Xylella fastidiosa :
Etat des connaissances et axes de recherche
Philippe Reynaud (Anses Montpellier) avec l’aide de J.Y.
Rasplus et al. (INRA) et F. Poliakoff et al. (Anses Angers)
Anses - Laboratoire de la santé des végétaux
Unité Mycologie
Nancy
Unité Ravageurs et agents pathogènes
tropicaux La Réunion Unité
Quarantaine Clermont-
Ferrand
Unité Entomologie et plantes invasives
Montpellier
Siège
et
Unité Bactériologie, virologie, OGM
Angers Unité
Nématologie Rennes
Laboratoires
de référence
• Etat des connaissances
• Axes de Recherche
Xylella fastidiosa
• Bactérie du xylème
Epiderme Cortex
Moelle
Cambium
Xylème Phloème
Cambium
Xylème Phloème
Xylella fastidiosa
• Produit des biofilms qui obstruent les vaisseaux
• 0,1-0,5 x 1-5 µm
Modélisation du mouvement de X. fastidiosa dans le xylème
Karyn L. Newman et al. PNAS 2004;101:1737-1742
Bactérie
Signal chimique
XXXXX:
• -
Découverte
• “California Vine Disease”:
Première détection à Anaheim (Ca) en 1884
(Pierce 1892)Newton B. Pierce
• 1949 : virus?
(Hewitt et al.)• Premier isolement sur milieu en 1978
(Davis et al.)• Nommée en 1987
(Wells et al.)• 1987 : Chlorose panachée des Citrus au Brésil
• Fin des années 1990 : maladie de Pierce, California
Découverte
Xylella fastidiosa : distribution
Brésil
Italie Ontario
Canada USA Mexico
Costa Rica
Venezuela Equateur
Argentine
Paraguay 1987 1880
Brésil
Xylella fastidiosa : distribution
Brésil
Italie
Iran Ontario
Canada USA Mexico
Costa Rica
Venezuela Equateur
Argentine Paraguay
Taiwan 2013
2014
2013
1987 1880
interceptions en 2012, 2014 et 2015 sur plants de caféier
Italie
Iran
Brésil
Foyers
Taxonomie et spectre d’hôte
Xf fastidiosa
(PD, ALS) : vigne, amandier, 42 famillesXf sandyi
(OLS) : laurier rose, caféiersXf morus
: muriers (fastidiosa x multiplex)Xf multiplex
(PDD, PLS) : Prunus, Quercus, oliviers, Polygala etcXf pauca
(CVC) : agrumes, oliviers, caféiers5 sous-espèces généralistes (env 300 plantes/60 familles au total)
Lignées génétiques avec spectres d’hôte plus réduits (à confirmer)
PD = Pierce’s disease
ALS = Almond leaf scorch disease PDD = Phony peach disease
PLS = Plum leaf scorch OLS = Oleander leaf scorch
CVC = Citrus variegated chlorosis
X. fastidiosa : distribution des sous espèces
Brésil
Italie
Iran Ontario
Canada USA Mexico
Costa Rica
Venezuela Equateur
Argentine Paraguay
Italie
Iran
Brésil
subsp. fastidiosa
subsp. sandyi subsp. multiplex subsp. pauca
Identification des souches X. fastidiosa en France
2 profils différents de Xylella fastidiosa, présents à la fois en Corse
et en région PACA:
X. fastidiosa subsp. multiplex
profil A (ST7)
profil B (ST6)
ST7
ST6
11
Distinctes de la souche CoDiRO X. f. subsp. pauca
présente en Italie
MLSA/MLST
(Scally et al., 2005 / Yuan et al., 2010)
Les insectes vecteurs
Les espèces vectrices potentielles
4 familles d’Hémiptères (51 spp F, 119 UE) Aphrophoridae (15 sp F, 29 sp UE)
Cercopidae (7 sp en F et UE) Cicadellidae (9 sp en F et UE)
Cicadidae et Tibicinidae (20 sp en F et 74 en UE)
Piqueurs-suçeurs de xylème
Mal connus
Globalement polyphages
Pour la plupart communs
Populations importantes
Déplacement relativement faible
En général une génération par an
Passe l’hiver sous forme d’œufs ou de larves (cigales)
Aphrophoridae
Cicadellidae Cicadidae
Cicadella viridis Cercopis intermedia
Cercopis larve Philaenus spumarius Aphrophora alni
Cicada orni Lyristes plebejus
Cercopidae
Graphocephala fennahi USA => UE
Cycle biologique type d’un Cicadellinae
Adulte Œufs
Larves vectrices Adultes vecteurs
Graphocephala atropunctata
Draeculacephala sp Graphocephala sp
Draeculacephala minerva
Homalodisca liturata
Les vecteurs nord-américains
Piqueurs-suçeurs de xylème
Appartiennent à des genres et des groupes différents
Bien connus, mais connaissance difficilement transposable
Plusieurs générations par an en région chaude
Certaines espèces passent l’hiver à l’état adulte
Un vecteur introduit récemment en CA a eu un impact fort sur la propagation de la maladie (Homalodisca vitripennis)
Cicadellidae
Philaenus spumarius UE => USA
Neophilaenus lineatus UE => USA
Xylème
Cibarium / précibarium
X. fastidiosa ne passe pas d’un stade à l’autre
Plantes hôtes identifiées en Corse
• Acer pseudoplatanus
• Artemisia arborescens
• Asparagus acutifolius
• Cistus monspeliensis
• Cistus salviifolius
• Coronilla valentina
• Cytisus racemosus
• Genista ephedroides
• Pelargonium graveolens
• Lavandula angustifolia
• Lavandula dentata
En vert: nouvelles plantes hôtes (genre et/ou espèce),
non listées précédemment par l’EFSA (Scientific opinion 2015).
Scientific report EFSA 2016 :
359 espèces hôtes / 75 familles botaniques
• Lavandula stoechas
• Myrtus communis
• Hebe sp.
• Polygala myrtifolia
• Prunus cerasifera
• Quercus suber
• Rosa x floribunda
• Rosmarinus officinalis
• Spartium junceum
Détection de X. fastidiosa sur plantes hôtes par PCR en temps réel : Méthode évaluée et validée
Extraction d’ADN automatisée avec le kit QuickPick™ Plant DNA (Bio- Nobile) et l’automate KingFisher™ mL
PCR en temps réel Harper et al., 2010, Erratum 2013
Méthode de référence MA039 version 1
Méthode disponible sur : www.anses.fr
Méthode de référence MA039 version 1
Xylella fastidiosa: bactérie du xylème
Analyse réalisée sur tissus fortement vascularisés de plantes en végétation: pétioles et/ou nervures centrales
2 prélèvements pour extraction d’ADN
4 amplifications géniques 1 échantillon
0,5 à 1 g par échantillon:
soit 5 à 100 pétioles
• Etat des connaissances
• Axes de Recherche
? ?
? ?
Ps Co
Xfp Cs
Olive Prunus
Réservoirs
Asymptomatique
Cultures
? ?
? ?
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Vecteurs
Maladie
Xfm
La problématique Xylella est complexe
Axes de Recherche
26
Travaux
d’identification des
souches de Xylella Test de
pathogénicité Identifier les vecteurs, diagnostiquer la
bactérie et identifier la souche concernée
Prévision et gestion du risque par la
modélisation Travaux pour la
détection de Xylella sur les vecteurs
Surveillance des vecteurs potentiels Evaluation des types de piégeage Collection de référence
Création de clés d’identifications
Xylella fastidiosa est très difficile à isoler de plantes contaminées. L’unité BVO (Angers) a néanmoins réussit à isoler sur milieu artificiel :
17 souches sur échantillons de Corse 3 souches sur échantillons de PACA 7 souches sur caféiers interceptés
Afin d’identifier rapidement les sous-espèces en présence sans réaliser d’isolement, l’Unité BVO a
optimisé les PCR Hernandez-Martinez et al. (2007) et Pooler et Hartung (1995) permettant de discriminer les quatre principales sous-espèces (fastidiosa, multiplex, pauca, sandyi), confirmées par MLSA
(séquençage de 7 gènes de ménage) (collaboration avec équipe INRA (Emersys).
4
Anses – INRA : Travaux d’identification des souches de Xylella
Centre International de Ressources
Microbiennes
Identification des sous-espèces par MLSA
Phylogénie par MLST
Séquençage partiel des gènes CysG, gltT, holC, leuA, malF, nuoL, petC
INRA/Anses : Test de pathogénicité : Projet régional SapAlien
Test de pathogénicité en cours (programme sur deux ans 2015- 2017)
Plantes hôtes potentielles
• Olea europaea
• Vitis vinifera
• Nerium oleander
• Coffea arabica
• Malus domestica
• Polygala myrtifolia
Souches de X. fastidiosa
• X. f. subsp. multiplex ST6 (Corsica)
• X. f. subsp. multiplex ST7 (Corsica)
• X. f. subsp. pauca (CoDiRO)
• X. f. subsp. pauca (from intercepted Coffee tree)
• X. f. subsp. fastidiosa/sandyi (from intercepted Coffee tree)
• X. f. subsp. fastidiosa (USA)
• X. f. subsp. multiplex (USA)
9
• Medicago sativa
• Nocotania tabacum
• Catharanthus roseus
Anses : Travaux pour la détection de Xylella sur les vecteurs
Optimisation, évaluation et validation de méthodes moléculaires pour la détection sur insectes (ex: Philaenus spumarius)
Janvier - mars 2016: Démarrage de l’optimisation de la méthode
Comparaison de méthodes d’extraction d’ADN
Utilisation de la PCR en temps réel (Harper et al., 2010)
Premiers résultats: bonne sensibilité avec le kit d’extraction ADN QuickPick Plant DNA
Besoin d’insectes contaminés (d’Italie) pour valider la méthode (collecte possible en avril)
Evaluation de méthode sur autres insectes vecteurs potentiels (cicadelles) Second semestre 2016: test de la méthode NGS proposée par l’UMR CBGP (JY.
Rasplus)
Comparaison de méthodes d’analyses sur échantillons artificiellement contaminés: NGS et PCR en temps réel (Harper et al., 2010), optimisation.
Test sur échantillons naturellement contaminés
Préparation d’un projet CASDAR pour application de ces méthodes à l’étude
comportementale des vecteurs potentiels sur cultures d’intérêt (novembre
2016)
• 1 marqueur pour l’identification du vecteur
• 1 marqueur pour détecter toutes les bactéries portées par le vecteur
• 1 ou 2 marqueurs pour identifier la plante d’alimentation
• Les 7-9 marqueurs diagnostiques de Xylella Utilisation d’approches haut-débit
1 run de séquençage => 20 M de séquences
Jusqu’à 1500 individus sur une douzaine de marqueurs.
On peut savoir qui est qui, qui porte quoi, qui a mangé quoi
(applicable sur les plantes)
INRA : Identifier les vecteurs de Xylella, diagnostiquer la présence de la bactérie et identifier la souche concernée par méthode NGS
Recherche du/des vecteurs potentiels de Xylella fastidiosa :
Faible prévalence, vecteurs inconnus => nécessité du volumique
• Identifier qui porte quoi dans une communauté de vecteurs ?
• Assurer la biosurveillance du vecteur et du vecté à haut-débit
• Mesurer la prévalence du vecté dans des populations de vecteurs
• Identifier des liens entre microbiome et phénotype ou vecté
INRA : Prévision et gestion du risque par la modélisation
Comprendre la diffusion Xylella (dispersion, climat, paysage).
Cartographie des zones à risque potentiel.
Cicadelle Homalodisca vitripennis
sud USA, puis Californie
vecteur de Xylella fastidiosa
Maladie de Pierce
Informations
écologiques Informations
climatiques Modèle
statistique
Estimation
défavorable
favorable
Anses : projet H2020 POnTE
(Pest Organisms Threatening Europe)Projet H2020 : Novembre 2015-Novembre 2019
Collection de souches, pathogénicité sur Citrus – Caféier – Pervenche, Luzerne et plantes ornementales, étude de la colonisation des plantes hôtes
Génétique de Xylella
Validation d’anticorps pour l’IF, technique d’extraction d’ADN par automate sur plantes et insectes, validation de PCR pour identification des souches (RT PCR, HRM)
Identification des vecteurs effectifs et proposition de méthodes
d’échantillonnage
Ateliers pour
améliorer la capacité des partenaires à la détection précoce d’émergence de Xylella fastidiosa
Anses : projet Euphresco VECTACROP
VECTACROP : Tracking vectors of bacteria and phytoplasmas threatening
Europe’s major crops
WP 2
: Surveillance des vecteurs potentiels dans et autour des cultures ciblesEvaluation des types de piégeage Collection de référence des vecteurs potentiels
Création de clés d’identifications
WP 3
: Recherche de Xylella dans les insectes (avec l’aide de l’Anses Angers)Projet : Mars 2016 - Mars 2018