Thesis
Reference
Complications de l'immunothérapie par transfusion de lymphocytes de donneur après greffe de cellules souches hématopoïétiques
SCHORER, Raoul
Abstract
Après greffe de cellules hématopoïétiques, les deux complications principales sont la maladie greffe contre hôte, et la rechute de la maladie. Contre la rechute, une transfusion de lymphocytes du donneur peut permettre d'induire un effet greffe contre hôte contrôlé, pour éradiquer les cellules hôtes résiduelles à l'origine de la rechute. Cependant, provoquer une maladie greffe contre hôte peut potentiellement induire des complications, et notre objectif est d'analyser l'épidémiologie de ces dernières, particulièrement sous les angles infectieux et cytopéniques, mais aussi sous celui de la récupération immunologique après greffe. Il s'agît d'une étude de cohorte rétrospective de 136 patients, dont 80 ayant reçu des lymphocytes du donneur, et 56 contrôles n'en ayant pas reçu. Les résultats n'autorisent pas de conclusion définitive, mais nous n'avons pas retrouvé d'impact négatif sur la survie. Nous concluons à un probable effet globalement bénéfique, et à la nécessité de plus amples recherches dans ce domaine.
SCHORER, Raoul. Complications de l'immunothérapie par transfusion de lymphocytes de donneur après greffe de cellules souches hématopoïétiques. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2014, no. Méd. 10744
URN : urn:nbn:ch:unige-420001
DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:42000
Available at:
http://archive-ouverte.unige.ch/unige:42000
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Section de médecine Clinique Département de Médecine Interne des Spécialités
Service d'Hématologie
Thèse préparée sous la direction du Professeur Yves Chalandon, ainsi que du Professeur Eddy Roosnek (co-directeur)
" Complications de l'Immunothérapie par Transfusion de Lymphocytes de Donneur après Greffe de Cellules Souches Hématopoïétiques "
Thèse
présentée à la Faculté de Médecine de l'Université de Genève
pour obtenir le grade de Docteur en médecine par
Raoul SCHORER de
Chêne-Bougeries(GE) Thèse n° 10744
Genève 2014
Résumé :
Après greffe de cellules hématopoïétiques, les deux complications principales sont la maladie greffe contre hôte, et la rechute de la maladie. Contre la rechute, une transfusion de lymphocytes du donneur peut permettre d'induire un effet greffe contre hôte contrôlé, pour éradiquer les cellules hôtes résiduelles à l'origine de la rechute. Cependant, provoquer une maladie greffe contre hôte peut potentiellement induire des complications, et notre objectif est d'analyser l'épidémiologie de ces dernières, particulièrement sous les angles infectieux et cytopéniques, mais aussi sous celui de la récupération immunologique après greffe. Il s'agît d'une étude de cohorte rétrospective de 136 patients, dont 80 ayant reçu des lymphocytes du donneur, et 56 contrôles n'en ayant pas reçu. Les résultats n'autorisent pas de conclusion définitive, mais nous n'avons pas retrouvé d'impact négatif sur la survie. Nous concluons à un probable effet globalement bénéfique, et à la nécessité de plus amples recherches dans ce domaine.
Table des matières
Résumé en Français
Introduction... I Eléments historiques... I Immunosuppression et Infection après HSCT ... I La reconstitution immune après HSCT... II Le système immunitaire inné ... II Le système adaptatif ... II L'effet Greffe contre Tumeur ... IV Immunothérapie par Transfusion de Lymphocytes du Donneur (DLI)... IV Les Mécanismes Biologiques de la DLI ... V Comment utiliser la DLI ... V Principaux Résultats ... VI Survie... VI Anémie et Cytopénie... VII Hémoglobine ... VII Leucocytes... VII Monocytes... VII Thrombocytes... VII Immunoglobulines non spécifiques ... VII Infections... VII Infections bactériennes... VIII Infections virales... VIII Infections mycotiques ... VIII
Texte original (anglais)
Introduction... 1
Historical elements... 1
Immunosuppression and infection after HSCT... 1
Immune reconstitution after HSCT ... 2
Innate immune system... 2
Adaptive immune system recovery... 3
Graft versus tumor effect... 4
DLI... 4
Biological mechanism of DLI... 5
How to use DLI... 5
DLI for specific situations... 6
Patients and Methods ... 7
Patient Parameters... 7
DLI... 8
Transplant and conditioning... 8
Donors ... 8
Conditioning ... 8
Serocompatibility ... 9
CMV ... 9
EBV... 9
Results ... 11
Survival ... 11
Anemia and Cytopenia ... 13
Hemoglobin ... 13
White Blood Cells ... 14
Monocytes... 14
Thrombocytes... 15
Non-specific immunoglobulins... 15
Infections... 17
Infectious agents ... 17
Infection sites ... 18
Infections overall... 18
Bacteria... 18
Virus... 19
Fungi ... 19
Discussion... 24
Survival ... 24
Cytopenia and Immune Recovery ... 25
Erythrocytes and Thrombocytes ... 25
Leukocytes... 25
Immunoglobulins... 26
Infections... 26
Bacterial Infections... 26
Viral Infections... 27
Fungal infections ... 27
Infection Sites... 28
Conclusion ... 28
References... 29
Résumé et Introduction en Français
Introduction
Eléments historiques
La transplantation de cellules souches hématopoïétiques (HSCT) est définie comme un transfert de moelle osseuse ou de cellules souches du sang périphérique du donneur au receveur, dans le but de faire du receveur une chimère muni d'un système hématopoïétique complet venant du donneur.
Ironiquement, ce sont les conséquences de l'explosion de la première bombe atomique en 1945 qui ont donné à ce champ de recherche l'impulsion nécessaire à son développement, même si des tentatives antérieures de HSCT ont existé. Jacobsen, Lorenz, et leurs collègues ont les premiers rapporté que l'injection de cellules spléniques dans le péritoine murin apportait la même protection contre les radiations ionisantes que la protection directe des organes hématopoïétiques eux-mêmes par des boucliers [1]. Il a ensuite été montré qu'un effet protecteur contre l'irradiation létale pouvait être apporté par l'infusion intraveineuse de cellules de la moelle osseuse d'organismes syngéniques [2]. Puis, le compartiment cellulaire de la transfusion fût reconnu comme le vecteur de la radioprotection, et les sujets d'expérience survivant au protocole d'irradiation suivi d'une transplantation furent nommés "chimères" [3, 4]. Chez les humains comme dans les modèles animaux, les premières tentatives dans le domaine de la transplantation de cellules souches (SCT) ont utilisé des autogreffes. La récupération de la moelle hématopoïétique après irradiation par infusion de cellules hématopoïétiques autologues préalablement congelées a été observé en 1958 [5]. Puis est venu la première HSCT croisée entre deux jumeaux, et la première HSCT allogènique aboutissant à la survie à long terme du patient, respectivement en 1959 et 1968 [6, 7].
Malheureusement, ces développements ont apporté leur lot de complications, parmi lesquels la maladie du greffon contre l'hôte (GVHD) et l'immunosuppression/l'aplasie médullaire sont les plus marquants. Il a déjà été noté en 1955 que les souris greffée à partir de donneurs syngéniques encouraient une mortalité liée à la greffe (TRM) moindre que celles recevant une greffe allogénique [8]. Les animaux présentaient des symptômes typiques de la GVHD, à l'époque désignée comme
"maladie secondaire". Il a finalement été découvert au début des années 1980 que l'incubation du greffon avec des anticorps anti lymphocyte T diminuait de façon conséquente l'incidence de GVHD [9]. Toutefois, la déplétion des cellules T augmentait l'incidence de rechute chez les patients atteints de leucémie myéloïde chronique (CML) par la disparition de l'effet greffe-contre-tumeur (GVT) qui était jusqu'ici particulièrement prononcé [10].
Immunosuppression et Infection après HSCT
Les infections sont une indication commune d'admission aux soins intensifs dans les suites de la HSCT, et sont un facteur prédictif extrêmement négatif pour la survie, en particulier si une ventilation mécanique est nécessaire [11]. Toutefois, l'apparition de la ventilation non invasive a amélioré le pronostic [12]. L'aplasie fébrile favorise également d'autres complications, parmi lesquelles la GVHD, le syndrome de détresse respiratoire de l'adulte, la maladie véno-occlusive, et l'expression clinique du cytomegalovirus, apparemment suite à une libération massive de cytokines induite par l'inflammation [13]. 20-40% des patients transplantés avec du tissu hématopoïétique sont susceptibles de nécessiter une admission aux soins intensifs, avec 13-18% des décès imputés aux
II
infections [14, 15]. Les pneumonies d'origine bactérienne prédominent dans le mois suivant la transplantation, avec une augmentation d'incidence des épisodes viraux et fongiques passé ce cap [16] [17].
La reconstitution immune après HSCT
Le système immunitaire inné
Après HSCT, les lignées cellulaires varient dans leur délai de prise de greffe. Les premières lignées à récupérer sont les monocytes et les granulocytes, puis viennent les thrombocytes et les cellules NK.
La prise de greffe est définie comme le premier jour où le compte de granulocytes atteint 0,5 G/L au moins, et dépasse ce seuil sur trois jours consécutifs [18]. Les premiers monocytes à apparaître dans la circulation proviennent du donneur, particulièrement si le greffon est issu de cellules souches mobilisées dans le sang périphérique par l'administration de G-CSF [19-21]. Les monocytes remplacent ensuite graduellement les macrophages résiduels du receveur [22]. Leur capacité fonctionnelle reste toutefois sujette à controverse [23, 24]. Les comptes de neutrophiles atteignent habituellement leurs niveaux normaux dès deux semaines après HSCT à partir de sang périphérique, trois semaines à partir de moelle osseuse, et quatre semaines si des cellules de cordon ombilical sont utilisées [25]. En présence de GVHD, la fonction des neutrophiles peut être diminuée à long terme, en paticulier chez les patients atteints par la forme chronique de la complication (cGVHD). Ceci reflète possiblement les doses importantes de corticostéroïdes administrées pour le traitement de la maladie [19]. Les cellules NK récupèrent par expansion clonale durant le premier mois post transplantation, et ceci marque le retour à un système immunitaire inné fonctionnel, et pouvant contribuer à l'effet GVT par la lyse des cellules leucémiques résiduelles [26, 27]. L'effet GVT est souligné par la corrélation de la récupération de la lignée NK avec le mismatch génétique des récepteurs KIR et leur pouvoir protecteur contre la rechute [28, 29]. Après la récupération des lignées précitées vient celle des cellules dendritiques (DC), qui survient préalablement à celle du système adaptatif [30, 31]. Il convient de clairement distinguer les DC circulantes et les DC tissulaires, puisque la majorité des premières seront issues du donneur dès les premières semaines après HSCT, alors que les secondes peuvent rester issues du receveur durant plus d'un an [32]. En effet, les DC tissulaires mettent habituellement plus d'un an à récupérer [33]. De plus, les DC peuvent être classifées selon leur localisation: Les cellules de Langerhans récupèrent au cours des six mois suivant la HSCT, comme les DC présentatrices d'antigènes [34-36]. Les DC circulantes deviennent détectables dès deux semaines après HSCT, les comptes de cellules DC1 (DC myéloïdes) se normalisant ensuite, alors que les taux diminués de DC2 (DC plasmacytoïdes) persistent bien après la première année [20, 33, 37, 38]. La récupération des DC thymiques n'a pas été étudiée chez les humains. Finalement, les centres germinaux réapparaissent tardivement (un an au moins) après transplantation, en corrélation avec la lente récupération des DC folliculaires [35, 36]. Il semble que la capacité fonctionnelle des DC soit aussi perturbée après HSCT, et il a été montré que la vaccination avec des DC préalablement chargées en peptides était supérieure aux vaccins standards dans la période post transplantation [39, 40].
Le système adaptatif Lymphocytes T
Les comptes de cellules B et T augmentent rapidement après transplantation, alors pourquoi l'incidence d'infection reste-elle élevée [21, 41, 42]? L'élément de réponse le plus important est
l'expansion clonale périphérique. Plusieurs processus contribuent à ce phénomène, et le transfert d'immunité de donneur à receveur est faible. L'un des facteurs aboutissant à l'expansion est le faible nombre de cellules T transfusées dans l'environnement dépourvu de lymphocytes du donneur. Après HSCT, IL-7 et IL-15, les initiateurs principaux de l'expansion homéostatique, stimulent les quelques lymphocytes T restants en compétition pour ces cytokines à se multiplier jusqu'à retrouver une numération normale [33, 43]. De plus, les cellules T stimulées par des antigènes à ce moment bénéficient d'un avantage compétitif, et peuvent aussi être activée par des peptides endogènes [44].
En conséquence, quelques cellules T ainsi activées se multiplient massivement et perdent les récepteurs nécessaires à l'extravasation dans le même temps, ce qui limite fortement le répertoire de spécificité antigénique de l'hôte [21, 45-47]. La littérature rapporte que le receveur possède plus de lymphocytes T activés et de cellules CD8+ que la normale dans l'année qui suit la greffe, avec comme conséquence une proportion de cellules T naïves plus faible [48, 49]. La stimulation antigénique amène un tel avantage compétitif que le répertoire T en période post greffe immédiate est principalement restreint aux clones cellulaires réagissant aux antigènes rencontré alors: les virus cytomegalovirus et Epstein-Barr, et les complexes majeurs d'histocompatibilité [50-54]. De plus, nous savons qu'entre les deux moyens de repopulation du compartiment T, soit l'expansion clonale périphérique et la récapitulation de l'ontogénie thymique, ce dernier ne joue qu'un rôle mineur à court terme, et les premières cellules T naïves originaires du donneur n'apparaissent pas avant 4 mois post greffe. La récupération de la population T naïve reste probablement incomplète jusqu'à plusieurs années après la transplantation, et ceci encore seulement chez les individus de moins de 50 ans [55-57]. Ajouté au lent développement des DC folliculaires après greffe, les éléments précités pourraient représenter un facteur limitant majeur pour la récupération des cellules B, qui ne débute pas avant 2 mois post transplantation [58]. Le résultat final de l'expansion clonale des cellules T est que les patients sont plus exposés aux infections que les contrôles ajustés pour l'âge jusqu'à deux ans après HSCT. Les agents pathogènes les plus communs sont les virus, et la réponse vaccinale reste quasi inexistante jusqu'à un an après HSCT [41, 59, 60]. Au vu du fait que le transfert d'immunité après greffe semble plus efficace pour les antigènes présents à ce moment-là, des essais cliniques de vaccination précoce sont en cours, et ce champ nécessitera de plus amples recherches [61].
Toutefois, la récupération complète du répertoire T ne peut venir que de la voie thymique [62]. Ceci a été clairement montré par le fait que les patients ayant subi une thymectomie ne récupèrent pas [63]. Une compréhension plus profonde de la récupération par la voie thymique sera nécessaire pour mieux définir un régime optimal de revaccination après HSCT.
Lymphocytes B
Un indice indirect de la récupération des cellules B après greffe est la réactivité à la (re)vaccination.
La réactivité des cellules B dépend toutefois de la récupération des cellules T CD4+, et le conditionnement du greffon par T déplétion ou l'administration de sérum anti lymphocytaire (anti thymocyte globulin, ATG) retarde la réapparition de la réponse vaccinale, particulièrement pour les antigènes de type polysaccharide [64]. La récupération différenciée de la réponse vaccinale dépend donc du type d'antigène considéré. En particulier, la réponse aux antigènes protéiques réapparait dans les 2 ans post greffe, soit bien plus tôt que la réponse aux polysaccharides. Les vaccins utilisant des antigènes auxquels le patient a déjà été exposé permettent également une réponse plus précoce que ceux pour lesquels il s'agit d'une primoexposition [65]. Il faut aussi noter la distinction entre les comptes lymphocytaires B et la fonctionnalité desdites cellules, puisque bien qu'une majorité d'entre elles proviennent du donneur, les anticorps de type "donneur" n'apparaissent que bien plus tard
IV
[65]. En effet, les principaux producteurs d'anticorps sont les plasmocytes, résidants dans les tissus et particulièrement radiorésistants [66, 67]. Comme nous l'avons vu plus haut, les comptes de cellules B restent faibles jusqu'à au minimum 2 mois post greffe, et l'incidence d'infection reste élevée même avec la récupération substantielle du taux d'immunoglobulines circulantes, puisque de nombreuses cellules sécrètent des anticorps inefficaces ou même des autoanticorps [68]. Malgré la récupération des cellules B, le taux de ces dernières reste souvent bas même à 2 ans post transplantation, et ces cellules sont majoritairement immatures en l'absence des lymphocytes T CD4+ et des DC folliculaires nécessaires au changement d'isotype [58, 69]. D'autre part, la récupération des immunoglobulines spécifiques semble être fortement liée aux antigènes rencontrés dans la période de greffe, comme peut cela peut être observé chez les patients recevant un greffon CMV positif [70]. Certains antigènes semblent être exclus du processus, et peuvent voir la réapparition de leur immunité spécifique retardée jusqu'à une vingtaine d'années [71]. Finalement, des données bien établies soutiennent la récapitulation de l'ontogénie lymphocytaire B comme moteur principal de leur récupération post greffe, avec un profil d'immunoglobulines évoluant en conséquence [72]. Au vu de la nécessité d'une aide des cellules T pour accomplir le changement de chaîne lourde des immunoglobulines, il est évident que la fonctionnalité des cellules B sera retardée au moins jusqu'à une récupération substantielle du compartiment T CD4+, laissant le patient avec une immunité humorale absente ou immature jusque là [58, 69].
L'effet Greffe contre Tumeur
La découverte de l'effet HSCT contre tumeur/leucémie (GVT) est survenue tardivement par rapport à l'identification de la GVHD, et la première publication rapportant un effet GVT nous est venue de Horowitz et ses collègues, en 1990 [73]. La rechute après greffe allogènique était connue pour augmenter avec l'utilisation de greffe T déplétées et l'intensité de l'immunosuppression post greffe [73, 74]. De plus le fait que la transfusion de lymphocytes du donneur après greffe (DLI) puisse induire une rémission indiquait que les cellules du donneur étaient les vecteurs de l'effet GVT [75].
En plus des cellules T, les cellules NK ont été reconnues commes vecteurs de l'effet GVT dans les greffes haploidentiques [29]. Les antigènes cibles de l'effet GVT sont actuellement en cours d'étude, mais puisque la GVHD semble intimement liée à l'effet GVT, il a été suggéré que leurs ensembles d'antigènes spécifiques sont probablement semblables, et que l'effet GVT pourrait cibler des alloantigènes non spécifiques à la tumeur [73, 76]. Une vaccination pour les antigènes spécifiques à la tumeur produit un effet GVT modeste. Malheureusement, l'intime association entre un effet GVT efficace et la GVHD indique que les alloantigènes induisent probablement une réponse plus efficace des cellules du donneur que les antigènes spécifiques à la tumeur [73, 76-78]. Toutefois, l'espoir d'une séparation de l'effet GVT et de la GVHD persiste, car les organes affectés par ces phénomènes dffèrent (épiderme, tube digestif, et foie pour la GVHD; moelle hématopoïétique et tissus lymphoïdes dans l'effet GVT) [79]. Les stratégies de séparation récemment tentées se sont concentrées sur la réduction de la sécrétion de cytokines associée au conditionnement pré greffe par des protocoles d'intensité réduite (RIC), avec ou sans DLI, et en augmentant la spécificité des cellules du donneur pour les antigènes spécifiques à la tumeur par ingénierie génétique ou par vaccination [79].
Immunothérapie par Transfusion de Lymphocytes du Donneur (DLI)
A partir des éléments cités plus haut, nous pouvons voir que l'optimisation de la HSCT consiste en bonne partie à trouver un équilibre entre l'immunosuppression et ses complications infectieuses et
cytopéniques, et l'immunocompétence et son association avec la GVHD et l'effet GVT. la DLI a été élaborée en réponse à ce paradigme sous la forme d'un effet GVT (et sa GVHD associée) contrôlé.
La DLI a été introduite par Kolb dans les cas de leucémie myéloïde chronique (CML), en montrant que la transfusion de buffy coats avec de l' IFN-α pouvait induire une rémission [75]. La première preuve de l'activité GVT de cellules allogéniques est venue de la clinique, où des rémissions complètes ont été observées après arrêt du traitement immunosuppresseur dans des patients en rechute, la GVHD étant associée avec une baisse du risque de rechute [80, 81]. Les lymphocytes T allogéniques ont été identifiés comme le vecteur de cet effet lorsqu'il a été noté que les patients recevant de greffes T déplétées encouraient plus de rechutes [82, 83]. Au vu de ces premiers succès, la DLI a ensuite été appliquée à une variété de pathologies, mais les meilleurs résultats sont restés ceux obtenus dans la CML [84-86]. Le stade de la pathologie est un facteur important pour la réponse à la DLI, pour laquelle la meilleure efficacité est obtenue dans les rechutes cytogénétiques/moléculaires. Le protocole optimal actuel serait donc de surveiller les patients à l'affût d'une rechute post greffe, et d'administrer promptement la DLI avant qu'une rechute hématologique puisse se développer [87].
Malheureusement, l'utilisation de la DLI a été limitée par la GVHD [88-91]. Dans l'intention de limiter l'incidence et la sévérité de la GVHD tout en préservant l'effet GVT de la DLI, le régime original de dose maximale initiale (bulk dose) a progressivement été remplacé par un régime de dose progressive (escalating dose regimen), consistant en l'administration de DLI itératives jusqu'au développement d'une rémission ou d'une GVHD secondaire [92, 93].
Les Mécanismes Biologiques de la DLI
La compréhension des mécanismes biologiques de la DLI est encore incomplète. Néanmoins, il est apparu clairement que la DLI avait deux conséquences principales: 1) la GVHD (effet indésirable) et 2) l'effet GVT. Un des problèmes les plus importants de la biologie de la transplantation actuelle est de dissocier ces effets, pour augmenter l'effet GVT tout en limitant la GVHD. Cette dernière semble trouver son origine dans les lésions tissulaires et le processus inflammatoire associé, qui active et provoque la prolifération des lymphocytes T alloréactifs. Ces cellules migrent ensuite vers les sites de lésion tissulaire pour causer davantage de dommages, conduisant à un cycle de destruction tissulaire et d'inflammation. La recherche actuelle vise donc à mieux définir le rôle des cellules médiatrices de l'inflammation, telles que les lymphocytes T CD4+ et les DC. D'autre part, il est postulé que l'effet GVT serait médié par deux voies principales: 1) l'immunité spécifiquement dirigée contre des antigènes tumoraux, tels que HA-1 ou HA-2, qui sont exprimés de façon normale dans l'organisme (voie principale), et 2) l'immunité dirigée contre des néoantigènes tumoraux (voie mineure) [94, 95].
Bien entendu, ces cellules effectrices requièrent l'aide d'autres cellules activatrices et présentatrices d'antigènes, et les modèles animaux suggèrent que les DC des patients receveurs jouent un rôle majeur dans l'effet GVT, contrairement aux DC d'origine "donneur" [96]. Des études se sont donc concentrées sur la manière de promouvoir les populations de DC adaptées [97]. Il a également été rapporté que les lymphocytes T régulateurs transfusés avaient le potentiel de rééquilbrer l'effet de la DLI vers l'effet GVT tout en diminuant les risques de GVHD, ainsi qu'il a été observé dans les modèles animaux [98].
Comment utiliser la DLI
Deux régimes d'administration principaux de la DLI ont été utilisés: 1) la dose maximale initiale (bulk dose, BDR), et 2) la dose itérative progressive (escalated dose regimen, EDR). Le régime BDR consiste en la transfusion de lymphocytes du donneur récoltés par leucophérèse en une dose unique. Cette
VI
technique résulte en des DLI comprenant des doses variables de cellules T, et est associée avec la GVHD [87, 88, 99]. L'incidence de GVHD est réduite avec l'utilisation du régime EDR, puisque les cellules sont alors administrées en doses incrémentales successives, commençant par la dose minimum estimée pour l'obtention d'une rémission [92, 93].
Un autre aspect à considérer est l'utilisation de la DLI thérapeutique (tDLI), ou de la DLI préventive (pDLI), ou encore des deux. La tDLI consiste en l'administration de DLI post greffe au besoin, ce dernier étant défini par une rechute, alors que la pDLI a été conçue comme traitement d'appoint pour les patients à haut risque de rechute, et est administrée à un intervalle de temps prédéfini après transplantation. D'après une étude, la pDLI diminue l'incidence de rechute sans pour autant augmenter l'incidence de GVHD ou de mortalité liée à la greffe (TRM), mais de plus amples recherches sont nécessaires pour confirmer ces résultats [86]. La situation est plus claire pour la tDLI.
Une importante méta analyse a montré une efficacité maximale de la tDLI dans les cas de CML, alors que son indication pour d'autres pathologies hématologiques malignes est controversée, en raison du risque augmenté de GVHD et de TRM [100].
L'effet dose-réponse de la DLI varie en fonction de la pathologie, certaines maladies faisant preuve d'une meilleure sensibilité aux doses élevées (CML), alors que d'autres ne semblent pas présenter d'effet dose-réponse (myélome multiple) [101]. Les doses de lymphocytes optimales ne sont pas encore clairement définies.
En plus du type de régime et de la dose utilisée, un autre aspect crucial dans l'utilisation de la DLI est comment augmenter l'effet GVT sans provoquer de GVHD. Des facteurs de risque, comme l'âge avancé, l'incompatibilité de sexe entre donneur et receveur, et un intervalle temporel raccourci entre la greffe et la DLI ont un impact négatif sur l'incidence de la GVHD [102, 103]. Il est aussi recommandé de respecter un intervalle minimum de trois mois entre les DLI dans un régime EDR, car des intervalles inférieurs augmentent le risque de GVHD [92, 93]. Une grande variété de stratégies sont actuellement expérimentées, comme l'intégration de gènes "suicide" dans les cellules T, la T déplétion sélective, l'ingénierie cellulaire, et les DLI de cellules activées [102, 104-107].
Principaux Résultats Survie
Les tests statistiques ont été réalisés selon la méthodes "competing risks" de Fine et Gray [108]. Le follow-up mesuré en années était la variable temporelle, et le fait d'avoir reçu ou non au moins une DLI la variable binomiale définissant les groupes de risque. Le dernier facteur censurait les patients selon si leur décès était ou non intervenu durant la période d'observation. A 2 ans post greffe, la survie dans le groupe contrôle était de 73.2% (15 décès), tandis que celle du groupe DLI était de 80%
(16 décès). La survie médiane des patients DLI était de 1702 jours (IC 95 1437-2076), tandis que celle du groupe contrôle était de 1672 jours (IC 95 1055-2099). La survie sur la période totale d'observation était de 63.75% pour les patients DLI, et de 66.07% chez les patients contôles.
L'analyse selon Fine et Gray était non significative, avec une valeur p de 0.9852 (figure 1). La fonction d'incidence cumulative de mortalité donnait des IC 95 à 5 ans post greffe de 22.01-42.81% de probabilité de décès pour les patients DLI, et de 20.75-45.67% pour les contrôles (table 3).
Anémie et Cytopénie
Un modèle mixte linéaire généralisé a été appliqué à toute les variables ci-dessous, en utilisant le statut (DLI ou contrôle), le nombre de DLI, la dose cumulée de cellules T, et le temps post greffe comme facteurs covariants. Un résumé des résultats est exposé dans les tables 5, 6, et 7.
Hémoglobine
L'anémie a été définie selon un niveau d'hémoglobine inférieur à 120 g/L pour tous les patients. Les patients DLI présentaient un taux d'hémoglobine significativement inférieur aux contrôles
(p=0.0445). La magnitude de l'effet moyen était de -5.5852 g/L (IC 95 -11.2323 à -0.1402) (table 5).
Leucocytes
Aucune différence statistiquement significative du taux de leucocytes en rapport avec le statut DLI/contrôle, le nombre de DLI, ou la dose cumulée de cellules T n'a pu être détecté jusqu'à 2 ans post greffe (tables 5, 6, et 7).
Neutrophiles
Concenant les neutrophiles, la dose cumulée de cellules T administrées était associée avec une diminution moyenne marginalement significative (p=0.00313) du taux de neutrophiles de 0.016 G/L par million de lymphocytes T administrés (table 7). Les autres résultats étaient non significatifs.
Lymphocytes
Aucun effet statistique des covariants n'a pu être détecté concernant les taux de cellules CD3+, CD4+, et CD8+ (tables 5, 6, et 7).
Monocytes
Aucun effet statistique significatif des covariants n'a pu être détecté concernant les taux de monocytes (tables 5, 6, et 7).
Thrombocytes
Le statut DLI/contrôle était efficacement prédit par les taux de thrombocytes dans notre étude, avec un taux moyen inférieur de 55 G/L (p=0.0009, IC95 -88.34 à -22.73) chez les patients DLI (table 5). Les autre résultats sont restés non significatifs (tables 6 et 7).
Immunoglobulines non spécifiques
Le statut DLI/contrôle pouvait être prédit de manière significative par les taux d'IgG et IgM non spécifiques dans notre étude. L'appartenance au groupe DLI était associé à une augmentation des taux d'IgG moyens de 1.89 g/L (p=0.0014, 95 CI 0.7334-3.0513), et de 0.26 g/L (p=0.0014, 95 CI 0.7334-3.0513) s'agissant d'IgM (table 5). Les autres résultats étaient non significatifs, et aucune influence significative n'a pu être trouvée en association avec les taux d'IgA (tables 5, 6, et 7).
Infections
Le statut DLI/contrôle (p=0.0437, IC 95 0.0107-0.7422), le nombre de DLI (p=0.0002, IC 95 0.1105- 0.3472), ainsi que la dose cumulée de cellules T (p=0.0001, IC 95 0.0061-0.0188) pouvaient tous être prédits par l'incidence d'infection durant les deux premières années post greffe dans notre étude (tables 5, 6, et 7).
VIII Infections bactériennes
L'incidence des infections bactériennes dans notre étude était un facteur prédicteur significatif du statut DLI/contrôle (p=0.0296, IC 95 0.0534-1.0235), du nombre de DLI administrées (p=0.0012 IC 95 0.0938-0.3806), et de la dose cumulée de cellules T (p=0.0015, IC 95 0.0044-0.0189). Selon les résultats décrits ci dessus, un incrément moyen de 0.54 infections bactériennes était associé à l'appartenance au groupe DLI, tandis qu'un incrément moyen de 0.24 et 0.012 infections bactériennes était associé respectivement à un incrément d'une DLI et d'un million de cellules T administrées (tables 5, 6, et 7).
Infections virales
Les infections virales comprenaient les primoinfections et les réactivations de tous types de virus, mais en particulier CMV et EBV. Le nombre d'infections virales était un facteur prédicteur significatif du nombre de DLI administrées (p=0.0051, IC 95 0.0672-0.38), et de la dose cumulée de cellules T administrée (p=0.0032, IC 95 0.004-0.0198). Un incrément moyen de 0.2236 et 0.0119 infections virales était associé respectivement à un incrément d'une DLI et d'un million de lymphocytes T administrés (tables 6 et 7). Les résultats étaient non significatifs concernant le statut DLI/contrôle (table 5).
CMV
Notre modèle statistique a permis de détecter une association significative mais très minime entre le nombre de copies d'ADN CMV par millilitre et la dose cumulée de cellules T administrées (p=0.01, IC 95 0.46-3.91, table 7). Les associations avec l'appartenance au groupe DLI ou contrôle et le compte de DLI n'étaient pas statistiquement significatives (tables 5 et 6).
EBV
Aucune association significative entre le nombre de copies EBV par millilitre et le statut DLI/contrôle, le nombre de DLI, ou la dose cumulée de cellules T n'a pu être détectée (tables 5, 6, et 7).
Infections mycotiques
Une association significative entre l'incidence d'infections mycotiques et la dose cumulée de cellules T a pu être détectée (p=0.0031, IC 95 0.005-0.0246, table 7). Aucune association significative n'est apparue en association avec le nombre de DLI ou l'appartenance au groupe DLI ou contrôle (table 5 et6).
Introduction
Historical elements
Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is defined as the transfer of bone marrow or peripheral blood stem cells from donor to receiver, aiming at turning the receiver into a chimera with a haematopoietic system of complete donor origin. Ironically, the consequences of the first atomic bomb in 1945 gave this field of research its first major push forward, even if earlier attempts of HSCT had been made. Jacobsen, Lorenz, and colleagues reported that the injection of spleen cells into mouse peritoneum allowed for the same protective effects against radiation than shielding the haematopoietic organs themselves [1]. It was then shown that protection against lethal irradiation could be provided by intravenous infusion of bone marrow cells in syngenic organisms [2].
Subsequently, the cell component of the transfusion was recognized as the effective protective agent against radiation, and animals surviving the irradiation-transplantation process were designed as
"chimeras" [3, 4].
In humans just as in animals, the first experiments in the field of stem cell transplantation (SCT) were done with autografts. Marrow recovery after irradiation by infusion of frozen autologous bone marrow cells was observed in 1958 [5]. Then came the first successful crossed HSCT between identical twins, and the first allogenous HSCT with long-term survival of the cured patient in 1959 and 1968, respectively [6, 7].
Unfortunately, those new developments did not come without complications, of which graft versus host disease (GVHD) and immunosuppression/marrow aplasia are the most prominent. It was already noted in 1955 that mice engrafted from syngeneic donors suffered much less from transplant related mortality (TRM) compared to mice receiving an infusion from a different murine strain donor [8]. The laboratory animals displayed a range of symptoms typical for GVHD, which at the time was designed "secondary disease", and which in 1958 finally lead to the description of a human alloantigen now known as HLA-A2, one of the major histocompatibility antigens in humans [109].
Looking for new strategies to improve the toxicity profile of HSCT, it was discovered in the early 1980's that the incubation of donor cells with anti-T cell monoclonal antibodies greatly decreased the incidence of GVHD [9]. However, T cell depletion also had the consequence to substantially increase relapse rates in CML patients by erasing the graft-versus-tumor (GVT) effect that was so pronounced up to that time [10].
Immunosuppression and infection after HSCT
Infections are a common reason for intensive care unit (ICU) admission in the post HSCT period, and are an extremely negative predictor for survival, particularly if mechanical ventilation is required [11]. However, the appearance of noninvasive ventilation has improved the prognosis [12]. Febrile aplasia also favors other complications, such as GVHD, adult respiratory distress syndrome (ARDS), veno-occlusive disease, or cytomegalovirus disease, apparently due to an inflammation-induced cytokine storm [13]. 20-40% of bone marrow transplant patients are likely to require ICU admission, with 13-18% of deaths being a direct consequence of infection [14, 15]. It appears that pulmonary infiltrates should prompt diagnostic bronchoscopy, since it has a high diagnostic yield, although no
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influence on survival was detected [16]. Diagnostic bronchoalveolar lavages studies allowed to precise the time incidence for specific pathogens; bacterial penumonia seems to predominate in the month following transplant, with viral and fungal episodes increasing in frequency afterwards [17].
Immune reconstitution after HSCT
Innate immune system
After HSCT, hematopoietic cell lines vary in their engraftment speed and cell count recovery. The first cell types to recover are monocytes and granulocytes, then platelets and natural killer (NK) cells, with HSCT engraftment being defined as the first day on which granulocytes cell counts reach 0.5 G/L or more, and remain so for three consecutive days [18]. The first monocytes to appear in the circulation are of donor origin, especially in granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) mobilized peripheral blood stem cell (PBSC) transplantation, which contain a lot more monocytes than transplants of bone marrow origin [19-21]. Monocytes then gradually replace recipient macrophages which have not been eliminated due to their extreme resistance to radiotherapy and chemotherapeutic agents [22].
The function of monocytes post HSCT is controversial [23, 24]. Neutrophile counts usually increase to normal levels by two weeks after HSCT from peripheral blood transplantation, three weeks after bone marrow transplantation, and four weeks after cord blood stem cell transplantation [25]. In the presence of GVHD, and possibly reflecting the high dose corticosteroid regimens used to treat the condition, neutrophile function can be diminished, and can remain so on the long-term, especially in chronic GVHD (cGVHD) patients [19]. NK cells recover from clonal expansion of donor cells during the first month post transplantation, and mark the return of an appropriate innate immune system that can contribute efficiently to the GVT effect by lysing remaining recipient leukemic cells [26, 27].
Moreover, the relation to the GVT effect is strengthened by the fact that remission rates correlate to NK cell recovery, and some studies have linked killer cell immunoglobulin-like receptors (KIR) mismatch to protection from relapse in mismatched transplants [28, 29]. After the innate immune system effector cells recovery comes the time of dendritic cells (DC) recovery, taking place before adaptive immune system recovery [30, 31]. One must make a clear distinction between circulating blood DC and tissue DC, since the majority of the first will be of donor origin as early as the first few weeks after HSCT, while the second can still be of recipient origin up to a year after transplantation [32]. Indeed, tissue dendritic cell counts usually take more than one year to recover from HSCT [33].
Furthermore, DC can be subclassified into several types based on their location, with specific post HSCT recovery dynamics: epithelial DC which migrate to lymphoid nodes after antigen capture (Langerhans cells), antigen-presenting DC inside lymphoid nodes, circulating blood DC, thymic DC, and germinal centre DC helping B cells to mature. Langerhans cells recover over the six months post HSCT, just as lymphoid nodes antigen-presenting DC [34-36]. Circulating blood DC become detectable as early as two weeks after HSCT, with DC1 (myeloid DC) counts subsequently normalizing, while DC2 (plasmacytoid DC) counts are still low well after one year [20, 33, 37, 38]. Thymic DC recovery has not been studied in humans. Finally, germinal centers appear late (one year or more) in the post transplantation course, in correlation with the slow recovery of follicular DC [35, 36]. It appears likely that DC function is also impaired post HSCT, since it was shown that DC-loaded peptides were superior to normal vaccination in the post transplantation period [39, 40].
Adaptive immune system recovery T Cells
The counts of B cells and T cells improve quite fast after HSCT, so why does the incidence of infectious episodes remains high even in the face of this increase [21, 41, 42]? The most important element of the answer to that question is peripheral clonal expansion of T cells. However, several factors contribute to this result, and the effective immunity transfer from donor to recipient is low.
Among factors driving T-cell clonal expansion is the number of T cell infused relative to the T-cell depleted donor environment and its natural homeostatic processes. After HSCT, IL-7 and IL-15, the main drivers of homeostatic expansion, stimulate the few remaining T cells that compete for cytokines until normal T-cell counts are reached [33, 43]. Furthermore, antigen-stimulated T cells gain a competitive advantage, and can also react to endogenous peptides [44]. Several select activated T-cell clones multiply extensively as a result, thereby severely limiting the T-cell specificity repertoire, and losing their homing receptors in the process [21, 45-47]. In this respect, extensive literature reports that the recipient T-cell compartment contains more activated T cells and CD8+ T cells in patients during the year following HSCT when compared to normal humans, with the consequence of a much smaller proportion of naive T cells [48, 49]. However, antigen stimulation provides such a competitive advantage that the post HSCT immediate T cell repertoire is mostly restricted to cells that react to antigens encountered at this particular time: cytomegalovirus, Epstein-Barr virus, and major histocompatibility antigens [50-54]. Additionally, it is known that out of the two possible pathways of T cell compartment repopulation after HSCT, namely peripheral clonal expansion and thymic ontogeny recapitulation, the latter holds a minor role in the short term, with naive donor T cells not appearing until 4 months after HSCT. The restoration of naive T cell levels likely remains incomplete at least during several years post transplantation, and even then only in individuals of no more than 50 years old [55-57]. Added to the slow development of follicular DC after HSCT, the above mentioned elements could represent a major limiting influence on the replenishment of B cells taking place not earlier than 2 months post transplantation [58]. The end result of T-cell clonal expansion is that patients are much more prone to infections in the two years following HSCT compared to normal controls of the same age. The most common pathogens are viruses, and response to vaccination stays almost inexistent up to one year after HSCT [41, 59, 60].
Given the fact that the transfer of immunity from donor to recipient seems more efficient for antigens present at the time of HSCT, early revaccination trials have been conducted and will require further study [61]. However, complete recovery of the T-cell repertoire can only come from the thymic dependent pathway [62]. This is very clearly demonstrated by the fact that patients having had thymectomy do not recover [63]. In this view, further study of the thymic recovery pathway is warranted to better define the optimal regimen of revaccination after HSCT.
B Cells
An indirect clue to B cell recovery post HSCT is reactivity to (re)vaccination. However, B cell reactivity depends on the recovery of CD4+ T helper cells, and measures such as anti thymocyte globulins (ATG) or T cell depletion slows the reappearance of vaccinal responses, especially in the case of polysaccharide antigens [64]. Differential recovery in response to vaccination can be observed depending on the type of antigen considered. In particular, response to protein antigens reappears in the 2 years following HSCT, much earlier than response to polysaccharidic antigens. Antigens used in vaccines preceding HSCT also allow faster responses compared to antigens presented to the patient's
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their function, since even if B cells are mostly of donor origin after transplantation, the switch from recipient to donor antibodies only comes gradually much later [65]. One must not forget that the main manufacturers of antibodies are the plasmocytes, which can reside in the tissues and are notably insensitive to irradiation [66, 67]. As stated above, B cell counts stay low for at least the first 2 months following HSCT, and infection rates stay high even with substantial recovery in the blood immunoglobulin content, since many cells secrete inefficient or even self-reactive antibodies [68]. B cell counts then increase, but counts are often still subnormal at 2 years post transplantation, and those cells are mostly immature because of the absence of the necessary CD4+ T cell and follicular DC help for isotype switching [58, 69]. Besides, specific immunoglobulin recovery seems to be closely linked to the antigens encountered in the transplantation period, as can be observed in seropositive CMV HSCT recipients [70]. Furthermore, some antigens seem to be excluded from the process, and can see their recovery delayed up to 20 years [71]. There is established data supporting the recapitulation of the normal B cell ontogeny as the drive to recovery post HSCT, with an immunoglobulin profile evolving along these lines [72].
Since T-cell help is necessary for B-cell heavy chain switch to occur, it is obvious that efficient B-cell immunity will be delayed at least until a substantial recovery of CD4+ helper T cells can take place, leaving the patient with absent or at best immature B-cell response against infection until then [58, 69].
Graft versus tumor effect
The discovery of the HSCT graft versus tumor/leukemia effect (GVT) came much later than the recognition of GVHD, as the first reported GVT effect observation was made by Horowitz and colleagues in 1990 [73]. Relapse after allogeneic HSCT was noticed to increase with the use of T cell- depleted grafts and with the extent of immune suppression after HSCT [73, 74]. Moreover, the fact that DLI could induce remission in relapse patients indicated that donor cells were the vector of the GVT effect [75]. In addition of T cells, NK cells have been implicated as vectors of the GVT effect in the haploidentical HSCT setting [29]. The target antigens for the GVT effect are currently under scrutiny, but since GVHD seems to be closely associated to the GVT effect, it has been suggested that their respective sets of antigens are likely closely related and that the GVT effect would target non- tumor specific alloantigens [73, 76]. A vaccine-induced specific targeting for tumor antigens has been shown to produce a modest GVT effect. Unfortunately, the close association between efficient GVT effects and GVHD indicates that alloantigens are probably more efficient in eliciting a donor cell response than tumor-specific antigens [73, 76-78]. However, hope for a separation of GVHD from the GVT effect remains, as the usual target organs of the two diseases differ (respectively skin, gut, and liver for GVHD; bone marrow and lymphoid tissues in GVT effects) [79]. Recent separation strategies have concentrated on conditioning-associated cytokine storm reduction using reduced-intensity protocols (RIC) with or without DLI, and increasing the specificity of donor cells for tumor-specific antigens by genetic engineering or vaccination [79].
DLI
From the elements cited above, we can see that optimizing the outcome of HSCT consists in good part in finding a balance between immunosuppression, with its associated infectious and cytopenic complications, and immunocompetence with its associated GVHD and GVT effect. DLI was designed as an answer to this paradigm in the form of controlled GVT (and GVHD) effect.
DLI was first studied by Kolb in CML patients, showing that donor buffy coats infused with IFN-α could induce remission [75]. The first evidence of GVT activity of allogeneic cells came from the clinics, where complete remission was observed after stopping the immunosuppressive treatment in relapse patients, with GVHD decreasing the risk of relapse [80, 81]. Allogeneic T cells were identified as the likely effector agent when it was noted that patients receiving T-cell depleted grafts were more prone to relapse [82, 83]. Given these first successes, DLI was then tried in a variety of diseases, but the best results have been obtained in chronic phase CML patients [84-86]. The advancement of disease is a major factor in DLI response, with best efficiency in molecular/cytogenetic relapse. It may therefore be the current optimal pathway to monitor patients for relapse after HSCT, and promptly administer DLI before hematologic relapse can develop [87]. Unfortunately, the use of DLI has been limited by GVHD [88-91]. In the perspective of limiting the incidence and severity of GVHD while preserving the GVT effect of DLI, the original bulk dose regimen was replaced over time by the escalating dose regimen, allowing iterative DLIs until development of either remission or GVHD [92, 93].
Biological mechanism of DLI
The understanding of the biological mechanisms of DLI is still in its developing state. However, it recently appeared clear that DLI had two main effects: 1) GVHD (side-effect), and 2) GVT effect (desired effect). One of the most challenging aspects of present day transplantation biology is trying to dissociate these effects to enhance the GVT effect and reduce GVHD. GVHD is thought to stem from tissue injury and the consequent inflammation, activating and making alloreactive T cells proliferate. These effector cells then home to tissue injury sites to cause further destruction, leading to a cycle of tissue injury and inflammation. Present research is thus aiming at better defining the role of inflammation effector cells such as T-helper lymphocytes and DCs.
On the other hand, the GVT effect is supposed to be mediated by two main pathways: 1) antigen specific immunity to tumour associated markers such as HA-1 or HA-2, that are normally expressed in the body (supposed to be the main pathway), and 2) immunity against tumor neoantigens (supposed to be a minor pathway)[94, 95]. Of course, those effector cells need helper cells and antigen presenting cells and interestingly, animal models suggest that HSCT receiver dendritic cells play a major role in GVT activity, while donor dendritic cells do not [96]. Some studies have therefore concentrated on how to promote the important dendritic cell populations [97]. It has also been stated that grafted T regulator cells could rebalance the effect of DLI on the GVT side while decreasing GVHD risks, since transplanted T regulator cells have the ability to reduce GVHD while preserving the GVT effect in animals [98].
How to use DLI
Two main approaches in the adminitration of DLI have been used: 1) bulk dose regimen (BDR), and 2) escalated dose regimen (EDR). BDR consists in the infusion of lymphocytes coming from a single donor leukapheresis as a single bolus. This technique provides DLIs with variable T-cell doses, and is associated with GVHD [87, 88, 99]. Prevalence of GVHD is smaller when using EDR, since effector cells are then administered in a succession of increasing doses, beginning with the minimum estimated dose to achieve remission [92, 93].
Another aspect to consider is whether one will use therapeutic DLI (tDLI), or preemptive DLI (pDLI), or both. tDLI consists in the administration of DLI post HSCT if need be, as defined by the occurrence
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of relapse, while pDLI has been conceived as an adjunct treatment for high-risk patients that are prone to relapse and is administered at a chosen time after transplantation. According to one study, pDLI lowers relapse rates without increasing GVHD or TRM, but further research is needed to confirm those results [86]. The situation is much clearer for tDLI. One large meta-analysis showed it to be most successful in the case of CML, while given the induced risk of GVHD and TRM consequent to tDLI, the indication for other hematologic malignancies was controversial and in need of further research [100].
The dose-response effect of DLI varies with the type of disease treated, with certain diseases showing better sensitivity to DLI with higher dose (CML), while others show no dose-response correlation (multiple myeloma) [101]. Optimal DLI doses are not yet clearly defined.
In addition to the type of regimen used and the dose given, another crucial aspect in the use of DLI is how to increase the GVT effect without increasing (or even diminishing) GVHD prevalence. Risk factors, such as advanced patient age, sex mismatch between donor and receiver, and a short time interval between HSCT and DLI have a negative impact on the incidence of GVHD [102, 103]. It is also recommended to respect a minimum interval of three months between DLIs on an EDR, since shorter intervals increase the risks of GVHD [92, 93]. A wide panel of other experimental strategies are currently being studied, such as providing effector T cells with suicide genes, selective T-cell depletion, T-cell engineering, and activated DLI [102, 104-107].
DLI for specific situations
Most studies conducted on the subject of DLI included less than 100 patients, but those had a great variety of diseases, thus making it difficult to identify the specificities of each disease subgroups (and such is the case in our study). Some have been calling for a common institution charged with the task of conducting multi-centric studies to circumvent those difficulties [110]. Indeed, published literature makes it increasingly clear that response to DLI is a disease-specific matter.
CML
CML has been the first disease in which DLI success has been reported, and holds the best DLI success rate. It is also the most studied of our diseases of interest, being the only one in which studies of appreciable sizes have been conducted [111-114]. Response to DLI has been noted to vary according to the type of relapse, with the following order from best to worst in a study of 583 infusions: molecular, cytogenetic, and hematological relapse [115]. Studies on DLI administered with adjunct treatment have also been tried: IFN-α in particular seemed to improve the efficiency of DLI [116]. Tyrosine kinase inhibitors unfortunately appeared to decrease the effect of DLI by acting on both donor effector cells and residual receiver cells [117]. Furthermore, there seems to be a sharp demarcation in DLI outcomes between molecular and cytogenetic relapse, and hematological relapse, as molecular and cytogenetic relapse may respond repeatedly to DLI while hematological relapse prognosis is dismal [118, 119]. This could be consequent to the presence of CML stem cells not recognized by DLI effector cells [120].
Other diseases
A retrospective analysis from the European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT) studied the DLI effect in 399 AML patients, revealing a significant increase in survival in DLI patients compared to non-DLI patients, although this difference might have come from other favorable parameters such as lower tumor burden, better cytogenetics, and remission status at the time of DLI
[121]. The literature on myelodysplastic syndrome (MDS) is scarce. Available studies are small and the parameters included in the analysis are heterogeneous, making it difficult to draw conclusions regarding MDS [122, 123]. Many other hematologic malignancies were studied for an indication to DLI, but for most of these, only preliminary case reports or extremely heterogeneous studies exist at the time being.
Our retrospective cohort study aimed at the detailed description of the influence of DLI on infectious and cytopenic complications of HSCT, more particularly focusing on the time of onset, organ systems involved, type of infectious agents, and long-term outcome.
Patients and Methods Patient Parameters
Our study was conducted in the hematology unit of the Geneva University Hospital. The data was extracted from the hospital database after acceptance of the research protocol by the local ethics committee. Patients were included if they had had at least one DLI after HSCT, and were excluded on the base of an absence of response to DLI (absence of hematologic remission) and/or absence of HSCT T-cell depletion. A total of 80 patients having received DLI, and 56 that did not, were identified.
The time period of inclusion ranged from 1992 to 2010 (date of first HSCT to end of follow-up).
Further details on patient parameters can be found in table 2.
Data was extracted from the patients' files in the archives of the hematology and transplantation unit of the Geneva University Hospital. A specific database was built, regrouping the data already obtained from the bone marrow transplantation (BMT) database with the specific data listed below:
Diagnostic tests for all infections with dates and specific germs
Complete blood counts including white blood cell repartition, CD 4+ and CD 8+ counts (there is a lack of consensus on CD 4+ and CD 8+ normal levels, and we selected 400 cells/mm³ as the lower reference limit for both types)
Dates and specific characteristics of graft versus host disease
DLI dates and specific characteristics
Vaccination dates and types, with specific immunoglobulin titers
Dates and types of immunomodulation drugs
Case-matching was performed using a computer algorithm allowing variable optimized matching over the cohort as a whole ("vmatch" macro for SAS v9 for Windows, courtesy of Jon Kosanke and Erik Bergstralh, Division of biomedical statistics and informatics, Mayo Clinic, Rochester, USA). The matching criteria were:
Sex
Age at transplantation
Chronic comorbidities (Sorror comorbidity score [124])
Comorbidites were classified according to the Sorror comorbidity score, which varied from 0 to 7 in our cohort (0: 55 patients; 1: 23 patients; 2: 27 patients; 3: 10 patients; 4: 10 patients; 5: 6 patients;
6: 4 patients; 7: 1 patient). In the control group, the Sorror score ranged from 0 to 5, with a mean of
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1.18 and a standard deviation of 1.43. In the case group, the score ranged from 0 to 7, with a mean of 1.78 and a standard deviation of 1.89. Cardiac comorbidities other than arrhythmia or valvular were the most represented (38/136), followed by pulmonary (18/136), psychiatric (14/136), renal (12/136), rheumatologic (8/136), hepatic (7/136), cardiac valvular (7/136), chronic infections (7/136), peptic ulcer (6/136), solid tumor (6/136), obesity (6/136), diabetes (6/136), and cerebrovascular pathologies (3/136).
Main diseases were varied, with by decreasing order of frequency: AML (40/136), CML (22/136), non- hodgkin lymphoma (NHL) (18/136), MDS (18/136), acute lymphocytic leukemia (ALL) (11/136), multiple myeloma (MM) (11/136), anemic aplasia (AA) (8/136), myeloproliferative syndrome (MPS) (5/136), chronic lymphocytic leukemia (CLL) (3/136). The details of the specific group distributions for main diagnoses are given below in table 1.
DLI
Our study regrouped 196 DLIs, with patients having had between zero (for controls) and 7 DLI occurrences (mean = 3, SEM = 0), that ranged from 27 days to 4049 days after transplantation with a mean of 657 days (SEM = 55 days) post transplantation. A lot of infusions were given shortly after transplantation, and most within 3 years (75th percentile=838 days after transplantation). A lot of DLI T-cell doses concentrated in the low range (mean = 1.73•10⁷ cells, SEM = 1.70•10⁶ cells, 75th percentile=1.83•10⁷ cells), with a maximum of 1.09•10⁸ cells. Donor lymphocytes were collected by leukapheresis and tDLI was administered following an escalating dose regimen until development of response, full chimerism, or GVHD. No patient was infected at the time of DLI. Statistics for which laboratory tests were used as endpoint or covariate limit the time period of analysis to two years after transplantation, with intermediate testing at 6 month and 1 year after transplantation. In our collective, 35 DLI occurrences were pDLI, and 161 were tDLI.
Transplant and conditioning
Transplantation occurred 21 to 9971 days after diagnosis, with a mean of 703 days and a standard deviation of 1141 days.
Donors
Most of the donors in our study were identical siblings (100/136), followed by matched unrelated (22/136), mismatched unrelated (10/136), and mismatched related donors (4/136). The distribution was quite different between DLI patients and controls, with the control group including the majority of matched related grafts (54/100) and 2 mismatched related grafts, the rest belonging to the DLI group.
Conditioning
Conditioning regimens were quite variable, as there were 27 different regimen types overall, although many of these were in fact modifications of the usual regimen given to a single patient due to various contraindications. The most prevalent regimen occurred in 38 patients and included corticosteroids, cyclophosphamide, and total body irradiation (TBI). 88 patients out of 136 had TBI, with doses ranging from 600 cGy to 1200 cGy broken in 2 to 6 fractions and up to 2 irradiation boosts.
Table 1Conditioning regimen and GVHD prophylaxis
Transplantation conditioning summary Patients campath/corticosteroids /cyclophosphamide/ciclosporin/methotrexate/TBI 38 ATG/campath/corticosteroids/cyclophosphamide/ciclosporin/TBI 16 ATG/busulfan/campath/corticosteroids/ciclosporin/fludarabin/mycophenolate 14 ATG/campath/corticosteroids/cyclophosphamide/ciclosporin/methotrexate/TBI 13
campath/cyclophosphamide/ciclosporin/methotrexate/TBI 10
busulfan/campath/corticosteroids/cyclophosphamide/ciclosporin 5 busulfan/campath/corticosteroids/cyclophosphamide/ciclosporin/methotrexate 5 ATG/campath/corticosteroids/cyclophosphamide/ciclosporin/methotrexate 5
campath/corticosteroids /cyclophosphamide/ciclosporin/TBI 4
ATG/busulfan/campath/corticosteroids/ciclosporin/fludarabin 4
ATG/campath/corticosteroids/ciclosporin/fludarabin/melphalan/mycophenolate 3
campath/corticosteroids /ciclosporin/VP16/TBI 2
busulfan/campath/corticosteroids/ciclosporin/fludarabin/mycophenolate 2
ATG/campath/cyclophos phamide/ciclosporin/methotrexate/TBI 2
ciclosporin/fludarabin/mycophenolate/TBI 1
campath/cyclophosphamide/ciclosporin/methotrexate 1
campath/corticosteroids /ciclosporin/melphalan/methotrexate/TBI 1 campath/corticosteroids /ciclosporin/etopophos/mycophenolate/TBI 1
busulfan/cyclophosphamide/ciclosporin/melphalan 1
busulfan/cyclophosphamide/ciclosporin/melphalan/mycophenolate 1
busulfan/campath/ciclosporin 1
busulfan/campath/ciclosporin/methotrexate/VP16 1
busulfan/campath/corticosteroids/cyclophosphamide/ciclosporin/methotrexate/VP16 1 ATG/campath/corticosteroids/ciclosporin/fludarabin/melphalan 1
ATG/campath/corticosteroids/cyclophosphamide/ciclosporin 1
ATG/busulfan/ciclosporin/fludarabin/mycophenolate 1
ATG/busulfan/corticosteroids/ciclosporin/fludarabin/mycophenolate 1
Serocompatibility
CMV
Of the 136 HSCTs considered, 87 were seroidentical for CMV, while 49 exhibited incompatible CMV serology between donor and receiver. 28 CMV seropositive HSCTs were administered to seronegative patients. 21 CMV seropositive patients were given seronegative HSCTs.
EBV
10 transplants were serologically incompatible for EBV with the receiver patients. 124 patients received a graft that was matched for EBV serology. 2 patients had an unknown EBV status. In particular, 7 EBV seronegative patients had seropositive HSCTs, while 3 seropositive patients were given a seronegative graft.
10
Table 2 Patient parameters.
Abbreviations : BM = bone marrow; DLI = donor lymphocyte infusion; f = female; HSCT = hematopoietic stem cell transplantation; m = male; MDS = myelodysplastic syndrome; MPS = myeloproliferative syndrome; PB = peripheral blood.
Parameter DLI patients Control patients
No. 80 56
Patient sex (m/f) 47 (58.75%)/33 (41.25%) 31 (55.36%)/25 (44.64%) Age at HSCT in years (median/range) 50/5-70 46/12-61
HSCT year (median/range) 2005/1992-2009 2004/1998-2009
Donor sibling/unrelated 48 (60%)/32 (40%) 54 (96.43%)/2 (3.57%)
BM/PB 6 (7.5%)/74 (92.5%) 2 (3.57%)/54 (96.43%)
Main Disease type
Acute lymphocytic leukemia 7(8.75%) 4(7.14%)
Acute myeloid leukemia 22(27.5%) 18(32.14%)
Aplastic anemia 0 8(14.29%)
Chronic lymphocytic leukemia 0 3(5.36%)
Chronic myeloid leukemia 19(23.75%) 3(5.36%)
Multiple Myeloma 7(8.75%) 4(7.14%)
MDS/MPS 14(17.5%) 9(16.07%)
Non-hodgkinian lymphoma 11(13.75%) 7(12.5%)
Years at which DLI were given
(mean/range) 2006/1999-2010
Interval transplant-first DLI
(days, mean/range) 427/27-3253
No. of DLI (total/mean/range) 196/3/1-7 DLI CD3+ cell dose
(cells/kg, mean/range) 1.73 x 10⁷/1 x 10⁵-1.09 x 10⁸ Total CD3+ cell dose
(cells/kg, mean/range) 4.25 x 10⁷/1 x 10⁵-5.27 x 10⁸ Survival Follow-up duration
(days, mean/range) 4281/41-6978 3283/63-4809
Follow-up duration for other
variables (days, mean/range) 652/41-730 605/63-730
Results Survival
Statistical tests were performed using the Fine and Gray competing risks method [108], with follow- up measured in years, and the fact of having received at least one DLI as a binomial factor. Subjects were censored depending on whether they were still alive at the end of the observational period. At 2 years after HSCT, 15 deaths had occurred in the control group (73.2% survival), while 16 DLI patients also had died (80% survival). When looking at a CML only subset, overall survival (OS) at 2 years was 100% in all 22 patients. Survival at 2 years for other diseases were as follows: AA 7/8 patients, ALL 7/11 (DLI 4/7; controls 3/4), AML 25/40 (DLI 13/22; controls 12/18), CLL 3/3, NHL 13/18 (DLI 8/11; controls 5/7), MDS 15/18 (DLI 9/9; controls 6/9), MPS 4/5, Myeloma 9/11 (DLI 7/7;
controls 2/4). At 5 years after HSCT, 38 (67.9%) survivors were left in the control group, while 55 (68.8%) patients of the DLI group were also alive. Overall, median survival in DLI patients was 1702 days (95 CI 1437-2076, based on sample bootstrapping), while median survival in control patients was 1672 days (95 CI 1055-2099). Overall survival was 63.75% in DLI patients, and 66.07% in controls.
The result of the competing risk estimation is of course far from significant, with a p value of 0.9852 (figure 1) when including the fullcorpusof data (up to 19 years of follow-up), and a 5 year pointwise 95% confidence interval of 22.01-42.81 % for DLI patients, and 20.75-45.67% for controls in the cumulative incidence of death function. Details of the influence of DLI on the cumulative incidence of death and its associated timewise confidence intervals can be found in table 3.
We then performed three serial univariate analyses for each of the following dependent variables:
CMV and EBV DNA blood copy counts, hemoglobin, white blood cells, neutrophiles (total, segmented, and non-segmented), CD3+, CD4+, and CD8+ cells, monocytes, thrombocytes, IgG, IgA, IgM, myelosuppression (as defined by anemia or leucopenia), and infection counts (bacterial, viral, and fungal). The three independent variables used were DLI status (table 5), DLI count (table 6), and DLI T cell cumulated dose (table 7). The dependent variables for which statistical significance was reached were included in the multivariate short-term survival Cox proportional hazard model, but no specific effect on survival was found (table 8). The time scope of the Cox model included data in the 2 years following transplantation.
