ROYAUME DU MAROC UNIVERSITE MOHAMMED V FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE -RABAT- ANNEE : 2019 THESE N° :10/19 CSVS
CENTRE D’ETUDES DOCTORALES DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE FORMATION DOCTORALE : BIOLOGIE MÉDICALE, PATHOLOGIE HUMAINE ET
EXPÉRIMENTALE ET ENVIRONNEMENT.
THESE
En vue de l’obtention du
DOCTORAT
Présentée et soutenue publiquement le 22/10 /2019 PAR
Mr. ELKHAZRAJI Abdelhak Devant le Jury :
Pr. NAJI M’BAREK Président honoraire Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V-Rabat
Pr. AIT HOUSSA MAHDI Président Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V-Rabat
Pr. MESSAOUDI NEZHA Directeur de thèse Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V-Rabat
Pr. IBRAHIMI AZEDDINE Co-directeur de thèse Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V-Rabat
Pr. NAYA ABDELLAH Rapporteur Faculté des sciences, Université HASSAN II Casablanca
Pr. LAKHAL ZOUHAIR Rapporteur Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V-Rabat
Pr. EL JAOUDI RACHID Rapporteur Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V-Rabat
Pr. HADEF RACHID Examinateur Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V-Rabat
Pr. BENSAID MOUNIA Examinateur École Royale du Service de Sante Militaire
Pharmacogénétique de l’Acenocoumarol :
Les gènes impliqués dans la variabilité de la réponse et
proposition d’un algorithme prédictif de la dose pour la
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REMERCIEMENTS
En tout premier lieu, je remercie le bon Dieu, tout puissant, de m’avoir donné la force pour survivre, ainsi que l’audace pour dépasser toutes les difficultés.
Ce manuscrit est l'aboutissement de cinq années passionnantes de travail et de rencontres, et je souhaite remercier les personnes qui m'ont accompagné tout au long de cette thèse.
Je souhaiterais remercier Madame le Professeur Nezha MESSAOUDI qui a fait l’honneur d’encadrer et diriger ce travail. Merci pour vos conseils, pour l’attention avec laquelle vous avez accompagné mes travaux de recherche, votre réactivité et surtout votre patience. Vos qualités scientifiques et d’enseignement sont très utiles pour moi chaque jour. C’est avec une grande reconnaissance et respect que je vous remercie. Je n’oublierai pas la confiance que vous m’avez accordé pour la réalisation de ce projet de thèse
Je remercie Monsieur le Professeur Azeddine IBRAHIMI de m’avoir accepté au sein de son laboratoire, pour son encadrement, ses conseils et sa patience. Je vous remercie de m’avoir transmis de nombreuses notions de biotechnologie médicale lors du cycle du master et de doctorat, pour vos qualités scientifiques qui sont des modèles pour moi. Je vous remercie pour la confiance que vous m’avez accordée pour la réalisation de ce projet très ambitieux au sein de votre laboratoire (Medbiotech).
Je remercie les membres de mon jury de thèse, qui ont accepté de m'aider à franchir cette étape importante qu'est la soutenance. En premier lieu, je remercie mon Maitre le Professeur El Mehdi AIT HOUSSA pour l’honneur que vous me faites en présidant le jury de cette thèse, je vous remercie encore pour votre précieuse collaboration et pour l’intérêt que vous porterez à ce travail.
Mes sincères remerciements à vous les Professeurs : Abdallah NAYA, Zouhair LAKHAL et Rachid EL JAOUDI, pour nous avoir fait l’honneur d’accepter de juger notre travail, pour le temps consacré à la lecture et à l’évaluation du manuscrit.
Je ne saurais exprimer ma gratitude et ma profonde reconnaissance à mes maitres les Professeurs Rachid HADEF et Mounia BENSAID de m'avoir fait l'honneur d'examiner et juger ce travail malgré votre emploi du temps chargé.
Lors de cette période de doctorat, plusieurs personnes ont été des supports incontournables dans la réalisation de mes activités de recherche, que cela soit dans le domaine scientifique et technique ou administratif. Un grand merci au Professeur El arbi. BOUAITI pour l’analyse statistique des données. Un grand Merci au Professeur Mounia BENSAID pour son expertise dans l’optimisation de la technique de PCR.
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A mon Maitre
Le Professeur NAJI M’BAREK
Vous êtes le grand militant, qui m’a toujours poussé à me
surpasser dans tout ce que j’entreprends, qui m’a transmis cette
rage de vaincre et la faim de savoir.
Vous êtes pour moi le père exemplaire, le grand frère, votre
patience sans fin, votre compréhension et votre encouragement
sont pour moi le soutien indispensable que vous avez toujours su
m’apporter.
Je vous dois ce que je suis aujourd’hui et ce que je serai demain
et je ferais toujours de mon mieux pour rester votre fierté et ne
jamais vous décevoir.
Ce titre de Doctorat National je le porterai fièrement et je vous
le dédie tout particulièrement.
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DEDICACES
Je dédie cette thèse à :A la mémoire de mon cher Père :
Je ne saurais exprimer mon grand chagrin en ton absence. J’aurais aimé que tu sois à mes côtés ce jour. Que ce travail soit une prière pour le repos de ton âme.
A ma très chère mère :
Aucune dédicace ne saurait exprimer mon grand respect, et ma reconnaissance pour les sacrifices que tu as consentis pour mon éducation. J‘implore dieu le tout puissant de vous accorder santé et longue vie.
A ma très chère épouse :
Tes conseils m’ont toujours accompagné, je t’offre en guise de reconnaissance, ce travail qui, sans ton aide, ta générosité infinie, tes encouragements n’aurait vu le jour. Nulle dédicace ne pourrait exprimer mes sentiments et mon profond attachement.
A Mon oncle, mes sœurs, frère, cousins, nièces et neveux :
Votre amour fraternel et votre soutien m’ont donné force et encouragement.
A mes professeurs du primaire (Ecole centrale d’ITZER), secondaire (Lycée El-bouhaira ITZER) et universitaire (Faculté des sciences de Rabat, Faculté de Médecine et Pharmacie de Rabat)
A tous le personnel médical et paramédical du service d’hématologie et d’immuno-hématologie de l’HMIMV.
A monsieur le professeur Hafid ZAHID: votre encouragement et soutien m’ont convaincu de ne rien lâcher.
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AVANT PROPOS
Ce travail de thèse s’inscrit dans le cadre d’un projet national portant sur la pharmacogénétique de l’Acenocoumarol au Maroc dont le but est de caractériser et de déterminer les facteurs génétiques impliqués dans la réponse à cette classe d’AVK, afin d’établir des algorithmes prédictifs de dose dans un échantillon de la population marocaine incluant en plus de ces facteurs; des facteurs non génétiques. Ces algorithmes permettront à la fois d’améliorer la qualité de la réponse et d’assurer la sécurité de la prescription de cet anticoagulant.
Ce travail a été effectué sous la direction du Professeur Nezha MESSAOUDI, Médecin chef du Service d’Hématologie et d’Immuno-Hématologie de l’Hôpital Militaire d’Instruction Mohammed V et Professeur à la Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat et la codirection du Professeur Azeddine IBRAHIMI, Directeur du Laboratoire de Biotechnologie Médicale de la Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat.
Les prélèvements ont été réalisés chez les malades suivis aux différents services cliniques de l’Hôpital Militaire d’Instruction Mohammed V après accord du :
- Pr E.ZBIR chef du service de cardiologie. - Pr E.AIT HOUSSA chef du service de CCV. - Pr A.BOURAZZA chef du service de neurologie. - Pr J.CHAARI chef du service de médecine A. - Pr A.BOUZIDI chef du pôle des laboratoires.
Le premier volet de ce travail a été mené au sein du Laboratoire d’Hématologie et d’Immuno-Hématologie de l’Hôpital Militaire d’Instruction Mohammed V. Il a été consacré d’une part à la réalisation de L’International Normalized Ratios (INR) pour chaque patient inclus dans l’étude durant toute la période de suivi jusqu’à stabilisation de l’INR dans la zone d’équilibre et d’autre part à la prise d’un échantillon sanguins (EDTA) de chaque patient pour l’étude génétique.
Le deuxième grand volet a été réalisé au niveau du laboratoire de Biotechnologie Médicale de la Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat. Il a été réservé à la réalisation de l’étude pharmacogénétique allant de l’extraction de l’ADN jusqu’au génotypage par PCR RFLP. Ce travail de thèse est le fruit de nombreuses collaborations, ayant impliquées notamment les services cliniques de l’hôpital pour le recrutement et la sélection des patients et aussi le Laboratoire d’épidémiologie et de recherche cliniques de la Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat pour l’analyse statistiques des données.
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LISTE DES ABRÉVIATIONS
20-HETE: Acide 20-hydroxyeicosatetraeonic A: Adénine
ABCB1: ATP Binding Cassette Subfamily B Member 1 ADN: Acide désoxyribonucléique
AODs : Anticoagulants oraux directs ApoE: Apolipoprotéine E
Arg: Arginine
ARN: Acide ribonucléique AT: Antithrombine
AVK: Antivitamines K C: Cytosine
C4b-BP: C4bbinding protein CALU: Calumenine
CNV: Copy number variant
CTAD: Citrate théophilline, Adénosine, dipyridamole
CYP1A2: Cytochrome P450 Family 1 Subfamily A Member 2 CYP2C19: Cytochrome P450 Family 2 Subfamily C Member 19 CYP2C9: Cytochrome P450 Family 2 Subfamily C Member 9) CYP3A4: Cytochrome P450 Family 3 Subfamily A Member 4 CYP4F2: Cytochrome P450 Family 4 Subfamily F Member 2 Cys: Cystéine
Dntp: Désoxyribonucléosides triphosphates EDTA: Éthylène diamine tétraacétique EMA: Agence Européenne du médicament
EMEA: Agence européenne pour l’évaluation des produits médicamenteux EPHX1: Epoxyde hydrolase
FA: Fibrillation auriculaire
FDA: Food and Drug Administration FT: Facteur tissulaire
FVIIIa: Facteur VIII activé G: Guanine
Gas 6: Growth arrest-specific gene 6
GBEA : Guide de bonnes exécutions des analyses GGCX: Gamma-glutamyl carboxylase
7 Gla: Acide γ- carboxyglutamique
Glu: Acide glutamique
GWAS: Genome wide association study HAS: Haute Autorité de Santé
His: Histidine
HTA: Hypertension artérielle HTZ: Hétérozygote
HWE: Équilibre de Hardy-Weinberg Ile: Isoleucine
In/Delet: Insertions/délétions
INR: International Normalized Ratio ISI: Indice de sensibilité internationale Kb: Kilobase
KHPM: Kininogène de haut poids moléculaire KO: Vitamine K époxyde
Leu: Leucine
LTB4: Leucotriène B4 Met: Méthionine
MDR1: Multi-Drug Resistance 1 MGP: Matrix Gla protein
MK: Ménaquinone
MTEV: Maladie thromboembolique veineuse Mut: Mutant
NADH : Nicotinamide adénine dinucléotide
NADPH: Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate NIH: National Institute of Health
NQO1: NADPH déshydrogénase de la quinone1 ORM1: Orosomucoid 1
ORM2: Orosomucoid 2 Pb: Paire de base PC: Protéine C
PCR: Polymerase Chain Reaction PD: Pharmacodynamie
PIVKA: Protein Induced by Vitamin K Absence or antagonist PK: Pharmacocinétique
8 PS: Protéine S
PT: Prothrombin time
PVKD: Protéines vitamino- K dépendants PZI: protein Z inhibitor
RCP: Résumés des Caractéristiques du Produit RFLP: Restriction Fragments Lenght Polymorphisms SDS: Sodium dodecyl sulfate
SNP: Polymorphisme simple de nucléotide T: Thymine
TBE: Tris-Borate-EDTA Tf : Température de fusion
TFPI: Inhibiteur de la voie du facteur tissulaire TP: Taux de prothrombine
TQ : Temps de Quick
TTR: Time in Therapeutic Range Thr: Thréonine
Val : Valine
VKH2 : Vitamine K dihydroquinone VKOR : Vitamine K oxydo-réductase
VKORC1 : Vitamine K époxyde réductase complex subunit 1 VNTR: Variable number of tandem repeats
vWF: Facteur de von Willebrand Wt: Wild-type
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LISTE DES FIGURES
Figure 1: Métaphore vestimentaire de la personnalisation (à gauche) et de l'individualisation des traitements (à droite) ... 22Figure 2: Intérêt de la caractérisation moléculaire des maladies ... 23
Figure 3: Définition de la médecine personnalisée selon EMA et FDA ... 24
Figure 4: Intégration des biomarqueurs dans le processus de découverte ... 29
Figure 5 : Les domaines d'intervention courants des biomarqueurs ... 29
Figure 6: Différentes classes de variants génétiques. D’après Frazer et al ... 36
Figure 7: Théorie reversée de la coagulation ... 40
Figure 8: Phase d’initiation de la coagulation ... 41
Figure 9: Phase d’amplification de la coagulation ... 42
Figure 10: Phase de propagation de la coagulation ... 43
Figure 11 : Schéma très simplifié des cascades de la coagulation montrant le rôle des proteines vitamine K dépendantes dans le déroulement de la coagulation ... 46
Figure 12 : Les Élus au prix Nobel 1943 de Physiologie et de Médecine ... 48
Figure 13 : Le cycle de la vitamine K. ... 51
Figure 14: Photo de K.P. Link montrant des affiches publicitaires sur la warfarine ... 52
Figure 15: Bases moléculaires des dérivés de la 4-hydroxycoumarine ... 54
Figure 16: Structure du gène humain CYP2C9 ... 56
Figure 17: Structure du VKORC1 et emplacement des SNPs ... 61
Figure 18: Topologie membranaire de la vitamine K époxyde réductase (VKORC1) ... 61
Figure 19: Structure du gène humain CYP4F2 ... 64
Figure 20: Organisation génomique du gène humain GGCX ... 66
Figure 21: Les gènes impliqués dans la réponse à l’Acenocoumarol ... 67
Figure 22: Hydroxylation du S- et R-Acenocoumarol ... 74
Figure 23: Principaux métabolites de l'Acenocoumarol et les voies impliquées ... 75
Figure 24 : Inhibition du cycle de la vitamine K par les AVK ... 76
Figure 25: Courbe d'Ingram montrant l'ajustement de volume d'anticoagulant... 79
Figure 26: Conversion du TQ en TP -Exemple de droite d'étalonnage, dite de Thyvolle ... 80
Figure 27: Méthode de détermination de la valeur de l'Indice de Sensibilité ... 81
Figure 28: Rôle de l’INR dans la détermination des phases thérapeutiques, ... 82
Figure 29: Automate STA Compact Max du Laboratoire d’hématologie et d’immuno-hématologie(HMIMV) ... 88
Figure 30: Extraction d'ADN par méthode classique au phénol-chloroforme sur hotte à flux laminaire ... 90
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Figure 31: Séparation de la phase aqueuse contenant de l’ADN après l'ajout du phénol ... 91
Figure 32: Composantes du Kit QIAmp DSP DNA Blood Mini ... 91
Figure 33: Présentation générale du NanoVue™ Spectrophotometer utilisé au laboratoire de biotechnologie de la FMPR ... 93
Figure 34: Étapes d’une amplification en chaine PCR ... 95
Figure 35: Thermocycleur utilisé au Laboratoire de Biotechnologie médicale de la FMPR 101 Figure 36: Écran de programmation des conditions de la PCR du thermocycleur Qantarus du laboratoire de biotechnologie médicale de la FMPR ... 101
Figure 37: Représentation schématique des étapes de la purification des produits PCR ... 105
Figure 38: Principe de la RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ... 106
Figure 39: Présentation du Transilluminator slider LED imager utilisé au laboratoire de biotechnologie Médicale de la FMPR ... 107
Figure 40: Marqueurs de taille d’ADN utilisés ... 109
Figure 41: Répartition des patients selon l'âge ... 111
Figure 42: Répartition des patients selon le sexe ... 112
Figure 43: Répartition des patients selon l'indication du traitement ... 112
Figure 44: Dose d’équilibre d’Acenocoumarol en fonction de l’âge ... 114
Figure 45: Analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) et modèles de bande représentatifs de profils électrophorétique de restriction obtenus à partir des produits d’amplification des régions adéquates des polymorphismes génétiques ... 118
Figure 46: Variabilité de la dose d’équilibre d’Acenocoumarol en fonction des génotypes du VKORC1 -1639G>A... 121
Figure 47: Variabilité de la dose d’équilibre d’Acenocoumarol en fonction des génotypes de VKORC1 1173C>T... 122
Figure 48: Variabilité de la dose d’équilibre d’Acenocoumarol en fonction des génotypes de l’haplotype CYP2C9 ... 123
Figure 49:Variabilité de la dose d’équilibre d’Acenocoumarol en fonction des génotypes du CYP4F2 1347 G>A ... 124
Figure 50: Variabilité de la dose d’équilibre d’Acenocoumarol en fonction des génotypes du GGCX 12970 C>G ... 125
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LISTE DES TABLEAUX
Tableau I: Classification des Biomarqueurs selon le National Institute of Health ... 30 Tableau II: Quelques types de biomarqueurs ... 31 Tableau III : Quelques biomarqueurs pharmacogénomiques qualifiés par la FDA et l’EMA32 Tableau IV: Principales caractéristiques des facteurs de la coagulation ... 39 Tableau V: Caractéristiques moléculaires des principaux inhibiteurs physiologiques de la coagulation ... 46 Tableau VI: Formule chimique des différentes classes de la vitamine K ... 49 Tableau VII: Propriétés pharmacologiques des AVK ... 55 Tableau VIII : Allèles de la variante CYP2C9 et fréquences dans différents groupes ethnique ... 60 Tableau IX: Action et Effet des autres gènes faiblement impliqués dans la réponse aux AVK ... 69 Tableau X: Traitement par l’AVK : ... 77 Tableau XI: Liste des amorces conçues avec leurs caractéristiques spécifiques utilisées pour la PCR des gènes, VKORC1, CYP2C9, CYP4F2et GGCX. ... 98 Tableau XII: Composition des milieux réactionnels pour la PCR à 25µl ... 100 Tableau XIII: Séquences des amorces sens et anti sens et conditions d’exécution de PCR pour les six SNP étudiés ... 102 Tableau XIV: Séquences d’amorces, enzymes de restriction et fragments d'ADN ... 108 Tableau XV: Analyse univariée de la dose d’Acenocoumarol et des facteurs non génétiques ... 113 Tableau XVI: Évaluation de l'équilibre de Hardy- Weinberg des fréquences alléliques de la cohorte au moyen du test du chi-deux (x2). ... 116 Tableau XVII: Distribution génotypique et allélique des SNP des CYP2C9, VKORC1, CYP4F2, GGCX et leur relation avec la dose hebdomadaire (mg) d'Acenocoumarol ... 120 Tableau XVIII: Effet combiné de génotypes (VKORC1 -1639 et VKORC1 1173) sur la dose hebdomadaire moyenne d'Acenocoumarol ... 126 Tableau XIX: Effet de la combinaison de génotypes de VKORC1 -1639 et l’haplotype CYP2C9 sur la dose hebdomadaire moyenne d'Acenocoumarol ... 127 Tableau XX: Effet de la combinaison de génotypes VKORC1 1173 et l’haplotype CYP2C9 sur la dose hebdomadaire moyenne d'Acenocoumarol ... 127 Tableau XXI: Résultats de la régression linaire multiparamétrique par étapes montrant le pouvoir prédictif de chaque facteur associé à la variabilité de la dose hebdomadaire en Acenocoumarol, et définissant le model final de prédiction de dose ... 130
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Tableau XXII: Dose hebdomadaire d'équilibre d'Acenocoumarol dans différentes populations ... 132 Tableau XXIII : La distribution des allèles VKORC1-1639 G>A et VKORC1-1173 C>T dans la population marocaine et dans d’autres groupes ethniques ... 135 Tableau XXIV: La distribution des allèles CYP2C9*2 et CYP2C9*3 dans la population marocaine et dans d'autres groupes ethniques. ... 138 Tableau XXV : La distribution des allèles CYP4F2 dans la population marocaine et d'autres groupes ethniques ... 140 Tableau XXVI: Les fréquences des allèles GGCX C>G dans la population marocaine et d'autres groupes ethniques. ... 142 Tableau XXVII: Résumé des études montrant la variabilité interethnique de doses d’équilibre en Acenocoumarol et l’effet de l’âge sur la réponse à l’Acenocoumarol. ... 146 Tableau XXVIII:Modèles d'algorithmes prédictifs de dose d'Acenocoumarol et de Warfarine élaborés dans différentes populations ... 152 Tableau XXIX : Paramètres génétiques et cliniques et les pouvoirs prédictifs(R2) de certains algorithmes pharmacogénétiques de prédiction de la dose d’acénocoumarol publiés ... 155
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TABLE DES MATIÈRES
INTRODUCTION ... 18PARTIE A : ... 20
ETAT DES CONNAISSANCES ... 20
Chapitre 1: La médecine personnalisée ... 21
I. Présentation ... 21
II. Définition ... 23
III. Les domaines d’application ... 24
1. La prédiction ... 25
2. Le diagnostic... 26
3. La thérapie ... 26
4. Le développement de nouveaux médicaments ... 27
Chapitre 2: Les Biomarqueurs... 28
I. Définitions ... 28
II. Classification des biomarqueurs ... 30
III. Le biomarqueur génomique ... 31
Chapitre 3: Pharmacogénétique et Pharmacogénomique ... 33
I. Historique ... 33
II. Définitions ... 33
III. L’apport de la pharmacogénétique dans les pratiques médicales ... 34
IV. Intérêt de l’étude des polymorphismes génétiques ... 34
V. Les formes des polymorphismes génétiques ... 35
1. Les polymorphismes mononucléotidiques SNPs ... 35
2. Les variations de structure ... 35
VI. L’Équilibre de Hardy-Weinberg (HWE) ... 36
1. Définition et principe ... 36
2. L’équation de Hardy-Weinberg ... 37
14
I. Le nouveau concept de la coagulation ... 38
1. La phase d’initiation ... 40
2. La phase d’amplification ... 41
3. La phase de propagation ... 42
II. Les facteurs vitamine K dépendants ... 43
1. Les facteurs de coagulation ... 43
1.1. Le Facteur II : Prothrombine ... 43
1.2. Le Facteur VII : Proconvertine ... 44
1.3. Le Facteur IX : facteur anti-hémophilique B ... 44
1.4. Facteur X : Facteur Stuart-Prower ... 45
2. Les inhibiteurs physiologiques de la coagulation ... 45
2.1. La Protéine C (PC) ... 46
2.2. La Protéine S (PS) ... 47
2.3. Protéine Z (PZ) ... 47
Chapitre 5: Les antivitamines K (AVK) ... 47
I. La vitamine K ... 47
1. Contexte historique ... 47
2. Classification structurale des vitamines K ... 48
3. La vitamine K et gamma-carboxylation des facteurs de coagulation vitamine ... 50
K- dépendants ... 50
II. Les antivitamines K (AVK) ... 51
1. La découverte des AVK : une innovation thérapeutique majeure ... 51
2. Classification des AVK ... 53
2.1. Classification chimique ... 53
2.1.1. Les dérivés de la coumarine (les 4 hydroxycoumariniques) qui comportent deux classes chimiques: ... 54
2.1.2. Les dérivés de l'indane-1, 3 -dione : ... 54
2.2. Classification pharmacologique ... 54
15
3.1. Les gènes influençant le plus la réponse aux AVK ... 56
3.2. Les autres gènes ... 67
4. Pharmacologie des AVK ... 73
4.1. Les propriétés pharmacocinétiques des AVK ... 73
4.2. Spécificité de la pharmacocinétique de l’Acenocoumarol ... 73
4.3. Les propriétés pharmacodynamiques des AVK ... 75
5. Les indications des AVK ... 76
6. La surveillance biologique du traitement par AVK ... 78
6.1. La phase pré-analytique ... 78
6.2. Les bilans biologiques de surveillance ... 79
7. Évaluation de la stabilité de l’INR par le TTR (Time in Therapeutic Range) ... 83
PARTIE B: MÉTHODOLOGIE ... 84
Chapitre 1: Patients et méthodes ... 85
I. Type, période et lieux de l’étude ... 85
II. Approbation par le Comité d’Éthique ... 85
III. Consentement ... 86
IV. Sélection de la population de l’étude ... 86
1. Critères d’inclusion... 86
2. Critères d’exclusion ... 87
V. Méthodes ... 87
1. Les échantillons sanguins ... 87
2. Méthodes ... 88
2.1. Test d’hémostase ... 88
2.2. Works flow de l’étude génétique des six polymorphismes ... 89
2.3. L’étude statistique ... 110
Chapitre 2: Résultats ... 111
I. Analyse descriptive de la population d’étude ... 111
1. L’effectif ... 111
16
3. Le sexe ... 112
II. Analyse des facteurs influençant la dose d'entretien en Acenocoumarol ... 112
1. Les facteurs non génétiques ... 113
Le Tableau XV représente les facteurs non génétiques évalués dans notre étude et qui sont : ... 113
2. Les facteurs génétiques ... 114
2.1. L’évaluation de l'équilibre de Hardy-Weinberg des fréquences alléliques de la cohorte ... 114
2.2. Les caractéristiques génétiques de la cohorte ... 117
Chapitre 3 : Discussion ... 132
I. Les facteurs influençant la variabilité de la réponse à l’Acenocoumarol ... 132
1. La dose d’équilibre de l’Acenocoumarol ... 132
2. Les facteurs génétiques ... 133
2.1. Le gène VKORC1 ... 134
2.2. Le gène CYP2C9 ... 137
2.3. Le gène CYP4F2 ... 139
2.4. Le gène GGCX ... 141
2.5. Effet cumulé de CYP2C9 et VKORC1 ... 143
2.6. Synthèse des données ... 144
3. Les facteurs non génétiques ... 145
3.1. Les facteurs statistiquement significatifs ... 145
3.2. Les facteurs statistiquement non significatifs ... 147
3.3. Le facteur dont l’influence est controversée : le sexe ... 148
II. Les algorithmes de prédiction des doses d’AVK ... 149
1. Naissances des algorithmes prédictifs de dose des AVK ... 149
2. Notre projet de recherche et algorithme prédictif de dose élaboré ... 150
CONCLUSION ... 156
PERSPECTIVES ... 158
17 ABSTRACT ... 162 صخلم ... 164 RÉFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 165 ANNEXES ... 196 ARTICLES PUBLIÉS ... 213
18
INTRODUCTION
Les antivitamines K (AVK) est un groupe d’anticoagulants à administration orale, majoritairement utilisés en thérapeutique depuis plus de 60 ans pour de nombreuses indications [1].
Malgré l’arrivée récente au marché mondial de nouveaux anticoagulants oraux directs (AODs) , dont la caractéristique majeure est leurs actions directes, et leurs effets thérapeutiques immédiats, les AVK restent encore à nos jours ; le traitement anticoagulant de référence dans le traitement et la prévention de pathologies cardiovasculaires fréquentes, telles que les valvulopathies, la maladie thromboembolique veineuse et les pathologies thromboemboliques artérielles, principalement la fibrillation auriculaire[2].
Au Maroc on manque d’études épidémiologiques sur l’utilisation des AVK, mais les données les plus récentes recueillies dans d’autres pays reflètent le risque iatrogène lié à l’usage de cette classe de médicaments. En effet, en France les complications hémorragiques liées aux AVK sont responsables à elles seules chaque année d’environ 17 000 hospitalisations [3] et de 5 000 à 6 000 décès par an[4]. Aux États-Unis, 17,3 % des consultations aux urgences liées à des effets indésirables des médicaments, sont dues à la warfarine, soit plus de 30 000 visites par an [5]. En Inde, les AVK seraient les médicaments responsables de 15,1 % des effets indésirables conduisant à une hospitalisation [6].
La variabilité inter-individuelle de la réponse aux AVK est liée; d’une part aux propriétés pharmacologiques de ce type de médicament et d’autre part à sa toxicité. En plus la marge d’efficacité thérapeutique étroite impose la surveillance biologique et rend compte de la difficulté de maniement des AVK en pratique quotidienne. L’instauration du traitement par les AVK constitue de ces faits un challenge permanent pour de nombreux cliniciens car le risque de sous ou surdosage guettent en permanence le patient.
A côté de facteurs démographiques ou environnementaux recensés depuis longtemps, des polymorphismes génétiques ont été identifiées depuis quelques années comme des déterminants majeurs de la réponse aux AVK, essentiellement les polymorphismes de VKORC1 et CYP2C9 qui sont très fréquents dans la population générale et varient en fonction de l’origine ethnique [7, 8].
Dans l’état actuel des connaissances, le génotypage VKORC1 et CYP2C9 à l’échelon individuel avant l’instauration du traitement par AVK pourrait participer à la prévention du risque hémorragique notamment chez les patients porteurs de ces polymorphismes et qui sont hypersensibles à ces traitements anticoagulants.
19
L’étude de ces facteurs génétiques intervenant dans la variabilité interindividuelle de la réponse aux AVK définit la pharmacogénétique, qui contribue au développement d’une médecine prédictive et personnalisée plus sûre.
En Europe et aux USA, des algorithmes prédictifs de la dose à l’équilibre de l’anticoagulant intégrant les facteurs démographiques, physiopathologiques et génétiques ont été validés et utilisés dans les cliniques d’anticoagulothérapies surtout pour la warfarine.
Notre travail de recherche s’inscrit dans la cadre de l’amélioration constante de la qualité de prise en charge des patients marocains sous Acenocoumarol et a :
pour objectifs spécifiques :
- dégager les fréquences alléliques des polymorphismes CYP2C9 (rs1799853, rs1057910), CYP4F2 (rs2108622), VKORC1 (rs9923231 et rs7196161) et GGCX (rs11676382) dans la population marocaine;
- étudier l’impact de ces polymorphismes génétiques et les caractéristiques épidémiologiques sur la dose d’équilibre de l’Acenocoumarol.
pour objectif final la proposition d’un algorithme de prédiction de la dose basé sur des données cliniques, biologiques, démographiques et pharmacogénétiques.
Pour se faire, il est nécessaire de rappeler des notions importantes afin d’arriver à nos objectifs. Nous commencerons notre travail, et avant de présenter notre étude et nos résultats, par une première partie où nous allons présenter les bases avec lesquelles nous avons travaillé à savoir :
la médecine personnalisée; les biomarqueurs;
la pharmacogénétique et la pharmacogénomique; les antivitamines K avec :
- impact sur la cascade de coagulation - surveillance au laboratoire
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PARTIE A :
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Chapitre 1: La médecine personnalisée
I. Présentation
Le concept de médecine personnalisée n’est pas nouveau : les médecins ont depuis longtemps constaté que des patients présentant des signes cliniques similaires peuvent avoir différentes pathologies, avec des causes différentes et une variabilité de réponse à des traitements identiques.
En pratique, la médecine personnalisée ne signifie pas littéralement la création de médicaments ou de dispositifs médicaux spécifiques pour chaque patient. Au contraire, il s’agit de la capacité de répartir les individus, dans des classes différentes, selon qu’ils sont ou non susceptibles de développer une maladie particulière, ou sont sensibles à un traitement spécifique. Des interventions à but préventif ou thérapeutique seront alors proposées uniquement à ceux qui pourront en bénéficier, épargnant ainsi les frais et les effets secondaires aux autres [9].
La médecine personnalisée s’intéresse donc au patient, non pas en tant que personne dont l’état de santé et la situation sont appréciés dans leur globalité, mais en tant qu’individu faisant partie d’un groupe particulier de personnes. Elle consisterait a mieux cerner et comprendre les variabilités inter-individuelle, afin de créer de nouvelles catégories.
Le nombre croissant de publications scientifiques récentes, annonce l’avènement d’une médecine dite personnalisée, affirmation étonnante pour tous ceux qui ont pu croire que la médecine impliquait déjà une attention a la singularité du cas de chaque personne, appréciée dans sa globalité. Toutefois, malgré la récurrence du terme ≪médecine personnalisée≫ dans les débats sur l’avenir de la médecine, il est difficile d’en trouver une définition consensuelle. Ce terme génère en plus un débat sur des expressions alternatives qui lui seraient préférables : médecine de précision, médecine stratifiée, médecine prédictive, médecine génomique [10]. A première vue, cette description métaphorique de la médecine personnalisée ne diffère guère d’une conception plus classique de la prise en charge personnalisée du patient.
Le principe qui consiste à ajuster un traitement aux caractéristiques spécifiques du patient n’est pas nouveau; il a toujours été l’objectif des médecins [9]. Il se réfère aux traitements médicaux «faits sur mesure» [the tailoring of medical treatment] selon les caractéristiques individuelles de chaque patient [9, 11]. La personnalisation de la médecine est un des enjeux des prochaines années afin qu’à chaque patient corresponde une prise en charge individualisée.
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La promesse de la médecine personnalisée consiste à proposer des soins ajustés [customisation of healthcare], suivant le profil de chaque patient, et ceci à toutes les étapes du processus : la prévention, le diagnostic, le traitement, et le suivi après traitement [10, 12]. Elle est le témoin d’un changement complet de paradigme entre une attitude commune pour tous (le blockbuster, one fits for all) à une attitude adaptée aux profils de patients (the right drug for the right person) (Figure 1) [13].
Figure 1: Métaphore vestimentaire de la personnalisation (à gauche) et de l'individualisation des traitements (à droite) [9, 11]
La médecine personnalisée est souvent présentée comme une médecine «sur-mesure», par opposition à une médecine qui serait de taille unique. Elle concerne tous les stades de l’acte médical, du diagnostic moléculaire à l’aide de biomarqueurs, aux modalités thérapeutiques détaillées. La médecine stratifiée, souvent abusivement confondue avec la médecine personnalisée. Elle consiste à identifier des sous-groupes de patients chez qui un «traitement ciblé» a le meilleur rapport bénéfice-risque. L’appellation «médecine de précision» a été proposée par un courant de pensée aux Etats-Unis, en remplacement au terme «médecine personnalisée», du fait de deux raisons antinomiques : l’une étant que toute «bonne médecine» est par définition personnalisée et l’autre qu’une vraie médecine personnalisée est une illusion, dans la mesure où les situations cliniques où il est réellement possible d’individualiser le choix du médicament sont extrêmement rares [14]. En effet, les « thérapies ciblées » ne permettent d’améliorer le rapport bénéfice-risque que pour une partie de la population présentant la pathologie. Les autres patients ne pouvant généralement recevoir que les thérapies «conventionnelles». Selon ses promoteurs, la «médecine de précision» est basée sur une information moléculaire qui améliore la précision du diagnostic, et donc la façon dont les patients sont traités[14]. Il ne s’agit donc, une fois encore, que de stratification de la population pour prescrire à bon escient le médicament et en ce sens, médecine de précision peut être considérée comme synonyme de médecine stratifiée, et non de médecine
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personnalisée qui repose sur des modalités très diverses, allant au-delà de la seule stratification de la population (Figure 2).
Figure 2: Intérêt de la caractérisation moléculaire des maladies
dans la personnalisation des traitements [14]
II. Définition
La médecine personnalisée est un nouveau concept de médecine appelée aussi médecine individualisée. C’est une médecine configurée, paramétrée qui repose de plus en plus sur le recours aux nouveaux biotechnologies et qui contribue à adapter la prise en charge diagnostique et thérapeutique à l’individu selon ses caractéristiques individuelles et les spécificités biologique et génétiques de leurs maladies. Elle implique l’utilisation de la pharmacogénomique et de plusieurs types de données médicales, pour permettre d’offrir les meilleurs soins aux patients [15].
La définition de la médecine personnalisée, communément admise et reprise par l’Agence Européenne du médicament (EMA) consiste à «donner au bon patient le bon traitement, chaque médicament étant donné à la bonne dose au bon moment », ce à quoi on peut ajouter «et pour la bonne durée» [16]. Selon la Food and Drug Administration (FDA) : «il s’agit d’ajuster le traitement médical aux caractéristiques individuelles, besoins et préférences de l’individu à toutes les étapes du soin (care), incluant la prévention, le diagnostic, le traitement et le suivi» [13] (Figure 3). Le National Institute of Health américain (NIH) a défini la médecine personnalisée comme «une pratique émergente de la médecine qui utilise le profil génétique des individus pour guider les décisions concernant la prévention, le diagnostic et le traitement des maladies»[17].
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Le concept et la définition de la médecine personnalisée ont évolué au cours des dix à quinze dernières années. Elle devient l’un des plus grands enjeux de la médecine de demain. Elle tire son origine des nouvelles possibilités offertes par les nouvelles technologies moléculaires et diagnostiques caractérisant le profil génétique et les biomarqueurs des maladies.
Les chercheurs fondent de nombreux espoirs sur la médecine personnalisée. Grâce aux progrès de recherche qui permettent de mieux connaître les mécanismes physiopathologiques normaux ou déréglés, cette médecine innovante, devrait permettre de développer des tests, des médicaments plus efficaces, et de passer du mode «traitement» au mode «prévention» en soins et d’offrir un accès plus large aux traitements [18, 19].
Figure 3: Définition de la médecine personnalisée selon EMA et FDA [13, 16]
III. Les domaines d’application
Au cours des dernières décennies, le champ médical est arrivé à un point où les innovations biotechnologiques et analytiques élargissent considérablement l’éventail des possibilités préventives, diagnostiques et thérapeutiques et changent souvent les notions fondamentales des processus à l’œuvre. De ce fait les domaines de la pharmacogénétique, de l’épigénomique, de la protéomique et de la métabolomique enregistrent des avancées similaires.
Actuellement, la médecine personnalisée est appliquée à quatre domaines : la prédiction, le diagnostic, la thérapie, et le développement de nouveaux médicaments.
25 1. La prédiction
En médecine personnalisée, la prédiction est utilisée pour le diagnostic pré-symptomatique, l’estimation des doses thérapeutiques et (également prénatal) et l’évaluation des risques, dans le but d’établir un pronostic, de poser un diagnostic et, le cas échéant, d’élaborer une stratégie préventive ou curative, à un stade précoce de la pathologie [20-22].
La médecine personnalisée peut donc apporter une prédiction plus significative en cas de maladies monogéniques. Cependant, en cas de maladies oligogéniques, caractérisées par un nombre faible de variations génétiques (rarement plus de 10) (certains types de cancer, par exemple), une prédiction juste est extrêmement difficile à cause d’une part de l’implication des facteurs environnementaux qui jouent un rôle important dans les maladies oligogéniques et d’autre part, aux interactions des variantes génétiques associés à la maladie, ce qui complique ou rend difficile une évaluation prédictive sérieuse. Cette problématique est accentuée pour les maladies polygéniques (par exemple maladie coronarienne, hypertension artérielle, démences, maladies psychiatriques). Dans la plupart des cas, le nombre élevé de facteurs de risque génétiques et non génétiques, leurs interactions compliquées, empêchent une prédiction fiable au niveau individuel [23, 24].
Par ailleurs, l’épidémiologie génétique combinée à des méthodes d’analyses génomiques, permet de modéliser l’amplitude des effets des interactions entre les gènes évaluées dans le sens d’une prédiction [25].
Suite aux résultats publiés de grandes séries confirmant l’intérêt de ces tests pharmacogénétiques, des algorithmes ont été ainsi proposés, et la FDA (Food and Drug Administration) et l’Agence européenne des médicaments ont modifiés des résumés des caractéristiques pour plus de 100 molécules (FDA, 2017). Parmi ces médicaments ≪ personnalisés ≫, 61 % sont utilisés pour traiter différents types de cancer. 41% restants sont des médicaments développés pour des maladies variées incluant les maladies mentales, les maladies cardiaques, le Sida (syndrome d’immunodéficience acquise) et les maladies dégénératives.
Il a été souligné que ces tests pouvaient optimiser la bonne dose plus rapidement, diminuer le temps d’hospitalisation et la survenue d’évènements indésirables.
La médecine personnalisée est déjà une réalité dans certains types de cancers. Cette approche fondée sur la connaissance approfondie des bases biologiques et génétiques de la maladie pourrait permettre de mieux traiter un plus grand nombre de cancers, mais aussi d’autres maladies comme Alzheimer ou l’asthme.
Dans le domaine cardio-vasculaire, l’utilisation de la pharmacogénétique pour améliorer la balance bénéfice/risque des anticoagulants ou des anti-agrégants plaquettaires est primordiale.
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Ainsi, un génotype particulier pourrait permettre d’identifier le patient sensible ou résistant et guider le praticien dans le choix et l’adaptation posologique de ces types de médicaments. Les patients bénéficiant de cette approche pharmacogénétique ont un meilleur contrôle de leurs facteurs de risque et une survie améliorée.
2. Le diagnostic
Un diagnostic affiné est la clé de la médecine personnalisée. Cette dernière garantie l’efficacité du traitement proposé, allant de pair avec la réduction des effets secondaires et l’anticipation avant que la maladie nécessite des interventions et des traitements lourds. L’apport de la médecine personnalisée dans le diagnostic et le pronostic des maladies est d’ores et déjà significatif, et son potentiel de développement est élevé. L’oncologie, qui a recours à des méthodes modernes basées sur la médecine personnalisée pour parvenir à un diagnostic moléculaire et à une caractérisation moléculaire des tumeurs malignes, fait figure de précurseur dans ce domaine. Le domaine de l’oncologie présente l’avantage de pouvoir réaliser directement les examens génomiques, épigénomique et protéomique sur le tissu tumoral et permettre une classification plus détaillée de chaque pathologie. La médecine personnalisée a permis un développement considérable des connaissances, dont profitent directement les patients. Plusieurs génomes complets de cancer ont déjà pu être séquencés, comme par exemple ceux de la leucémie myéloïde aiguë et de certains carcinomes bronchiques [26-28].
En plus de l’oncologie, d’autres domaines spécialisés utilisent la médecine personnalisée pour élargir le répertoire diagnostique et pronostique, comme par exemple la cardiologie. Au moyen d’approches métabolomiques, et protéomique, il est possible de différencier les stades de l’infarctus du myocarde aigu et de l’angine de poitrine instable [29, 30]. Également, des tests génétiques sont validés pour l’évaluation du degré de gravité d’une maladie coronarienne [31, 32].
3. La thérapie
Dans le domaine de la thérapie, la médecine personnalisée est en avance. L’oncologie y joue également un rôle de précurseur, notamment dans la prise en compte des paramètres pharmacologiques. Les développements de la thérapie et de l’évaluation des résultats vont de pair avec les développements des méthodes diagnostiques, c’est-à-dire d’une meilleure sous-typisation basée sur les caractéristiques moléculaires de la tumeur[33].
En effet, il existe des programmes à large échelle (en France, aux Etats-Unis, en Norvège et en Grande-Bretagne) dont l’objectif est de personnaliser des thérapies efficaces et d’éviter les
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traitements inutiles et potentiellement dangereux, toute en se basant sur la caractérisation moléculaire complète des pathologies. Ces développements ne se limitent pas seulement au domaine de l’oncologie, mais en principe à tous les domaines cliniques (cardio-vasculaires, métaboliques, neuro-psychiatriques et dermatologiques).
4. Le développement de nouveaux médicaments
L’application de méthodes pertinentes pour la médecine personnalisée revêt une importance majeure dans le développement de nouveaux médicaments. Le rôle de la génomique, de l’épigénomique et de la protéomique demeure essentiel, à chaque stade du développement des médicaments (target identification, target validation, lead development, preclinical phases, clinical phases, market) [34].
Il est très intéressant de souligner qu’avant l’introduction d’un nouveau médicament, son efficacité sélective et son risque de toxicité doivent être vérifiées à l’aide de méthodes basées sur la médecine personnalisée. Malgré que les études cliniques nécessaires sont coûteuses (surtout les études de phase III), la sélection et la stratification des sujets d’étude basée sur la médecine personnalisée améliore effectivement l’amplitude d’effets, de telle sorte que le nombre de participants peut être réduit. Manifestement, l’influence de la médecine personnalisée sur le développement des médicaments est positive et significative. Chaque entreprise pharmaceutique tient compte aujourd’hui de la médecine personnalisée dans le développement de nouveaux médicaments pour tous les domaines de la médecine (Figure 4).
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Chapitre 2: Les Biomarqueurs
I. Définitions
Un biomarqueur («marqueur» et «biologique») est défini selon la Haute Autorité de Santé (HAS), comme une «caractéristique des patients pouvant représenter un indicateur de risque (facteur de risque), d’effet du traitement (modificateur de l’effet du traitement) ou d’utilité de traiter (marqueur prédictif)». Le National Institute of Health (NIH) le définit comme «une caractéristique mesurée objectivement et évaluée comme indicateur de processus biologiques normaux, pathologiques ou de réponses pharmacologiques à une intervention thérapeutique». En effet, le biomarqueur est un concept polyvalent qui correspond à une multitude d’opérations réalisées par les chercheurs durant les différents stades de recherche et développement des médicaments. Il est généralement associé à la majorité des domaines thérapeutiques (oncologie, cardio-vasculaire, infectiologie, immunologie, neurologie...). Il s’agit surtout d’un outil de mesure qui permet de distinguer un état physiologique normal d’un état pathologique, ou de mesurer une réponse à un traitement.
L’un des principaux enjeux de la recherche pharmaceutique actuelle, est d’identifier le biomarqueur adéquat, qui permettra aux cliniciens de faire le diagnostic et de suivre le plus précocement possible et avec précision l’évolution de la maladie, ou bien sa réponse à un traitement.
Les biomarqueurs représentent aujourd’hui un domaine vaste puisqu’ils se présentent sous différentes formes physiques et biologiques et couvrent différents domaines d’application aussi bien au cours du développement pharmaceutique que dans la médecine clinique (Figure 4 et 5)
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Figure 4: Intégration des biomarqueurs dans le processus de découverte et de développement des médicaments[35]
Figure 5 : Les domaines d'intervention courants des biomarqueurs [36]
Stade 8% Efficacité 28% Mécanisme 22% Maladie 22% Toxicité 20%
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II. Classification des biomarqueurs
Le National Institute of Health propose une classification des biomarqueurs selon leurs fonctions et leurs niveaux d’application. (Tableau I).
Tableau I: Classification des Biomarqueurs selon le National Institute of Health [37, 38]
Dénomination Définition
Biomarqueur de type 0 Marqueur biologique de la progression de la maladie relié à un paramètre clinique connu
Biomarqueur de type I Marqueur biologique qui reflète les effets d’une thérapeutique selon son mécanisme d’action
Biomarqueur de type II Marqueur biologique considèré comme un critère de substitution : une modification de ce biomarqueur est associée à un bénéfice clinique ou à un risque
Critère de substitution [ou « Surrogate endpoint »]
Catégorie de marqueurs destinés à se substituer à un critère d’évaluation clinique devant permettre de déterminer le bénéfice clinique ou le risque à partir de données épidémiologiques, thérapeutiques ou physiopahologiques
Critère d’évaluation clinique
[ou « Clinical end point»]
Caractéristique ou variable qui reflète l’état du patient.
Marqueur pronostique Marqueur permettant de différencier des catégories de patients à différents risques pour une évolution déterminée, indépendamment du choix du traitement administré (ou du choix de ne pas administrer de traitement)
Marqueur prédictif Marqueur permettant de prévoir les éventuels bénéfices (efficacité) et risques (toxicité) d’un traitement selon le statut du marqueur.
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Tableau II: Quelques types de biomarqueurs [36]
Dénomination Définition
Biomarqueur diagnostic Marqueur permettant d’identifier la présence d’une pathologie et de définir la population cible répondeuse.
Biomarqueur mécanistique (ou de recherche)
Rend compte de l’effet observé du médicament en aval. Il permet d’étudier ou de découvrir les mécanismes physiopathologiques d’intérêts.
Biomarqueur d’efficacité
Reflète le résultat bénéfique du traitement
Marqueur de toxicité Rend compte de l’effet toxicologique du médicament in vitro et in vivo. Avec le biomarqueur d’efficacité, il permet une évaluation provisoire du ratio bénéfice/risque.
Biomarqueur de stade Permet de faire la distinction entre les différents stades de la maladie. Biomarqueur génomique C’est l’indicateur des processus biologiques normaux, des processus
pathogènes et/ou de la réponse à des interventions thérapeutiques ou autres.
Il pourrait, par exemple, être une mesure de :
L'expression d'un gène;
La fonction d'un gène;
La régulation d'un gène
III. Le biomarqueur génomique
C’est une ou plusieurs caractéristiques d’Acide désoxyribonucléique (ADN) et/ou d’Acide ribonucléique (ARN). Il peut s’agir d’un polymorphisme simple de nucléotide (SNP), d’une variabilité des répétitions de séquences courtes, d’haplotypes, de modifications de l’ADN (méthylations…), de délétions ou d’insertions de nucléotides, de variations du nombre de copies ou de réarrangements cytogénétiques (translocations, duplications, délétions ou inversions…), de variations de niveaux d’expression d’ARN, de transformation de l’ARN (épissage et traduction) et des niveaux de microARN [39].
Biologiquement on peut mesurer l’expression d’un gène, sa fonction et sa régulation. Malgré la multitude de biomarqueurs génomiques potentiels identifiés, le nombre de
biomarqueurs pertinents autorisés par les autorités sanitaires pour l’usage en pratique clinique reste faible (Tableau III), et tous ne sont pas forcément spécifiques à une pathologie ou couplés à une thérapie [13].
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Tableau III : Quelques biomarqueurs pharmacogénomiques qualifiés par la FDA et l’EMA -Situation 2017[13]
Médicament Aire
thérapeutique
Biomarqueur Catégorie de test Intérêt du biomarqueur
Warfarine Hématologie CYP2C9
VKORC1
Test recommandé Recherche recommandée, dans la mesure du possible,
avant l'instauration d'un traitement par AVK.
Abacavir Anti rétroviral Allèle
HLAB*5701
Test obligatoire Dépistage chez tout patient infecté par le VIH
avant début du traitement contenant de l'Abacavir. Trioxyde
d’arsenic
Oncologie t (15;17)
Gène PML/RARα Test obligatoire Pour diagnostic, rémission, rechute de la leucémie aigue promyélocytaire (LPA) =LAM3
Carbamazepine Neurologie Allèle
HLA B1502
Test recommande Recommandé avant l'instauration du Carbamazepine
(risque de réaction cutanée sévère)
Cetuximab Oncologie EGFR KRAS Test obligatoire Indiqué dans le cancer colo-rectal métastatique
Imatinib Oncologie Chromosome Ph+
t(9,22)
Test obligatoire Traitement des patients de LMC Ph+ en phase chronique
après échec du traitement par l’interféron alpha, ou en phase accélérée ou en crise blastique
Lenalidomide Hématologie Chromosome 5q Test recommande Lenalidomide inhibe la prolifération de certaines cellules malignes
hématopoïétiques (y compris les plasmocytes malins de myélome multiple et celles présentant des délaitions du chromosome 5)
Rasburicase Oncologie G6PD Test recommande Risque accru d’hémolyse concernant les patients avec déficit en G6PD
Tamoxifene Oncologie Récepteur aux
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Chapitre 3: Pharmacogénétique et Pharmacogénomique
I. Historique
Depuis longtemps, les médecins pensaient que la réponse aux médicaments pouvait varier en fonction de facteurs héréditaires. Déjà en 510 Av. J.C., Pythagore avait observé les effets dangereux produits par la consommation des fèves chez certains sujets [40]. Celles-ci entraînaient une anémie hémolytique chez les individus affectés d’un certain polymorphisme génétique [41]. En effet, ce n’est qu’en 1902 que la relation entre les gènes et les structures jouant un rôle primordial dans les réactions aux médicaments, a été établie pour la première fois par Archibald Garrod [42]. Ces observations sur la variabilité des réponses aux médicaments ont entraîné la naissance de la Pharmacogénomique, nouvelle discipline scientifique aux confins de la génétique, de la biochimie et de la pharmacologie [43].
Le terme pharmacogénétique; utilisé pour décrire l’étude des effets de l’hérédité sur la réponse aux médicaments; a fait son apparition en 1959 [44]. Durant les années 80, on a commencé à identifier les bases moléculaires génétiques des traits héréditaires, projet d’envergure dont les progrès furent intimement liés au séquençage de la totalité du génome humain et qui donna naissance à la pharmacogénomique [44].
II. Définitions
Il y a un lien étroit entre la pharmacogénétique et la pharmacogénomique bien qu’il s’agisse de deux disciplines distinctes. La pharmacogénétique s’intéresse à l’étude des différences de métabolisme entre les individus ainsi qu’aux capacités héritées d’absorption et d’élimination des médicaments. L’analyse génétique se fait grâce à l’étude des expressions phénotypiques, en particulier des différences inter-individuelles dans l’équipement enzymatique et de leurs conséquences sur le métabolisme de l’organisme. Selon l’Agence européenne pour l’évaluation des produits médicamenteux (EMEA), la pharmacogénétique peut être définie comme «l’étude des variations inter-individuelles dans les séquences d’ADN en relation avec les réponses aux médicaments» [45].
La pharmacogénétique a pour objectif ultime d’aboutir à un traitement personnalisé de chaque patient en fonction de son profil génétique. «Le bon médicament à la bonne dose pour le bon patient au bon moment».
Cependant, l'identification des différences génétiques individuelles (polymorphismes) au sein des populations, peut également être utile pour améliorer la qualité des soins de santé dans une population donnée. Il devient de plus en plus important de rassembler les données des différentes populations pour constituer une base de données, pouvant être utilisée dans des
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enquêtes épidémiologiques, afin de mieux comprendre les facteurs de risque génétiques, qui exposent à certaines maladies et pour être capable de prédire ces facteurs de risque à l’avenir. La pharmacogénomique va plus loin, grâce au développement des techniques de génétique moléculaire. Elle s’applique au gène lui-même et non plus seulement à son expression. Elle englobe la pharmacogénétique et la renouvelle en identifiant les variations du génome responsable des modifications des réponses de l'organisme [46].
La pharmacogénomique se veut donc l’étude de la totalité des gènes impliqués dans les réactions aux médicaments [47]. Elle fait aussi référence à l’utilisation de la génomique dans la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques[48].
Malgré l’existence d’un certain consensus sur ces définitions au sein de la communauté scientifique, les deux termes restent souvent utilisés indistinctement pour définir une même réalité : l’analyse de la relation fondamentale entre les médicaments et les gènes. Cet usage est lié au fait que certains considèrent la pharmacogénomique comme étant une sous-discipline de la pharmacogénétique; alors que d’autres la considèrent comme une évolution de celle-ci en une nouvelle discipline qui engloberait la pharmacogénétique traditionnelle.
III. L’apport de la pharmacogénétique dans les pratiques médicales
La caractérisation approfondie des mécanismes qui relient les variations génétiques et la réponse aux médicaments promet de nombreux bénéfices pour la prise en charge des patients [45-48]. Ceci pourra permettre de déterminer la façon par laquelle les polymorphismes génétiques affectent les cibles thérapeutiques : le métabolisme, le transport, la distribution, l’excrétion et l’absorption du médicament [49]. La pharmacogénomique pourrait aussi révolutionner le champ de développement des nouveaux médicaments grâce à des essais cliniques plus efficaces, plus rapides et plus sécuritaires [50]. En effet, grâce à la pharmacogénomique, on pourra exclure de la phase III des essais cliniques avec utilisation plus sécuritaire des médicaments en se basant sur la corrélation entre le profil génétique spécifique et les doses optimales en prenant en considération les effets indésirables[51]. La pharmacogénomique pourra aussi remettre sur le marché certaines molécules retirées à cause de leurs effets indésirables [52, 53]. La pharmacogénomique promet donc une plus grande efficacité thérapeutique, une minimisation des effets indésirables, une meilleure tolérance des médicaments et donc une réduction du coût.
IV. Intérêt de l’étude des polymorphismes génétiques
Le polymorphisme génétique est un des facteurs impliqué dans la variabilité inter-individuelle de la réponse au médicament. Il se définit comme une modification fréquente de la séquence
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génétique, observée chez plus de 01 % de la population. De ce fait, le polymorphisme génétique peut avoir des conséquences fonctionnelles : diminution ou augmentation de l’activité, ou de l’expression des protéines selon une fréquence qui varie de 01 à 80% dans la population générale [54].
Sur les trois milliards de bases du génome humain, 99,9% sont identiques d'un individu à l'autre. Le 0,1% restant représente les variations ou polymorphismes, pourcentage infime mais qui est à la base des différences entre les individus.
V. Les formes des polymorphismes génétiques
1. Les polymorphismes mononucléotidiques SNPs
Le niveau le plus simple des polymorphismes génétiques est représenté par des variations d’une seule base nucléotidique (A, T, G, C) correspondant aux substitutions nucléotidiques ou en langage anglo-saxon ‘‘single nucléotid polymorphism’’ ou SNP.
Les SNPs peuvent être estimés à environ 11 millions répartis au sein du génome et surviennent toutes les 100 à 300 paires de bases. Pour ces SNPs, on peut définir des variantes rares qui correspondent à moins de 01% de la population. On peut estimer à 7 millions, le nombre de SNPs dont l’allèle mineur avec une fréquence supérieure à 05%. Il est important de noter que les différences entre les individus porteront sur des variations reconnues comme fréquentes plutôt que rares [55].
2. Les variations de structure
On distingue les séquences répétées (mini ou micro-satellites ou VNTR pour ‘‘variable number of tandem repeats’’) et les insertions/délétions (InDel) qui correspondent à la présence ou l’absence d’une ou de plusieurs bases alors qu’elles ne sont pas présentes dans un autre génome et dont la taille est inférieure à 1 kilobase (kb). Les altérations de structure correspondent aux délétions, duplications, insertions, inversions et translocations. Les variations de structure peuvent ainsi modifier la quantité d’ADN comme les CNV (copy number variant), qui intéressent des fragments d’ADN de plus de 1 kb (Figure 6).
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Single nucleotide variant AGGCCTTAACCAATCATGCACGATAT AGGCCTTAACCAATTATGCACGATAT
Insertion-deletion variant AGGCCTTAACCAATCGATATGCACGATAT AGGCCTTAACCAAT---TATGCACGATATT
Block substitution AGGCCTTAACCAATCATGGCACGATAT
AGGCCTTAACCAATCCACGCACGATAT
Inversion variant AGGCCTTAACCAATCATGGCACGATAT
AGGCCTTTTCCAATCATGGCACGATAT
Copy number variant ATTGGCCTTACGCCTTAACCCCCGATTATCAGGAT
ATTGGCCTTA---ACCCCCGATTATCAGGAT
Figure 6: Différentes classes de variants génétiques. D’après Frazer et al. [56]
VI. L’Équilibre de Hardy-Weinberg (HWE)
1. Définition et principe
En 1908, deux scientifiques, Godfrey H. Hardy, mathématicien anglais, et Wilhelm Weinberg, médecin allemand, élaborèrent indépendamment une relation mathématique associant les génotypes aux fréquences alléliques [57].
Leur concept, appelé principe de Hardy-Weinberg (HWE), est un concept crucial en génétique des populations. Il prédit comment les fréquences des gènes seront héritées de génération en génération [58] : dans une population se reproduisant de manière aléatoire, les fréquences alléliques resteront les mêmes de génération en génération, en supposant qu'il n'y a pas de mutation, de migration de gène, de sélection ou de dérive génétique [59] . Ce principe est important car il fournit aux biologistes un standard à partir duquel ils mesurent les changements de fréquence d'allèles dans une population. Il est utilisé dans les études d'association génétique pour se protéger des erreurs de génotypage et de la stratification de la population. Le HWE est un état idéal qui ne se produit jamais dans la nature car il y a toujours une influence perturbante dans la nature. Les exemples d'influences perturbatrices incluent : l’accouplement non aléatoire, les mutations, la sélection, la taille limitée de la population, la dérive génétique aléatoire et le flux de gènes. Les fréquences alléliques observées et attendues dans une population étudiée seraient en HWE si p> 0,05. Une population d'allèles doit respecter toutes les règles suivantes pour être considérée «en équilibre»:
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- pas de mutations géniques, donc pas de changement d'allèles. - pas de migration d'individus entrant ou sortant de la population.
- l'accouplement aléatoire doit se produire, les individus se reproduisent au hasard. - aucune dérive génétique ne doit se produire, un changement de fréquence d'allèle peut survenir.
- pas de sélection naturelle.
Un changement de fréquence d'allèle en raison de l'environnement peut se produire. Un écart par rapport au HWE est obtenu lorsque p <0,05 et indique l'évolution de l'espèce. Les déviations des fréquences de génotype par rapport aux HWE peuvent affecter la validité des tests d'association utilisant des contrastes à base d'allèles [60]. L’équilibre de HWE est donc utilisé comme un contrôle de qualité dans l'analyse statistique des données génétiques.
2. L’équation de Hardy-Weinberg
Deux équations sont nécessaires pour résoudre une question HWE :
la première est : p + q = 1;
la deuxième est : p2 + 2pq + q2 = 1 - p est la fréquence de l'allèle dominant, - q est la fréquence de l’allèle récessif,
- p2 est la fréquence des individus avec le génotype dominant homozygote,
- 2qp est la fréquence des individus avec le génotype hétérozygote et q2 est la fréquence des individus avec le génotype homozygote récessif.
Par exemple : une population contenant les génotypes A/A, aa et Aa. La fréquence de A/A sera toujours p2, celle de aa sera q2 et celle de Aa sera 2pq à l'équilibre, où p est la fréquence de A et q est la fréquence de a.
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Chapitre 4: Les acteurs de la coagulation plasmatique vitamine K
dépendants
I. Le nouveau concept de la coagulation
La coagulation plasmatique correspond à la transformation du fibrinogène soluble en fibrine insoluble. Cette conversion est la conséquence d’une cascade enzymatique à laquelle participent plusieurs protéines plasmatiques appelées facteurs de la coagulation (Tableau IV). Les surfaces cellulaires des plaquettes activées, des monocytes et des cellules endothéliales font partie intégrante de la fonction de coagulation puisqu’elles participent à l’assemblage des unités catalytiques des protéines de la coagulation sous forme active et augmentent ainsi leur activité enzymatique.
La description biologique de la cascade de la coagulation a fait l’objet d’importantes modifications, et l’approche classique qui séparait cette cascade en voie extrinsèque et intrinsèque a été remplacée par un modèle plus intégré qui prend en compte les cellules à la surface desquelles se déroulent les réactions de la coagulation (Figure 7) [61] : c’est le nouveau concept de la coagulation in vivo qui comporte trois phases :
- La phase d’initiation - La phase de propagation - La phase d’amplification
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Tableau IV: Principales caractéristiques des facteurs de la coagulation[62, 63]
Facteur de coagulation Masse moléculaire (KDa) Rôle Lieu de synthèse Vit K dépendant Concentration plasmatique (mg/l) Demi-vie plasmatique (h)
I (Fibrinogène) 340 Substrat Foie NON 2000-4000 120
II (Prothrombine) 72 Zymogène Foie OUI 100-150 80
III (Facteur tissulaire)
47 Cofacteur Sous
endothélium
NON
V (Pro-accélérine) 330 Cofacteur Foie NON 05,00 -10 24
VII (Proconvertine) 50 Zymogène Foie OUI 0,35 -0,6 6
VIII (Facteur anti -hémophilique A)
330 Cofacteur Foie, Rate, Poumon
NON 0,1 -0,2 12
IX (Facteur anti -hémophilique B)
57 Zymogène Foie OUI 3,0 -5 48
X (Facteur Stuart)* 59 Zymogène Foie OUI 7,00 -17 24
XI (Facteur Rosenthal)*
160 Zymogène Foie NON 03,00 -06 60
XII (Facteur Hageman)*
80 Zymogène Foie NON 30-40 60
XIII (Facteur stabilisant la fibrine)
320 Zymogène Foie NON 20-30 240
Prékallikréine(facteur Fletcher)* 85 Zymogène ? NON 25-50 35 Kinininogène de haut poids moléculaire (facteur Fitzgerald) 100 Cofacteur ? NON 60-90 150
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Figure 7: Théorie reversée de la coagulation [64]
1. La phase d’initiation
Le facteur tissulaire (FT) est l’élément clé de l’amorçage de la coagulation in vivo. Il est exprimé de façon constitutive par les cellules extra-vasculaires telles que les fibroblastes et les monocytes. Lors d’une lésion vasculaire, le FT entre en contact avec le milieu endo-vasculaire et va se lier avec le facteur VIIa(FVIIa) circulant pour former le complexe FT–FVIIa qui va activer le facteur X (FX). Le FX activé va alors se lier avec le facteur V activé (FVa) et transformer la prothrombine (facteur II) en thrombine (facteur IIa). Cette petite quantité de thrombine formée va activer le FV, le facteur XI et cliver le facteur VIII (FVIII) lié au facteur de von Willebrand (vWF).
À l’état basal, il existe une faible quantité de FT circulant, insuffisante pour initier la coagulation mais déterminante pour franchir le seuil d’amplification en association avec le FT exposé par les tissus lésés [65] (Figure 8).
