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Méthodes d’ionisation des molécules

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Academic year: 2022

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Texte intégral

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Envenimations 212

Introduction

L

a spectrométrie de masse est une technique qui permet de caractériser des molécules purifiées ou présentes en très faible quantité, de l’ord re du femtomole (soit 10- 1 5), au sein d’un mélange. Cette technologie nécessite que les biomolécules soient volatilisées et ionisées pour être analysées. Ces diff é- rentes opérations sont réalisées dans les spectro m è t res de masse.

Ces appareils sont constitués par une source d’ionisation, d’un ou plusieurs analyseurs de masse, d’un détecteur et d’un système de traitement de données.

La source d’ionisation est la partie du spectro m è t re où les molé- cules biologiques vont être ionisées et désorbées de leur sup- p o rt avant d’entrer dans l’analyseur de masse. Actuellement, il existe deux méthodes diff é rentes pour ioniser les biomolécules.

Méthodes d’ionisation des molécules

MALDI (matrix assisted laser desorption ionisation)

La molécule ou le mélange à étudier est mélangé à une matrice composée de petites molécules organiques aro m a-

tiques et acides. Ce mélange est déposé sur un support métallique et séché. L’échantillon se re t rouve donc à l’état solide, cristallin. Il est introduit dans la source d’ionisation du spectro m è t re de masse (sous un vide de 10- 7To rr). Un faisceau laser “pulse” sur l’échantillon, échauffant ainsi les molécules de la matrice. Quand l’énergie interne de ces der- n i è res est suffisante, elles désorbent de leur support en entraînant avec elles les biomolécules. Une réaction de désol- vatation consistant au transfert d’un proton d’une molé- cule de matrice vers la biomolécule a ensuite lieu. La biomolécule se re t rouve ainsi volatilisée et ionisée. Elle est prête à re n t rer dans l’analyseur de masse.

ESI (électrospray)

Avec ce mode d’ionisation, les molécules sont analysées en solution, dans un mélange éluant (méthanol/eau/acide for- mique 1 %). La solution est amenée dans la source d’ionisa- tion par l’interm é d i a i re d’un capillaire. Cette source se tro u v e à pression atmosphérique. Le spray sortant du capillaire tra- verse un rideau de gaz qui “dessèche” les gouttelettes et libère les biomolécules polychargées vers l’analyseur de masse.

N ouvelles techniques de spectrométrie de masse appliquées à l’étude des venins.

Summary:New mass spectrometry techniques applied to the study of venoms.

Mass spectrometry is a technique for the analysis and very sensitive identification of molecules. It allows one to determine the mass of the studied product, whether pure or in a mixture, and pro - vides some information on its molecular structure. In the particular case of peptides, this method can, under certain conditions, also provide information on the amino acid sequence. There are two complementary methods in mass spectrometry for the study of the biological molecules: i) ionisa - tion by laser desorption assisted by matrix (MALDI) coupled to a mass analyser of the time of flight type (TOF), which is very effective for the direct study of a mixture of products and ii) ionisation by electronebulisation (ESI) coupled to mass analysers of the quadripolar type and time of flight (Qq- TOF), which allows the interfacing between high phase liquid chromatography and mass spectro - metry. These two complementary techniques were already used to draw up toxin charts of snake and spider venoms. The purpose is to be able to characterise species based on an actual peptide print of poisonous gland secretions.

Résumé :

La spectrométrie de masse est une technique d’analyse et de détermination de structures extrême - ment sensible. Elle permet non seulement de déterminer la masse des produits étudiés, en mélange ou purifiés, mais également de donner des éléments de structure des molécules. Dans le cas parti - culier des peptides, cette méthodologie permet dans certaines conditions d’obtenir des éléments de la séquence en acides aminés. Il existe deux méthodologies complémentaires en spectrométrie de masse pour l’étude des molécules biologiques: l’ionisation par désorption laser assistée par matrice (MALDI) couplée à un analyseur de masse de type temps de vol (TOF), très efficace pour l’étude directe d’un mélange de produits, et l’ionisation par électronébulisation (ESI) couplée à des analy - seurs de masse de type quadripolaire et temps de vol (Qq-TOF), technique qui permet l’interfaçage entre la séparation chromatographique en phase liquide et le spectromètre de masse. Ces deux méthodes complémentaires ont été déjà utilisées pour dresser des cartes de toxines des venins de serpents et d’araignées. L’intérêt est de pouvoir caractériser des espèces grâce à une véritable empreinte peptidique des glandes à venins.

C. Auvin-Guette

Laboratoire de chimie des substances naturelles, ESA 8041 CNRS, 63 rue Buffon,75005 Paris, France (auvin@cimrs1.mnhn.fr)

spectrometry venom analyse

spectrométrie venin analyse

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Bull Soc Pathol Exot, 2002,95, 3, 212-213 213

Analyseurs de masse

Ce sont des appareils qui enre g i s t rent la masse des molécules ionisées présentes. Ils sont très précis et résolutifs.

Plusieurs analyseurs de masse peuvent être positionnés en série. On a affaire alors à des spectromètres de masse en tan- dem (MS/MS).

Dans ce type d’appareil, une molécule ionisée est sélectionnée dans le 1er analyseur de masse, cassée ensuite dans une chambre de collision et les ions fils (fragments) qui en résultent vont être analysés dans le 2eanalyseur de masse.

On obtient ainsi des informations de séquences sur les pep- tides, par exemple.

Application à l’étude de la biodiversité des toxines animales

L

a spectrométrie de masse se révèle être actuellement la technique analytique de choix pour l’étude de la biodi- versité des toxines animales.

À partir de venins bruts extraits des mygales de la famille des Téraphosidés, nous avons dressé des cartes toxiniques pour chaque espèce. Nous avons procédé selon la stratégie sui- vante :

- l’empreinte peptidique du venin brut est enregistrée grâce à une expérience effectuée sur un appareil de type Maldi-Tof ; - le venin brut est séparé sur colonne HPLC en phase inverse et chaque fraction est récupérée et analysée par Maldi-To f . Nous obtenons ainsi des cartes massiques très précises, per- mettant de caractériser une espèce.

Cette stratégie peut, bien sûr, être appliquée à l’étude des venins de serpents et de scorpions.

Cette technique ne permet pas seulement de donner une e m p reinte massique de l’espèce, elle donne également très rapi- dement un renseignement sur la nature des toxines présentes dans les venins. Les cartes nous renseignent sur les longueurs des toxines présentes et des expériences complémentaires peu- vent nous donner des informations sur la séquence de ces t o x i n e s .

Cette stratégie conduit tout naturellement à construire une banque de données de la biodiversité des toxines animales.

Références

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