HAL Id: jpa-00246616
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Submitted on 1 Jan 1992
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Analyse de la diffusion diffuse donnée par les cristaux de protéines
J. Doucet, J.-P. Benoit, P. Faure, D. Durant
To cite this version:
J. Doucet, J.-P. Benoit, P. Faure, D. Durant. Analyse de la diffusion diffuse donnée par les cristaux de protéines. Journal de Physique I, EDP Sciences, 1992, 2 (6), pp.981-993. �10.1051/jp1:1992191�.
�jpa-00246616�
J. Phys. I France 2 (1992) 981-993 JUNE 1992, PAGE 981
Classification
Physics
Abstracts 87.15BAnalyse de la diffusion diffuse donnde par les cristaux de
protdines
J. Doucet (1,
2),
J.-P. Benoit(I),
P. Faure (~) et D. Durand (~, 3) (1) L-U-R-E-, Bit. 209-D, Universit£ Paris-Sud, 91405Orsay
Cedex, France(2) Laboratoire de
Physique
desSolides,
Bit. 510, Universitd Paris-Sud, 91405Orsay
Cedex, France(3) Laboratoire Ldon Brillouin
(CEA-CNRS),
91191 Gif-sur-Yvette, France(Regu
le 3Jjanvier1992,
acceptd le 13 mars J992)Rksumd. Cet article est consacrd h
l'apport
del'analyse
de la diffusion diffuse de rayons X au problbme de la ddforrnabilitd des protdines cristallisdes. Nous passons d'abord en revue lesprincipales
dtudespublides, puis
nous tentons d'effectuer unesynthbse
de ces rdsultats en y incluant des observations nouvelles que nous avons obtenues sur d'autresprotdines.
IIapparait
que deux types
principaux
deddplacements
affectent les moldcules : desddplacements
intramold- culaires corrdlds seulement h trbs courte distance et desddplacements
interrnoldculaires corrdldssur
plusieurs
mailles. Lapossibilitd
de ddtection de diffusion diffuse provenant deddplacements
intramoldculaires corrdlds h l'dchelle de portions entibres de moldcules est discutde. '
AbstracL This paper is devoted to the contribution offered by the X-ray diffuse scattering
analysis
to theproblem
ofplasticity
ofcrystallized protein
molecules. We first review the mainpublished
results, then we try toperform
asynthesis
of these results and of new observations thatwe have obtained on various
proteins.
Two types ofdisplacements
emerge from this review : intramoleculardisplacements
correlated at very short range andlong-range
correlated inter- moleculardisplacements.
Thepossibility
ofdetecting
diffusescattering resulting
from in-tramolecular
displacements
correlated within entire parts ofproteins
is discussed.1. Prdsentation
gknkrale.
La
compr£hension
desph£nom~nes
de flexibilit£ et de d£forrnabilit£ desprot£ines
constitueun des
probmmes majeurs
de labiologie
mol£culaire structurale actuelle. Eneffet,
la seule connaissance de la structure tridimensionnelle desprot£ines
foumie par la diffraction de rayons X se r£vine souvent insuffisante pourexpliquer
les m£canismes fonctionnels des mol£cules. Tr~s souvent, il faut supposer l'existence de mouvements corrd16ssupp16mentai-
res, comme dans
l'exemple
bien connu de la mo16cule de COqui
ne peut acc6derjusqu'au
siteactif de la
myoglobine qu'apr~s
ouverture d'un passageimpliquant
des mouvements concert6sde nombreux atomes de la
protdine. L'ouverture, qui ddpend
des conditionsphysico-
chimiques environnantes,
sert desystbme r6gulateur
de la r£actionbiochimique [Il.
Le nombre d'atomes
impliqu6s
dans cesddplacements
est trbsvariable;
il s'dchelonneentre
quelques
atomes(comme
parexemple
pour la fixation de laglycyltyrosine
sur lacarboxypeptidase
A[2]) jusqu'h
des domaines entiers comportantplusieurs
milliers d'atomes(comme
pour les kinases[3])
ou mdmejusqu'h
des mouvements entre sous-unit£s dans lesprotdines composdes
deplusieurs
chdnespolypeptidiques.
Lesfrdquences
assocides h laplupart
de ces mouvements,qui d£pendent
entre autres du nombre d'atomesimpliqu6s,
s'dtendent dans la gamme
10I2 Hz-10I°Hz,
mais des mouvements defrdquences beaucoup
plus
basses existent aussi. Une bonnedescription
de l'ensemble des mouvements affectant lesprotdines
et de leursfr£quences
est donnde en[4].
La
complexitd
structurale desprotdines
et la diversitd des mouvements dont elles sont lesibge
rendent tr~s d£licatel'analyse
de leurdynamique.
Deuxgrandes approches
sont actuellementexplordes.
Lapremibre
est la simulationnum£rique
de ladynamique
moldcu-laire;
d'excellents articles de revue d£crivent les diffdrentestechniques
de calcul[5, 6].
Malgrd
lesprogrbs
considdrables effectuds r£cemment dans cettevoie,
les limitations actuellesdes calculs n'autorisent pas h se passer de
l'approche exp6rimentale qui
reste doncindispensable.
De nombreuses
techniques
ont £t£ utilisdes pouranalyser
ladynamique
desprot6ines
citons entre autres les
techniques
de R-M-N-[7, 8],
l'E.S.R.[9],
laspectroscopie
Raman[10],
la
spectroscopie
M6ssbauer[III,
l'extinction de fluorescence[12],
la diffusion de neutrons[13],
les£changes hydrogkne-deut£rium [14],
la mesure des constantes£lastiques [15].
Chaque technique
apporte une contribution int£ressante pour une gamme defrdquence
et untype de mouvement donnds. C'est pour cela que
l'analyse
de ladynamique
intramol£culairedes
prot£ines
ndcessitel'apport
duplus grand
nombrepossible
detechniques compldmentai-
res.
Ainsi,
une nouvelletechnique d'analyse,
basde surl'exploitation
de la diffusion diffuse de rayons X donn6e par les cristaux deprot6ines,
est actuellementd6velopp6e
; cettetechnique devraitfournir
desinformations
sur les corrdlations entre lesddplacements atomiques
pour desprotdines
cristallisdes.2.
Rappels
sur la diffusion diffuse.La diffusion diffuse est constitu6e par l'intensitd diffus£e par un monocristal en dehors des r6flexions de
Bragg,
rdflexionsqui t6moignent
de la structurepdriodique
tridimensionnelle du cristal. Enrdalitd,
seule la structure moyenne estrigoureusement p6riodique.
Les dcarts hcette structure moyenne se traduisent par une diminution de l'intensit6 des r6flexions de
Bragg
: l'intensitd r6elle est6gale
auproduit
de l'intensitdthdorique (sans ddsordre)
par unfacteur dit
d'agitation therrnique
ouDebye-Waller,
facteurqui
neddpend
que desddplacements
individuels des atomes. L'intensit6 «perdue
» se retrouve diffusde en dehors des r6flexions deBragg
: onl'appelle
diffusion diffuse. Lardpartition
de la diffusion diffuse dansl'espace r6ciproque ddpend
des corrdlations entre les diversd6placements atomiques.
Plus
pr6cisdment,
en utilisant le forrnalisme de Guinier[16], l'expression
de l'intensitd diffuse s'dcritID(s)
=iv (r~) lP~ exp(-
2 iar sr~) (i)
oh S est le vecteur de
diffusion,
r~ la distance entre deux mailles616mentaires,
et4l~
est la fonction de corr£lation des dcarts q~~ des facteurs de structure h leur valeur moyenne, soit :4l~
= (q~~
q~z~~) (* signifie complexe conjugud).
Le facteur V(r~)
tient compte dupoids
relatif des terrnes4l~
selon r~.En
r£sumd, d'apr~s
la forrnule(I),
on constate que la localisation de la diffusion diffuseddpend
des corr61ations entre dcarts h la structure moyenne(c'est-h-dire
entred6placements
N° 6 DIFFUSION DIFFUSE DONNIiE PAR LES PROTEINES 983
atomiques
par l'interrnddiaire de la fonction de corr£lation4l~).
Notons que la diffusion diffuseint~gre
tous lesd6placements, qu'ils
soientstatiques
oudynamiques,
dtant donna que lesfr£quences
des rayons X(typiquement
10I8Hz)
sont au moins106
foisplus
£levdes quecelles des mouvements les
plus rapides
dans lesprot£ines.
L'exploitation
de la diffusion diffuse pour les cristaux min£raux etorganiques
est ancienneelle n'en est encore
qu'au
stade de faisabilit6 pour les cristaux deprot6ines.
Cet article a pourbut de faire le
point
SW l'6tat de latechnique
pour lesprot£ines,
en passant d'abord en revue lesprincipaux
travauxpubli£s
h cejour,
ensynth£tisant
et en discutant leursr£sultats,
etfinalement en essayant d'en
d£gager
lespotentialit£s
et les limites eu£gard
auprobmme
de la mobilit£ intramol£culaire.3.
Principales analyses
de diffusion diffuse de cristaux deprotdines.
3, I TROPOMYOSINE. Les fibres de
tropomyosine jouent
un rble clef dans lesph£nom~nes
de
r£gulation
musculaire. Les cristaux forrn6s par cesfibres, qui
contiennent environ 95 9bd'eau,
ne diffractentqu'h
15h
de r6solution.Philips
et al. ontremarqud
lapr£sence
de zonesdiffuses localisdes dans la
partie
centrale desdiagrammes
de diffraction etallongdes
dans les directionsperpendiculaires
aux fibres[17].
Ils ont montr£ que cesfigures
de diffusion diffuse£taient dues h des fluctuations transversales de
position
des fibres avec uneamplitude
de l'ordre de 5A.
3.2 LYSOzYME. La
premi~re
Etude de recherchesystdmatique
de la diffusion diffuse6manant de cristaux de
prot6ines
a 6t6 effectu6e en 1987 par Doucet et Benoit sur des cristaux delysozyme
depoule (forrne orthorhombique) [18].
Elle a r6v616 l'existence de diffusions localis6es sur deux familles deplans
r6ticulaires du r6seaur6ciproque perpendiculaires
auxdeux directions
cristallographiques
a et c(Fig. I).
Ces diffusionstraduisent,
dansl'espace direct,
l'existence deddplacements atomiques qui
sereproduisent
lelong
des directions a et cavec les
p6riodes
a et c. Pluspr6cis6ment,
les auteurs ont montr6 que lesd6placements
encause sont des translations simultandes
longitudinales
de mo16cules entibresaligndes
lelong
des axes a et c. Autrement
dit,
desrang6es
demoldcules, longues
d'environcinq
h six mailles etalign6es
dans les directions a ou c, sont translatdesparallblement
h elles-mdmes en bloc parrapport
h leurposition
moyenne(Fig. 2).
Ces translations sontpratiquement inddpendantes
d'une
rangde
h une autre et leuramplitude
a dtd estimde h environ0,25 h.
Noussommes ici
en
prdsence
de translationsglobales
de mo16cules corrdldes de maille h maille.3.3 INSULINE.
L'analyse
par D-L-D-Caspar
et al.[19]
de la diffusion diffuseapparaissant
sur les
diagrammes
de diffraction des cristaux d'insuline de porc estcomp16mentaire
de celle men6e sur lelysozyme.
Les auteurs se sontprincipalement
attach6s hanalyser
la diffusion non structur6e provenant ded6placements
intramo16culaires non corr61ds de maille h maille. Ilsont ainsi pu mettre clairement en 6vidence l'existence de mouvements
d'amplitude 0,4h
(r.m.s.) coup16s jusqu'h
des distances de 6h.
Cesd6placements
constituent la composante laplus importante
des ddsordresrdgnant
dans le cristal. Ce r6sultat prouvequ'h temp6rature
ambiante,
la moldcule d'insuline n'est pas unobjet rigide,
sa conformation rdelle fluctuantautour d'une conformation moyenne bien d6terrninde. D'autre
part, l'analyse
de la diffusionlocalis6e au
pied
des r6flexions deBragg
prouve l'existence ded6placements
de mo16cules enti~resd'amplitude 0,30 h (r.m.s.), d6placements qui
sontcoup16s
de maille ~ maille sdr environ30h,
mais les directionsprivi16g16es
de corr61ations n'ont pas £t6 d6terrnin£escomme dans le cas du
lysozyme.
3.4 MYOGLOBINE. La diffusion diffuse donn6e par les cristaux de
myoglobine
a £t6analys6e
parspectroscopie
M6ssbauer. En combinant deuxtechniques
de r£sonanceM6ssbauer,
laspectroscopie d'absorption
M6ssbauer et la diffusionRayleigh
de r6sonanceW ~'a~
%4-
~g
~ .].W
?'
%
O .
*
M
o »
'
" *
~
*
~
w J
" o
~
«~ ~
" @
~'
~
,
w .
, ~ *
'
O , w
*
~mw
,
~
«
Fig.
I.Exemple
defigures
de diffusion diffuse donndes par les cristaux delysozyme
depoule,
forrneorthorhombique.
Les diffusions sont concentrdes sur des plansparallbles
aux axesrdciproques
a* et c*(resp,
vertical et horizontal), cequi
donne sur le film des trAindes diffuses passant par Ies deux familles derang£es
de rdflexions de Bragg. Le film a >t> obtenu h L-U-R-E-, sur le poste D16, eng£om£trie
fixe(film photographique perpendiculaire
au faisceau incident), avec unelongueur
d'onde de 1,61A.
[Example
of diffusescattering
featuresgiven by
henlysozyme
orthorbombiccrystals.
The features are concentrated alongplanes perpendicular
to thereciprocal
axes a* and b*(resp.
vertical andhorizontal).
On the pattem the
scattering
is visible along rows joining Bragg reflections. The ram has been obtainedon station D16 at L-U- R-E-,
using
a still geometry (filmperpendicular
to the incident beam,wavelength
1.61A),j
M6ssbauer,
Nienhaus et al.[20-22]
ont conclu h l'existence de deux types ded£placements
:des
ddplacements
corr£I£s h courte distance(fluctuations
de conformationmol£culaire)
et desddplacements
corrd16s de maille h mailleimpliquant
des moldcules entibres. Lesddplacements
corr61ds h
longue distance, d'amplitude 0,13h (r.m.s.)
h300K, persistent
h bassetemp6rature,
au moinsjusqu'h
100K(amplitude 0,08h (r,m.s.)) (remarquons
que ceparamdtre
est obtenu par latechnique
de diffusionRayleigh
de r6sonanceMbssbauer, technique qui
nerequiert
pas laprdsence
d'un atome de fer dans lamoldcule).
Aucontraire,
les fluctuations de conformation semblentdisparfltre
au-dessous de 200 K environ.Grfice h la tr~s faible
largeur
de bande en6nergie
6mise par une source~?Fe
de rayonsy
(=4,7
xl0~~eV),
il estpossible
des£parer
la diffusion£lastique
de la diffusionindlastique
et ainsi d'affirrner que les deux types deddplacements
d£crits ci-dessus fontintervenir des vibrations dont les
fr£quences
sontsupdrieures
h 10? Hz. Laspectroscopie
M6ssbauer perrnet donc d'obtenir certaines inforrnations concemant les
fr6quences
assoc16es h la diffusiondiffuse,
ce que ne perrnettent pas les sources de rayonsX,
mais son utilisationest limit6e par la trbs faible intensitd des sources.
N° 6 DIFFUSION DIFFUSE DONNEE PAR LES PROTEINES 985
~ 2"
3"
4' 2'
hi
3'- 1'
~ -
a
Fig.
2.Projection
de la structure duIysozyme
depoule,
forrneorthorhombique
sur leplan
(a, b) [40]. La maille dldmentaire contient quatre moldcules : 1, 2, 3, 4. La structure peut Etre ddcritecomme la
juxtaposition
derang£es
altemdes de moldcules de type (3-1-3'-1'.. ) et (4-2-4'-2'...)parallbles
h l'axe a. Ce sont les translations de cesrangdes parallblement
h elles-mEmesqui
sont hl'origine
de la diffusion diffuse sur lesplans perpendiculaires
h l'axerdciproque
a*. A noter que lesrangdes parallbles
h l'axe b (1-2-1"-2"...) et(3-4-3
"-4". .) n'existentqu'en projection
car les moldcules 3 et 4 ne sont pas h la mEme cote, iln'y
a pas contact entre ces deux moldcules.[Projection
onto the (a, b)plane
of the henlysozyme
orthorhombic stricture [40]. The unit cell contains four molecules : 1, 2, 3, 4. The stricture can be described as thejuxtaposition
of altemated rows ofmolecule of type (3-1-3'-1'...) and
(4-2-4'-2'...) parallel
to a. The diffusescattering along reciprocal planes perpendicular
to a*originates
in translations of these rows in a directionparallel
to a. Let us note that the rowsparallel
to the b-direction(1-2-1"-2"...)
and(3-4-3"-4"...)
areonly
apparent sincemolecules 3 and 4 have not the same
height,
no contact exists between these molecules.]Ces travaux sur la
tropomyosine,
lelysozyme,
l'insuline et lamyoglobine
soul~vent uncertain nombre de
questions
que nous pouvons forrnuler de lafagon
suivante :la diffusion diffuse donn6e par les cristaux de
protdine
neprovient-elle
pas d'un artefact?quel
est ledegrd
deg£n£ralit£
de ces observations ?se
d£gage-t-il
un modme couvrant l'ensemble des observations ?avons-nous affaire ~ des d6sordres
statiques
oudynamiques
?peut-on avoir acc~s par cette
technique
aux mouvements corr£16s h l'int6rieur d'une mdme mol£cule(par exemple, d6placements
d'£I£ments de la structure secondaire les uns par rapport auxautres).
4. La diffusion diffuse
provient.elle
d'un artefact ?Plusieurs artefacts
possibles
ont 6t6invoqu£s
ausujet
de l'existence de la diffusion diffuse donn6e par les cristaux deprot6ines.
Il a tout d'abord 6t6sugg6r6
que la diffusion diffuseprovenait
deph6nomknes
de r6sonance entre les modes de vibration deprot6ines
cristallis£eset la structure
temporelle
discr~te des faisceauxsynchrotrons
de rayons X(fr£quence
del'ordre de 106
Hz).
Cet argument est imm6diatement r6fut6 par le fait que les mdmesdiffusions sont observables et
identiques
en toutpoint
en utilisant comme source ung£n6rateur classique
de rayons X.Le second artefact
possible
estbeaucoup plus
subtil. Il est bien connu que les rayons Xd£gradent plus
ou moinsrapidement
lesprot£ines
; laquestion
se pose donc de savoir si la diffusion diffuse ne serait pas lesigne
d'uned6gradation
des cristaux. Nous avonsremarqud qu'il
faut en rdalitddistinguer
deux types de diffusion. Lepremier
type,qui
est celuiqui
a dtdanalys£
dans les articles rdsumdsci-dessus,
estpr£sent
dds lapremi~re irradiation,
aussicourte
soit-elle,
et a tendance hdisparaitre
en mdmetemps
que la r£solution desdiagrammes
se ddt£riore. Au
contraire,
le deuxikmetype
de diffusionn'appardt qu'h
un staderelativement avanc£ de la
d6gradation
des cristaux sous l'effet desphotons
X ; la diffusion est alors localis£e essentiellement dans lapartie
centrale del'espace r6ciproque.
Il faut donc fake attention de ne pas confondre les deuxtypes
dediffusion,
seul lepemier type
faitl'objet
dupr£sent
article.La
possibilit6
ded6gradation
des cristaux deprot6ines
par lesphotons
X rend hautement souhaitable l'utilisation dessynchrotrons
comme source de rayons X. Eneffet,
lesddgrada-
tions
n'apparaissent qu'apr~s
un certaintemps, qui
est variable selon lesprotdines
maisqui
ned6pend
que peu de l'intensit£ du faisceau de rayons X. Il y a donc tout int6rdt h travailler leplus rapidement possible,
avec les sources lesplus
intenses.5.
Analyse gdndrale
de la diffusion diffuse.Les observations sur les cristaux de
tropomyosine
ne sont pas en faitreprdsentatives
du comportement de lamajorit6
desprot£ines.
Il existe en effet tr~s peu de fibresqui
cristallisent(la majorit6
desprot6ines qui
cristallisent sont de forrneglobulaire)
et le contenu des cristauxen solvant
(95 9b)
est tr~ssup£rieur
aux contenus habituelsqui
sont de l'ordre de 30 9b ~ 60 9b.En
revanche,
nous allons montrer que les observations sur les cristaux delysozyme, d'insuline,
et demyoglobine
semblent dtrecaract6ristiques
de laplupart
des cristaux deprotdines,
et que les diffusionscorrespondantes
conduisent h deux sortes ded6placements
bien diff6rents : translations de moldcules entibres corr616es de maille ~ maille dans la structure
cristalline,
et fluctuations de conformation moldculairequi
ne sont corr61desqu'h
trbs courte distance(d£placements
detype liquide).
S-I DtPLACEMENTS DE MoLtcuLEs coRRtL#Es DE MAILLE A MAILLE. Les observations
que nous avons effectudes sur
plus
d'unevingtaine
deprotdines (entre
autresfragments
FAB
d'immunoglobuline [23], d£soxyh£moglobine [24] (Fig. 3),
16cithine desoja [25],...) indiquent
lapr6sence
pour tous cescomposds,
h une ou deuxexceptions pr~s,
de diffusionsdiffuses localis6es de la mEme
fagon
que dans lelysozyme,
h savoir sur diffdrentes « familles » deplans r6ciproques.
Nous n'avons pasanalys6
dans le ddtail ces diffusions pour tous lescompos6s
mais le modme des translations d'ensembles deplusieurs
moldculesalign6es
dans des directionscristallographiques simples explique 6galement
convenablement les observa- tions sur laddsoxyhdmoglobine.
Tout porte h croire en fait que cetype
de d£sordre est unecaractdristique
presqueg6n6rale
des cristaux deprot6ines.
Deux remarques sont h forrnuler au
sujet
de ce type de ddsordre. Lapremi~re
conceme la sensibilit6 del'analyse
de la diffusion diffuse. La localisation des diffusions sur des ensembles deplans r6ciproques paralmles, implique
sansambiguit6
l'existence ded6placements atomiques
serdpdtant
selon lap6riode
caract6risant l'axed'alignement
des moldcules. Lad6terrnination de la nature des
d6placements
en cause et des atomesimpliqu6s
ne peut se fairequ'h partir
decomparaisons
entre lesdiagrammes expdrimentaux
et des simulationsnumdriques.
Nous avons tests la sensibilit6 de cette m6thoded'analyse
dans le cas dulysozyme
depoule
en simulant diff£rentstypes
deddplacements
: translationsglobales
de mol£cules(c'est l'exemple qui correspond
le mieux auxobservations)
et oscillations de moldcules autour de leur centre degravitd.
Les simulations sont calcul£es hpartir
de laN° 6 DIFFUSION DIFFUSE
DONN(E
PAR LESPROTfINES
987~
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Fig.
3,Exemple
dediagramme
de diffusion diffuse, obtenu h L.U.R.E., donnde par un cristal deddsoxyhdmoglobine
humaine. On remarque encore les traindes diffuses passant par les rdflexions deBragg.
[Example
of diffusescattering
pattemgiven by
a humandeoxyhemoglobin
crystal (obtained atL-U-R-E-)-
Diffusescattering joining Bragg
reflections rows areagain clearly
visible.]forrnule suivante
qui
n'est valable quelorsque
les groupes demol£cules,
dont lesd£placements
sontcorr£16s,
sontind6pendants
entre eux, ce que l'on peut presquetoujours
supposer:
ID(S)
=
(i~fl~) l~f) l~ (2)
ok lF est le facteur de structure du groupe de mo16cules corr61£es et oh la valeur moyenne
porte
sur l'ensemble des groupes constituant le cristal. Dans le cas de trarJslationsglobales
demoldcules, l'expression
de l'intensitd diffuseprend
la forrne tr~ssimple
:ID(S)
=
(lF(~(l -exp(-4 ar~S~(u~))) (3)
oh u est le vecteur de translation. Darts les autres cas de
d6placements,
notamment ceuxfaisant intervenir des
rotations,
il n'existe pas de forrnuleanalytique simple
et il faut alorsd6composer
lestrajectoires
end6placements
61dmentaires et effectuernum£riquement
des moyennes.L'analyse
s'effectue en recherchant les ensembles d'atomes ou de mol£cules dont lesd6placements
peuvent dtre corr616s. Lesparam~tres
h ddterrniner parcomparaison
entre les filmsexpdrimentaux
et les simulations sont : la direction desrang£es
decorr£lation,
leurlongueur (dgale
h l'inverse del'dpaisseur
desplans diffus),
lacomposition
mol£culaire des ensembles et lesd£placements
mis enjeu (g£omdtrie, direction, amplitude).
o
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e , i - e
j
a) b)
Fig.
4.Comparaison
de deux simulations de diffusion diffusecorrespondant
au quartsupdrieur
droit de lafigure
I. Lafigure
4a est obtenue avec Ie modble de translations de files de moldculesparallbles
aux axes a et c, l'accord avec le film est assez bon. La
figure
4b est obtenue avec le modble d'oscillations de dimbres (moldcules de type 2~l et 4-3") autour de l'axe c. L'intensit£ diffuse est tout h fait diff6rente de celle observdeexpdrimentalement.
[Comparison
between two simulated diffusescattering
pattems of the upper andright
part offigure
I.Figure
4a is obtainedassuming
a model with translations of entire rows of moleculesparallel
to the a andc~axes ; the agreement is rather
good. Figure
4b is obtainedassuming
a model with oscillations of« dimers » (molecules of type 2-1 and 4-3'i around the c~axis. The simulated diffuse
scattering
featuresare
quite
different from the observed ones.]La
figure
4 montre diffdrentes simulationscorrespondant
au film de lafigure
I obtenuesavec des translations
(4a)
ou des oscillations(4b).
Les simulations sont suffisamment diffdrentes les unes des autres pour perrnettre d'affirrner que l'on a bien affaire h destranslations et non h des oscillations. Les oscillations
analysdes
sont en fait des oscillations decouples
de moldcules lifes entre elles par un axe 21parallme
h l'axe c. A I'£chelle de cesdimbres
l'empilement
moldculaire est detype
«herringbone packing
», h savoif constitu£ pardes colonnes
parallkles
h l'axe c, formdes de dim~resempilds
les uns sur les autres,altemativement orientdes selon deux directions autour de leur axe de
fagon
h conduire hl'empilement
leplus compact possible.
Cetype d'empilement
est trbsfrdquent
pour les moldculesorganiques [26]. Remarquons
que nous avons dcartd apriori
le mod~le consistanten des
ddplacements
detype ouverture-ferrneture,
autour d'unechami~re,
des deux lobesconstituant la moldcule de
lysozyme.
Ce type ded£placement
est en effet interdit parl'empilement
des moldcules dans le cristal :chaque
moldcule a un lobepris partiellement
en tenaille entre les deux lobes d'une moldcule voisinequi
estgrossikrement perpendiculaire
h lapremikre,
et l'autrepris
en tenaille entre deux moldculescontiguds
lelong
de l'axe c. Il en rdsulte que lesddplacements
des lobes sontpratiquement compl~tement bloquds
par lesmol£cules voisines dans le cristal.
La deuxidme remarque est relative h la vraisemblance
physique
de ces translationsN° 6 DIFFUSION DIFFUSE DONNEE PAR LES PROTEINES 989
corr61£es. Pour que les translations soient corrd16es de moldcule h moldcule il est n6cessaire que celles-ci soient li£es de
fagon
relativement forte les liaisonscorrespondantes
sont trbscertainement assurdes par les contacts interrnoldculaires. L'examen de ces contacts montre en
effet que les directions de corrdlation
correspondent
bien aux directions oh les contacts interrnoldculaires sont lesplus nombreux, typiquement
une demi-douzaine de liaisons inf£rieures h 4h accompagndes
de formations de liaisonshydrogkne.
Parexemple,
l'absence de contacts selon la direction bexplique,
dans le cas dulysozyme,
l'absence de translations corrdldes selonb,
cequi
n'61imine pascependant
lapossibilit6
de translations individuelles des mo16cules dans cette direction.Une
approche
diffdrente del'analyse
des corr61ations hgrande
distance a 6tdpr6sent6e
parCaspar
dans l'6tude de l'insuline[19]
elle est bas6e surl'analyse
des halos de diffusionqui
entourent les r6flexions de
Bragg.
La localisationp6riodique
de cetype
de diffusion diffuseindique
que le d6sordrequi
est h sonorigine
respectepartiellement
la structurep6riodique,
c'est-h-dire que l'on a affaire ~ des
d6placements
noncompl~tement ind6pendants
de maille h maille. Ceph6nomkne,
tout h faitg6n6ral,
se retrouve pour tous les cristaux. Dans le cas des cristaux «classiques
», larigidit6
de la structure cristalline perrnet aux vibrationsatomiques
de se propager dans le cristal sous forrne d'ondes
harmoniques (phonons).
La diffusionqui
enr6sulte est concentr6e en halos autour des r6flexions de
Bragg
et son intensit6 vane enI/q~
oh q est la distance parrapport
au centre de la rdflexion[16].
Dans le cas del'insuline,
cette ddcroissance en intensitd est
plus
lente(I/q~
avec 1~ <2),
cequi
traduit l'existence de vibrationsanharrnoniques
dont laport£e
des corr61ations est limit6e(environ 30h
pourl'insuline,
soit un h deux diamktresmo16culaires).
Autrementdit,
lesddplacements globaux
des mol£cules d'insuline ne se transmettent, dans le
cristal,
que sur une h deux mailles en moyenne.Un comportement
analogue
a £t6 observ£ avec les cristaux colloidaux[27]
et certainesm6sophases smectiques [28]
pourlesquels
une d£croissance de l'intensit£ aupied
des rdflexions deBragg
du mdmetype
a £t£ observ£e.Ainsi,
bien que les cristaux deprotdines pr£sentent g6n6ralement
des forrnes caract6risdes par des facesplanes
et desangles vifs,
et donnent desfigures
de diffraction tr~s biend6finies,
ils constituent en r6alit6 desobjets
« mous », au sens oh les corr61ations des
d6placements
sont de courteport6e.
Contrairement h la m6thode
d'analyse adoptde
dans l'dtude dulysozyme,
lapr£sente
approche
des corr£lations desd£placements
moldculaires dans le cristal d'insuline ne s'attachepas h rechercher d'6ventuelles directions
privil£gides
de corrdlations. Il nous sembleimportant
en fait de ne pas se limiter hl'analyse
de la d£croissance de l'intensitd des halos de diffusion autour des r£flexions deBragg
maisd'analyser
l'ensemble des diffusions afin de d£terrniner les directionsprivil£g16es
desd6placements
et des corrdlations parrapport
aux axes cristallins. Eneffet,
nous avonsd6jh soulign6
que lesd6placements
corr616s de maille h maille sont eng6n6ral
tout h faitanisotropes
etqu'ils
reflktentl'anisotropie
des contactsinterrno16culaires.
L'amplitude quadratique
moyenne desd£placements
moldculaires est estim6e h0,3h
(r.m.s.)
pour l'insuline cette valeur est16gkrement sup6rieure
h celles mesur6es par diffusionin61astique
de neutrons[29]
et parspectroscopie
M6ssbauer[20-22]
sur lamyoglobine
:0,14 h
h0,17 h (r.m.s.).
Pour lelysozyme,
lesamplitudes
sont de l'ordre de0,25 h,
maisce sont des valeurs
correspondant
h deux directions bienprdcises,
donc difficilement compara- bles aux autres.Bien que ce
type
de ddsordre necontribue, d'aprbs [19], qu'~
20 9b-40 9b du facteurDebye- Waller,
l'intensit6 diffusequ'il engendre
estbeaucoup plus
intense que pour lesd£placements
de courte
port6e
car le nombre d'atomes corr616simpliqu6s
estbeaucoup plus grand,
surtoutclans le cas de corrdlations s'dtendant h
longue
distance. L'intensit6 desplans
diffus peut atteindre le dizidme de l'intensitd moyenne des r6flexions deBragg.
Enfin,
il estimportant
de remarquer que cetype
deddsordre,
caract6risd par desd6placements
mo16culairesrigides
corr61£s de maille ~maille,
se rencontre tr~sfr6quemment
dans les cristaux
organiques
detype
mo16culaire[31-33].
Ces d6sordres setraduisent,
comme pour lesprot£ines (que
l'on peut aussi consid£rer comme des cristauxorganiques
mo16culai-res)
par de la diffusion diffuse localis6e lelong
deplans
del'espace r6ciproque.
5.2 FLUCTUATIONS DE CONFORMATION CORR#L#ES A COURTE DISTANCE. D-L-D-
Caspar
et al.
[19]
ont tr~s bien d6crit etanalys6
la diffusion diffuse r6sultant des mouvements corr616s h courte distance dans leur Etude sur l'insuline.L'expression
de l'intensitd diffuse peut s'dcriredans ce cas :
I~(s)
=
(i exp(-
4«2s2(u2) )) (Fo(s)(~
* TF
jc (y)j (4)
oh
(u~)
est led6placement quadratique
moyen,Fo(S)
le facteur de structure de la maille moyennequi
est convolu£ ~TF[C (y)],
transforrn£e de Fourier d'une fonction de coupurequi
tient compte de laport6e
r6duite y descorr61ations;
la fonction C choisie est:C(y) =exp(-0,5(r/y)~).
La diffusion diffuse est donc moddlisable ~pant
de deuxparam~tres
:(u~)
et y.L'expression (4)
ne contient pas de terrne d'interfdrenceprovenant
d'unep6riodicitd quelconque
desd£placements.
L'intensit£ diffusecorrespondante
se trouve parcons£quent r£partie
defagon
continue et monotone dansl'espace rdciproque.
Cette intensitd est tr~s faible(de
l'ordre du milli~me de l'intensitd des rdflexions deBragg)
car tr~s peu d'atomesinterfbrent
constructivement,
cequi signifie
que sa d£tectionrequiem
uneanalyse
ddlicate du fond continu avec soustraction de toutes les autrescomposantes
de diffraction-diffusion(principalement
diffusion dusolvant,
ducapillaire
et effetCompton).
Le calcul de l'intensit£ diffuse
repr£sente
d'autre part unimportant
volume de calculs ~cause du
produit
deconvolution,
cequi
rend assez difficilel'exploitation
de ce type dediffusion. Dans le cas de
l'insuline,
lacomparaison
d'un seuldiagramme
de diffraction ~ des simulations de diffusion diffuse aperrnis
de d£duire les deuxparambtres pertinents,
h savoiru =
0,4h (r.m.s.)
et y=
6h;
cette valeur de u estcomparable
h celle obtenue sur lamyoglobine
: u=
0,36 A
par diffusion de neutrons[29].
La faible valeur de laportde
des corr£lationssignifie
que lesd£placements
ne sont corr£ldsqu'h
courtedistance,
entreplus proches voisins,
comme dans lesliquides.
Enimportance
relative parrapport
aux autres types de ddsordrespossibles,
la contribution des ddsordres ~ courte distance a £t£estim£e, toujours
dans le cas de
l'insuline,
de 60 h 80 9b dud6placement quadratique
moyen total. Cette valeurest donnde par le facteur
d'agitation therrnique qui
somme toutes les contributions enu
(0,5 I (r.m.s.)).
A noter que l'6tudeen diffusion
in61astique
de neutrons sur lamyoglobine [29]
conduit ~ une valeuranalogue.
Les fluctuations intramol£culaires de type
liquide
observ6es pour l'insulineapparaissent-
elles
dgalement
avec les autres cristaux deprot£ines
? Nous pouvonsapporter
~ cettequestion
deux d16ments de
r6ponse ind£pendants.
Lepremier
est foumi par le fait que desanalyses
menses sur d'autres
prot6ines,
en utilisant la mEmetechnique [34],
ont abouti aux mEmes conclusions que pour l'insuline. Le second 616ment estfoumi,
comme nous l'avonsd6j~
mentionn6,
par lesanalyses
de diffusionin61astique
de neutrons[29, 30]
et de diffusion M6ssbauer[20-22]
effectu6es sur lamyoglobine
et lelysozyme.
Ces deuxtechniques
ontmontr6
l'existence,
~temp6rature ambiante,
ded6placements qui
semblent dtre de mEmenature, et
indiqu6
leurdisparition
en dessous de 190 K.L'image
que l'onpeut
se fake des cristaux deprotdines
~partir
dugrand
nombre et de la finesse des rdflexions deBragg,
~ savoir des moldcules de conformation bien ddfinie forrnantun cristal tr~s bien
ordonn6,
est en r6alitd trbstrompeuse.
Nous avons en effetessayd
deN° 6 DIFFUSION DJFFUSE DONNEE PAR LES PROTEINES 991
montrer que
l'analyse
de la diffusion diffuse donn6e par ces cristaux conduit h une tout autreimage.
Pluspr6cisdment,
les cristaux deprot6ines,
comme laplupart
des cristauxorganiques moldculaires,
sont lesi~ge
ded6placements globaux
des mo16culesqui peuvent
se transmettre de maille h maille(d£placements interrno16culaires)
maisqui
sont tr~s amortis. Outre cesddplacements globaux,
la conformation des mo16cules fluctue autour d'une conformation moyenne, les corrdlations desd£placements
entre atomes voisins sont de trbs courteportde (ordre
detype liquide).
Ce doublecomportement
tr~sparticulier
est lid ~ laprdsence
de mol£cules d'eau autour et h l'int6rieur desprot£ines.
Cepoint
a £t6analysd
par D-L-D-Caspar
dans un article r£cent consacr6 ~ laplasticit£
desprot£ines
cristallis£es[35].
Lesmoldcules d'eau ne seraient pas distribu£es uniforrn£ment comme dans un
liquide,
mdmecelles
n'appartenant
pas ~ lapremi~re
couche autour de laprot£ine,
et leur mobilitd rdduite conditionnerait la d£forrnabilit6 desprot6ines.
5.3 CARACTiRE STATIQUE OU DYNAMIQUE DES D#PLACEMENTS A L'ORIGINE DES DIFFU-
sIoNs DIFFUSES.
D'apr~s
lesexp£riences
sur lamyoglobine d£jh
cit£es itapparait
clairement
qu'au
moins unepartie
ou lamajeure partie
desd£placements,
intramol£culaires«
liquides
» et interrnol£culaires sont de naturedynamique
avec desfr£quences
de l'ordre de 10~° h 10I2 Hz. Mais ces r£sultats n'excluent pas l'existencepossible
ded£placements
defrdquences plus
basses ou mdmestatiques.
La
persistance
desd£placements
corr£I£s de maille ~ maille ~ bassetemp6rature (au
moinsjusqu'~
100K)
et le «gel
», dbs200K,
des fluctuations de conformation n'est pas sansrappeler
le comportement des verres[36]
ou despolym~res [37] qui
sont caract£ris£s par deux types de relaxation : une relaxation a lentequi
est unphdnom~ne
collectif etqui persiste
~basse
temp£rature,
et une relaxationrapide fl, caractdristique
de mouvementslocaux, qui disparait
h bassetemp£rature
il fautcependant
segarder
de poussertrop
loinl'analogie
carles mouvements dans les cristaux de
protdines
nes'analysent peut-dtre
pas en terrnes derelaxations de mdme nature que dans les verres ou les
polym~res.
Une
expdrience
int£ressante pour confirrner ces rdsultats consisterait h suivre lecomporte-
ment des diffusions en descendant en
temp£rature
: les diffusions provenant de d£sordresstatiques
ou de tr~s bassesfrdquences (probablement
desddplacements
de mol£cules enti~resavec corrdlation de maille ~
maille)
ne devraient pas dtremodifides,
contrairement aux diffusions de caractbredynamique (fluctuations
deconformation)
dont l'intensit6 devrait diminuer.Pour terminer ce
paragraphe,
il fautsignaler
que mdme la d6tection de d£sordresstatiques
peut avoir unesignification
au niveau du comportementdynamique
desprot£ines.
Eneffet,
on
peut imaginer
queparmi
l'ensemble des conformations que peutadopter
uneprot6ine
ensolution,
deux ou trois de cesconformations,
et non uneseule,
se trouventfig6es
dans le cristal h cause de l'environnementcompact.
L'observation de ces conformations serait alorsl'indice d'une mobilit6 intramoldculaire entre
plusieurs
conformations. Une telle observationa dtd faite sur le mutant du
lysozyme phage
T4 dont les quatre mo16cules de l'unitdasymdtrique adoptent
quatre conformations distinctes[38].
Les diffdrences se situentprincipalement
au niveau de l'ouvertureangulaire
entre les deux lobesqui
vane dans uneplage
de 30°. Un autre cas mdrite d'dtresigna16
bienqu'il
ne conceme pas lesprot6ines,
mais I'ADN. La mise en Evidence de la coexistence de deux conformations A et B de I'ADN surdes cristaux
d'oligonucl60tides d(GGTATACC)
a 6t6 obtenuegrice
~l'exploitation
de ladiffusion diffuse
(Fig. 5)
: des moldculessuppldmentaires
de conformation B sont ins6rdes dans delarges
canaux creux forrn£s par les moldcules de la matrice cristallis£equi,
elles,adoptent
la conformation A[39].
*
-, '~ w-I '~
.'''
*4 W #
,
Fig.
5.Exemple
de diffusion diffuse donnde par les cristaux del'oligonucldotide d(GGTATACC) (fragment
d'ADN contenant huitpaires
de bases). Les moldculessuppl£mentaires qui n'appartiennent
pas h la matrice cristalline donnent des
figures
de diffusion diffuse tr~s intenses le long du mdridien(vertical)
et des strates en croix dans la partie centrale dudiagramme.
[Example
of diffusescattering
featuresgiven
bycrystallized oligonucleotide
d(GGTATACC) (DNAfragments
of eightbase-pairs length).
The additional molecules which do notbelong
to thecrystalline
matrix
give
rise to intense diffusescattering
featuresalong
the meridian (vertical) and weak ones in the central part of the pattem (linesperpendicular
to the meridianforming
a cross).]6. Peut.on avoir accks aux
ddplacements
intramolkculaires corrdlds ?Les
premibres analyses
de la diffusion diffuse donnde par les cristaux deprotdines
ont mis en Evidence deux types de ddsordres : des d6sordres intramol£culaires(fluctuations
de conforma-tion)
et desd6placements globaux
de moldcules corrd16s de maille ~ maille. D'6ventuelsddplacements
intramoldculaires caract6risds par desd£placements
concert6s de groupesd'atomes au sein d'une mdme mol£cule,
qui
sont lesplus
int£ressants dupoint
de vuebiologique,
n'ont pas encore dtd ddcelds par cettetechnique.
La raison de cette lacune r£sidesans doute dans la difficult6 de
distinguer
ce type de diffusion des deux typesprincipaux
quenous venons de ddcrire. En
effet,
lesd£placements
intramol£culaires recherch£s seront soitnon corral£s de maille ~
maille,
et dans ce cas on s'attend ~ observer desfigures
de diffusion faibles et tr~s peustructur£es, qui
auront parcons£quent
tendance ~ se confondre avec ladiffusion 6manant des fluctuations de «
type liquide
», soit corr£I£s de maille ~maille,
cequi
devrait conduire ~ des diffusions localis6es aux mdmes endroits que les diffusions
produites
par les
ddplacements globaux
de moldcules, mais moduldes diff£remment en intensit£(diffusions
selon des familles deplans
del'espace rdciproque).
La contribution d'dventuels
