Correction mai 2007
Pour répondre à ce sujet, il fallait connaître un peu de la biologie des choanoflagellés et des éponges. Connaître un peu la multicellularité aidait fortement à rédiger une discussion de qualité.
- Pour mettre en évidence la présence de gènes codant pour des kinases Src et Csk, chez les deux organismes, le plus simple est d'amplifier de l'ADN génomique issu de ces deux organismes avec des oligonucléotides dégénérés élaborés à partir des régions conservées des kinases Src et Csk. La séquence des produits PCR obtenus permet de vérifier s'ils sont bien amplifiés à partir des gènes Src et Csk. Enfin pour obtenir les séquences codantes complètes des gènes Src et Csk, il faut cribler des banques (génomique ou d'ADNc) en utilisant les fragments PCR comme sonde. Notez que les génomes de ces deux organismes ne sont pas encore connus. Si cela était le cas, une recherche dans les fichiers de séquence par BLAST de protéines similaires aux Src et aux Csk aurait suffi.
(4 points)
- Pour mettre en évidence la phosphorylation de c-Src, le plus simple est de faire un extrait brut de cellule de rat dépourvu d'activité Csk mais avec une activité Src et l'incuber avec les protéines Csk de M. ovata et E. fluviatilis. Celles-ci peuvent être produites par E. coli via un système d'expression (méthode préférable) ou directement par les cellules de rat après transfection de celles-ci (notez que leur purification à partir des deux organismes est probablement très difficile). Le témoin négatif sera l'incubation de l'extrait de cellule de rat sans protéine ajoutée. Pour voir la phosphorylation de c-Src, il faut ensuite faire un western blot et détecter avec un anticorps spécifique de Src phosphorylée, éventuellement, d'un anticorps anti-tyrosine phosphorylée (si on ajoute les protéines Csk purifiées à partir de E. coli car alors il sera presque sur que la phosphorylation observée sera due à Csk). Notez que (1) on doit détecter le niveau basal d'autophosphorylation de c-Src dans le cas d'un anticorps anti-phosphotyrosine et (2)
l'on pourrait aussi indirectement détecter la baisse de phosphorylation des protéines 293T mais que cela ne donnerait pas le niveau de phosphorylation de c-Src. (2 points)
- Pour mettre en évidence la phosphorylation des Src par la Csk de rat, il faut faire la même expérience mais en utilisant un extrait de cellule de rat avec activité Csk mais sans activité Src et les protéine Src de M. ovata et E. fluviatilis. Les anticorps seront les mêmes. (2 points).
- L'inactivation des protéines Src se fait en regardant par Western Blot, le degré de phosphorylation des protéines 293T dans le même extrait. Il doit être faible dans le cas de l'incubation avec la protéine de E. fluviatilis et fort avec la protéine de M. ovata. Un témoin possible de ces expériences est l'utilisation d'une c-Src de rat (2 points)
- Pour voir les effets physiologiques des protéines Src dans les cellules de rat, il faut construire la cassette avec le promoteur de mammifère suivi des séquences codantes de chacun des gènes de M. ovata et E. fluviatilis sur un plasmide qui l'associe à un marqueur de sélection (résistance à une drogue). Ce plasmide est ensuite introduit dans des cellules de rat sans activité Src (par électroporation par exemple). Les cellules qui ont une cassette intégrée sont sélectionnées grâce à leur résistance à la drogue. On peut vérifier l'expression de la cassette par Northern Blot (détection des messagers) ou Western Blot (détection des protéines Src). L'observation au microscope permet d'observer les morphologies cellulaires. (2 points)
- Ces résultats sont très intéressant d'un point de vue évolutif et plus particulièrement sur la mise en place de la multicellularité chez les animaux. En effet, ces résultats montrent :
(1) la présence de protéines kinases impliquées dans la multicellularité chez une éponge (pour laquelle, la multicellularité est plutôt primitive) et un choanoflagellé, un
organisme unicellulaire (même s'il est toujours possible qu'il soit un stade unicellulaire d'un organisme pluricellulaire). Cela suggère que des outils utilisés pour gérer la multicellularité complexe des animaux, sont déjà présents chez des organismes plus simples et que ceux-ci ont déjà des potentialités de multicellularité. Les raisons de ces potentialités ne sont pas claires. On peut émettre l'hypothèse que ces protéines ont une fonction autre (en particulier dans la prolifération cellulaire: leur activité pourrait réprimer la division cellulaire en réponse à la carence par exemple). (4 points)
(2) une corrélation entre inhibition de l'activité Src par la Csk et la mise en place d'un système de régulation de la prolifération cellulaire, l'activité de la Src de l'unicellulaire M. ovata n'étant pas inhibée par les Csk alors que celle du pluricellulaire E. fluviatilis
l'est. Il est donc probable que la mise en place de la multicellularité a passé par la mise en place de la régulation de Src par la Csk. Enfin, cela soulève le problème du rôle de la Csk chez M. ovata. Notez que le sens inverse de l'évolution (perte de la multicellularité chez M. ovata est possible mais peu probable car pas en accord avec les autres données connues sur la phylogenèse des eucaryotes. (4 points)
