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matrices cellules-collagène
Andrea Iordan, Alain Duperray, Anaïs Gerard, Alexeï Grichine, Claude Verdier
To cite this version:
Andrea Iordan, Alain Duperray, Anaïs Gerard, Alexeï Grichine, Claude Verdier. Rôle du remodelage cellulaire sur la rhéologie de matrices cellules-collagène. CFM 2011 - 20ème Congrès Français de Mécanique, Aug 2011, Besançon, France. �hal-03421404�
Rôle du remodelage cellulaire sur la rhéologie de matrices cellules- collagène
A. IORDANc, A. DUPERRAYa,b, A. GERARDa,b, A. GRICHINEa,b,C. VERDIERc
a. INSERM U823, Grenoble, FRANCE
b. Université Joseph Fourier-Grenoble I, Faculté de Médecine, Institut d'oncologie/développement, Albert Bonniot et Institut Français du Sang, UMR-S823, Grenoble, FRANCE
c. CNRS-Univ. Grenoble I (UM5588) LIPhy, 140 rue de la Physique, 38041 Grenoble cedex, FRANCE
Résumé :
Des tissus modèles sont préparés, constitués de cellules dans une matrice de collagène. Les propriétés rhéologiques sont mesurées, qui présentent des non linéarités, en fonction de la concentration en cellules et en collagène. Des expériences complémentaires en microscopie confocale permettent la visualisation des fibres de collagène ainsi que la forme des cellules. Ainsi les cellules remodèlent la matrice, en attirant le collagène vers elles, et en créant des zones dépourvues de collagène, ce qui modifie les propriétés rhéologiques.
Abstract :
Model biological tissues are investigated, by including cells within a collagen matrix. Rheological properties are measured, and reveal nonlinearities, as a function of cell and collagen concentration. Complementary confocal microscopy enables visualization of collagen fibres and cell shape. We conclude that cells remodel the matrix by attracting collagen, and also creating collagen depleted regions, thus modifying the rheology.
Mots clefs :
rhéologie, cellules, remodelage, collagène1 Introduction
Les propriétés rhéologiques de matériaux biologiques sont d'une très grande importance en bioingénierie, ainsi que pour la fabrication de prothèse ou biomatériaux. Ils sont naturellement complexes dans le sens où ils sont composés en général d'une matrice constituée de fibres (matrice extra-cellulaire: collagène, laminine, fibronectine, etc.) dans un milieu aqueux, auxquels se rajoutent des cellules vivantes, qui contrairement aux matériaux classiques peuvent avoir un effet sur les constituants de base. De nombreux travaux ont déjà porté sur les propriétés mécaniques de gels de protéines filamenteuses comme les gels de collagène, de laminine, élastine, fibronectine [1]. Ces travaux se sont concentrés sur la dépendance du module élastique en fonction du type ou de la concentration des fibres. Mais les propriétés de ces réseaux de polymères peuvent donner naissance à des propriétés élastiques non linéaires [2-3].
L'introduction de cellules dans une matrice de collagène [4] complexifie encore la nature des propriétés puisque les cellules participent activement à la réorganisation des fibres ou des éléments structuraux du matériau [5-7]. Des outils actuels sont disponibles au niveau cellulaire comme les techniques de microrhéologie (pinces optiques, AFM, micropipettes, méthodes dites de « tracking ») ; mais il existe aussi de nombreuses solutions globales macroscopiques pour comprendre la rhéologie de tels systèmes (rhéométrie [4], traction, compression [5]).
Afin de comprendre plus précisément la nature des phénomènes en présence, il est fondamental d'introduire des méthodes complémentaires de microscopie, ou des techniques basées sur le rayonnement (X, neutrons, lumière) pour l'investigation de la microstructure des échantillons testés [8]. Ainsi il sera possible de suivre la morphologie des cellules à l'intérieur d'un tissu 3D. De telles méthodes ont récemment été développées
Dans ce travail, nous proposons de mettre en œuvre ces techniques basées sur la microscopie confocale et de coupler ces analyses à la mesure globale des propriétés rhéologiques des systèmes cellules-collagène. Nous pourrons ainsi déterminer la nature des interactions entre les cellules et la matrice de collagène, c'est à dire étudier le remodelage de la matrice par les cellules. Le paragraphe 2 donne les détails des méthodes utilisées tandis que la partie 3 présente les résultats et une discussion propose d'expliquer les phénomènes observés.
2 Matériels et méthodes
2.1 Systèmes biologiques
Le réseau de protéines choisi est celui du collagène (type I, queue de rat, BD Biosciences) qui est préparé à 4°C, puis mélangé à un milieu de culture (DMEM, 10% sérum fœtal de veau). Ensuite le pH est ajusté avec de la soude 0.1M pour atteindre une valeur de 7.4. On rajoute enfin des cellules et on chauffe l'ensemble à 37°C. La polymérisation du réseau du réseau prend environ 30 min. Les cellules choisies sont des cellules épithéliales de type CHO (Chinese Hamster Ovary) qui se comportent comme des fibroblastes. Ces cellules ont déjà été étudiées précédemment en suspension [10].
2.2 Rhéométrie
L'étude de rhéométrie est faite en essais oscillatoires afin de déterminer le module élastique G' et le module visqueux G''. Ces deux modules dépendent de la fréquence de sollicitation qui varie dans notre cas entre 0.01Hz et 2Hz. Le domaine linéaire a été déterminé et se situe en dessous de 2% en déformation (avec ou sans cellules). La température est maintenue à 37°C après avoir attendu la fin de la polymérisation du collagène. Des essais sans cellules et avec cellules ont été effectués.
En général, pour ces systèmes et dans l'intervalle de fréquences choisies, le module G' est quasiment constant et on peut ainsi déterminer un module de plateau G0. Le module G'', dans tous les cas, suit assez fidèlement l'évolution du module G', c'est pourquoi nous avons choisi de représenter par la suite uniquement les valeurs de G'.
2.3 Microscopie confocale
Les essais en microscopie confocale ont été réalisés sur des échantillons préparés de manière analogue et consistent à envoyer un faisceau laser (λ=633nm) afin de mesurer les variations de la polarisation induite par la présence des fibres de collagène (voir FIG. 1). En parallèle, nous pouvons observer les changements morphologiques des cellules car elles expriment la GFP (excitation à 488nm).
FIG. 1 – Schéma du principe de l'illumination en microscopie confocale
3 Résultats et discussion
Quelques résultats sont présentés ci-dessous. Tout d'abord, des courbes de rhéométrie ont été obtenues sur les systèmes à base de collagène seul. Différentes concentrations en collagène ont été utilisées, quatre en tout : 0.42 mg/mL, 0.95mg/mL, 1.38mg/mL et 1.8 mg/mL. La plupart des auteurs utilisent des gels assez concentrés aux alentours de 2mg/mL [5,11] et nos résultats sont en accord avec leurs données expérimentales. La FIG. 2 ci-dessous illustre la variabilité du module G' du collagène, en présence de cellules ou non. Dans le cas où des cellules ont été rajoutées, 3 concentrations différentes ont été testées: 0.7 107 cellules/mL, 1.17 107 cellules/mL et 1.8 107 cellules/mL.
FIG. 2 – Modules élastiques des réseaux cellules-collagène
Les résultats sur le réseau de collagène seul prédisent une dépendance du module de plateau G0 qui varie en puissance G0∼ c2.6, où c désigne la concentration en collagène. Ce résultat est en accord avec la littérature [3]. Les valeurs de G0 obtenues varient entre 1 Pa et 100 Pa, en accord avec d'autres auteurs [11]. Ce résultat valide nos données, et on peut donc s'intéresser aux modifications de ces valeurs lorsque des cellules CHO sont insérées dans le gel de collagène. La FIG. 2 montre les effets non linéaires observés, difficile à modéliser avec un modèle simple d'inclusions. A une concentration de 0.42mg/mL, le module G' augmente lorsque la concentration en cellules augmente. A 0.95mg/mL, le module augmente mais les faibles concentrations en cellules sont confondues avec le système de collagène seul. A plus hautes concentrations (1.38mg/mL et 1.8 mg/mL) en collagène, l'ajout de cellules diminue le module G' qui remonte lorsqu'on ajoute beaucoup plus de cellules. Par ailleurs, si l'on extrait le module de plateau de ces courbes (à 1Hz environ), on observe une dépendance G0∼ c1.1 [4], qui résume bien le fait que les cellules jouent un rôle actif vis-à-vis du collagène.
Afin d'étudier ce phénomène plus localement nous observons en microscopie confocale (FIG. 3) les réseaux de collagènes contenant des cellules.
FIG. 3 – Microscopie confocale d'un réseau de collagène contenant des cellules (c=0.42-0.95-1.38-1.8mg de
On observe le comportement non simple des cellules dans la matrice: les cellules semblent être plus allongées lorsque la matrice est moins dense.
A grande concentration, le réseau se dissocie et semble donner naissance à des régions remplies de fluide interstitiel (milieu de culture). Ceci indique que la structure a été réorganisée par les cellules. Notons qu'aux temps considérés (inférieurs à 3h), il n'existe pas de mécanisme de dégradation enzymatique mis en route par ces cellules. La dépendance non linéaire ainsi que la réorganisation du réseau a été attribué à la compétition entre divers mécanismes de remodelage des cellules :
− densité du réseau (A). Ce dernier possède une maille caractéristique qui ne permet pas forcément aux cellules de s'étaler comme elles le souhaiteraient. Plus le réseau est dense, moins les cellules s'étalent.
− adhésion des cellules à la matrice (B). Comme dans tout processus de migration cellulaire, les cellules développent des adhésions transitoires ou stables sur la matrice (ici le collagène) qui leur permettent de bien s'étaler/adhérer [12]. Plus la concentration en collagène est forte, plus celles-ci s'étalent
En fonction de la prédominance de l'un ou l'autre de ces deux aspects, les cellules peuvent ou non s'étaler, ce qui explique que la forme allongée des cellules est prononcée à faible concentration, alors qu'à grande concentration, cette forme sature et tend vers un plateau [4].
Enfin, nous avons pu observer un troisième mécanisme qui pourrait expliquer le remodelage qui est dû à la capacité des cellules à attirer le collagène et créer des régions moins denses en collagène. Grâce à la microscopie confocale, nous pouvons mesurer l'intensité du collagène localement et mesurer une concentration normalisée par une valeur de référence. Ceci est illustré en FIG. 4.
FIG. 4 – Suivi d'une cellule CHO durant 3h remodelant le réseau de collagène (0.9mg/mL). Les deux flèches sur les axes indiquent l'échelle (9µm)
La région indiquée en blanc (cube) sur la FIG. 4 permet de mesurer la densité de collagène présente dans la boîte. On constate qu'après 1h, la densité est divisée par 2, alors que sur la troisième image, la densité est divisée par 4 (voir Ref [4]), tandis que la cellule se déplace vers le bas à droite. Ceci permet d'amener une hypothèse supplémentaire quant à la réorganisation du collagène menant à une microstructure contenant des trous, ou plus exactement une microstructure où l'on trouve des zones dépourvues de collagène.
− remodelage par les cellules de la structure (C). Les cellules, en se déplaçant, attirent le collagène et le transportent avec elles, ce qui crée des zones dépourvues de collagène, affaiblissant ainsi la structure et contribuant à une diminution des propriétés mécaniques du réseau.
Ce sont probablement la contribution de ces trois principes énoncés ci-dessus (A-B-C) qui mènent à une
«désorganisation» du réseau de collagène. Il est maintenant utile de proposer des modèles qui prendront en compte non seulement la mécanique des réseaux (concentration, propriétés individuelles des cellules), mais aussi les propriétés d'adhésion cellule-matrice extra cellulaire [13], et enfin le comportement actif des cellules.
4 Conclusions
Dans ce travail, il a été montré que les propriétés rhéologiques d'un tissu biologique constitué de cellules enchâssées dans une matrice de collagène sont complexes et régies par des mécanismes intervenant à des petites échelles, où les interactions cellule-matrice sont essentielles. Les facteurs qui gouvernent la rhéologie d'un tel réseau sont la densité de maille du réseau – c'est à dire la concentration – mais aussi les propriétés adhésives des cellules et enfin leur capacité à remodeler les fibres de ce réseau. Cette approche a été possible grâce à la combinaison d'une technique de rhéométrie et d'une nouvelle méthode d'investigation en microscopie confocale. Les conclusions de ce travail permettent de proposer une explication à l'effondrement du réseau de collagène, qui est déstructuré par le remodelage actif des cellules à l'intérieur du réseau.
Remerciements
Ce travail a été financé en partie par le réseau européen Marie Curie (MRTN-CT-2004-503661) sur la modélisation du cancer. Nous remercions l'équipe de la plate-forme de microscopie à l'Institut Albert Bonniot (financement « Association pour la recherche sur le cancer » Villejuif, et le programme "Nanobio").
Références
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