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Submitted on 5 Jun 2020
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Effet de la metformine, un modulateur du métabolisme sur le développement gonadique : Utilisation de deux
modèles expérimentaux
Mélanie Faure
To cite this version:
Mélanie Faure. Effet de la metformine, un modulateur du métabolisme sur le développement go- nadique : Utilisation de deux modèles expérimentaux. Biologie du développement. Université François Rabelais (Tours), 2016. Français. �tel-02792944�
UNIVERSITÉ FRŁNÇOIS RŁłELŁISDE TOURS
ÉCOLE DOCTORŁLE: SSłCV
UMRINRŁ-CNRS PHYSIOLOGIE DE LŁ REPRODUCTION ET DES COMPORTEMENTS
ÉQUIPE : Gonades, Conservation, Régénération
THÈSE
présentée par:Mélanie FŁURE
soutenue le:29 novembre 2016
pour obtenirle grade de :Docteur del université François Rabelais de Tours
Discipline/ Spécialité:Science dela vie/ łiologie dela reproduction
EFFET DE LŁ METFORMINE, UN MODULŁTEUR DU METŁłOLISME SUR LE DEVELOPPEMENT
GONŁDIQUE: Utilisation de deux modèles expérimentaux.
THÈSE dirigée par :
Mr FROMENT Pascal Chargé de recherche,HDR,INRŁ, Tours RŁPPORTEURS :
MrFEVE łruno PUPH,HDR,INSERM, Université Pierre et Marie Curie, Paris 6 Mr VOLLE David Directeur de recherche, HDR,INSERM, Clermont-Ferrand
JURY :
MrFEVE łruno PUPH, HDR,INSERM, Université Pierre et Marie Curie, Paris 6 Mr FORETZ Marc Chargé de recherche, HDR,Institut Cochin, CNRS, Paris
Mr FROMENT Pascal Chargé de recherche,HDR,INRŁ, Tours
Mr LEMŁZURIER Emmanuel Chargé de recherche,INERIS, Verneuil en Halatte Mme ROUILLER-FŁłRE Virginie Professeur, HDR,INSERM, Université Paris Diderot Mme TESSERŁUD Sophie Directeur de recherche, HDR,INRŁ, Tours
MrVŁUDIN Pascal MCU, HDR, Université François-Rabelais, Tours
Mr VOLLE David Directeur de recherche, HDR,INSERM, Clermont-Ferrand
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Remerciements
Cetravail dethèse a été co-financé parle Conseil Régional dela Région Centre etl INRŁ.
Jetienstout d abord à adresser mes plus sincères remerciements aux membres dujury. À Messieurs łruno FEVE et David VOLLE qui ont accepté d être les rapporteurs de ce travail.
À Mesdames Virgine ROUILLER-FŁłRE, Sophie TESSERŁUD et Messieurs Marc FORETZ, Emmanuel LEMŁZURIER et Pascal VŁUDIN d avoir accepté del examiner. Je souhaite remercier Monsieur Florian GUILLOU, directeur de l Unité PRC, qui m a soutenu dans de nombreuses démarches, et Madame Françoise MÉDŁLE, directrice du département PHŁSE pour m avoir ouvert les portes de cette structure. Je remercie également Monsieur Thierry MOREŁU, directeur de l Ecole Doctorale SSłCV et Monsieur Michel DUCLOS, directeur del Unité URŁ, pourleur accueil.
J adressetoute ma reconnaissance à Pascal FROMENT, mon directeur dethèse, pour m avoir permis de réaliser ce travail de recherche en autonomie, tout en étant vigilant; pour son partage de connaissances, sa grande disponibilité, son aide précieuse, ses conseils avisés, ses lectures multiples, sa patience durant toute la réalisation de ces travaux et sa véritable implication à mes côtés.
Je remercie profondément Joëlle DUPONT, Michaël łERTOLDO et Christelle RŁMÉ pour leurs conseils,leur aide etleur disponibilité. Łinsi que Séverine MŁZŁUD-GUITTOT, Sonia METŁYER-COUSTŁRD et Nicolas GUYOT pour m avoir accompagné au cours de cestrois années notammentlors du comité dethèse.
Mes sincères remerciements àtous nos collaborateurs pourleur aide d expert et à Charlène R, étudiante de master, pour sa véritableimplication dans cestravaux.
Je remercie les membres de l équipe GCR, Elisabeth łLESłOIS, Michèle MŁGISTRINI et Marina GOVOROUN de m avoir accueilli au sein de cette équipe et à Łurore J, Łurore T, Diep N, Edith G, Eric J, Isabelle C, Isabelle G, Laura SV, Maëva C, Maëva H, Pierre M,
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Sabine Ł, Sophie F et Vanessa G ainsi queles membres del équipe FRPO pourtousles éclats de rire que nous avons partagé.
Un grand merci aux animaliers de l UEPŁO, Claude CŁHIER, Marine CIROT, Deborah CRESPIN et également de PEŁT, plus particulièrement, Fréderic MERCERŁND, Patrice GŁNIER et Olivier CŁLLUT qui ont pris soin des animaux nécessaires dans ce travail de thèse.
Je souhaite également remercier mes relecteurs pour avoir accordé dutemps et del attention à ma rédaction ainsi que toutes les personnes qui m ont entouré au cours de ces années de recherche et qui ont contribué àla réalisation de cetravail.
Mes remerciements à mes enseignants, Łnne DUITTOZ, Delphine PILLON, Pascal VŁUDIN et Véronique łOZON d avoir su noustransmettreleur savoir,leur expérience etla passion de leur discipline. Merci également à Monsieur Phillipe VENDRIX, directeur de l Université François-Rabelais de Tours, Christelle SUPPO et Delphine PILLON de m avoir permis d animer des TP/TD.
À Sabine Ł et Isabelle C, merci d avoir partagé votre quotidien. Je sais déjà que le łDM va me manquer. À Laura SV merci pour tes conseils et recommandations concernant ma recherche d après thèse. À vous trois, ce fut un plaisir de passer ces moments à vos côtés:
« Miaouuu !!! »
Je remercie vivement mes amis, łlandine, Céline, Charlotte, Fanny, Laura, Nadège, Sabine, Sabrina, Charles, Damien, Doudou, Greg, Max, Michaël, Romain etles łasketteurs pourleur soutien sans faille,leur bonne humeur ettousles précieux moments que nous avons partagé. Enfin, je remercie et ne remercierai jamais assez mes parents, Marlène et Sébastien pourleur amour,leurtolérance etleur soutieninconditionnel. Merci
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Résumé
La metformine, utilisée chezles patients et patientes atteints du diabète detype II, peut être également administréelors d uneinfertilitéliée à uneinsulino-résistance ou à un désordre métabolique.
Mon projet de recherche a été d analyserles effets de cet antidiabétique surla fonction gonadique au stade fœtal et àla puberté. Pour cela nous avons utilisé deux approches.
Une approche in vivo, où nous avons regardé chez la souris les conséquences d une exposition fœtale à la metformine sur le développement des gonades mâles et femelles. En parallèle, nous avons évalué les effets d une exposition à cet antidiabétique durantla période pré-pubère surla spermatogenèse chezle poulet.
Pour mieux comprendre le mode d action de la metformine surle testicule à l échelle cellulaire ; nous avons étudié son rôle à l aide de cultures de cellules de Sertoli immatures (souris et poulet). Łinsi, nous avons évaluéles conséquences dutraitement sur la viabilité, la prolifération et sur le métabolisme des cellules protectrices des cellules germinales :les cellules de Sertoli.
Nous avons montré qu une administration orale de metformine (150 mg/kg/jour) à des poulets pré-pubères entraîne un retard de puberté. Il se caractérise par une réduction du poids testiculaire et du diamètre des tubes séminifères. De plus, une baisse de 50% de la testostérone sérique ainsi qu une chute de l expression de la protamine, un marqueur des cellules germinales différenciées, a été mesurée.
Chezla souris, une exposition des fœtus mâles àla metformine conduit àl âge adulte à une augmentation du poids dutissu adipeux de 3 fois ainsi qu à une diminution dela fertilité. Celle-ci s illustre par une diminution de la taille des portées de 30% uniquement chez les mâles exposés in utero. Ce dysfonctionnement est associé à des marques épigénétiques sur l ŁDN et des anomalies morphologiques de la tête des spermatozoïdes, sans modification de la productiondetestostérone.
Les résultats obtenus dans ces deux modèles suggèrent qu une exposition à la metformine pourrait agir surla fertilité et surle métabolisme soulevant ainsila question de ses effets pour la santé et la reproduction humaine en fonction de la dose et de la période d exposition.
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Les analyses in vitro sur les cellules nourricières (cellules de Sertoli de souris et de poulet) ont été réalisées par des techniques à haut débit sans a priori (protéomique, métabolomique). Nous avons décrit que la metformine induit des modifications métaboliques; une augmentation de la production de lactate et un blocage de la synthèse d ŁTP. De plus, une diminution de la prolifération des cellules de Sertoli à la dose de 5 mM de metformine est observée. L approche protéomique (MŁLDITOF ICM-MS) sur cellules entières, complétée par une analyse top-down (nanoLC-MS/MS), nous a permis d identifier des protéines qui présentent des différences d abondance entre les cellules exposées à la metformine et les cellules contrôles. Ces protéines sont connues pour être impliquées dans : (1) l organisation du cytosquelette, (2) l adhésion cellulaire, (3) la compaction de l ŁDN, (4) la régulation de la réponse cellulaire à l hypoxie et (5) l immunité. En complément, une analyse fonctionnelle a mis en évidence un effet positif puis négatif dela metformine selonla dose sur la mobilité de ces cellules ainsi que sur la perméabilité des jonctions cellulaires qui constituentla barrière hémato-testiculaire.
Enfinla metformine entraîne une modulation de la réponseimmunitaire des cellules de Sertoli. Elle provoque une forte activité de phagocytose et induit aussi la surexpression d interleukines et de plusieurs récepteurs de type Toll Like-Receptors. En revanche, une préstimulation avec la metformine abolit l activation de la voie de signalisation MŁPK induite par le lipopolysaccharide seul à court terme et d Łkt à plus long terme. De plus, ce prétraitement amplifie la réponse de la voie de signalisation NFĸł sans induire d effet sur le pourcentage de cellules germinales en prolifération in vitro.
En conclusion, ces données montrent d une part que la metformine affecte le métabolisme des cellules de Sertoli et d autre part queleurs grandes fonctions de sécrétion, de support et de protection sont modifiées par cet antidiabétique.
Mots clés : Metformine, Fertilité, Gonades, Cellules de Sertoli, Cellules germinales, Souris, Oiseau
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Résumé en Łnglais
Metformin,is used on patients affected by type II diabetes,could be also administered duringinfertility associatedtoinsulin-resistance orto a metabolic disorder.
My research project wasto analyzethe consequences of metformin exposure on gonad function from foetalto adult period. We have usedtwo approaches, in vivoand in vitro.
With in vivo approach, we evaluated the effects of exposure to metformin during the prepubertal period on spermatogenesis in chicken and in mice the consequences of fetal exposureto metformin on gonads development.
To better understand the mechanism of action of metformin at the cellular level: We have studied mouse and chicken Sertoli cells and germ cells through cell culture. We were able to evaluate the consequences on viability, proliferation and Sertoli cells metabolism.
The oral administration of metformin (150 mg/kg/day) in prepubertal chickens have shown to delayed puberty. It is characterized by a reduction in testis weight and diameter of the seminiferous tubules. In addition, a 50% decrease in serum testosterone and a decline in the expression of protamine, a marker of differentiated germ cells were measured.
In mice, exposure of male fetuses with metforminleadsin adultto a 3 foldincrease in adipose tissue weight as well as a decrease in fertility. Thus, we observed a 30% decrease in litter size among males exposed in utero. This dysfunction is associated with morphological abnormalities of the sperm head and epigenetic marks on DNŁ without modification of testosterone production.
Overall, these two models suggest that exposure to metformin could modify fertility and metabolism, and raising the question of the metformin effects on health and human reproduction.
The second approch used proteomics and metabolomics strategy on Sertoli cells. We have describedthat metformin-induced metabolic changes;lactate productionisincreased and ŁTP synthesis is blocked. In addition, 5 mM of metformin incubation decrease the proliferation of Sertoli cells. The proteomic approach (MŁLDITOF ICM-MS) on whole cells, complemented by a top-down analysis (nanoLC-MS/MS) has allowed to identify differential
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expressed proteins between cells exposed to metformin and controls cells. These proteins are involved in: (1) cytoskeletal organization, (2) cell adhesion, (3) the DNŁ compaction, (4) regulation of cells response to hypoxia and (5) immunity. In addition, a functional analysis showed a positive and negative effect of metformin according to the concentration, on the mobility ofthese cells as well as on the permeability of cell junctions involved on the blood- testis barrier.
Finally, metformin causes a modulation in the immune response of Sertoli cells. It causes a strong activity of phagocytosis and overexpression of interleukins and toll-like receptors. In addition, a metformin pretreatment enhances the NFĸł signaling pathway in vitro.
In conclusion,these data show firstlythat metformin affectsthe metabolism of Sertoli cells and secondly, the secretory functions of support.
Key words: Metformin, Fertility, Gonads, Sertoli cells, Germ cells, Mouse, łird
