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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Leyns, L. (1991). Patterns des organes sensoriels: Isolement et étude de gènes (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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^3- f'ii

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté des Sciences

Laboratoire de Génétique Professeur R.Thomas

Patterns des organes sensoriels;

Isolement et étude de gènes.

Thèse présentée en vue de l'obtention du grade légal de

Docteur en Sciences Zoologiques par

Luc Leyns

Directeur: C.Dambly-Chaudière Juin 1991

1. Introduction

J'al choisi d'étudier comment un pattern est-il généré de manière reproductible à partir d'un ensemble de cellules équivalentes ?

L'approche génétique qui consiste à chercher des phénotypes particuliers pour disséquer une opération développementale, a déjà permis de comprendre les lignes directrices de certaines étapes développementales comme la formation de la vulve du nématode C, elegans (ref) ou l'établissement de la segmentation de l'embryon de Drosophila melanogaster (revue par Akam).

La drosophile est par ailleurs un organisme pour l'étude duquel les outils génétiques sont très puissants: de plus, le temps de génération est court et on peut aisément manipuler un grand nombre d'individus.

Evidemment, la drosophile est une mouche et pas un homme.

Néanmoins, elle est évolutivement très proche de l'homme. Les deux espèces ont divergé seulement depuis x millions d'années alors que la première plante vascularisée serait apparue il y a Y millions d'années, la première cellule eucaryote, Z millions, le premier être vivant, W milliards d'années. La terre, quant à elle, se serait formée il y a 4,6 milliards

d'années et l'univers depuis une quinzaine de milliards d'années.

Outre cette parenté évolutive, la drosophile présente un autre avantage sur les espèces plus proches de l'homme; elle ne crie pas (de manière audible par nous) et n'a pas "l'air" de souffrir lors des diverses

manipulations, ce qui contribue à apaiser les tourments psychologiques liés à l'utilisation d'animaux de laboratoire.

Tous ces arguments, ajoutés au fait qu'il existe une unité de

recherche en génétique du développement à l'ULB, m'ont convaincu de

travailler sur la drosophile pour étudier le problème de la formation des patterns.

Plus particulièrement, j'ai choisi d'étudier les patterns des organes sensoriels du thorax qui ont l'avantage d'être visibles sur des individus vivants.

Toutefois, avant de détailler ces patterns, je vais vous décrire brièvement

le développement de la drosophile.

1.1. Développement de la drosophile.

La drosophile est un insecte holométabole, elle vit donc deux "vies"

actives, l'une larvaire et l'autre adulte et a deux phases développementales principales, l'embryogenèse et la métamorphose.

1.1.1. L'embrvogenèse.

De la féçondation à l'éclosion, se passent 24 h (à 25°C) durant lesquelles une larve se forme; la figure IA schématise différentes phases de

l'embryogenèse. Les gènes qui interviennent dans ces phases font l'objet de nombreuses études, ce qui permet d'avoir maintenant une idée globale des hiérarchies et interactions génétiques qui interviennent dans

certaines étapes du développement embryonnaire (détermination de sexe, formation des segments, établissement de l'identité segmentaire,.,.).

Cela permet d'avoir une représentation mentale des opérations effectuées lors de ces processus développementaux.

Pendant la phase embryonnaire, quelques groupes d'une dizaine de cellules épithéliales s'invaginent et forment les disques imaginaux et les histoblastes. Ces cellules sont les précurseurs de structures adultes qui se différencieront à la métamorphose.

1.1.2. La larve.

La larve est un organisme qui ne se reproduit pas et qui possède un

système nerveux périphérique spécifique. Durant la phase larvaire, les

cellules larvaires ne se divisent plus quoique leur ADN continue à se

répliquer: seules les cellules des disques imaginaux et les histoblastes

(***CNS ?) continuent à se multiplier. Après deux mues (environ 4 jours

après l'éclosion), la larve s'immobilise et forme le puparium, elle entame sa métamorphose.

1.1.3. La métamorphose.

Lors de la métamorphose, les cellules larvaires lysent tandis que les cellules précurseurs de l’adulte, se divisent et se différencient pour former un adulte après 4 à 5 jours de métamorphose.

Les histoblastes sont regroupés en quelques amas dans chaque segment abdominal de la larve et ils vont former l'épiderme de l'abdomen adulte.

Les disques imaginaux sont, quant à eux, constitués d'un épithélium pseudo-stratifié reployé en forme de sac. Durant la période larvaire, ces disques vont grandir et lors de la métamorphose, s'évaginer pour former des structures adultes (fig. IC), Ces disques imaginaux sont au nombre de

19 et formeront l'épiderme, le système nerveux périphérique et les

muscles de la tête, du thorax, des pattes ainsi que des pièces génitales (cf fig. ID). Chaque disque forme une moitié (gauche ou droite) de la

structure sauf le disque génital qui donnera la totalité des pièces sexuelles (P.Bryant dans Ashburner).

Le CNS ne subit pas de métamorphose complète mais il est fortement remanié. ***

A la fin de la métamorphose, sort un adulte (fig. lE) dont l'épiderme porte des organes sensoriels de divers types.

1.2. Introduction générale au système nerveux périphérique.

Tant la larve que l'adulte de drosophile ont des organes sensoriels

externes et internes qui sont disposés en une grande variété de patterns,

constituant ainsi le système nerveux périphérique.

Je vais détailler la structure, la fonction ainsi que les patterns de ceux de ces organes que J'ai étudiés dans mon travail.

Je me suis particulièrement intéressé au mécanisme de formation des patterns des organes sensoriels externe du notum et de l'aile qui proviennent du disque imaginai d'aile-thorax.

1.2.1. Description des organes sensoriels de l'aile et du thorax.

Les soies et les sensilles trichoïdes du notum (la partie dorsale du thorax) ainsi que la plupart des soies de la marge de l'aile sont des organes

mécanorécepteurs (fig. IF).

Les sensilles campaniformes sont également des organes sensoriels mécanorécepteurs dont la structure cuticulaire est en forme de dôme;

ces organes sont localisés sur la surface de l'aile.

Chaque organe sensoriel externe mécanorécepteur est composé de quatre cellules, une cellule formant la structure externe (trichogène), une cellule (tormogène) supportant cette structure, un neurone et une cellule

enveloppant celui-ci.

Chaque neurone envoie son axone dans le système nerveux central où il établira des connections spécifiques de l'organe et de sa position.

Outre ces organes mécanorécepteurs, il existe des soies

chémoréceptrices semblables aux soies mécanoréceptrices mais qui sont innervées par cinq neurones.

D'autres parties de corps de l'adulte ainsi que la larve porte, en plus de

certains de ces organes, d'autres organes externes (les organes de Keilin,

les kôlbchens,...) ainsi que des organes sensoriels internes comme les

récepteurs d'étirement (les chordotonaux) ou des organes, probablement

propriocepteur, innervés par un neurone multidendritique (organes MD)

(ref + CDC et AG, 1986).

1.2.2. Disposition des organes sensoriels.

Les patterns* des organes sensoriels qui sont principalement étudiés dans ce travail sont les patterns de soies et de sensilles campaniformes du notum et de l'aile.

* Note en bas de page: Un pattern est la disposition d'éléments particuliers au sein d'un ensemble. £££voir Pattern Formation £££

Dorsalement, chaque hémithorax porte 11 grandes soies, appelées aussi macrochaetes. Ces soies sont disposées en des emplacements spécifiques et chacune d'elles porte un nom (fig. IG, gros points sur le notum).

De chaque côté de la macrochaete aPA, il y a deux très petites soies, des sensilles trichoïdes (fig IG, petites croix).

Outre le pattern hautement reproductible de macrochaetes, il y a une centaine de petites soies (microchaetes) sur chaque hémi-notum (fig. IG, petits points sur le notum) dont la disposition est variable mais dont l'écartement semble relativement constant.

Quant aux sensilles campaniformes de l'aile, certaines sont en des

positions fixes et d'autres sont groupées en des positions précises, alors que leur nombre et écartement varient au sein du groupe (fig. IG).

De cette description, on peut en déduire qu'il existe probablement plusieurs types de patterns. Un type où la position de chaque organe est bien définie (ex. macrochaete): un autre type où c'est la position d'un groupe qui est très précisément définie. Et un troisième type, où

l'espacement entre les organes est constant mais tant le nombre que la

position au sein d’un groupe sont variables (ex.microchaetes).

Les patterns des soies et des sensilles campaniformes ont été choisis comme modèle non seulement parce qu'ils sont de plusieurs

types, mais aussi parce que ces organes sensoriels se développent à partir d'un même disque imaginai, le disque d'aile-thorax et que, dans le cas des soies, leurs patterns sont visibles sur des adultes vivants et donc

susceptible d'être croisés après observation.

1.3. Analyse morphogénétique de ces organes sensoriels.

Les organes sensoriels externes mécanorécepteurs sont formés de 4 cellules issues après deux cycles de divisions (appelées divisions

différenciatrices) d'une même cellule (fig. IH); cette cellule initiale a été nommée précurseur.

Des études morphologiques ont montré que la différenciation cellulaire des macrochaetes n'est visible qu'à partir de 15 heures après la formation du puparium (Poodry dans Ashbumer).

Toutefois, P. Bryant a montré que certains des précurseurs de

macrochaetes étaient déjà déterminés (cf Encadré 12) dans le disque du troisième stade larvaire tardif en réalisant, par différenciation in vitro de morceaux de disques, une carte des tissus présomptif (fig 11).

La détermination des organes a donc lieu plusieurs heures avant leur différenciation morphologique ce qui permet d'analyser au cours du temps, la phase de détermination.

Encadré 12 : Notion de détermination et de compétence.

Cet encadré est rendu nécessaire à cause de la diversité des sens attribués à ces mots, aussi, je souhaite préciser le sens dans lequel j'ai utilisé les mots:

détermination et compétence.

L’état déterminé d'une cellule est caractérisé par le fait qu'un choix a été effectué et que seul ce choix se réalisera lors du développement normal. La détermination n'est qu'une forme précoce de différenciation: cette phase de

détermination dure, dans notre système, suffisamment longtemps que pour pouvoir être étudiée.

La compétence a quasi le même sens que détermination si ce n'est que toutes les cellules compétentes ne deviennent pas pour autant déterminées. C'est donc une forme réversible de détermination.

A la même époque, A. Garcia-Bellido a étudié l'origine des organes

sensoriels ainsi que la croissance du disque d'aile-thorax au moyen d'un puissant outil, l'analyse clonale. Cette technique consiste à marquer génétiquement une cellule du disque et à observer dans l'adulte la distribution de tous ses descendants (Encadré 13).

Encadré 13 : Analyse clonale

Afin de marquer génétiquement une cellule, on provoque une recombinaison somatique par irradiation aux R.X. Occasionnellement, une cellule, après réplication de l'ADN, subit un échange entre chromatides homologues.

Les cellules filles sont alors parfaitement homozygotes pour le fragment chromosomique distal au point de recombinaison.

Pour autant que cette partie distale porte des mutations visibles, les descendants

de une ou des deux cellules filles seront marqués.____________________________

*** Dessin ***

Grâce à ce type d'analyse, on peut notamment étudier la vitesse de division, les axes de divisions, le moment d'apparition de précurseur, le nombre de cellules initiales du disque,... tant dans le type sauvage que dans des mutants.

Sans entrer dans le détail des résultats de Garcîa-Bellido et des

discussions qu'ils suscitent, une conclusion marquante est que les soies thoraciques ne sont pas originaires d'un seul précurseur commun à tous les organes. En effet, chaque précurseur d'un organes sensoriel apparaît au sein d'une population de cellules qui deviendront épidermiques. Cette détermination du précurseur par rapport à ses voisins, se fait, pour la majorité des macrochaetes, lors du Sième stade larvaire.

Dans des systèmes similaires (Calliphora et la sauterelle), des expériences d'ablation au laser de précurseurs de neuroblastes ont montré que des cellules voisines pouvaient prendre le relais et devenir organes sensoriels (Doe Goodman, Bâte). Ce résultat suggère que plusieurs cellules sont équivalentes mais qu'une seule deviendra organe sensoriel.

1.4. Formation des organes sensoriels: analyse génétique.

Il existe beaucoup de mutations (Encadré 14) affectant les soies, certaines en changent la couleur, la forme, d'autres provoquent des

duplications occasionnelles,... Toutefois, dès les années trente, un gène a attiré l'attention des chercheurs, le gène scute (sc). Des mutations dans ce gène, localisé sur le chromosome X, sont responsables de la disparition de macrochaetes: chaque mutation affecte quelques macrochaetes

spécifiques alors qu'une délétion du gène les ôte quasi toutes. Les

quelques macrochaetes restantes ainsi que les microchaetes sont supprimées par une délétion d'un gène voisin, le gène achaete (ac).

Ces deux gènes font partie du locus complexe achaete-scute (C-AS) et définissent deux sous-ensembles quasi complémentaires de soies.

Encadré 14 : Conventions génétiques utilisées.

Le nom des gènes ainsi que des mutations est systématiquement écrit en italique.

Lorsque les mutations isolées dans ce gène sont récessives, son nom commence par une lettre en minuscule, au contraire si les mutations sont dominantes, le nom commencera par une majuscule (sauf dans quelques cas précisés dans le texte).

D'une manière générale, je décrirai le phénotype homozygote quand il s'agit de mutations récessives et du^phénotype hétérozygote pour des mutations

dominantes (sauf indications dans le texte).

De plus, j’emploie couramment l'expression synthétique "phénotype homozygote"

à la place de "phénotype d'individus possédant la mutation à l'état homozygote".

Pour décrire un génotype, j'utiliserai le type de notations: A7+ ; B7B- qui signifie que l'individu est hétérozygote pour une mutation du gène A et est

homozygote pour une mutation dans le gène B localisé sur un autre chromosome.

1.4.1. Le complexe achaete-scute.

A. Garcîa-Bellido a mis en exergue certaines observations qui

suggèrent que le complexe achaete-scute joue un rôle clé dans une étape précoce de la formation des organes sensoriels: l'étape de détermination.

Les mutations de perte de fonction de scute ou d'achaete sont

responsables de la disparition de soies alors que des mutations

dominantes par gain de fonction de ces gènes, mutations appelées Hairy- wing, provoquent l'apparition de soies supplémentaires, tant en des

régions où il y a déjà des soies que dans des régions qui en sont normalement dépourvues.

Cela suggère que ces gènes sont des gènes décisifs dans le processus de formation du pattern d'organe sensoriel. A.Garcia-Bellido a mené une analyse génétique et développementale très poussée du rôle du complexe chez l'adulte. Cette analyse a été complétée par l'étude du rôle du C-AS dans la formation des organes sensoriels larvaires et par une analyse moléculaire des gènes et mutations. De cela, il ressort qu'il existe au sein du C-AS, 4 gènes homologues entre eux, impliqués dans la neurogenèse et dont les phénotypes sont brièvement décrits dans l'encadré 15.

Encadré 15 : Les gènes du complexe achaete-scute.

• achaete : ac est nécessaire à la formation de toutes les microchaetes et de quelques macrochaetes du thorax ainsi qu'à celle d'autres organes sensoriels de l'adulte. De plus, il est indispensable au développement de nombreux organes sensoriels larvaires.

•

scute : SC est crucial pour la formation de la plupart des macrochaetes thoraciques ainsi que d'autres organes adultes mais il semble ne jouer aucun rôle dans

l'établissement du pattern sensoriel larvaire.

En outre, scute (alias, sisterless-b) intervient dans la détermination du sexe de la drosophile en participant au calcul du rapport entre le nombre de chromosomes X et le nombre de "groupes de chromosomes autosomiques".

•

léthal of scute : l'sc ne semble pas avoir de rôle dans l'établissement du pattern

des organes sensoriels, mais seulement dans la formation du système nerveux

central larvaire et probablement adulte. La délétion de ce gène provoque une forte réduction du nombre de neuroblastes dans l'embryon.

• asense joue un rôle très important dans l'apparition des organes sensoriels externes de l'embryon. Il est également nécessaire à l'apparition de quelques organes sensoriels adultes.

Je vais me concentrer sur le gène scute et sur son rôle dans la formation du pattern des macrochaetes.

Campuzano et al. ont mis en évidence une particularité des mutations de scute-, en effet, la localisation par rapport à l'unité de transcription des points de rupture affectant scute est corrélée à l'importance du

phénotype: il est donc possible d'établir une sériation phénotypique (AGB 79 et Gampuzano et al.,1985). Plus le point de rupture est proche de l'unité de transcription de scute, plus il y a de soies qui disparaissent. Ce qui est particulièrement important, c'est que les macrochaetes qui sont affectées, disparaissent systématiquement mais aucune autre. Plus le point de rupture est proche de l'unité de transcription de scute, plus le nombre de soies qui sont affectées est grand (cf fig. IJ).

Cette corrélation entre l'éloignement du point de rupture et l'importance du phénotype a suggéré à M.Ruiz-Gômez et J.Modolell une hypothèse quant à la régulation de scute et à la formation du pattern (ref).

Ils proposent que scute est régulé par différentes régions d'ADN qui sont activées, ou non, en fonction de la position de la cellule dans le disque.

Les sites de régulation seraient activés par une combinaison de facteurs distribué régionalement; ces facteurs serviraient d'information

positionnelle aux cellules. Le site activé se comporterait alors comme

"enhancer" pour scute, il enclencherait l'expression de scute. Cette

hypothèse permet d'expliquer la corrélation entre l'éloignement du point

1 3

de rupture et l’importance du phénotype. En effet, les points de rupture déconnecteraient certains des sites de l'unité de transcription, ce qui empêcherait l'activation de scute dans certaines régions du disque et donc l'apparition de macrochaetes. Chaque macrochaete dépendrait donc d'un site de régulation. La majorité des sites de régulation sont situés en aval de l'unité de transcription de scute, sur une distance d'une

cinquantaine de kilobases. La figure IK schématise cette h 3 rpothèse.

Un argument important en faveur de cette hypothèse est que la seule délétion interne dans la région non codante du complexe, sc^, ôte les soies du groupe G mais pas celles du groupe H, plus distant de l'unité de transcription: cette mutation n'entre donc pas dans la sériation

phénotypique et suggère que les sites de régulation G sont absents sans que cela n’affecte les autres sites car la continuité de l'ADN est maintenue entre-la région codante et les sites H. „ ^

Afin de tester cette hypothèse. Romani et al. ont étudié la

distribution des transcript de scute et d'achaete dans le disque d'aile- thorax à la fin du 3^^™® stade larvaire. Ils ont montré que les patterns d'expression des deux gènes sont quasi identiques mais surtout qu'ils sont exprimés dans des groupes de cellules qui sont localisés dans le disque aux endroits où va apparaître plus tard l'organe sensoriel.

Selon l'endroit, un ou quelques organes sensoriels sont déterminés au sein de chaque groupe d'expression. Ils ont également montré que pour un point de rupture ayant un phénotype scute fort, les groupes

d'expression correspondant aux soies absentes ont complètement

disparu. De plus, la délétion sc^ qui affecte les soies du groupe G, retire

seulement le groupe d'expression correspondant. Ces résultats appuient

l'hypothèse d'une régulation de scute par des sites spécifiques de position

(fig. IL).

En plus des résultats génétiques et moléculaires qui indiquent que les gènes du complexe achaete-scute jouent un rôle crucial dans la

formation du système nerveux périphérique de drosophile, il a été trouvé dans le rat, deux gènes fortement homologues à ceux du complexe

achaete-scute (MASH: Mammalian Achaete-Scute Homologues). Deux domaines sont conservés à environ 80% entre les gènes MASH et les gènes du C-AS (les motifs HLH ainsi que les domaines de fixation à

l'ADN); entre les domaines des deux gènes MASH, cette conservation est d’environ 95%. Ces gènes MASH semblent exprimés transitoirement dans certaines parties du système nerveux embryonnaire de mammifères et notamment dans des précurseurs du système nerveux périphérique (Johnson et al., 1990).

Cette conservation évolutive suggère que les gènes du complexe achaete- scute ont une fonction extrêmement importante dans le développement du système nerveux.

1.4.2. dauahterless. hairu et les autres.

D’autres gènes que ceux du complexe achaete-scute interviennent dans la formation du pattern des organes sensoriel . Bien qu’ils soient moins bien connus, je vais en présenter deux qui agissent avec les gènes du C-AS et qui sont utilisés dans ce travail.

dauahterless:

A. Ghysen, C. Dambly-Chaudière, Y.N Jan et L.Y.Jan ont criblé une panoplie de déficiences et ont sélectionné celles qui, à l’état homozygote,

provoque une altération du système nerveux périphérique dans les

embryons. L’ensemble des déficiences analysées couvre environ le tiers du génome de drosophile. Parmi ces déficiences, quelques unes (+/- 15%

des déficiences) affectent le système nerveux périphérique et, en

particulier, la Df(2L)J27 est responsable de l'absence de tous les organes sensoriels.

Par l'analyse génétique de cette déficience, ils ont montré que c'est le gène daughterless (da) qui est nécessaire à la formation de tous les

organes sensoriels. Les embryons homozygotes pour da sont dépourvu de tous leurs organes sensoriels et des clones de cellules mutantes pour da sur le thorax de l'adulte suppriment également les soies. Des analyses ont montré que la détermination des organes sensoriels n'a pas lieu dans ces individus (cf.§1.5.).

Auparavant, le gène da était seulement connu pour son effet sur un autre système développemental: la détermination du sexe. En effet, les femelles homozygote pour l'allèle da^ ne produisent pas de filles; ceci est dû à un effet maternel sur la détermination du sexe.

11 apparaît que da est important, non seulement précocement dans la détermination du sexe mais aussi plus tardivement, dans la détermination des organes sensoriels, tant dans l'adulte que dans l'embryon. La première fonction dépend d'un effet maternel (c.-à-d. que les gonades de la mère doivent être da^, quelque soit le génot 5 q)e de l'embryon) tandis que l’autre fonction est zygotique (c.-à-d. qu'il faut au moins une copie normale de da dans le zygote pour obtenir un phénotype sauvage).

daughterless est donc utilisé dans au moins deux opérations

développementales complètement différentes.

Comme son nom le suggère, des mutations de ce gène provoquent l'apparition de soies supplémentaires chez l'adulte. Des microchaetes additionnelles apparaissent sur tout le notum et sur l'aile. 11 semble que ces soies additionnelles soient déterminées plus tardivement que les microchaetes normales. En outre, hairy est épistatique sur achaete (le double mutant ac”, hr a un phénotype achaete); hairy régulerait donc négativement achaete.

D'autre part, on a montré que l'absence de hairy altère la segmentation embryonnaire, hairy fait partie du groupe de gènes "segment polarity" qui est responsable de la périodicité segmentaire de l'embryon.

De même que daughterless, ce gène est utilisé dans au moins deux étapes développementales différentes.

D'autres gènes interviennent également dans la formation du pattern sensoriel, mais sont mal connus, aussi je les citerai brièvement dans le texte.

1.5. La visualisation des précurseurs.

Jusqu'en 1989, toutes les analyses des mutations étaient basées sur l'observation du pattern des organes sensoriels, c.-à-d. sur le résultat final de l'opération développementale de formation du pattern. 11 était donc très difficile de décider à quel niveau intervenait le gène étudié

(détermination, divisions cellulaires, différenciation,...).

Une nouvelle technique autorise, aujourd'hui, l'étude précoce de la détermination grâce à la visualisation des précurseurs.

En effet, la méthode "enhancer trap" permet d'obtenir des lignées

transgéniques de drosophile qui expriment le gène bactérien lacZ

spécifiquement dans les précurseurs d’organes sensoriels et dans leurs descendants.

Le principe de cette méthode est de provoquer l'insertion dans le génome d'une construction contenant le gène bactérien lacZ contrôlé par un promoteur faible qui, seul, ne permet pas l'expression du gène lacZ.

Cette construction est placée entre les extrémités d'un élément

transposable P afin de permettre l'insertion aléatoire, dans le génome, de toute la construction.

Si l'insertion de cet élément se fait à proximité d'un "enhancer", celui-ci peut, quand il est actif, enclencher l'expression de lacZ qui s'exprimera éventuellement comme le gène endogène.

L'observation du pattern d'expression de lacZ dans des milliers de

lignées, a permis d’isoler quelques lignées transformantes qui expriment spécifiquement lacZ dans les précurseurs d'organes sensoriels et dans leurs descendants.

Grâce à une coloration spécifique ou à un immunomarquage, le pattern d'expression de lacZ peut être visualisé. La figure IZ présente un schéma de la séquence d'apparition des précurseurs de macrochaetes et sensilles trichoïdes dans le disque d’aile-thorax.

Une telle lignée, combinée avec une mutation permet de déterminer si la mutation affecte l'apparition des précurseurs des organes sensoriels ou si l'effet est postérieur. La combinaison des mutants achaete et scute ainsi que daughterless avec une lignée "enhancer trap " montre que ces gènes affectent l'apparition des précurseurs. Ces gènes sont appelés gènes

proneuraux à cause de leur rôle précoce dans la formation du pattern des organes sensoriels.

Ces résultats, ainsi que d'autres, ont incité A. Ghysen et C. Dambly-

Chaudière, a émettre une hypothèse globale sur l'établissement du pattern

1 8

des organes sensoriels. Cette h 5 ^othèse, présentée dans Trends in Genetics, est résumée dans le chapitre suivant.

Cette hypothèse servira de guide tout au long des résultats et discussions dans ce travail.

1.6. Survol de l'hypothèse

Selon cette hypothèse le processus de formation du pattern

sensoriel est progressif et peut être décomposé en quelques étapes clés.

Toutes ces étapes sont présentées successivement, néanmoins certaines d'entre elles peuvent se chevaucher dans le temps. De plus, cette

h 3 q)othèse schématise le processus d'apparition d'un organe sensoriel, isolé en un endroit précis, au sein d'un ensemble de cellules, La formation des patterns sensoriels se ferait de manière similaire pour les patterns larvaires et adultes; l'h 5 q)othèse se base tant sur des résultats obtenus dans l'embryon que dans les disques imaginaux.

Selon cette hjrpothèse, il existe, au sein d'un tissu de cellules équipotentes, un prépattern (fig. IMa), c'est-à-dire, une combinaison d'une série de zones d'expression de gènes qui constituent une source d'information positionnelle qui est interprétée par chaque cellule.

La combinaison de certaines de ces informations enclenchent

l'expression de gènes proneuraux (ex: achaete, scuté) dans un petit groupe de cellules du tissu (fig. 1Mb).

Au sein de ce groupe proneural, toutes les cellules sont équivalentes et sont compétentes à devenir organe sensoriel: cependant, parmi elles, une cellule va se singulariser et devenir précurseur d'un organe sensoriel (fig.

IMc).

Simultanément ou subséquemment à cette détermination, le précurseur empêche, par un procédé d'inhibition latérale, ses voisins du groupe proneural de devenir également précurseur (fig. IMd).

Ensuite, le précurseur se divise selon le lignage spécifique du t}q)e

d'organe sensoriel. Par exemple, dans le cas des soies mécanoréceptrices, le précurseur réalise deux cycles de divisions différenciatrices (flg. IMe).

Les quatre cellules se différencient morphologiquement et forment ainsi l'organe complet composé de la soie (le trichogène), de la cellule support (tormogène), du neurone et de la cellule enveloppe du neurone (fig. IMf).

Après cette brève esquisse, je vais reprendre chacune des étapes et la détailler quelque peu.

1.6.1. Le prépattem:

Ce prépattern n'est en fait qu'un pattern particulier qui est utilisé pour en générer un autre: il constitue l'information positionnelle dans le tissu. Les produits d'une série de gènes s'exprimant dans des régions spécifiques du tissu, constituent la base du prépattern. Ces produits agissent de manière combinatoire comme répresseur et/ou activateur, notamment de gènes proneuraux.

Ces gènes de prépattem servent probablement aussi à d'autres opérations comme le pattern de division, la morphogenèse, la régénération, ... et peuvent dériver de ces opérations. La manière dont s'établit l'expression de ces gènes est elle-même une autre opération.

Dans l'embryon, un prépattem a été bien étudié, celui qui mène à

l'établissement de la segmentation. Ces gènes, dits de segmentation, sont

exprimés en une série de bandes chevauchantes qui sont utilisées pour

établir la segmentation de l'embryon et probablement le pattern des

organes sensoriels. L'absence d'un de ces gènes provoque la disparition

d'une partie (une "tranche") de chaque segment embryonnaire et souvent, la partie restante du segment est dupliquée en miroir.

Certains de ces gènes ainsi que quelques autres sont connus pour s'exprimer dans des régions particulières des disques imaginaux, ils pourraient intervenir dans l'établissement du prépattem utilisé pour la formation des patterns adultes des organes sensoriels. Toutefois, il n'a été montré pour aucun de ces gènes qu'ils interviennent spécifiquement dans le processus d'établissement du pattern sensoriel adulte.

L'h 5 q)othèse suggère qu'une situation semblable à celle de l'embryon existe dans les disques imaginaux et qu'une combinaison de facteurs

régionaux activerait l'expression de gènes proneuraux.

.—^--- 1.6.2. L'étape proneurale:

Suite à cette activation, un ou quelques uns des gènes proneuraux sont exprimés dans un groupe de cellules au sein duquel va apparaître le précurseur de l'organe. Toutes les cellules de ce groupe proneural sont équivalentes dans leur potentialité à devenir précurseurs d'organes

sensoriels. Les gènes achaete, scute et asense du complexe achaete-scute jouent un rôle clé dans cette étape.

De plus, il existe très probablement d'autres gènes ayant une fonction analogue pour les autres types d'organes qui ne sont pas affectés par les gènes du complexe achaete-scute.

11 existe aussi trois gènes [daughterless, hairy, extramacrochaete) qui agissent probablement conjointement avec ceux du C-AS dans l'étape proneurale.

Les protéines codées par ces gènes portent un motif commun (X à Y % d'homologie), le motif HLH (Hélix-Loop-Helix). Ce motif est

caractéristique d'un domaine de la protéine, reployé en: hélice - boucle -

hélice, qui est impliqué dans la formation de dimères: il existe une grande famille de ces gènes tant dans le drosophile que chez les

vertébrés [myoDl,. . . )******. De plus, les gènes du complexe achaete- scute et daughterless codent pour un domaine de liaison à l'ADN.

Il existe donc dans les cellules du groupe proneural, une série de

protéines à motif HLH qui peuvent former entre elles des hétéro- et des homo-dimères qui seront, ou non, actifs, c.-à-d. capable de se lier à l'ADN et d'enclencher d'autres gènes.

De plus, bien que contenant un domaine HLH, la protéine

extramacrochaete ne porte pas de domaine de fixation à l'ADN et la

protéine hairy aurait un domaine de liaison à l'ADN non fonctionnel: elles peuvent donc réguler la formation de dimère actif.

Ces différentes combinaisons permettent de définir les groupes de cellules exprimant des gènes proneuraux (groupes proneuraux) en

fonction de l'information positionnelle fournie par le prépattern.

1.6.3. La détermination d'un précurseur.

Au sein d'un groupe proneural, toutes les cellules sont équivalentes et pourraient devenir précurseur d'organe sensoriel. Toutefois, seulement l'une d'elles va le devenir et c'est probablement toujours la "même" cellule qui devient précurseur, vu que le précurseur apparaît toujours au même endroit au sein d'un groupe proneural et que la soie résultante occupe toujours la même place sur le thorax.

Pour ce faire, il existe donc un mécanisme qui assure le choix, choix qui sera figé lors de l'étape d'inhibition latérale.

L'idée que le précurseur apparaissait au sein d'un groupe de cellules

a été émise par A. Ghysen et J. Richelle. Ils ont proposé un modèle basé

sur une distribution pyramidale de probabilités qu'a une cellule du groupe d'enclencher un gène dont le produit est diffusible. Par une série de

simulations, ils ont montré que ce produit serait toujours plus concentré au milieu du groupe de cellules et, qu'au dessus d'un certain seuil, il provoquerait la détermination du précurseur.

1.6.4. Inhibition latérale:

Le précurseur, ainsi déterminé, va empêcher les cellules voisines dans le groupe proneural de faire le même choix. Cette étape d'inhibition latérale peut être simultanée à l'étape de choix d'un seul précurseur.

Plusieurs gènes interviennent dans ce processus d'émission/réception du signal et il a été montré que l'altération de chacun de ces gènes donne le même phénotype, à savoir l'apparition d'un groupe de précurseurs

(A.Gorielly et al; Posakony et al) ce qui mène une h)q)ertrophie du système nerveux (toutes les cellules du groupe proneural seraient déterminées en organe sensoriel).

Ces gènes sont appelés génériquement neurogènes et interviennent dans plusieurs étapes développementales impliquant un choix, au sein d'un groupe, entre plusieurs devenirs.

1.6.5. Choix du type d'organe sensoriel et lignage.

Les gènes de cette étape définissent le type d'organe que deviendra le précurseur (x t 5 q)es différents ont été identifiés).

Cette étape de choix s'effectue probablement précocement dans le

processus de formation du pattern et peut-être même en plusieurs

phases. Le type de gènes proneuraux qui s'exprime dans le groupe

proneural limite déjà le type d'organe (ex: les groupes dépendants du C- AS produisent soit des organes sensoriels externes soit des organes larvaires multidendritiques); ensuite d'autres gènes spécifient plus

précisément le tjqje de l'organe et sont exprimés dans le précurseur dès sa détermination.

Les mutations des gènes eut et poxn provoquent, dans l'embryon comme dans l'adulte***, la transformation d'un type d'organe en un autre (ex, dans poxn-, les organes chémorécepteurs sont transformés en

mécanorécepteurs***) tandis que leur surexpression provoque la

transformation inverse; ce qui suggère que ces gènes sont décisifs lors du choix du type d'organe sensoriel. D'autres gènes du même genre existent probablement pour spécifier les autres types d'organes.

Selon le type d'organe choisi, le précurseur se divise de manière spécifique et les cellules filles sont déterminées selon ce t 3 q)e; cette phase constitue le lignage du précurseur.

Chaque précurseur de macrochaete se divise à un moment défini et selon une orientation précise, dépendant, probablement, de la position du précurseur.

D'une manière générale, chaque précurseur réalise plusieurs cycles (deux pour les organes mécanorécepteurs) de divisions dites différenciatrices qui produisent les cellules filles (quatre pour les organes

mécanorécepteurs).

Un processus particulier de détermination fixe le devenir de chacune des cellules filles, tant lors du premier cycle de division différenciatrice que lors du deuxième cycle. Dans le cas des organes externes

mécanorécepteur, les quatre cellules filles seront déterminées à devenir

trichogène (soie), tormogène (soquet), neurone et cellule enveloppant le

neurone.

On connaît quatre gènes qui interviennent dans le lignage (Notch, oversensitive, numb, Hairless) en modifiant le devenir de cellules filles résultant de la première et/ou de la deuxième division différenciatrice (cf fig. 10).

1.6.6. Différenciation.

Chaque cellule fille va se différencier morphologiquement selon sa détermination qui résulte des choix que la cellule et ses ancêtres ont effectués.

Le signe le plus précoce de différenciation d'un organe est l'expression du gène lacZ, dans certaines lignées "enhancer trap", dans les précurseurs des organes sensoriels (fig. IP) peu après leur détermination.

Toutefois, la différenciation morphologique a lieu après les divisions différenciatives à partir 15 h après la formation du puparium pour les soies thoraciques. Ensuite, le neurone envoie son axone dans le système nerveux central, les processus externes se forment et les cellules

s'interpénétrent. Les organes sont complètement formés environ à 42 h après la formation du puparium (Poodry dans Ashbumer).

Il en résulte alors ce pattern (fig. IQ) auquel j'ai consacré une partie de ma vie.

1.6.7. Conclusion.

L’hypothèse que Je viens de présenter servira de ligne directrice

dans la conception des expériences, l'interprétation des résultats et leur

discussion dans la suite de cette thèse.

1.7. Introduction particulière au sujet.

La disposition des organes sensoriels sur l'épiderme dépend directement du pattern d'expression des gènes proneuraux dans des groupes de quelques cellules. Ce pattern d'expression préfigure le pattern des organes sensoriels, aussi je me suis focalisé sur la génération de ce pattern proneural.

Une manière d'approcher ce problème est d'étudier le contrôle spatial de l'expression des gènes achaete et scute.

Dans l'embryon, une série de gènes sont exprimés en bandes chevauchantes au sein de chaque segment. Ces gènes, dits de

segmentation, sont indispensables à la formation des segments

embryonnaires: si l'un d'eux est altéré, une partie du segment est absente et souvent, la partie restante est dupliquée en miroir. Dans de nombreux cas, la partie manquante dans chaque segment est différente (c.-à-d.

décalée, plus grande,,.,) du domaine d'expression du gène affecté. Cela démontre une certaine non-autonomie de ce gène.

11 a été montré que les gènes de segmentation utilisent comme prépattem, des protéines distribuées spécifiquement dans de large régions de l'embryon.

En plus de ce prépattern, les gènes de segmentation interagissent entre eux afin de raffiner progressivement leur domaine d'expression. Ils

finissent par être exprimés en bandes répétées avec une périodicité segmentaire et d'une largeur d'environ 1/Xième de cette périodicité’^’^’^

(schéma à la figure IIA). La formation des patterns d'expression de ces

gènes de segmentation dépend donc, au moins en partie, de leurs

interactions entre eux. A.Garcia-Bellido a proposé qu'un ensemble de

gènes interagissant pour réaliser une opération développementale, soit

appelé syntagme.

Certains des gènes de segmentation semblent impliqués dans la régulation, directe ou indirecte, des gènes du complexe achaete-scute. Ils constituent probablement une partie du prépattern utilisé lors de

l'établissement du pattern des organes sensoriels larvaires.

Quelques uns de ces gènes de segmentation sont également exprimé dans des régions spécifiques des disques imaginaux. Ils pourraient aussi servir d’information positionnelle interprétée par les gènes proneuraux pour établir les patterns sensoriels adultes.

Cela est toutefois difficile à tester dans le mesure où ces gènes

interviennent dans plusieurs étapes développementales dont celle de la segmentation: les individus mutants meurent donc durant

l'embryogenèse.

Contrairement à l'établissement de la segmentation dans l’embryon, l'opération de formation du pattern des organes sensoriels est peu

connue.

Toutefois, on connait quelques gènes indispensables à l'apparition de nombreux organes sensoriels. Les gènes du complexe achaete-scute sont nécessaire à la formation des précurseurs de tous les organes sensoriels externes et de la plupart des organes internes multidentritiques et le gène daughterless est indispensable à l'apparition des précurseurs de tous les organes sensoriels (figllB).

De plus, Jan et al ont analysé une batterie de déficiences en étudiant le système nerveux périphérique d'embryons homozygotes. Parmi ces délétions, plusieurs diminuent fortement le nombre des organes sensoriels (flglIA).

Il est toutefois difficile de déterminer à quel niveau du processus de formation du pattern, les gènes délétés agissent et surtout, si ces gènes font partie d’un même syntagme ou, au contraire, agissent

indépendamment les uns des autres.

Une manière de tester si deux gènes appartiennent à un même syntagme est de voir si des individus, doublement hêtêro^gotes pour une mutation récessive dans chacun des gènes, ont un phénotype altéré. Ce phénotype dominant résulte de la perturbation de l'interaction entre les deux gènes à cause d'une double haploinsufflsance alors que les mutations de ces gènes sont normalement récessives.

Lorsqu'un individu, double hétérozygote pour deux gènes intervenant dans l'établissement du pattern sensoriel, présente un phénotype altéré, c'est que ces gènes font partie d'un même s)nitagme.

Cette analyse d'individus double hétérozygote permet de tester l'appartenance à un même S)mtagme, de mutations qui ont, à l'état

homozygote, un même genre de phénotype ainsi que d'isoler de nouvelles mutations.

C.Dambly-Chaudière et al ont combiné, en double hétérozygote, une délétion du complexe achaete-scute et une mutation du gène

daughterless\ ces individus ont quelques macrochaetes fréquemment absentes (figllC). Cela suggère que les produits du C-AS et de da

interagissent entre eux pour établir le pattern des soies adultes. Cette interaction a été confirmée par la suite, par la découverte des motifs HLH, utilisé pour la dimérisation et qu'au moins un produit du complexe est capable de former, in vitro, des hétérodimères, avec la protéine da, qui se lient à l'ADN.

L'analyse moléculaire confirme donc l'interaction mise en évidence par les doubles hétérozygotes entre les gènes du complexe achaete-scute et le gène daughterless. Ces auteurs ont également testé en double

hétérozygote, une série de sept déficiences qui affectent à l'état homozygote, le pattern des organes sensoriels larvaires.

De l'analyse de toutes les combinaisons entre ces déficiences ainsi qu'avec

une délétion du C-AS et une mutation de da, il ressort que, seule la

déficience Df(4) M62f interagit avec la déficience du C-AS. Les adultes doublement hétérozygotes ont généralement quelques macrochaetes en moins (cf figllC).

Cela Indique qu'il y a au moins un gène, délété dans cette déficience, qui appartient au même syntagme que les gènes du complexe achaete-scute.

Cette déficience délète notamment le locus Ce/cP qui fait partie des gènes de segmentation. Ce locus pourrait être impliqué dans la formation des patterns sensoriels.

J'ai étudié plus en détail cette déficience et je l'ai utilisé comme point de départ lors de mutagenèses pour sélectionner de nouvelles mutations qui interagissent en double hétérozygote avec cette déficience M62f.

L'étude, en double hétérozygote, de mutations présente l'avantage de mettre en évidence des gènes intervenant dans un même syntagme et _ ce, même si ils sont également impliqués dans d'autres opérations

développementales.

En effet, de nombreux gènes importants sont impliqués dans plusieurs étapes du développement mais leur rôles multiples peuvent être masqués par un phénot 5 q)e précoce lors de l'analyse de mutations homozygotes.

Ce problème est dépassé par l'analyse en double hétérozygote, ce qui permet maintenant de mieux étudier la formation du pattern des organes sensoriels adultes.

Formation du système nerveux périphérique: embryon et adulte.

A ce jour, la plupart des gènes analysés interviennent dans la

formation du pattern des organes sensoriels tant larvaires qu'adultes. Les

mêmes gènes sont donc nécessaires dans l'embryon et dans les disques

imaginaux.

De plus, ces gènes semblent avoir une même fonction lors des deux développement.

Cela suggère que les patterns sensoriels larvaires et adultes sont

probablement construit de la même manière, selon les mêmes principes

et avec les mêmes gènes. Les résultats obtenus dans < des systèmes

peuvent donc être Intégrés dans un même schéma.

RESULTATS.

1. Le complexe achaete-scute et les sensilles campaniformes alaires.

1.1. Introduction.

Le locus complexe achaete-scute (C-AS) de drosophile contient plusieurs gènes qui sont requis pour le développement des systèmes sensoriels adulte et larvaire (Muller et Prokofyeva, 1935; Garcia-Bellido,

1979; Dambly-Chaudière et Ghysen, 1987). Diverses analyses (cf Intro) indiquent que scute (sc) et achaete (ac) interviennent non seulement dans la détermination de cellules ectodermiques en organes sensoriels mais aussi dans la localisation des organes sensoriels.

achaete et scute sont deux gènes nécessaires à la formation des organes sensoriels de l'adulte; leur effet a été étudié principalement au niveau des macrochaetes du thorax et de la tête de l'adulte. Ces gènes s'expriment dans des régions du disque imaginai où apparaissent les précurseurs des organes; Romani et al. ont montré que le pattern de macrochaetes

dépend notamment du pattern d'expression de sc. (Romani et al., 1989).

L'analyse phénotypique et moléculaire d'une série de points de rupture scute a mené à l'hypothèse que la transcription du gène scute est contrôlée par une batterie d'éléments spécifiques (probablement 7 sites), semblables à des "enhancers", dont la plupart sont répartis dans une région d'une cinquantaine de kilobases en aval de sc. (cf schéma dans l'introduction; Carramolino et al., 1982; Campuzano et al., 1985; Ruiz- Gômez et Modolell, 1987; Ghysen et Dambly-Chaudière, 1988). Ce qui est particuliérement intéressant dans cette hypothèse, c'est que ces

éléments de contrôle ont une spécificité régionale en ce sens que chacun

d'eux assurerait l'expression de scute dans une région précise du disque.

ce qui aboutirait grâce à des eommunications intercellulaires et à l'expression d'autres gènes, au développement en cet endroit, d'une

macrochaete (Stem, 1954; Ghysen et Richelle, 1979; revue par Ghysen et Dambly-Chaudière, 1989).

Ici, nous avons analysé l'effet de délétions et mutations du complexe achaete-scute sur un autre type d'organes sensoriels, les sensilles

campaniformes de l'aile (Hertweek, 1931).

Nous avons cherché de quel(s) gène(s) du complexe achaete-scute, le pattern des sensilles dépend et dans quelle mesure.

Parmi les sensilles qui dépendent de scute, nous avons cherché à

déterminer si leur formation requiert également des régions de contrôle spécifiques et nous avons tenté de les identifier.

1.2. Description.

Le pattern complet des sensilles campaniformes sur la lame alaire est montré à la figure 1. On observe qu'il est beaucoup plus diversifié que celui des macrochaetes sur le thorax: il inclut des groupes de sensilles (sc4d, sc25,

12, sc4v, sc3), des rangées de sensilles (sc5, TSM, L3d) et un nombre de sensilles à localisation unique (HCVv, HCVd, sel, ACV).

Ces sensilles sont disposées sur la face ventrale ou dorsale de l'aile.

La carte moléculaire de la région achaete et scute est reproduite dans la figure 2 (Campuzano et al., 1985; Ruiz-Gômez et Modolell, 1987). Cette carte montre non seulement la localisation des séquences codantes achaete et scute, mais aussi la position des points de rupture et des déficiences utilisées.

1.3. Effets des délétions des gènes du complexe.

Nous avons regardé la présence des différentes sensilles dans des individus délétés pour achaete, scute ou simultanément pour oc et sc. La figure 3 résume ces résultats. Aucune sensille ne se développe en

l'absence et d'ac et de sc.

On observe que dans une délétion d'achaete, quelques sensilles

appartenant à des catégories différentes (groupes, sensilles isolées,..) manquent. En l’absence de scute, la majorité des sensilles sont absentes.

Le retrait soit d’ac soit de sc (fig3: deux colonnes suivantes) révèle que l’entièreté de l’ensemble de sensilles peut être résolue en deux sous- ensembles complémentaires, le premier dépendant d’ac, le second de sc.

Un plus grand nombre de sensilles dépendent de scute que d'achaete, comme cela a été montré pour les macrochaetes.

Ce résultat suggère que les deux gènes ac et sc définissent deux sous- patterns indépendants et complémentaires.

Un troisième gène du complexe, asense (ase) (A. Ghysen and C. Dambly- Chaudière ref) est impliqué dans la formation d’un grand nombre

d’organes sensoriels larvaires mais pas dans l’apparition de soies thoraciques; c’est pourquoi ce gène a été découvert tardivement.

J’ai décidé d’observer le pattern des sensilles alaires dans une délétion d’asense. Les résultats (fig. X, colonne Y) montrent que la sensille sel et le groupe ventral sc3 sont fortement affectés, le groupe ventral sc4 étant légèrement diminué.

L’apparition de ces sensilles dépend donc de asense mais aussi du gène scute.

asense définit probablement un sous-ensemble du pattern dépendant de scute.

1.4. Mise en évidence de la région scute nécessaire au développement des

sensilles alaires.

Dans le cas des macrochaetes dépendant de scute, le

fonctionnement correct de ce gène requiert l'entièreté de la région située en aval de l'unité de transcription; la plupart des macrochaetes n'apparaissent pas si cette région en aval est déconnectée de la région codante par le point de rupture sc^. sc^ a donc un effet drastique sur les macrochaetes, à l'opposé, j'ai observé que sc^ n'a qu'un faible effet sur les sensilles campaniformes (Fig. 3b, colonne d'extrême droite).

Afin de déterminer si la région en amont de scute est importante pour la formation des sensilles, nous avons caractérisé les phénotypes associés à l'ensemble de déficiences terminales RT schématisées à la Fig 2. Ces déficiences enlèvent les gènes de la partie distale du chromosome X, le gène achaete ainsi qu'une partie variable (selon la déficience) de scute", le chromosome Y des individus observés porte une duplication du gène achaete et des gènes distaux à celui-ci. Dans ces combinaisons, scute est donc le seul gène affecté.

Les phénotypes des points de rupture RT ont été classés selon

l'importance de leur effet (Fig. 3b). La sériation ainsi obtenue correspond de manière générale à l'ordre moléculaire des points de rupture comme établi deux ans auparavant (Fig. 2). Le manque de corrélation complète est probablement dû à l'instabilité relative des points de rupture RT qui

continuent à perdre de l'ADN terminal de sorte que l'ordre précis des points de rupture proches peut changer en quelques mois (Biessman et Mason, 1988).

1.5. Analyse de la formation de groupes de sensilles.

Dans tous les cas où un point de rupture est la cause d'une

diminution substantielle du nombre de sensilles campaniformes

34

appartenant à un seul groupe, nous nous sommes demandé si la mutation supprime complètement un sous-ensemble de ce groupe ou si, par

contre, elle a un effet partiel sur l'ensemble du groupe. Dans ce but, nous avons comparé des dessins faits à la caméra lucida représentant des ailes mutantes et de type sauvage. Dans la majorité des cas, (voir Fig. 4 pour les groupes sc25 et sc4d) on a constaté que la mutation a un effet partiel sur l'ensemble du groupe.

Le cas des trois sensilles dorsales sur la troisième veine (L3d) est intéressant du point de vue de la formation de leur pattern (Fig.5 A, B).

Une possibilité serait que chacune de ces trois sensilles soit formée en une localisation unique indépendamment des deux autres sensilles.

Alternativement, les trois sensilles pourraient être déterminées, de manière équidistante au sein d'un groupe disposé le long de la veine. Le fait que les trois sensilles dépendent d'une région commune en amont de scute (Fig. 3 B) plaide en faveur d'un mécanisme commun pour la

localisation des trois sensilles (contre la première possibilité). Afin de voir plus clair dans ce mécanisme, nous avons examiné les phénotypes intermédiaires dans une combinaison mutante {RT 629/ sc‘) qui présente une, deux ou trois sensilles. Lorsque seulement deux sensilles sont

présentes, on les trouve dans les positions t 3 qDiques des première et deuxième sensilles (Fig.SD) ou des deuxième et troisième sensilles (Fig.

5C), alors que, s'il n'y a qu'une seule sensille, elle occupe invariablement la position typique de la deuxième sensille (Fig. 5 E).

L'interprétation la plus simple est que le processus menant au pattern

est, en premier lieu, la détermination d'une sensille à la moitié de la

veine, et, ensuite, la détermination des deux sensilles additionnelles de

part et d'autre de la première. Autrement dit, la présence de la sensille

centrale conditionne l'apparition des deux autres. Cette interprétation est

étayée par des travaux antérieurs selon lesquels la deuxième sensille, - ou

tout au moins sa partie neurale, - se forme avant les deux autres (Murray

et al., 1984; Jan et al., 1985).

2. Isolement de mutants du système nerveux périphérique.

2.1. Principe de base.

Bien que le complexe achaete-scute joue un rôle clé dans

l'établissement des patterns sensoriels externes, il n'est pas le seul à intervenir. En effet, on connaît d'autres gènes qui participent également à ce processus (ex: daughterless, hairy, extramacrochaete,...cf intro) et il est probable que d'autres restent à identifier comme le suggère l'analyse d'une batterie de déficiences (cf introduction; Jan et al., 1985).

L'étude d'autres opérations développementales telles la détermination du sexe (ref), la détermination de l'axe antéro-postérieur (Akam, 1987;

Nüsslein-Volhard et-Wieschaus, 1980) a montré que l'exécution correcte de l'opération nécessite également une batterie de gènes et de plus, que ces gènes interagissent entre eux.

Ce groupe de gènes qui interagissent, directement ou non, est appelé syntagme (A.Garcia-Bellido) (cf introduction; ref).

Ces interactions ont été mises en évidence génétiquement par Botas et al. qui ont montré en 1982 qu'au sein d'un même syntagme, la quantité du produit d'un gène par rapport à celle d'un autre est souvent cruciale pour la réussite complète de l'opération (voir encadré Bl) (Botas et al., 1982).

Encadré B1 :

J.Botas, M del Prado et A.Garcia-Bellido ont cherché des mutations

(symbolisée par une astérisque, *) qui à l'état hétérozygote et en présence de

duplications du C-AS (*/+; Dp C-AS/Dp C-AS), altèrent le pattern des soies thoraciques (Botas et al., 1982).

Ils ont, en fait, augmenté la quantité du produit des gènes du C-AS et

simultanément cherché, par mutagenèse, un gène dont une diminution d'activité débouche sur un phénotype altéré.

Ce phénotype est dû à une modification de la balance entre ces gènes (et probablement de leurs produits). Ils en infèrent que ces gènes interagissent et appartiennent à un même syntagme.

Ils ont ainsi isolé deux gènes, hairy {h) (déjà connu) (ref) et

extramacrochaete {emc) dont les mutations dans les conditions de double

hétérozygote (hV+i Dp C-AS/Dp C-AS ou emc/+-, Dp C-AS/Dp C-AS) provoquent l'apparition de quelques soies supplémentaires alors que, séparément, ces mutants sont normaux {hr/+ ou emc/+ ou Dp C-AS/Dp C-AS).

Qui plus est, ces mutations, homozygotes, augmentent fortement le nombre de soies adultes (cf intro).

Les auteurs proposent que hairy e\ extramacrochaete sont des régulateurs négatifs du C-AS et interviennent dans le même syntagme (Moscoso del Prado et Garcia-Bellido, 1984; ref emc et h).

Sur base de ce résultat, A. Garcîa-Bellido a suggéré à A.Ghysen et C.Dambly-Chaudiére certaines expériences qui sont, notamment, à l'origine de mon travail.

Après la découverte du phénotype dans le système nerveux

périphérique de mutant daughterless, A.Ghysen et C.Dambly-Chaudiére se sont posés la question suivante:

"da et les gènes du complexe achaete-scute font-ils partie d'un même

syntagme ?"

La manière choisie pour approcher cette question, est de tester

l'interaction entre différents gènes impliqués dans la détermination du système nerveux périphérique.

Pour ce faire, C.Dambly-Chaudière a combiné une mutation dœ à l'état hétérozygote avec une déficience du C-AS également hétérozygote (C-AS' /+;da /+). On savait que les hétérozygotes (C-ASV+ ou da'/+) ont un

phénotype normal. Par contre, il apparaît que les individus, double hétérozygotes, ont environ la moitié de leurs soies qui manquent sur le thorax et la tête (schéma B.A.) (Dambly-Chaudière et al., 1988).

Ce qui est particulièrement intéressant est que les adultes, hétérozygotes pour les deux déficiences sont affectés dans le même processus que

chaque mutant à l'état homozygote, l'établissement du système nerveux périphérique.

Ce résultat de double hétérozygote indique que les produits des gènes du C-AS et de da interagissent au sein d'un même réseau pour établir le pattern des organes sensoriels: cette interaction identifiée génétiquement, a été corroborée depuis lors par des résultats de biologie moléculaire (cf Intro).

Cette combinaison, de double hétérozygote de gènes d'un même syntagme, fragilise probablement l'opération développementale,

fragilisation qui peut occasionnellement être telle que la suite des étapes ne se fait pas correctement et mène donc à un phénotype modifié.

Dans le cas du pattern des soies et plus particulièrement des

macrochaetes, la détermination a lieu, souvent indépendamment, en des sites différents du disque imaginai (cf intro) et donc, bien que chaque soie ait une faible probabilité de ne pas être présente, il manque souvent une ou plusieurs soies par mouche (schéma B.A.).

Malgré cette faible pénétrance, la combinaison en double

hétérozygote de mutations, a l'incommensurable avantage de rendre

visible par "double haplo-insuffisance", l'interaction entre deux gènes dont les mutations sont récessives. La généralisation de ce résultat constitue une nouvelle technique d'analyse de mutations.

Cette technique ne mettrait en évidence que des gènes qui interviennent dans une même opération; ce qui permettrait d'outrepasser tous les

problèmes d'effets pléiotropiques des mutations à l'état homozygote (ex:

létalité précoce,...) dus à une autre fonction d’un des gènes dans d'autres opérations développementales.

Le revers de la médaille est que des gènes, intervenant dans un même syntagme, pourraient ne pas interagir ou l’interaction pourraient être trop faible que pour être détectée. De plus, on risque de mettre en évidence des interactions triviales entre deux mutations qui

n'interviennent pas spécifiquement dans la formation des organes

sensoriels. 11 est donc indispensable d'analyser par d'autres méthodes les mutations qui interagissent.

Non seulement, cette technique de double hétérozygote permet une analyse de mutants connus mais surtout, elle peut être utilisée lors de mutagenèse pour l'identification de nouvelles mutations qui interagissent avec un mutant connu.

Le principe est le suivant: on part d'une mutation à l'état hétérozygote dans un gène A important dans la neurogenèse et on recherche des

mutations qui, en double hétérozygote [A /+: */+), donnent un phénotype modifié. Cette mutation affectera un gène qui est important pour la

neurogenèse et qui interagit avec le gène A. Et ce pour autant que les simples hétérozygotes n'aient aucun phénot}q)e anormal caractéristique de l'étape étudiée.

La mutagenèse consiste donc à croiser des mouches mutagénisées

C^/+: n’importe quel gène pouvant être affecté) avec des mouches A'/+ et