé dans une pièce sombre pour éviter l’intervention d’une lumière parasite.

D'autres améliorations ont rendu ces instruments plus stables. (35)

Les années 1950 ont vu le développement de la « BBL Fibromètre », un instrument que l'on trouve encore dans les laboratoires de la coagulation, bien qu'il ne soit plus fabriqué. Cet instrument emploie une méthode électromécanique de détection des caillots, ayant permis aux laboratoires la transition de l'inclinaison manuelle de tube ou la réparation de caillot à l’aide du crochet, vers une méthode semi-automatique plus précise, où le spécimen et le réactif étaient mélangés manuellement et l'appareil enregistrait l'apparition du caillot. (37)

Les instruments d’hémostase actuelle se reposent sur les principes de détection de caillot des premiers systèmes d'analyse : Soit ils observent la formation d'un caillot (appareil à détection photo-optique), ou ils détectent le caillot par "sensation" (appareil à détection électromécanique basé sur le changement de la viscosité lors de la coagulation). Bien que, les principes restent les mêmes, les instruments ont été améliorés pour éliminer les variations dans le pipetage et la détection du point final. Ils permettent également de faire plusieurs analyses effectuées simultanément sur le même spécimen. (36,38)

Actuellement, des instruments capables de travailler à partir des tubes primaires bouchés, identifiables par code à barre, jusqu’au rendu du résultat, sont disponibles. Les appareils sont le plus souvent des analyseurs multiparamétriques, accessibles en continu et adaptés à la fois aux techniques colorimétriques, chronométriques et immunonéphélémétriques (automates mixtes).(39)

Les instruments modernes ont l’avantage d’optimiser les analyses et de les rendre plus automatisées, avec la possibilité de connexion, au besoin, à une chaîne robotisée, tout en contribuant à l’amélioration de la fiabilité et la reproductibilité des résultats d’analyses.

2. automatisation de la phase pré analytique et post analytique :

1. La phase pré-analytique :

Les conditions pré-analytiques constituent un volet majeur d’assurance de la fiabilité et de la validité des résultats en hémostase. Elles constituent les sources les plus importantes des résultats erronés ou non interprétables. La maîtrise et les efforts de standardisation de ces conditions pré-analytiques sont

primordiaux pour assurer la qualité de l’exploration en hémostase, ainsi l’automatisation de la phase pré-analytique permet une réduction de la durée de cette phase qui est la plus consommatrice de temps de travail « technique » et permet d’accroître l’efficacité et la rentabilité du laboratoire. (40)

L’offre industrielle est multiple et évolutive. Il existe depuis quelques années des machines qui simplifient l'étape de pré-analyse en automatisant les étapes de centrifugation, de débouchage, d'aliquotage, de rebouchage, de triage… (41)

L’automatisation de la phase pré-analytique a pour objectifs : (40,42)

 Une optimisation de la régulation des flux de prélèvements arrivant aux postes d’analyse , en assurant un délai constant lors de l’étape pré-analytique, et permettant ainsi au laboratoire de s’engager sur une durée précise de traitement.

 Une vérification automatique de la conformité du prélèvement : volume, indices de la qualité du prélèvement (absence d’hémolyse, de lactescence et de bilirubine).

 Un débouchage automatique des tubes avec une amélioration des conditions d’hygiène et sécurité biologique.

 Un aliquotage sécurisé avec des portoirs spécifiques dédiés aux automates.

 Une diminution du risque d’erreurs ou de contaminations éventuelles du personnel ce qui n’est pas le moindre des avantages. (43,44)

 Une traçabilité parfaite des prélèvements, des « réanalyses» ou des tests réflexes.

2. La phase post-analytique :

La phase post-analytique concerne tous les évènements qui peuvent se produire après l’analyse, cette phase comporte : (45)

- La validation biologique : Commentaires, interprétation. - La transmission des résultats.

- La conservation des échantillons. - L’archivage.

L’automatisation de la phase post analytique permet : (46)

- D’automatiser l’archivage des tubes, leur récupération éventuelle (en cas de besoin : Notamment lorsqu’un praticien réclame (souvent en urgence) une analyse complémentaire) et leur élimination.

- De garantir la qualité des échantillons conservés grâce à la régulation thermique dans la zone de conservation.

- D’améliorer la sécurité du personnel.

3. Automatisation de la phase analytique :

A. Techniques de mesure des automates :

Les techniques utilisables pour détecter la formation du caillot sont :

 Les techniques coagulantes ou chronométriques mesurant un temps de formation de caillot.

 Les techniques enzymatiques ou chromogéniques utilisant un enzyme et un substrat avec libération d’un chromogène.

 Les techniques immunologiques utilisant une réaction antigène-anticorps.

1. La technique chronométrique :

La technique chronométrique consiste à mesurer la vitesse de formation du caillot de fibrine après ajout de réactif(s) déclenchant(s) approprié(s). (39) Pour cette technique, on a deux différents systèmes de détection de caillot, qui sont utilisés :

- Système de détection photo-optique, - Système de détection électromécanique.

a. Détection photo-optique :

Les systèmes optiques sont basés sur le fait que la formation de caillot provoque un changement dans la densité optique du plasma. Lors de la formation du caillot, les caractéristiques optiques du plasma/des réactifs mesurées initialement se modifient. Ces modifications sont monitorées et utilisées pour déterminer le temps nécessaire pour qu’un certain degré de changement se produise. (47)

Cette méthode de détection utilise deux propriétés photo-optiques : (37)  La turbidimétrie : mesure l’épaisseur d’un milieu trouble empêchant la vision nette d’un test optique placé derrière ce milieu. Il s’agit de l’absorbance.

Figure 4: Diffusion et transmission de la lumière dans une suspension : I0 : intensité incidente, I : Intensité. (61)

Le Coagulomètres à détection turbidimétrique, détectent lors de la formation de caillot un changement de densité optique (DO, transmittance) de plasma.

La lumière polychromatique est focalisée par un collimateur et filtrée pour transmettre une lumière d'une longueur d'onde spécifiée. La lumière monochromatique est transmise par la fibre optique et traverse la cuvette contenant l’échantillon. Quand la fibrine se forme, l’opacité augmente et l'intensité de la lumière atteignant le détecteur diminue.

Lorsque la densité optique atteint un certain niveau prédéterminé, le chronomètre s’arrête, indiquant la formation d'un caillot.

Les effets d’hyperlipidémie et l'ictère sont minimisés, parce que la Densité Optique (DO) de base est soustraite de la DO finale. (36)

 La néphélémétrie : mesure l’intensité de la lumière diffusée par la suspension. Il s’agit de la diffusion.

Le principe néphélométrique est utilisé par certains systèmes. Dans des tests de coagulation, une source de lumière laser monochromatique est transmise, par exemple, au moyen de fibres optiques. La lecture de la dispersion de la lumière est rendue possible par un capteur qui peut être installé à 90 ou à 180 degrés du trajet de la lumière, selon le système employé, qui mesure par la suite la lumière diffusée à un certain angle ou qui enregistre les changements de la transmission de la lumière. Lorsque la lumière atteint des complexes insolubles comme les fibres de fibrine, elle se disperse vers l’avant à des angles diffus (180 degrés) et à des angles diffus latéraux (90 degrés). Le chronomètre s’arrête lorsque la quantité de lumière diffuse ou de lumière transmise atteint un certain niveau prédéterminé. La différence entre la lumière diffuse ou transmise avant et après la formation du caillot est habituellement proportionnelle à la quantité de fibrine formée.(47)

Figure 6: Détection de caillot par la méthode néphélométrique.

A : un capteur installé à 180 degrés du trajet de la lumière, B : le capteur instalé à 90 degrés du trajet de la lumière. (36)