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Analyse des propriétés physico-chimiques et pharmacologiques d'Imidazole [1,2-¯]pyridine : évaluation de l'apport de la RMN HR-MAS pour la compréhension de ces mécanismes

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HAL Id: tel-00573124

https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00573124

Submitted on 3 Mar 2011

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pharmacologiques d’Imidazole [1,2-¯]pyridine : évaluation de l’apport de la RMN HR-MAS pour la

compréhension de ces mécanismes

Sébastien Follot

To cite this version:

Sébastien Follot. Analyse des propriétés physico-chimiques et pharmacologiques d’Imidazole [1,2-

¯]pyridine : évaluation de l’apport de la RMN HR-MAS pour la compréhension de ces mécanismes.

Médecine humaine et pathologie. Université Grenoble Alpes, 2011. Français. �NNT : 2011GRENS003�.

�tel-00573124�

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THÈSE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE GRENOBLE

Spécialité : Modèles, Méthodes et Algorithmes en Biologie Discipline : Biophysique, Biochimie et Biologie Cellulaire

Arrêté ministériel : 7 août 2006

Présentée par

Sébastien FOLLOT

Thèse dirigée par Jean-Claude DEBOUZY

préparée au sein de IRBA/CRSSA dans l’Unité de Biophysique Cellulaire et Moléculaire

dans l'École Doctorale de l’Ingénierie pour la Santé la Cognition et l'Environnement

Analyse des propriétés physico-chimiques et pharmacologiques

d’Imidazo[1,2- αααα ]pyridine :

Evaluation de l’apport de la RMN HR-MAS pour la compréhension des mécanismes d’interaction avec les

cibles biologiques.

Thèse soutenue publiquement le 9 février 2011, devant le jury composé de :

PR Hatem FESSI

DR Yves CHANCERELLE DR Mohamed SKIBA DR David CROUZIER PR Jean-Claude DEBOUZY

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THÈSE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE GRENOBLE

Spécialité : Modèles, Méthodes et Algorithmes en Biologie Discipline : Biophysique, Biochimie et Biologie Cellulaire

Arrêté ministériel : 7 août 2006

Présentée par

Sébastien FOLLOT

Thèse dirigée par Jean-Claude DEBOUZY

préparée au sein de IRBA/CRSSA dans l’Unité de Biophysique Cellulaire et Moléculaire

dans l'École Doctorale de l’Ingénierie pour la Santé la Cognition et l'Environnement

Analyse des propriétés physico-chimiques et pharmacologiques

d’Imidazo[1,2- αααα ]pyridine :

Evaluation de l’apport de la RMN HR-MAS pour la compréhension des mécanismes d’interaction avec les

cibles biologiques.

Thèse soutenue publiquement le 9 février 2011, devant le jury composé de :

PR Hatem FESSI

DR Yves CHANCERELLE DR Mohamed SKIBA DR David CROUZIER PR Jean-Claude DEBOUZY

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Dans la vie, les hommes sont tributaires les uns des autres. Il y a donc toujours quelqu'un à maudire ou à remercier.

Madeleine Ferron

Remerciements

Mes remerciements chaleureux s’adressent tout d’abord :

A Monsieur le Professeur FESSY pour avoir bien voulu participer au jury et pour l’honneur qu’il me fait en acceptant de juger cette thèse.

A Monsieur le Docteur Mohamed SKIBA et Monsieur le Docteur Yves CHANCERELLE pour m’avoir accordé une partie de leur temps afin d’examiner ce mémoire, d’en être le rapporteur.

L’ensemble de ce travail a reçu le soutien financier de la DGA au titre du POR6 CT4, PEA n°010807. N’oublions pas le Service de Santé des Armées, l’Armée de l’Air et la Gendarmerie Nationale pour m’avoir fait découvrir l’armée et assuré mon soutien financier personnel durant cette période.

(6)

Un grand merci à Monsieur le Professeur Jean-Claude Debouzy qui porta la casquette de directeur de laboratoire avec de grandes qualités scientifiques, suivi de directeur de thèse avec un énorme travail pour améliorer ma rédaction en anglais, mais surtout un ami qui m’a fait découvrir les réunions scientifiques du mercredi. Une petite citation de Hans Christian Andersen pour résumer :

La reconnaissance est la mémoire du cœur.

Je remercie tout particulièrement le Docteur David Crouzier, qui a toujours été présent et qui a joué le rôle de co-directeur de thèse. Merci pour ton éternelle bonne humeur, ton positivisme, tes encouragements, les longues discutions non scientifiques, pour la participation de tes lapins et tout le reste.

Un merci à Madame Maëlle Thorand, ma partenaire de bureau, sans qui la thèse n’aurait pas été aussi agréable, et encore désolé pour la musique.

J’adresse mes remerciements à tout le reste de l’équipe de biophysique Christine, Vincent, Raymonde, Anne pour leurs sympathies et leurs amitiés.

Je souhaite adresser un merci à toutes les personnes qui m’ont aidé à réaliser ce travail mais surtout apporté leurs amitiés : la VSSA team bien sur (une grande famille), le Bat 18 (Tomtom la barre des 34 min est possible, les shim de Patrick, les motards, les

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travailleurs……), le service informatique qui a résolu tout mes problèmes, la restauration qui m’a nourri matin, midi et soir, et toutes les personnes avec qui j’ai travaillé et surtout discuté.

Merci à l’ensemble du personnel du laboratoire de la faculté de pharmacie de Tour et plus particulièrement aux Professeurs Cécile Enguehard-Gueiffier et Alain Gueiffier pour leurs participations pratiques et techniques mais surtout pour leur aide.

A mes parents, Brigitte et Pierre, mon frère Christophe et à

toute ma famille, qui m’on toujours soutenu dans mes décisions et

(8)

Le chercheur doit être libre de tenter des expériences audacieuses, de soutenir des théories révolutionnaires, voire paradoxales. Il doit disposer du droit à l'erreur.

Pierre Joliot

Internet est le produit d’une combinaison unique de stratégie militaire, de coopération scientifique et d’innovation contestataire.

Manuel Castells

(9)

Résumé

La MAP kinase p38 régule la transduction du signal en réponse à un stress environnemental.

Les inhibiteurs spécifiques de p38, qui sont connus pour bloquer la production de cytokines pro-inflammatoires, mais peuvent également intervenir sur le phénomène d’apoptose.

C’est dans cette dernière optique que de nouvelles structures d’inhibiteurs ont été synthétisées. Ces structures, après caractérisation par RMN, ont ensuite été évaluées en termes de mécanisme d’action et de disponibilité biologique. Outre les méthodes classiques cette évaluation a finalement fait appel aux techniques HR-MAS.

Les sept molécules ainsi synthétisées ont été regroupées en trois familles (1a, 2a-c, 3a-c).

Bien que les propriétés physico-chimiques de ces motifs soient très différentes, il en ressort une potentialité d’action commune en tant qu’inhibiteur de la MAP kinase p38.

Mots clés : RMN ; Inflammation ; Apoptose ; Monocyte.

Abstract

p38 MAP Kinase regulates the signal’s transduction in response to an environmental stress.

The specific p38 inhibitors, which are known to bloc the pro inflammatory (cytokines) production, can intervene on the (apoptosis) phenomenon too.

This is in this last perspective that news inhibitors’ structures have been synthesized. These structures, after RMN characterization, have been estimated in term of the mechanics of an action and biological ability. As well as the classical methods, this evaluation finally requires HR-MAS technics.

The 7 molecules synthesized in this manner have been in 3 families regrouped (1a, 2a-c, 3a- c). Although the physic-chemical properties of these motives are very different, it stands out a common potentiality of action as an MAP Kinase p38 inhibitor

Keyword : NMR ; Inflammation ; Apoptosis ; Monocyte.

(10)

INTRODUCTION ...1

INTRODUCTION GENERALE...4

1 ) Physiologie et environnement cellulaire ... 5

1.1. Cycle cellulaire... 5

1.1.1. Les différentes phases du cycle cellulaire ... 6

1.1.1.1. Interphase ... 7

1.1.1.2. La phase mitotique ... 7

1.1.2. Contrôle du cycle cellulaire... 9

1.2. L’inflammation... 11

1.2.1. Généralités... 11

1.2.2. La réponse inflammatoire... 11

1.2.3. Les médiateurs de l’inflammation... 12

1.2.3.1. Les médiateurs plasmatiques... 13

1.2.3.2. Les médiateurs cellulaires ... 14

1.2.4. L’inflammation et les voies de signalisation intracellulaire... 15

1.3. Le processus de mort cellulaire par apoptose... 17

1.3.1. Caractéristiques morphologiques ... 18

1.3.2. Caractéristiques biochimiques... 19

1.3.3. Les principaux effecteurs de l’apoptose... 20

1.4. Les protéines kinases... 24

1.4.1. Introduction ... 24

1.4.2. Généralités... 24

1.4.3. Différentes classes d’inhibiteurs ... 25

1.4.4. La famille des p38 MAP Kinases... 26

1.4.4.1. Propriétés et structure des p38 ... 26

1.4.4.2. Régulation de la voie d’activation de p38 ... 29

1.4.4.3. L’inflammation et p38... 30

1.4.4.4. L’apoptose et p38 ... 30

1.4.4.5. Le cycle cellulaire et p38 ... 31

1.4.4.6. Les inhibiteurs de p38 en développement ... 32

2 ) Etude des interactions... 34

2.1. L’ADN ... 34

2.1.1. L’hélice ADN ... 34

2.1.2. La chaîne phosphodiester ... 36

2.1.3. La torsion des sucres ... 37

2.1.3.1. Le concept de pseudorotation et de stabilité du sucre ... 37

2.1.3.2. La liaison glycosidique... 39

2.1.4. Polymorphisme de l’ADN... 39

2.2. Les phospholipides et les membranes ... 41

2.2.1. La membrane biologique... 41

2.2.2. Les phospholipides... 43

2.2.2.1. La structure... 44

2.2.2.2. Le polymorphisme lipidique ... 45

2.2.2.3. Fluidité de la membrane ... 45

(11)

2.2.3. Le modèle membranaire... 47

3 ) Méthode d’étude par RMN ... 49

3.1. Etude des interactions par RMN ... 49

3.1.1. Les interactions avec les membranes modèles ... 49

3.1.1.1. La RMN-31P ... 49

3.1.1.2. La RMN-2H ... 51

3.1.2. Les interactions avec l’ADN ... 52

3.1.2.1. RMN à une dimension... 52

3.1.2.2. RMN à deux dimensions ... 54

3.2. Etude par RMN HR-MAS... 55

3.2.1. Etude des cellules ... 55

3.2.2. La RMN HR-MAS : Avantages et limitations ... 56

3.2.2.1. La vitesse de rotation... 56

3.2.2.2. L’effet de la température ... 57

3.2.2.3. Observation simultanée des métabolites et des lipides ... 57

TRAVAIL EXPERIMENTAL ...59

1 ) Etude des propriétés physico-chimiques des drogues ... 60

1.1. Généralités de l’étude... 60

1.2. Les molécules synthétisées... 60

1.3. Analyse des composés de la famille 3... 62

1.3.1. Interactions drogue/membrane ... 62

1.4. Interaction drogue/membrane : Approche par HR-MAS ... 97

1.4.1. Résultats de l’étude ... 97

1.4.2. Conclusion... 102

1.4.3. Interaction drogue/ADN... 104

1.5. Analyse des composés de la famille 1 et 2... 106

1.5.1. Interaction drogue/membrane ... 106

1.5.2. Interaction drogue/ADN... 106

1.6. Appendice : Essai de solubilisation en milieu aqueux. ... 107

2 ) Etude des propriétés inhibitrices des drogues ... 109

2.1. Sélection de la méthode RMN adaptée à la problématique ... 109

2.1.1. Evaluation du stress mécanique de l’échantillon à l’angle magique : Validation du modèle ... 109

2.1.2. Analyse métabolomique par RMN de cellules THP-1... 139

2.2. Analyse du potentiel inhibiteur des composées des familles 1, 2 et 3 ... 167

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ...200

ANNEXES ...205

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...245

(12)

FIGURES ET TABLEAUX

Figure 1 : Altération génétiques touchant des acteurs importants du cycle cellulaire en fonction du tissu (Malumbres and Barbacid 2001). ... 6 Figure 2 : Représentation schématique du cycle cellulaire (Purves, Sadava et al. 2003). ... 6 Figure 3 : Différentes phases du cycle cellulaire observées par microscopie à fluorescence sur des cellules de rein de rat kangourou (Potorous Tridactilus Kidney) (Denoulet and Prat). ... 9 Figure 4 : Les CDKs qui contrôlent le cycle cellulaire régulé par des phosphorylations/déphosphorylations et par des inhibiteurs protéiques (Meijer 2006). ... 10 Figure 5 : Réponse inflammatoire lors d’une agression d’origine bactérienne (Annane, Bellissant et al. 2005). ... 12 Figure 6 : Schéma des différents médiateurs de l’inflammation... 13 Figure 7 : Schéma présentant le rôle des cytokines dans l’inflammation. ... 15 Figure 8 : Représentation schématique de la structure chimique du LPS (Caroff, Karibian et al. 2002)... 16 Figure 9 : Schéma de transduction du signal pour l’activation du gène COX-2... 17 Figure 10 : Microscopie électronique de cellules en... 17 Figure 11 : Représentation schématique de l’apoptose et de la nécrose (Kerr, Wyllie et al.

1972)... 18 Figure 12 : Les phases de l’apoptose, intégration séquentielle du signal apoptotique... 19 Figure 13 : Comparaison entre l’apoptose et la nécrose. ... 20 Figure 14 : A) et B) Structure tridimensionnelle (squelette α-carboné) respectivement de la caspase 1 et 3, les peptides YVAD et DEVD sont représentés en blanc au niveau du site actif.

C) et D) Représentation de la structure en volume de la caspase 3. E) Représentation de la poche du site actif de la caspase 3 en liaison avec le substrat, Cys285 (vert, a), His237 (bleu, b), Gly238 (vert, b), Gln283 (vert, c), Arg341 (bleu, c). F) Même caspase et substrat mais avec une orientation opposée (Earnshaw, Martins et al. 1999). G) Désignation et relation phylogénétique de la famille des caspases (humaines) (Alnemri, Livingston et al. 1996). ... 21 Figure 15 : Schéma de la régulation pro et anti apoptotique des protéines de la famille Bcl-2 entre la mitochondrie et le réticulum endoplasmique (Rong and Distelhorst 2008)... 22 Figure 16 : Activation des caspases par les récepteurs de mort impliquant l’interaction avec des DD, des domaines effecteurs de morts ou des domaines de recrutement des caspases (Rathmell and Thompson 1999)... 23

(13)

Figure 17 : Schéma présentant les sites d’action des protéines kinases lors de la

phosphorylation... 25

Figure 18 : Propriétés des protéines kinases de la famille p38 (Ono and Han 2000). ... 27

Figure 19 : Structure d’un inhibiteur de la p38α et de la p38β entrant en compétition avec l’ATP. ... 27

Figure 20 : Représentation tridimensionnelle de p38α, révélant les résidus importants pour le positionnement de l’ATP et du SB203580 dans le site catalytique. A) ATP est représenté en vert avec les phosphates en orange, les acides aminés en magenta qui sont importants pour l’activité catalytique de p38. B) SB203580 est représenté en vert, les acides aminés en bleu sont ceux qui lorsqu’ils étaient muté diminuaient l’interaction de l’inhibiteur avec l’enzyme et ceux en bleu augmentaient cette interaction. Les résidus en rouge sont les trois acides aminés majeurs pour la reconnaissance de l’inhibiteur par l’enzyme. Les résidus en gris présentent les acides aminés qui n’ont aucune incidence lorsqu’ils sont mutés sur les interactions de l’ATP ou du SB203580 (Gum, McLaughlin et al. 1998)... 28

Figure 21 : Représentation schématique des voies d’activation des cascades de signalisation de p38 mises en jeu par différents stress (Blenis 2003). ... 29

Figure 22 : Représentation schématique de l’activation de p38 avec la régulation de médiateurs de l’inflammation (Gaestel, Kotlyarov et al. 2009). ... 30

Figure 23 : Représentation schématique de l’activation de la mort cellulaire programmé par le récepteur CD437 dans les cellules de carcinome ovarien. Cette cascade apoptotique induit l’activation de p38 (Holmes, Soprano et al. 2003)... 31

Figure 24 : Représentation schématique de l’activation par les UV de p38 et son rôle dans la régulation du passage de la phase G2 à M du cycle cellulaire (Thornton and Rincon 2009). . 32

Figure 25 : Schéma d’un fragment d’ADN simple brin... 35

Figure 26 : A) Angle dièdre du squelette de l’ADN et angle de torsion du sucre. B) Nomenclature d’un angle. ... 37

Figure 27 : Schémas du cercle de pseudorotation et conformation en O4’-endo et O4’-exo... 38

Figure 28 : Conformation de l’ADN : A, B, Z. ... 40

Figure 29 : Représentation schématique d’un modèle membranaire (Cooper 2000)... 42

Figure 30 : Structure de phospholipides membranaires (Schechter 1990)... 44

Figure 31 : Schématisation de diverses phases adoptées par les lipides (Daoud, Raïos et al. 1998; Tresset 2009)... 45

Figure 32 : Représentation schématique d’un changement de phase (Schechter 1990). ... 46

(14)

Figure 33 : Représentation schématique des différents mouvements des lipides dans la membrane (Schechter 1990)... 47 Figure 34 : Représentation schématique de vésicules (Tresset 2009)... 48 Figure 35 : Forme des spectres de RMN-31P de phospholipides sous forme de poudre, ou organisés en différentes phases : lamellaire rigide, mobile, hexagonale et isotrope (Dufourc 1986)... 51 Figure 36 : Spectre proton d’un oligonucléotide d(CGATCG)2. ... 53 Figure 37 : Spectre HR-MAS 1H de cellules de THP-1 obtenus à 278K et une vitesse angulaire de rotation 1,9 kHz. ... 56 Figure 38 : Spectres HR-MAS 1H de MLV de DMPC obtenus à différentes températures : 299.8K (1), 298.5K (2), 297.3K (3), and 296.0K (4)... 57 Figure 39 : Structure chimique des sept composés de imidazole[1,2-α]pyridine. ... 61 Figure 40 : A) Représentation de la molécule de DMPC, B) Spectre RMN-1H HR-MAS (400 MHz) de MLV (50 mM) dans le D2O, avec une rotation de 4 kHz à 300 K. ... 98 Figure 41 : A) Courbe des valeurs du CSA en fonction de la température de la DMPC pure (○), et en présence de 3a (□), 3b (◊), 3c (●), B) Spectre 31P-RMN (bas) de MLV DMPC (50 mM) à la température de transition (296 K) (haut) et en présence de 3a (rapport drogue lipides 1/5 W/W), C) Courbe des valeurs de la mesure de la largeur à mi-hauteur de DMPC pure (○), et en présence de 3a (□), 3b (◊), 3c (●), D) Spectre 1H-RMN HR-MAS des CH3 de la choline de la DMPC pure (en haut) et en présence de 3a (bas). ... 99 Figure 42 : : Spectre 1H-RMN HR-MAS (9.4T, de 6,0 – 9,0 ppm), de la DMPC (50 mM dans D2O) en présence de 3a (0.5 mM dans D2O) à différentes températures A) à 288 K, B) à 291 K, C) à 296 K, D) à 298 K, E) à 300 K et F) à 304 K. ... 101 Figure 43 : Spectre 1H-RMN HR-MAS (9.4T, de 6,0 – 9,7 ppm), de la DMPC (50 mM dans D2O) en présence de 3a (0.5 mM dans D2O), A) spectre RMN de diffusion, B) spectre 1H- RMN HR-MAS CPMG, C) spectre 1H-RMN HR-MAS. ... 102 Figure 44 : Spectre de proton de d(CGATCG)2 pur 1,5 mM dans le D2O, 297 K (en rouge) et présence de 3b 3 mM (en noir)... 104 Figure 45 : Structure chimique d’un nouveau composés de imidazole[1,2-α]pyridine (Log P : 1,6)... 202

(15)

Tableau 1 : Inhibiteurs de p38 entrant en compétition avec l’ATP. ... 33 Tableau 2 : Paramètres hélicoïdaux et les angles du squelette des trois conformations de l’ADN (Wang, Quigley et al. 1979; Wang 1979; Arnott, Bond et al. 1980). ... 40 Tableau 3 : Composition en lipides des membranes en % de la quantité totale de lipides (Schechter 1990). ... 43 Tableau 4 : Propriétés de différents modèles membranaires (Debouzy, Neumann et al. 1989).

... 48 Tableau 5 : Déplacements chimiques (ppm) et variations des déplacements chimiques des protons des sucres et des bases de d(CGATCG)2 seul et en présence de drogues 3a, 3b et 3c.

... 105 Tableau 6 : Coefficients de partage des composés de imidazole[1,2-α]pyridine... 106

(16)

INTRODUCTION

(17)

Les protéines kinases sont des enzymes qui catalysent le transfert d’un groupement phosphate sur l’hydroxyle des chaînes latérales des acides aminés porteurs d’une fonction alcool. Cette phosphorylation intervient directement dans l’activation, la transduction et la régulation d’un grand nombre de voies cellulaires (division cellulaire, morphogenèse, inflammation…). De par son rôle important dans la transduction du signal chez les eucaryotes, la MAP Kinase p38 est impliquée dans la régulation d’étapes clés de la vie cellulaire comme la prolifération, la différenciation et la survie/mort cellulaire (inflammation et apoptose). L’identification et le développement d’inhibiteurs de ces protéines kinases constitue un axe de recherches en tant que cibles thérapeutiques. C’est dans cette stratégie que la synthèse de nouveaux inhibiteurs fondés sur des motifs hétérocycliques à azote angulaire à été entreprise, en vue d’obtenir dans le cas précis une activité inhibitrice de la MAP Kinase p38.

Dans la recherche de structures actives à partir d’un motif structural donné, une stratégie classique repose sur le criblage d’une chimiothèque de molécules ou de structures proches actives. A cette démarche systématique mais aléatoire a été préférée une attitude plus orientée de « drugs design », à partir d’un motif déterminé et en vue de l’obtention de propriétés reconnues comme liées à un type de modification chimique (halogénation, méthylation…), naturellement suivie de l’étude des propriétés des molécules. Les résultats obtenus permettent alors de suggérer un rapprochement entre les modifications suivantes de la structure et les effets in vivo des molécules nouvellement synthétisées.

Avant la présentation des résultats expérimentaux, les données bibliographiques générales utiles à la compréhension de ces résultats sont exposées dans une première partie : les protagonistes que sont la cellule et sa physiologie (cycle cellulaire, apoptose, inflammation), suivie de la MAPK p38 (structure, fonction), enfin un certain nombre d’éléments indispensables à propos des interactions drogue/membrane et drogue/ADN, ainsi que leurs méthodes d’études par RMN.

En effet, le premier objectif du travail de recherche présenté ici était l’étude des aspects fondamentaux des propriétés physico-chimiques de ces structures, et leurs rapports

(18)

Le second objectif s’articule autour d’une cible pharmacologique précise, la MAP Kinase p38. Ce travail a consisté en l’identification des inhibiteurs potentiellement actifs sur p38 et en la détermination des requis structuraux nécessaires à l’obtention d’inhibiteurs intéressants au prix de modifications structurales de la structure originale.

Enfin, dans la recherche de nouvelles stratégies, l’utilisation de la RMN HR-MAS et les apports potentiels de ces nouvelles méthodes, à chacune des étapes de l’études, ont été évalués de façon critique.

Les résultats des différents objectifs ont fait l’objet de la rédaction de différents articles, publiés, soumis ou à soumettre. Ainsi :

_ La publication 1 : Physicochemical properties and membrane interactions of anti- apoptotic derivatives 2-(4-fluorophenyl)-3-(pyridin-4-yl)imidazol[1,2-α]pyridine depending on the hydroxyalkylamino side chain length and conformation : a NMR and ESR study, porte sur l’évaluation des propriétés physico-chimiques des composés de la famille 3 par RMN.

_La publication 2 : Molecular and physiological response of living cells to mechanical stress by spinning motion HR-MAS, présente l’évaluation de l’effet de la rotation à l’angle magique sur des cellules THP-1.

_ La publication 3 : Apoptosis and inflammation-related metabolic alterations in monocytic cells : comparative approaches by liquid 1H-NMR and HR-MAS on intact cells, propose une évaluation du choix de la méthode RMN adéquate pour l’étude du changement du métabolisme cellulaire.

_ La publication 4 : Study of imidazo[1,2-α]pyridine derivates, potential p38 inhibitors in humamn myelomonocytic cell line after inflammation or apoptosis induction : is glycine marker for inflammation, porte sur une évaluation comparative des différentes méthodes d’étude dans l’approche des propriétés inhibitrices des drogues.

Enfin, l’ensemble des résultats obtenus a permis d’envisager une continuité à ce travail, évoquée dans la partie ’’Conclusion et perspectives’’.

(19)

INTRODUCTION GENERALE

(20)

1 ) Physiologie et environnement cellulaire

1.1. Cycle cellulaire

Le cycle cellulaire est le processus qui permet la division des cellules (Howard and Pelc 1953; Howard and Pelc 1986). La découverte du concept de cycle cellulaire est suivie de la légendaire phrase de Rudolf Virchow en 1958 « toute cellule provient d’une cellule ». Ce concept suivait ceux de la réplication du matériel génétique avec le modèle de la double hélice ADN en 1953 (Watson and Crick 1953; Watson and Crick 2003), et l’établissement de la théorie chromosomique de l’inhérence (modèle de ségrégation des chromosomes dupliqués aux deux cellule filles) (Goldschmidt 1916). Loin d’être une répétition simple et automatique d’évènements, chaque phase de ce cycle est régulée avec l’existence de point de contrôle (check-point) permettant l’arrêt de la division cellulaire à la moindre anomalie (Kastan and Bartek 2004). Un tel blocage peut entrainer diverses conséquences :

_ Soit des mécanismes de réparation de la lésion cellulaire permettant la reprise de la division.

_ Soit un mécanisme de mort cellulaire programmée (apoptose) qui se met en place lorsque les dommages sont irréversibles et ne peuvent donc pas être réparés (Meijer 2006).

La perturbation de la régulation de ces mécanismes peut in fine, aboutir à diverses situations pathologies, comme une division cellulaire incontrôlée (cancer) (Figure 1) ou au contraire une division cellulaire défectueuse (vieillissement) (Fürthauer and González-Gaitán ; Malumbres and Barbacid 2001).

Globalement le cycle cellulaire peut être séparé en quatre phases (Howard et Pelc).

Les points de contrôle et de régulation du cycle cellulaire ont été mis en évidence plus récemment, grâce à la génétique et la biologie moléculaires (Nurse 1990).

(21)

Figure 1 : Altération génétiques touchant des acteurs importants du cycle cellulaire en fonction du tissu (Malumbres and Barbacid 2001).

1.1.1. Les différentes phases du cycle cellulaire

Les étapes du cycle cellulaire ont été définies par rapport aux événements majeurs de la vie de la cellule (Pines and Rieder 2001; Winey and O'Toole 2001), alternant la succession de l’interphase, suivie de la phase mitotique (Figure 2). A partir d’une cellule mère, deux cellules filles (Cytokinesis) contenant le même patrimoine génétique sont produites (Purves, Sadava et al. 2003). Les cellules hors du cycle cellulaire sont dites en état de quiescence (G0).

Figure 2 : Représentation schématique du cycle cellulaire (Purves, Sadava et al. 2003).

M (mitosis)

G1 (Gap 1)

Cells that cease G2

(Gap 2)

EUKARYOTIC CELL CYCLE

(22)

1.1.1.1.Interphase

L’interphase regroupe 3 phases (G1, S et G2), ce qui permet à la cellule de croître et de dupliquer son ADN (Figure 3-A).

_ La phase G1 (G = gap) est l’intervalle compris entre la fin de la phase M (Mitose) et le début de la phase S (synthèse de l’ADN). C’est la phase la plus longue du cycle cellulaire, elle correspond à la phase de croissance durant laquelle un « point de contrôle » de la taille permet l’arrêt du cycle cellulaire. La cellule reçoit des signaux dits mitogènes qui lui permettent de franchir un point de non-retour (point de restriction), au-delà de laquelle la présence de facteurs de croissance n’est plus nécessaire à la progression du cycle cellulaire.

_ La phase S permet la synthèse et la réplication de l’ADN, la synthèse des ARNm des histones et l’arrêt de la synthèse des autres ARN. La synthèse de l’ADN est un processus de réplication semi-conservatif, avec une duplication totale du génome. A la fin de la phase S, les chromosomes sont constitués de deux chromatides sœurs attachées, avec un début de la duplication de son centrosome.

_ La phase G2 est la dernière période de croissance. Cette phase courte prépare la cellule à entrer dans la phase de division cellulaire. Pendant cette période, la cellule synthétise la plupart des protéines nécessaires à la poursuite du cycle cellulaire comme les protéines SCM de la condensation de la chromatine (par enroulement de la chromatine, avec mise en œuvre des histones H1).

1.1.1.2.La phase mitotique

La division cellulaire permet la distribution de façon égale de l’ADN entre deux cellules filles. Cette division engendre aussi bien la répartition des éléments nucléaires (caryodiérèse) que les éléments cytoplasmiques (cytodiérèse). La phase mitotique comprend la mitose et la cytocinèse. La mitose est marquée par un cycle de condensation/décondensation des chromosomes avec un cycle de phosphorylation/déphosphorylation des histones (D'Anna, Gurley et al. 1978; Gurley, Walters

(23)

et al. 1978; Hans and Dimitrov 2001). Elle se divise en cinq phases : la prophase, la prométaphase, la métaphase, l’anaphase et la télophase.

_ La prophase (Figure 3-B) prépare la division cellulaire par la division du centrosome et la condensation de la chromatine. Lors de la phase G1, le centrosome contient 2 centrioles, qui se différencient en procentrioles pendant la phase S et G2. Pendant la prophase, le centrosome se dédouble et chaque centrosome contient un procentriole (Nigg 2002). Ils se séparent et débutent leur migration aux deux pôles. Le nucléole diminue de diamètre et disparaît, avec un ADN nucléolaire qui s’associe aux chromosomes au niveau des constrictions secondaires, et une enveloppe nucléaire qui se fragmente en petites vésicules.

_ La prométaphase (Figure 3-C) se traduit par l’accrochage des chromosomes aux microtubules par l’intermédiaire des kinétochore (Maiato, DeLuca et al. 2004; Tanaka and Desai 2008) dont la direction est perpendiculaire à l’axe du chromosome. Les chromosomes se disposent perpendiculairement aux fibres fusoriales et migrent vers le plan équatorial de la cellule, c’est le début des mouvements de congression des chromosomes (Foley and Kapoor 2009). La membrane nucléaire est totalement désagrégée. Enfin les mitochondries se rassemblent dans la partie moyenne de la cellule.

_ La métaphase (Figure 3-D) est caractérisée par une condensation maximale des chromosomes avec leur rassemblement sur la plaque équatoriale (ou plaque métaphasique) par des mouvements de congression. Chaque chromosome métaphasique est constitué de deux chromatides sœurs liées grâce aux cohésines centromérique. Chaque fuseau est constitué des microtubules d’aster, des microtubules polaires et des microtubules kinétochoriens.

_ L’anaphase peut être divisée en deux grandes phases. Dans un premier temps (Figure 3-E) s’effectue le partage des chromosomes à deux chromatides en deux lots identiques de chromosomes à une chromatide. Chaque chromatide a été tirée vers l’un des pôles de la cellule par séparation des centromères (topo-isomérase). Dans un deuxième temps (Figure 3-F) les microtubules kinétochoriens (étirement du fuseau, par dépolymérisation) se raccourcissent alors que les microtubules polaires s’allongent pour préparer la future séparation des deux cellules filles.

_ La télophase commence par le regroupement des chromosomes aux pôles cellulaires (Figure 3-G). Les chromosomes achèvent leur décondensation et la reconstruction

(24)

membrane nucléaire. Le fuseau mitotique se dépolymérise progressivement, alors que les nucléoles se reconstituent (Figure 3-H). Une membrane (Figure 3-I) séparant les deux cellules filles se forme enfin (cytodiérèse).

Figure 3 : Différentes phases du cycle cellulaire observées par microscopie à fluorescence sur des cellules de rein de rat kangourou (Potorous Tridactilus Kidney) (Denoulet and Prat).

1.1.2. Contrôle du cycle cellulaire

La division des cellules eucaryotes est extrêmement régulée et contrôlée (Heinrichs 2002; Tyson and Novak 2008; Mazza and Cavaliere 2009). L’une des découvertes majeures dans le domaine du cycle cellulaire a été l’identification d’une famille de kinases sérine- thréonine dites kinases cyclines dépendantes (cyclin dependent kinases, CDKs). Les CDKs

MITOSE

A B C

D E F

G H I

INTERPHASE

(25)

subissent des modifications post-traductionnelles, des assemblages transitoires avec des cyclines, des associations temporaires avec des inhibiteurs protéiques et des phosphorylations/déphosphorylations qui modulent leur activité (Becker, Enna et al. 2007).

Le contrôle de la progression en phase G1 est régi par les cyclines C, D1-3 et E (CDK4 et CDK6, associées à des cyclines D) (Yang, Cao et al. 2004). La transition de la phase G1 à S est régulée par la cycline E suivie de la cycline A avec la CDK2 (McCarthy Campbell, Werts et al. 2009). Les cyclines dites mitotiques comme les cyclines A et B vont intervenir dans la transition G2 à M et en mitose (Figure 4).

Figure 4 : Les CDKs qui contrôlent le cycle cellulaire régulé par des phosphorylations/déphosphorylations et par des inhibiteurs protéiques (Meijer 2006).

Chaque composante du contrôle peut subir des disfonctionnements dans un processus cancéreux ou d’inflammation. Un tel dérèglement peut par exemple intervenir lors de la transition de G0 à G1. Ce processus est régulé par une grande variété de facteurs mitogènes qui agissent par l’intermédiaire de récepteurs transmembranaires (tyrosine kinase ou protéines G). Une conséquence en est l’activation de la cascade de protéines kinase telles que la p38 ou Erk1/2 (Zhu, Rottkamp et al. 2000). Ceci entraine une stimulation de la transcription de gènes essentiels pour l’entrée en division comme les CDKs ou les cyclines D.

S

G2

M

G1

(26)

1.2. L’inflammation 1.2.1. Généralités

L’inflammation est définie comme une réponse aiguë ou chronique des tissus vivants de l’organisme à une agression (brûlure, infection, réaction auto-immune ou allergie). Ce processus peut être une réaction générale (syndrome inflammatoire, fièvre et altération de l’état général), ou locale/loco-régionale (dans le cas de tissus non vascularisés qui sont incapables de développer une réaction inflammatoire complète) (Serhan and Savill 2005).

L’inflammation est un processus habituellement bénéfique (Ryan and Majno 1977), rapide et de courte durée. Ce processus est mis en place pour éliminer des agents pathogènes, mais aussi pour réparer les lésions tissulaires. L’inflammation peut être causée par des infections (virus, parasites…), des agents physiques (traumatisme, stress thermique, radiations…), des agents chimiques (composés acides ou basiques, toxines, venins…), des corps étrangers, des défauts de vascularisation (nécrose), des agressions dysimmunitaires. Quelle que soit la nature de l’activation, il existe une certaine similitude physiopathologique dans leur mise en jeu.

Cependant, comme une partie des voies d’activation dépend de l’agent agresseur ou du tissu cible, une grande variété peut exister dans l’intensité et la durée de la réaction inflammatoire.

1.2.2. La réponse inflammatoire

Toute agression de l’organisme, quelle qu’en soit l’origine (coupure, infection…), s’accompagne d’une réaction de défense précoce (dans les minutes qui suivent) (Figure 5) (Annane, Bellissant et al. 2005). On schématise la réaction inflammatoire en deux phases différentes, mais étroitement liées. La phase vasculo-sanguine comporte une réaction de congestion active (avec une vasodilatation des vaisseaux sanguins et une augmentation de leur perméabilité), un œdème inflammatoire (avec dilution du foyer inflammatoire, formation de fibrinogène), la diapédèse leucocytaire (traversée active des parois vasculaires par les leucocytes). La phase cellulaire comporte l’apport de défenses immunologiques (lymphocytes, plasmocytes), mais aussi la migration de cellule de soutien (fibroblastes).

(27)

Figure 5 : Réponse inflammatoire lors d’une agression d’origine bactérienne (Annane, Bellissant et al.

2005).

Le déroulement de la réponse inflammatoire commence par une réaction vasculaire (vasodilatation, augmentation de leur perméabilité). L’infiltrat de neutrophiles dans les espaces tissulaires occasionne des réactions de phagocytose et la libération de médiateurs. Ces médiateurs libérés attirent les macrophages qui, à leur tour, libèrent des cytokines (TNF-α, IL-1β, IL-12, IL-6…) (Cannon 2000). Toutes ces cytokines vont avoir différents rôles comme l’augmentation de l’expression de molécules d’adhésion à la surface des cellules endothéliales, la production de chimiokines (cytokines chimiotactiques, représentées par plus de 50 polypeptides différents), et finalement la mise en place d’une réponse immunitaire adaptée (Sloane, Ledeboer et al. 2009) et in fine la réparation tissulaire (Meunier, Braz et al.

2004).

1.2.3. Les médiateurs de l’inflammation

Comme évoqué ci-dessus, aux différents stades de l’inflammation, des médiateurs

(28)

transmission et la modulation du message (Figure 6). Ils exercent des actions spécifiques en se fixant sur des récepteurs membranaires de cellules cibles. Ceux-ci vont engendrer des réactions en cascade qui peuvent déclencher la libération d’autres médiateurs qui agissent de façon synergique ou antagoniste.

Figure 6 : Schéma des différents médiateurs de l’inflammation.

1.2.3.1.Les médiateurs plasmatiques

Ils sont présents dans le plasma sous forme de précurseurs inactifs dont l’activation résulte généralement d’une protéolyse. Le plasma contient trois systèmes de protéines plasmatiques qui interviennent en tant que médiateurs de l’inflammation :

_ Le système des kinines : la molécule active de ce système est appelé la bradikinine, et son rôle essentiel est la vaso-constriction.

_ Le système du complément : il joue un rôle majeur dans les réactions immunitaires et dans certaines étapes de la réaction inflammatoire (Kirschfink 1997). Certaines fractions interviennent très rapidement après l’histamine et la bradikinine. Un grand nombre de

Plasmatiques

Système de la coagulation et de la fibrinolyse

Système du complément Système des kinines

Cellulaires

Préformés

Nouvellement synthétisées

Amines Vaso-active Protéases lysosomes Radicaux libres

Histamine Sérotonine

Métabolites de l’acide arachidonique

Prostaglandines Sérotonine PAF

Cytokines

TNF IL-1

Facteurs de croissance EGF PDGF FGF TGF

(29)

composantes du complément est activé en cascade. Ceci aboutit au complexe d’attaque des membranes qui entraine la perforation des membranes cellulaires et une augmentation de la perméabilité cellulaire. Cette cascade d’activation met en jeu un grand nombre de produits actifs dans la phase vasculo-sanguine de l’inflammation.

_ Le système de la coagulation et de la fibrinolyse : le premier intervient par la production de fibrino-peptides au cours de la constitution du caillot. Les fibrinopeptides vont augmenter la perméabilité vasculaire, mais aussi stimuler le chimiotactisme. Quant au système fibrinolytique, il intervient aussi dans les phénomènes vasculo-sanguins de l’inflammation et le facteur XIIa. Ceci entraine la lyse du caillot du fibrine, et l’activation d’autres facteurs des phénomènes inflammatoires (Zegura, Keber et al. 2003).

1.2.3.2.Les médiateurs cellulaires

Ils sont présents dans des granules intra-cellulaires (substances préformées) ou synthétisés de novo en réponse aux stimuli. Les substances préformées sont constituées des amines vaso-actives (interviennent dans la phase active immédiate de l’inflammation), des constituants lysosomiaux (action dans les phagolysosomes, augmentation de la perméabilité vasculaire, le chimiotactisme et la dégradation cellulaire) et les radicaux oxygéné libres (sont relargués dans les tissus interstitiels, participent à la réponse inflammatoire en augmentant la perméabilité vasculaire par altération des cellules endothéliales). Les substances nouvellement synthétisées sont constituées :

_ Des métabolites de l’acide arachidonique (formé à partir des phospholipides membranaires, à action pro-inflammatoires comme l’augmentation de la perméabilité, le chimiotactisme, l’agrégation plaquettaire, la vasoconstriction veinulaire et la broncho- constriction).

_ Du platelet activating factor (PAF) à fonctions multiples comme l’agrégation plaquettaire, la vasodilation, la diminue le débit sanguin rénal….

(30)

_ Les facteurs de croissance et des cytokines (Figure 7) (Galley and Webster 1996;

Van Eldik, Thompson et al. 2007).

Figure 7 : Schéma présentant le rôle des cytokines dans l’inflammation.

1.2.4. L’inflammation et les voies de signalisation intracellulaire

Il existe un grand nombre de voies de signalisation intracellulaire activées lors de l’inflammation. Ces voies d’activation dépendent du mode d’agression et des tissus cibles.

L’infection bactérienne constitue un bon exemple : les bactéries (gram négative) expriment sur leur paroi externe des lipopolysaccharides (LPS) (Figure 8).

Macrophage Cellules endothéliales

Tout type cellulaire

Endotoxine, Complexes Immuns, Processus Inflammatoire, Agents Physiques, Toxines.

Endothélium

- Synthèse de molécules d’adhésion

- Synthèse de PGI 2 - Synthèse de PAF

- Augmentation des fonctions coagulantes

Signes Généraux

- Fièvre - Leucocytose

- Augmentation du sommeil lent

- Augmentation des corticoïdes

Fibroblastes

- Chimiotactisme - Multiplication

- Augmentation de synthèse du collagène - Facteurs angiogéniques

(31)

Figure 8 : Représentation schématique de la structure chimique du LPS (Caroff, Karibian et al. 2002).

Cette molécule est fortement immunogène. Lors d’une d’infection, le récepteur CD14 (formes membranaire mCD14 et soluble sCD14), réparti sur la membrane des monocytes et des macrophages, est le récepteur du LPS par excellence (Albright, Chen et al. 2008).

L’activation cellulaire intervient après un laps de temps de 15 à 30 minutes, délai lié à l’internalisation du complexe LPS/CD14. L’activation est déclenchée grâce à la coopération de la CD14 avec la protéine TLR4 et MD2 (Schnabl, Brandl et al. 2008). Ensuite, deux protéines adaptatrices MyD88 et TIRAP mobilisent la voie de signalisation dépendante des protéines IRAK4, TRAF6, TAB1 et TAK1 (Chen, Lim et al. 2004). La protéine TAK1 est capable d’activer la voie des MAP kinase et plus particulièrement la protéine p38 (Matsumoto-Ida, Takimoto et al. 2006).

Cette cascade d’activations moléculaires induit l’activation d’AP1 (Karin, Takahashi et al. 2001) menant à l’activation transcriptionnelle. AP1 est largement connu pour jouer un rôle dans la prolifération (Karin and Shaulian 2001), la différenciation, l’apoptose (Piu, Aronheim et al. 2001), la survie (Shaulian and Karin 2001) mais surtout l’inflammation. Les gènes de l’inflammation régulés par AP1 sont très variés comme les gènes codant pour des cytokines (IL-1, IL-6, TNF…) (Tanaka, Akira et al. 1995), des chimiokines (IL-8…) (Sebkova, Pellicano et al. 2004), des métalloprotéases (MMP-1…), des molécules d’adhésion (intégrine…) (Berrou and Bryckaert 2001) ou encore des enzymes comme COX-1 et 2 (Sun, Xu et al. 2008) (Figure 9).

Hep Hep Hep

Kdo- Kdo- P-

P-

P- P-

P- GlcN

GlcN NH3+

n

Outer core Inner core

Polysaccharide Glycophospholipid

O-specific Chain Core LipidA

(32)

TLR4 TLR4TLR4 TLR4 CD14 CD14 CD14CD14

COX COX COXCOX----222 2

Figure 9 : Schéma de transduction du signal pour l’activation du gène COX-2.

1.3. Le processus de mort cellulaire par apoptose

Les cellules ayant subi de graves lésions ont deux voies principales menant à la mort cellulaire : la nécrose ou l’apoptose (en grec : apo pour éloignement et ptose pour chute). La nécrose est considérée comme une mort accidentelle, alors que l’apoptose (Figure 10) est un processus physiologique de suicide cellulaire (Kerr, Wyllie et al. 1972; Wood 2001). Celui-ci est aussi un processus non inflammatoire impliqué dans le maintien de l’homéostasie et le développement embryonnaire (morphogenèse des doigts, mise en place des systèmes nerveux et immunitaire) (Wood, Turmaine et al. 2000). L’apoptose est donc une mort différente de la nécrose tant d’un point de vue morphologique que biochimique (Figure 11).

Figure 10 : Microscopie électronique de cellules en apoptose.

(33)

Des fonctionnements anormaux du processus d’apoptose ou de son contrôle sont à l’origine de nombreuses pathologies : cancers (Wheeler, Rogers et al. 1994; Thompson, Thulasi et al. 1995), maladies neurodégénératives du système nerveux central (Parkinson) (Yuan and Yankner 2000; Irrcher and Park 2009), maladies inflammatoires (asthme, maladie de Crohn (Van den Brande, Koehler et al. 2007), polyarthrite rhumatoïde (Wijbrandts, Remans et al. 2008)…).

Figure 11 : Représentation schématique de l’apoptose et de la nécrose (Kerr, Wyllie et al. 1972).

1.3.1. Caractéristiques morphologiques

L’apoptose occasionne des changements morphologiques importants et spécifiques (Figure 13) (Ziegler and Groscurth 2004). Le premier changement est la réduction du volume

(34)

du cytoplasme qui conduit à une modification de la forme et de la taille de la cellule. Ceci entraîne la diminution de la cohésion entre cellules voisines. La chromatine se condense d’abord en périphérie de la membrane nucléaire, puis l’enveloppe nucléaire est elle-même désintégrée et la chromatine dégradée en petits fragments. Finalement, la cellule présente à la surface des vésicules renfermant des amas de chromatine et des fragments cytoplasmiques (les organites restent intacts jusqu'à la phase terminale de l’apoptose), entourés de membrane plasmique. Ces vésicules détachent et forment les corps apoptotiques qui sont phagocytés par les cellules voisines ou les macrophages (Allen, Hunter et al. 1997).

1.3.2. Caractéristiques biochimiques

De nombreux changements biochimiques sont observés en parallèle des changements morphologiques survenant lors de l’apoptose (Figure 13). Ainsi, la modification du flux calcique est responsable de l’activation de nombreuses enzymes, dont les nucléases qui induisent la dégradation homogène de l’ADN en fragments d’environ 180 paires de bases.

Figure 12 : Les phases de l’apoptose, intégration séquentielle du signal apoptotique.

L’activation des trans-glutaminases permet la réorganisation des éléments du cytosquelette qui permettent la formation d’invaginations membranaires et la constitution des corps apoptotiques. Un autre changement important est la perte de l’asymétrie de la membrane plasmique avec externalisation de la phosphatidylsérine depuis le feuillet interne vers le feuillet externe de la membrane. Bien d’autres phénomènes sont mis en place comme l’accumulation des céramides ou la production de radicaux libres (Figure 12)…

-Dommages cellulaires -Récepteurs de mort -Carences en glucose, facteurs de croissance et de survie

-Drogues

-Agents pathogènes -…

-Famille des Bcl-2 -Caspases initiatrices -Céramides

-FRO

-Facteurs de transcription -p53

-Oncogènes -…

-Mitochondrie

-Caspases effectrices

-Nucleases MORT

(35)

Nécrose Apoptose

Perte de l’intégrité membranaire « Bourgeonnement » de la membrane Commence par des gonflements du cytoplasme et

de la mitochondrie

Agrégation de la chromatine à la membrane nucléaire

Lyse cellulaire totale Commence par la condensation du cytoplasme et du noyau

Lyse des organelles Formation de corps apoptotiques

Perte de la régulation de l’homéostasie ionique Régulation fine nécessitant des activations et des étapes enzymatiques

Phénomène passif sans demande d’énergie Mécanisme ATP dépendant

Digestion aléatoire de l’ADN Fragmentation régulière de l’ADN Relargage de facteurs par la mitochondrie

(cytochrome c)

Activation d’une cascade de caspase

Modification de l’asymétrie membranaire

affecte un groupe de cellules proches affecte des cellules individualisées

Phagocytose par des macrophages Phagocytose par des macrophages

Réponse inflammatoire Pas de réponse inflammatoire Significations physiologique

Critères morphologiques

Critères biochimiques

Figure 13 : Comparaison entre l’apoptose et la nécrose.

1.3.3. Les principaux effecteurs de l’apoptose

Les premières études des différents gènes contrôlant les mécanismes de l’apoptose et la découverte de différentes voies de son activation (Yuan and Horvitz 1992) ont été réalisées sur un nématode modèle (Caenorhabditis elegans) (Hengartner and Horvitz 1994; Hengartner

(36)

and Horvitz 1994). Les composants essentiels de la plupart des voies conduisant à l’apoptose sont des protéases à cystéine ou caspases (Curtin and Cotter 2003).

Le nom caspase a une signification précise : le C pour spécifier la cystéine du site actif, ASP pour la spécificité du clivage après l’acide aspartique et ASE pour protéase (Figure 14) (Alnemri, Livingston et al. 1996; Earnshaw, Martins et al. 1999).

La première caspase décrite est ced-3, cette découverte est suivie de l’identification d’une quinzaine d’enzymes homologues chez les mammifères. Les caspases sont impliquées dans un signal pro-apoptotique lié à des récepteurs de mort de type TNF (ou Tumor Necrosis Factor) ou Fas/Tnfrsf6/CD95 (voie extrinsèque). D’autres interviennent dans la transduction du signal pro-apoptotique mitochondrial (voie intrinsèque) (Earnshaw 1999).

Figure 14 : A) et B) Structure tridimensionnelle (squelette αααα-carboné) respectivement de la caspase 1 et 3, les peptides YVAD et DEVD sont représentés en blanc au niveau du site actif. C) et D) Représentation de la structure en volume de la caspase 3. E) Représentation de la poche du site actif de la caspase 3 en liaison avec le substrat, Cys285 (vert, a), His237 (bleu, b), Gly238 (vert, b), Gln283 (vert, c), Arg341 (bleu, c). F) Même caspase et substrat mais avec une orientation opposée (Earnshaw, Martins et al. 1999). G) Désignation et relation phylogénétique de la famille des caspases (humaines) (Alnemri, Livingston et al. 1996).

G

(37)

_ La voie intrinsèque ou voie mitochondriale (Opferman and Korsmeyer 2003;

Opferman, Letai et al. 2003). L’induction de l’apoptose induit des modifications (Figure 15) très précoces chez la mitochondrie (Suen, Norris et al. 2008; Arepalli, Sridhar et al. 2009).

L’une des principales modifications est la diminution du potentiel transmembranaire due à une perméabilisation des membranes sous le contrôle des protéines de la famille Bcl-2 qui se divisent en deux classes :

_ Les protéines pro-apoptotiques (Bax, Bak, Bcl-xs Bik, Bad, Bid).

_ Les protéines anti-apoptotiques (Bcl-2, Bcl-xl, Bcl-w, Mcl-1).

Figure 15 : Schéma de la régulation pro et anti apoptotique des protéines de la famille Bcl-2 entre la mitochondrie et le réticulum endoplasmique (Rong and Distelhorst 2008).

_ La voie extrinsèque ou voie des récepteurs de mort (Figure 16) fait intervenir les récepteurs de la famille du facteur nécrosant des tumeurs ou TNF (Tumor Necrosis Factor).

En plus de leur caractère trans-membranaire, ces récepteurs possèdent un domaine d’interaction protéique appelé domaine de mort ou DD (death domain) (Debatin 2004). La transduction du signal de mort se fait par activation de la famille des caspases. En fonction du type cellulaire ou des conditions de culture, la voie majoritaire sera la voie pro ou anti- apoptotique.

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