Pharmacogenetic studies on methadone and immunosuppressive drugs

Thesis

Reference

Pharmacogenetic studies on methadone and immunosuppressive drugs

CRETTOL, Séverine

Abstract

La méthadone est un agoniste du récepteur mu aux opiacés utilisé comme traitement de substitution lors de la dépendance aux opiacés. Ce travail a pemis de démontrer que les cytochromes P450 (CYP) 3A4 et CYP2B6 sont les principaux CYPs impliqués dans le métabolisme de la méthadone. Le CYP2B6 présente une stéréosélectivité vis-à-vis de la (S)-méthadone, inactive sur le récepteur mu mais qui inhibe plus fortement le canal cardiaque hERG. Les polymorphismes génétiques de la P-glycoprotéine contribuent légèrement à la variabilité de la pharmacocinétique de la méthadone. Toutefois, les polymorphismes de ces quatres protéines n'influencent pas la réponse thérapeutique au traitement alors que les métaboliseurs lents du CYP2B6 sont associés à un risque supérieur de cardiotoxicité. La ciclosporine est un immunosuppresseur prescrit pour prévenir les rejets de greffe suite à une transplantation. Les polymorphismes génétiques de la P-glycoprotéine influencent ses concentrations intracellulaires et pourraient donc influencer la réponse au traitement immunosuppresseur.

CRETTOL, Séverine. Pharmacogenetic studies on methadone and immunosuppressive drugs . Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2007, no. Sc. 3854

URN : urn:nbn:ch:unige-23406

DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:2340

Available at:

http://archive-ouverte.unige.ch/unige:2340

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UNIVERSITE DE GENEVE FACULTE DES SCIENCES Section des Sciences Pharmaceutiques Professeur Pierre-Alain Carrupt Laboratoire de Chimie Thérapeutique

UNIVERSITE DE LAUSANNE FACULTE DE BIOLOGIE ET Département de Psychiatrie - CHUV MEDECINE

Centre de Neurosciences Psychiatriques Dr Chin B. Eap, Privat-docent, Unité de Biochimie et de Maître d’enseignement et de Psychopharmacologie Clinique recherche

P HARMACOGENETIC STUDIES ON METHADONE AND IMMUNOSUPPRESSIVE DRUGS

THESE

présentée à la Faculté des Sciences de l’Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention sciences pharmaceutiques

par

Séverine CRETTOL

Randogne (VS)

Thèse N° 3854

PRILLY-LAUSANNE 2007

REMERCIEMENTS

R EMERCIEMENTS

Je remercie toutes les personnes qui m’ont apporté leur aide et leur soutien pendant les 4 ½ ans passés à l’Unité de Biochimie et de Psychopharmacologie Clinique.

Je remercie tout particulièrement le Dr. Chin B. Eap, pour m’avoir permis de réaliser cette thèse sous sa direction, pour son aide, son soutien, son enthousiasme ainsi que pour sa disponibilité. Je remercie également tous mes collègues de l’Unité de Biochimie et de Psychopharmacologie Clinique pour leur aide et pour les bons moments que nous avons partagés au laboratoire ou ailleurs.

Je tiens également à remercier tous les patients inclus dans l’étude méthadone, ainsi que toutes les personnes qui ont permis la réalisation de cette étude : Dr. J.-J. Déglon, Dr. M. Croquette-Krokar, Dr. I. Gothuey, Dr. R. Hämmig, Dr. M. Monnat et Prof. J. Besson, Dr. H. Hüttemann, Dr. A. Al Amine, M. J. Bergeron, Dr. M. Bourquin, Mme I. Girod, Mme S. Meynet, Mme I. Soulignac, Dr. R.

Rajeswaran, M. D. Uk. Je remercie également Prof. H. Abriel, Prof. P.-A. Carrupt, Dr. J.-S. Rougier, Mme L. Sintra Grilo, Dr. J. Schläpfer, Dr. M. Preisig, Dr. K.Q. Do et Prof. A. Malafosse pour leur collaboration.

Merci à tous les patients inclus dans l’étude sur les immunosuppresseurs ainsi qu’aux Prof. M.

Pascual, Dr. J.-P. Venetz, Dr. M. Fontana et Dr. J.-D. Aubert pour leur aide précieuse dans la réalisation de cette étude. Je remercie également Dr. C. Berutto, Mme H. Aebi, Mme M. Arslan, Mme A.-L. Berger, Mme E. Boute, Mme S. Ciganek, Mme B. Leger, Mme C. Rotzetter, Mme R.

Sonnay, Mme A. Vodoz, Mme S. Weber, Dr. M. Fathi, M. N. Ansermot, Dr. D. Werner, Dr. C. Roux, Mme M. Vaglio et Dr. M. Berode pour leur contribution aux diverses étapes de cette étude.

Je remercie Dr. A. H. Schinkel, Prof. A. Telenti, Dr. H. Henry, Dr. S. Colombo, Mme M. Steinmann et Dr. J.-R. Cardinaux pour la mise à disposition de cellules, conseils et locaux pour mes expériences de cultures cellulaires ainsi que M. J. Spagnoli, Dr. M. Bochud, Dr. T. Buclin pour leur aide en statistiques et Dr. G. Bleiber et Dr. M. Rotger pour leur aide en biologie moléculaire.

Finalement, je tiens à remercier le Fond National Suisse de la Recherche Scientifique, l’Office Fédérale de la Santé Publique, le Prof. P.-A. Carrupt ainsi que Novartis et Fujisawa pour leur soutien financier.

Et je remercie plus particulièrement mon mari, ma famille et mes amis pour leur soutien et leurs encouragements tout au long de cette thèse.

TABLE OF CONTENTS

- 2 -

T ABLE OF C ONTENTS

ABBREVIATIONS 4

RÉSUMÉ 6

CHAPTER 1 INTRODUCTION 24

CHAPTER 2 PHARMACOGENETICS OF METHADONE 44

2.1.METHADONE ENANTIOMER PLASMA LEVELS,CYP2B6,CYP2C19, AND

CYP2C9 GENOTYPES, AND RESPONSE TO TREATMENT 46

2.2.ABCB1 AND CYTOCHROME P450 GENOTYPES AND PHENOTYPES:INFLUENCE

ON METHADONE PLASMA LEVELS AND RESPONSE TO TREATMENT 70

2.3.STEREOSELECTIVE BLOCK OF HERG CHANNEL BY (S)-METHADONE AND QT

INTERVAL PROLONGATION IN CYP2B6 SLOW METABOLIZERS 98

2.4.ASSOCIATION OF DOPAMINE AND OPIOID RECEPTOR GENETIC POLYMORPHISMS WITH RESPONSE TO METHADONE DURING MAINTENANCE TREATMENT 122 CHAPTER 3 PHARMACOGENETICS OF IMMUNOSUPPRESSIVE DRUGS 144

3.1.CYP3A7,CYP3A5,CYP3A4, AND ABCB1 GENETIC POLYMORPHISMS,

CYCLOSPORINE CONCENTRATION, AND DOSE REQUIREMENT IN TRANSPLANT

RECIPIENTS 146

3.2.INFLUENCE OF ABCB1 GENETIC POLYMORPHISMS ON CYCLOSPORINE

INTRACELLULAR CONCENTRATIONS IN TRANSPLANT RECIPIENTS 166 CHAPTER 4 PERMEABILITY GLYCOPROTEIN 186

4.1.IN VITRO P-GLYCOPROTEIN-MEDIATED TRANSPORT OF (R)-,(S)-,(R,S)-

METHADONE,LAAM, AND THEIR MAIN METABOLITES 188

CHAPTER 5 CONCLUSIONS AND PERSPECTIVES 204

ABBREVIATIONS

- 4 -

A BBREVIATIONS

ABC Adenosine triphosphate–binding cassette ADP Adenosine diphosphate

ADR Adverse drug reaction ANOVA Analysis of variance ATP Adenosine triphosphate ATPase Adenosine triphosphatase AUC Area under the curve

BCA Bicinchoninic acid

C0 Trough or predose concentration CD Cluster of differentiation

CI Confidence interval CYP Cytochrome P450

DiNorLAAM Levo-α-acetyldinormethadol DNA Deoxyribonucleic acid DRD1 Dopamine D1 receptor gene DRD2 Dopamine D2 receptor gene ECG Electrocardiogram

EDDP 2-ethylidene-1,5-dimethyl-3,3-diphenylpyrrolidine EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EM Extensive metabolizer

EMDP 2-ethyl-5-methyl-3,3-diphenyl-1-pyrroline F Female

FMO Flavin-containing monooxygenase GC Gas chromatography

hERG Human ether-à-gogo related gene HIV Human immunodeficiency virus HLA Human leukocyte antigen

HPLC High performance liquid chromatography IC50 Half-maximal inhibitory concentration IM Intermediate metabolizer LAAM Levo-α-acetylmethadol LC Liquid chromatography LLC-PK1 Pig kidney epithelial cell M Male

ABBREVIATIONS

- 5 - MAO Monoamine oxydase

MGB-NFQ Minor groove binder non-fluorescent quencher MMT Methadone maintenance treatment

MR Metabolic ratio

mRNA Messenger ribonucleic acid MS Mass spectrometry

MTD Methadone

NAT N-acetyltransferase NorLAAM Levo-α-acetylnormethadol OPRD1 δ-opioid receptor gene OPRM1 µ-opioid receptor gene

OR Odds ratio

PBMC Peripheral blood mononuclear cell PBS Phosphate buffered saline

PCR Polymerase chain reaction

P-gp Permeability glycoprotein or P-glycoprotein Pi Inorganic phosphate

PM Poor metabolizer PRA Panel reactive antibody QTc Heart-rate-corrected QT

RT Room temperature

SD Standard deviation SE Standard error SM Slow metabolizer

SNP Single-nucleotide polymorphism UDP Uridine dinucleotide phosphate UGT UDP–glucuronosyltransferase UM Ultra-rapid metabolizer UNG Uracil N-glycosylase Vmax Maximum velocity

WHO World Health Organization

RÉSUMÉ

- 6 -

R ÉSUMÉ

INTRODUCTION

Pour tous médicaments utilisés à doses standards, un certain nombre de patients ne répondent pas, répondent partiellement ou présentent des effets indésirables. Ces différences individuelles dans la réponse aux médicaments résultent de facteurs physiologiques et environnementaux tels que l’âge, le sexe, la maladie, les interactions médicamenteuses, la nutrition et certains comportements (par exemple, le fait de fumer ou de consommer de l’alcool) ainsi que de facteurs génétiques. La pharmacogénétique étudie les mécanismes d’origine génétique intervenant dans la variabilité individuelle de la réponse aux médicaments. Elle s’intéresse notamment aux variations génétiques des enzymes qui métabolisent et transportent les médicaments ainsi qu’aux cibles des médicaments.

Les médicaments sont généralement métabolisés en composés plus hydrophiles afin d’être plus facilement éliminés. Mais dans certains cas, les métabolites produits ont une forte activité thérapeutique ou des propriétés toxiques. La superfamille des enzymes du cytochrome P450 (CYP) est la plus importante pour le métabolisme des médicaments. Les familles 1 à 3 sont principalement impliquées dans le métabolisme des médicaments alors que les autres familles métabolisent surtout des substances endogènes. La plupart des CYPs peuvent être induits ou inhibés par certains médicaments, par la fumée de cigarette ou l’exposition à des produits chimiques. De plus, les gènes codant pour les CYPs des familles 1 à 3 sont polymorphiques, produisant parfois des enzymes inactives ou avec une activité réduite, altérée ou augmentée.

La glycoprotéine de perméabilité (P-gp) est une protéine transmembranaire impliquée dans l’efflux de substances endogènes et exogènes. Elle transporte de nombreux médicaments du domaine intracellulaire vers le domaine extracellulaire, jouant ainsi un rôle protecteur par diminution de l’accumulation potentiellement toxique des médicaments, par augmentation de leur élimination et par limitation de leur distribution dans l’organisme. Elle est exprimée dans de nombreux tissus tels que les intestins, le foie, les lymphocytes et la barrière hémato-encéphalique et, de ce fait, joue un rôle important dans l’absorption intestinale des médicaments et leur distribution dans l’organisme. De nombreux polymorphismes ont été décrits dans le gène ABCB1 codant la P-gp. Le polymorphisme

RÉSUMÉ

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3435C>T est le premier à avoir été associé à une diminution de l’expression de la P-gp dans le duodénum, mais de nombreux résultats contradictoires sur l’impact des différents polymorphismes génétiques ont depuis été publiés.

La méthadone est un agoniste synthétique du récepteur mu aux opiacés qui est utilisé comme traitement de substitution lors de la dépendance aux opiacés et comme traitement de la douleur. Son efficacité comme traitement de substitution a été démontrée par une diminution de la criminalité, de la contamination au VIH, de la mortalité ainsi que par une amélioration de la réinsertion sociale. La méthadone est administrée sous forme racémique, alors que la (R)-méthadone est la forme active sur le récepteur aux opiacés.

Plusieurs études in vitro et in vivo ont démontré que le CYP3A4 et, dans une moindre mesure, le CYP2D6 sont les principales enzymes responsables du métabolisme de la méthadone. D’autres CYPs, tels que les CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19 et CYP1A2, pourraient également y participer. L’implication du CYP2B6 a récemment été démontrée in vitro, avec une stéréo-sélectivité de cette enzyme pour la (S)-méthadone. Selon différents modèles cellulaires et animaux, la méthadone est un substrat de la P-gp. Concernant la pharmacodynamique, plusieurs polymorphismes génétiques ont été décrits dans le gène codant pour le récepteur mu aux opiacés. Le plus intéressant d’entre eux, le 118A>G, a été associé à une diminution de l’effet de certains opiacés, y compris de la méthadone. De plus, les récepteurs à la dopamine semblent être impliqués dans l’effet de récompense des drogues, les souris knock-out ne montrant plus d’effet de récompense aux opiacés. A nouveau, plusieurs polymorphismes génétiques ont été décrits dans les gènes des récepteurs D1 et D2 à la dopamine. L’un d’entre eux, le TaqI A, a déjà été associé à la réponse au traitement de substitution. Des cas de cardiotoxicité ont été décrits chez des patients prenant de la méthadone, généralement à haute dose. Ce phénomène est dû au blocage du canal cardiaque potassique human ether-à-gogo related gene (hERG) par la méthadone, qui conduit à une prolongation de l’intervalle QT de l’électrocardiogramme.

La ciclosporine et le tacrolimus sont des médicaments immunosuppresseurs prescrits notamment pour prévenir les rejets de greffe suite à une transplantation. Ce sont tous deux des inhibiteurs de la calcineurine qui présentent un index thérapeutique étroit et une grande variabilité pharmacocinétique et pharmacodynamique. De ce fait, le monitoring des taux de ciclosporine et de tacrolimus fait partie intégrante du suivi des patients transplantés. La ciclosporine et le tacrolimus sont fortement métabolisés dans le foie par les enzymes du CYP3A et sont également substrats de la P-gp.

RÉSUMÉ

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Les objectifs de cette thèse sont de déterminer les facteurs génétiques influençant :

• les concentrations plasmatiques de méthadone et les concentrations sanguines et intracellulaires de ciclosporine et tacrolimus,

• la réponse au traitement de substitution par la méthadone et la réponse à l’immunosuppression suite à une transplantation.

ETUDE PHARMACOGENETIQUE SUR LA METHADONE

Relation entre les taux plasmatiques des énantiomères de la méthadone, les génotypes CYP2B6, CYP2C19 et CYP2C9 et la réponse au traitement

Deux études in vitro ont récemment démontré un rôle important pour les CYP2B6 et CYP2C19 dans le métabolisme de la méthadone, avec une stéréo-sélectivité du CYP2B6 pour la (S)-méthadone et du CYP2C19 pour la (R)-méthadone. Le CYP2C9 pourrait également être impliqué dans le métabolisme de la méthadone. Ces trois enzymes étant polymorphiques, nous avons cherché à déterminer l’influence de certains de leurs polymorphismes génétiques sur la pharmacocinétique de la méthadone et sur la réponse au traitement de substitution à la méthadone.

Pour cela, 209 patients participant à un programme de substitution ont été inclus dans trois groupes selon leur réponse au traitement et leur dose journalière de méthadone. Le premier groupe comprend les patients répondant à leur traitement et recevant une dose de méthadone comprise entre 40 et 80 mg/j (répondeurs basse dose; n=69). Le deuxième groupe comprend les patients répondant à leur traitement et recevant une dose supérieure à 120 mg/j (répondeurs haute dose; n=80). Finalement, le troisième groupe comprend les patients ne répondant pas à leur traitement et recevant plus de 120 mg/j (non-répondeurs haute dose; n=60). Tous les patients ont été génotypés pour les CYP2B6 (allèles *4, *5, *6,

*7 et *9), CYP2C9 (*2 et *3) et CYP2C19 (*2 et *3). Leurs taux plasmatiques à l’équilibre de (R)-, (S)- et (R,S)-méthadone ont été mesurés juste avant la prise de méthadone (T0) et 4 heures plus tard (T4). Les rapports des concentrations plasmatiques à T4 sur celles à T0 ont également été calculés.

Les 209 patients sont pour la plupart de sexe masculin (77%), caucasiens (95%), fumeurs (92%) et polymédiqués (78%). Leur dose journalière moyenne de méthadone est de 140 ± 82 mg/j (écart, 3-430 mg/j), alors qu’elle est de 55 ± 17, 188 ± 76 et 175 ± 55 mg/j pour les répondeurs basse dose, répondeurs haute dose et non-répondeurs haute dose,

RÉSUMÉ

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respectivement. Les taux plasmatiques de méthadone présentent une grande variabilité interindividuelle, avec des taux de (R,S)-méthadone allant de 30 à 1997 ng·kg/ml·mg à T0.

Les fréquences des allèles et des génotypes des CYP2B6, CYP2C9 et CYP2C19 sont similaires à celles reportées pour d’autres groupes de caucasiens. Parmi les allèles analysés du CYP2B6, l’allèle *6 est celui qui influence les taux plasmatiques de méthadone, le génotype *6/*6 étant associé à une diminution d’activité. Les taux plasmatiques de méthadone ont donc été comparés entre les porteurs homozygotes, les porteurs hétérozygotes et les non-porteurs de l’allèle *6. Une différence significative a été trouvée pour les taux plasmatiques de (S)- et de (R,S)-méthadone à T0 et T4 selon le génotype du CYP2B6*6 (p=0.0004 et p=0.006), alors que les taux de (R)-méthadone n’étaient pas différents à T0 et que seule une tendance était observée à T4 (p=0.07). Les taux de (S)-méthadone sont donc plus fortement influencés par le génotype du CYP2B6*6, avec des valeurs médianes à T0 de 209, 122 et 105 ng·kg/ml·mg (Figure 1) et à T4 de 265, 195 et 197 ng·kg/ml·mg chez les porteurs homozygotes, hétérozygotes et les non-porteurs de l’allèle *6, respectivement. En revanche, les génotypes du CYP2C9 et CYP2C19 n’influencent pas les taux plasmatiques de méthadone.

02004006008001,000

(S)-méthadone [ng/ml]

Non-porteur de l’allèle*6

Porteur hétérozygote

Porteur homozygote

*6/*6 P < 0.0004

Figure 1. Distribution (médiane et écart interquartile) des taux plasmatiques de (S)-méthadone à T0 chez les patients porteurs ou non du CYP2B6*6.

D’autre part, chez les patients non-répondeurs, des taux plasmatiques inférieurs de (R)-, (S)- et (R,S)-méthadone ont été mesurés à T0 et T4 (p<0.02), ainsi que des rapports T4/T0 supérieurs (p<0.0005). Toutefois, la distribution des génotypes du CYP2B6*6 n’est pas différente entre les patients répondeurs et non-répondeurs ou entre ceux recevant une haute ou une basse dose de méthadone. La stéréo-sélectivité du CYP2B6 pour la (S)- méthadone, inactive sur le récepteur mu aux opiacés, explique en partie ce résultat.

RÉSUMÉ

- 10 -

En conclusion, le CYP2B6 influence significativement les taux plasmatiques de (S)- méthadone et peu ou pas ceux de (R)-méthadone. Comme seule la (R)-méthadone participe à l’effet agoniste sur le récepteur mu aux opiacés, une influence majeure du génotype du CYP2B6 sur la réponse au traitement est peu probable et n’est pas démontrée dans cette étude. L’observation de taux plasmatiques inférieurs et de rapports T4/T0 supérieurs chez les patients non-répondeurs suggère une clairance augmentée et un temps de demi-vie diminué chez ces patients. Ceci est en accord avec les mesures prises en clinique en cas de non-réponse, soit l’augmentation de la dose journalière de méthadone et la fragmentation de cette dose en plusieurs prises.

Influence des génotypes et phénotypes des cytochromes P450 et d’ABCB1 sur les taux plasmatiques de méthadone et sur la réponse au traitement

In vivo, l’implication des différentes isoformes du CYP et de la P-gp sur la pharmacocinétique de la méthadone n’est pas claire. Suite à notre précédent rapport, nous désirons examiner en détail l’influence de facteurs génétiques influençant la pharmacocinétique de la méthadone ainsi que la réponse au traitement. Dans ce but, le nombre de patients inclus dans l’étude a été augmenté pour atteindre 245 patients en traitement de substitution à la méthadone, inclus dans les mêmes groupes que précédemment. Leurs taux plasmatiques de (R)-, (S)- et (R,S)-méthadone ont été mesurés à l’état d’équilibre avant la prise de méthadone (T0) et, pour certains patients, 4 heures plus tard (T4). Tous les patients ont été génotypés pour des polymorphismes génétiques des CYP1A2 (allèle *1F), CYP2B6 (*4, *5, *6, *7 et *9), CYP2C9 (*2 et *3), CYP2C19 (*2 et

*3), CYP2D6 (*3, *4, *5, *6, *xN), CYP3A4 (*1B), CYP3A5 (*3), ABCB1 (61A>G, 2677G>T et 3435C>T) et UGT2B7 (*2a). Les polymorphismes du CYP3A4 n’étant pas de bons marqueurs de son activité, un test de phénotypage au midazolam a également été réalisé pour mesurer cette activité chez 183 patients.

A nouveau, les 245 patients sont majoritairement de sexe masculin (76%), caucasiens (96%), fumeurs (93%) et polymédiqués (79%). Leur dose journalière moyenne de méthadone est de 134 ± 82 mg/j (écart, 3-430 mg/j). Les fréquences des allèles et des génotypes de tous les polymorphismes génétiques sont similaires à celles reportées pour d’autres groupes de caucasiens. Les patients porteurs de l’allèle CYP3A4*1B (n=18) présentent des taux de (S)-méthadone légèrement supérieurs à T0 et T4 (p=0.048 et p=0.019) alors que les taux de (R)-méthadone ne diffèrent pas. Cette absence de différence est probablement imputable au petit nombre de patients porteurs du CYP3A4*1B plutôt qu’à la présence d’une réelle stéréo-sélectivité. La moyenne géométrique du ratio

RÉSUMÉ

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métabolique du midazolam est de 3.08 (écart, 0.35-19.75). Les taux de (R,S)-méthadone ainsi que ceux de chaque énantiomère corrèlent faiblement mais significativement avec le ratio métabolique du midazolam (r²=0.11, p<0.00005). Pour évaluer l’effet de l’activité du CYP3A sur les taux de méthadone, les patients ont été séparés en trois groupes selon leur ratio métabolique. Les patients avec une faible activité du CYP3A présentent à T0 et T4 des taux de (R,S)-méthadone supérieurs à ceux des patients avec une activité moyenne ou élevée (4.3, 3.0 et 2.3 ng/ml·mg à T0, respectivement; p=0.0002). Cette relation est également observée pour les taux de (R)- et (S)-méthadone. Par contre, la comparaison des taux de chaque énantiomère ne montre pas de stéréo-sélectivité dans le métabolisme de la méthadone par le CYP3A.

Confirmant les résultats du précédent rapport, les patients porteurs du génotype CYP2B6

*6/*6 présentent des taux de (S)-méthadone significativement supérieurs à ceux des porteurs hétérozygotes et des non-porteurs de l’allèle *6 à T0, alors que seule une tendance est observée pour les taux de (R)-méthadone (p=0.07). Les résultats sont similaires à T4, confirmant ainsi la stéréo-sélectivité pour la (S)-méthadone du CYP2B6. Le génotypage du CYP2D6 permet de prédire les phénotypes de métaboliseur ultrarapide, bon, intermédiaire ou mauvais. Les métaboliseurs ultrarapides du CYP2D6 présentent des taux de (R,S)-méthadone inférieurs à ceux observés chez les métaboliseurs bons et intermédiaires (2.4 et 3.3 ng/ml·mg, respectivement; p=0.04), alors que le phénotype de mauvais métaboliseur n’influence pas les taux plasmatiques (p>0.2). Le fait que la majorité des patients soient polymédiqués pourrait expliquer cette absence de différence, le CYP2D6 pouvant être inhibé chez certains patients bon métaboliseur. En outre, les génotypes des CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A5 et UGT2B7 n’influencent pas les taux plasmatiques de méthadone.

Concernant la P-gp, les porteurs des allèles ABCB1 61G et 3435T présentent des taux inférieurs à T0 mais pas à T4 et une tendance similaire est observée pour les porteurs de l’allèle 2677T. Par exemple, les taux plasmatiques de (R,S)-méthadone sont de 2.7 et 3.4 ng/ml·mg pour les patients porteurs du génotype ABCB1 3435TT et 3435CC, respectivement (p=0.01), représentant ainsi une diminution d’environ 20% chez les porteurs du génotype muté. En comparant les résultats des énantiomères de la méthadone, aucune stéréo-sélectivité dans le transport de la méthadone par la P-gp n’est observée. Finalement, la fréquence des différents génotypes a été comparée entre les groupes répondeurs et non-répondeurs et entre les groupes recevant de hautes et basses doses de méthadone. Aucune différence de fréquence n’est observée pour les génotypes

RÉSUMÉ

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analysés selon la réponse au traitement et seule une faible influence sur la dose nécessaire est observée pour le CYP3A4*1B.

En conclusion, les CYP3A4 et CYP2B6 sont les principaux CYPs impliqués dans le métabolisme de la méthadone, le CYP2D6 contribuant également mais de façon mineure.

Les polymorphismes génétiques de la P-gp contribuent aussi légèrement à la variabilité de la pharmacocinétique de la méthadone. Toutefois, les polymorphismes de ces quatre protéines n’influencent pas la réponse au traitement et n’influencent que peu la dose de méthadone.

Blocage stéréo-sélectif du canal hERG par la (S)-méthadone et prolongation de l’intervalle QT chez les métaboliseurs lents du CYP2B6

La méthadone inhibe le canal cardiaque potassique hERG et, de ce fait, peut causer une prolongation de l’intervalle QT. Une forme particulière de tachycardie ventriculaire, appelée torsade de pointes, peut résulter de cette prolongation et causer une mort subite.

Récemment, plusieurs cas de torsades de pointes et de mort subite ont été décrits chez des patients prenant de la méthadone.

La méthadone est prescrite sous forme racémique alors que son activité thérapeutique est principalement due à la (R)-méthadone. Aucune donnée concernant une possible stéréo- sélectivité de l’inhibition du canal hERG n’étant publiée, des expérience de patch-clamp sur cellules entières exprimant le canal hERG ont été réalisées sur la (R)-, (S)-, (R,S)- méthadone ainsi que sur ses principaux métabolites (EDDP et EMDP). Les résultats obtenus montrent que la (S)-méthadone bloque le canal hERG 3.5 fois plus fortement que la (R)-méthadone, avec des concentrations d’inhibition 50% (IC50%) de 2 et 7 µM à 37°C, respectivement. En revanche, les deux métabolites analysés ne participent pas à l’inhibition du canal hERG. L’IC50% de 7 µM mesurée pour la (R)-méthadone, qui est l’énantiomère responsable de l’activité thérapeutique, est 6 à 9 fois supérieure aux concentrations plasmatiques mesurées à T0 et T4 chez les patients inclus dans notre étude. Par contre, l’IC50% de 2 µM mesurée pour la (S)-méthadone pourrait facilement être atteinte chez des patients traités avec de hautes doses de méthadone ou dont le métabolisme est déficient.

Suite à nos précédents rapports, le génotype CYP2B6 *6/*6 est associé à un statut de métaboliseur lent du CYP2B6 et conduit à une diminution de la capacité à métaboliser la (S)-méthadone. Nous avons donc cherché à savoir si les patients porteurs de ce génotype

RÉSUMÉ

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présentent une prolongation de leur intervalle QT corrigé par la fréquence cardiaque (QTc).

Dans ce but, un électrocardiogramme a été obtenu pour 179 patients en traitement de substitution à la méthadone. Leur génotype CYP2B6 a également été déterminé ainsi que les taux de (R)-, (S)- et (R,S)-méthadone. Selon la classification de l’Agence Européenne des médicaments (EMEA), un intervalle QTc est considéré comme prolongé lorsqu’il est supérieur à 450 ms pour les hommes et à 470 ms pour les femmes, et comme critique lorsqu’il est supérieur à 430 ms pour les hommes et à 450 ms pour les femmes.

Une corrélation faible mais significative est observée entre les intervalles QTc et les taux plasmatiques de (R,S)-méthadone à T0. Parmi les 179 patients, 16 ont un intervalle QTc prolongé et 42 ont un intervalle QTc critique. Les analyses univariées de l’intervalle QTc et des différents facteurs de risque connus montrent que les concentrations et la dose de méthadone, la prise de comédications, le calcium sérique et le statut de métaboliseur lent du CYP2B6 sont prédictifs de l’intervalle QTc. Ces résultats sont confirmés par une analyse multivariée. Malgré le fait que les taux de méthadone ne reflètent que partiellement la variation de l’intervalle QTc, la moyenne de l’intervalle QTc est tout de même supérieure de 17 ms chez les patients avec des taux plasmatiques de (R,S)-méthadone supérieurs à la moyenne de l’ensemble du groupe (445 ng/ml; p<0.00005). De plus, le génotype CYP2B6 influence significativement l’intervalle QTc, la valeur moyenne observée étant supérieure chez les patients métaboliseurs lents du CYP2B6 comme le montre la figure 2.

Le statut de métaboliseur lent est ainsi associé à une augmentation du risque de prolongation de l’intervalle QTc (rapport des cotes, 4.5; p=0.03).

P = 0.017

350400450500

IntervalleQTc[ms]

Bon métaboliseur

CYP2B6 Métaboliseur lent CYP2B6

Figure 2. Comparaison de l’intervalle QTc mesuré à T0 chez les patients métaboliseurs lents du CYP2B6 (génotype *6/*6, n=11) et les bons métaboliseurs (tous les autres génotypes, n=168). Les points rouges représentent les intervalles QTc prolongés, les points orange les intervalles QTc critiques, et les points verts les intervalles QTc normaux.

RÉSUMÉ

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En conclusion, cette étude rapporte le premier facteur génétique impliqué dans le métabolisme de la méthadone qui augmente le risque d’arythmie cardiaque et de mort subite. Or, ce risque pourrait être diminué par administration de (R)-méthadone, l’énantiomère actif au niveau du récepteur mu aux opiacés et moins fortement inhibiteur du canal hERG, à la place du mélange racémique actuel.

Relation entre la réponse au traitement de methadone et différents polymorphismes des gènes des récepteurs aux opiacés et de la dopamine

Les variations génétiques des gènes codant les récepteurs aux opiacés et les récepteurs de la dopamine pourraient influencer la réponse au traitement de méthadone. Nous avons inclus 238 patients en traitement de substitution à la méthadone selon leur réponse au traitement et leur dose journalière de méthadone ainsi que 217 sujets qui ne présentent pas de dépendance. Tous ont été génotypés pour plusieurs polymorphismes génétiques des récepteurs D1 et D2 de la dopamine ainsi que les récepteurs mu et delta aux opiacés.

La comparaison de la fréquence des allèles des polymorphismes génétiques analysés montre que les polymorphismes 118A>G du récepteur mu aux opiacés, 921T>C du récepteur delta aux opiacés, DdeI du récepteur D1 de la dopamine et TaqI A du récepteur D2 de la dopamine ne sont pas associés à la réponse au traitement de substitution à la méthadone ni à la dose journalière de méthadone. Par contre, le polymorphisme 957C>T du récepteur D2 de la dopamine est associé à la réponse au traitement. Les porteurs du génotype 957CC sont plus fréquemment non-répondeurs à leur traitement, avec 25% de 957CC dans le groupe des non-répondeurs et seulement 12% dans le groupe des répondeurs (rapport des cotes, 2.4; p=0.02). De plus, les porteurs du génotype 957CC présentent une période exempte d’urine positive aux opiacés et à la cocaïne quatre fois plus courte (1.5 mois contre 6 mois pour les 957CT/TT; p=0.02). En revanche, le polymorphisme 957C>T n’est pas associé à la dose de méthadone.

Aucune différence dans la fréquence des allèles des différents polymorphismes génétiques n’a été observée entre les patients en traitement de substitution et le groupe contrôle, suggérant une absence de relation entre ces polymorphismes et la dépendance aux opiacés.

En conclusion, l’association du polymorphisme 957C>T du récepteur D2 de la dopamine et de la réponse au traitement de substitution à la méthadone est rapportée ici pour la première fois, le génotype 957CC étant plus fréquent chez les patients non-répondeurs.

RÉSUMÉ

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Des résultats contradictoires ont été publiés sur l’influence du polymorphisme TaqI A du récepteur D2 de la dopamine sur la réponse au traitement de substitution à la méthadone, mais aucune étude n’a examiné le polymorphisme 957C>T. Ces deux polymorphismes étant liés, d’autres études pharmacogénétiques sont nécessaires pour confirmer l’association entre le polymorphisme 957C>T du récepteur D2 de la dopamine et la réponse au traitement de substitution à la méthadone. En revanche, aucun des polymorphismes analysés n’est associé à la dépendance aux opiacés.

ETUDE PHARMACOGENETIQUE SUR LES IMMUNOSUPPRESSEURS

Influence des polymorphismes génétiques des CYP3A7, CYP3A5, CYP3A4 et ABCB1 sur les concentrations sanguines et les doses journalières de ciclosporine chez des patients transplantés

La ciclosporine est un substrat du CYP3A et de la P-gp, pour lesquels de nombreux polymorphismes ont été décrits. Les polymorphismes génétiques CYP3A5*3 et CYP3A7*1C, qui affectent l’expression des CYP3A5 et CYP3A7, sont les candidats les plus intéressants. Le génotype CYP3A5 *3/*3, présent chez 75-90% des caucasiens, résulte en l’absence d’activité CYP3A5 alors que l’allèle CYP3A7*1C est associé à une forte expression du CYP3A7 chez les adultes, pouvant représenter jusqu’à 20% du contenu hépatique du CYP3A.

Pour étudier l’influence des polymorphismes génétiques CYP3A5*3, CYP3A7*1C, CYP3A4*1B, ABCB1 61A>G, 2677G>T et 3435C>T sur la pharmacocinétique de la ciclosporine, 73 patients ayant reçus une greffe rénale (n=64) ou pulmonaire (n=9) ont été inclus. Les taux de ciclosporine corrigés par la dose (en ng·kg/ml·mg) et les doses journalières de ciclosporine (en mg/kg) des patients 1, 3, 6 et 12 mois après la transplantation ont été obtenus dans leur dossier médical.

Les patients exprimant le CYP3A5 (porteurs du génotype *1/*3; n=8-10) présentent des concentrations inférieures de ciclosporine corrigées par la dose 3, 6 et 12 mois après la transplantation en comparaison à celles des patients n’exprimant pas le CYP3A5 (porteurs du génotype *3/*3; n=55-59; p<0.05). De plus, comme le montre la figure 3, durant toute la première année suivant la transplantation, la dose journalière de ciclosporine est supérieure chez les patients qui expriment le CYP3A5 (p<0.01).

RÉSUMÉ

- 16 -

1 10 20

Dose journalière de ciclosporine[mg/kg]

Temps après la transplantation [mois]

1 3 6 12

p=0.01 p=0.004 p=0.004 p=0.0001

Figure 3.Influence du génotype CYP3A5*3 sur la dose journalière de ciclosporine 1, 3, 6 et 12 mois après la transplantation. Les points blancs représentent le génotype CYP3A5 *3/*3 et les points noirs le génotype CYP3A5 *1/*3.

Les patients porteurs de l’allèle CYP3A7*1C reçoivent également des doses journalières de ciclosporine 1.4 à 1.6 fois supérieures à celles des patients non-porteurs de cet allèle durant la première année qui suit la transplantation (Figure 4 ; p<0.05). Par contre, aucune conclusion sur l’effet de l’allèle CYP3A4*1B n’est possible, car même si les porteurs de cet allèle reçoivent des doses journalières supérieures, ils expriment tous le CYP3A5.

1 10 20

Dose journalière de ciclosporine[mg/kg]

Temps depuis la transplantation [mois]

p=0.0004 p=0.05 p=0.04 p=0.006

1 3 6 12

Figure 4. Influence du génotype CYP3A7*1C sur la dose journalière de ciclosporine 1, 3, 6 et 12 mois après la transplantation. Les points blancs représentent le génotype CYP3A7 *1/*1 et les points noirs le génotype CYP3A7 *1/*1C.

Les taux de ciclosporine non corrigés au jours 7, 14 et au premier mois après la transplantation ont également été comparés afin de déterminer si les génotypes du CYP3A influencent le temps nécessaire pour atteindre une concentration cible de 200 ng/ml. En accord avec les résultats précédents, 7 jours après la transplantation, les patients exprimant le CYP3A5 ont une concentration de ciclosporine non corrigée inférieure à celle

RÉSUMÉ

- 17 -

des personnes n’exprimant pas le CYP3A5 (Figure 5; p=0.03). De plus, ils sont plus nombreux à avoir une concentration non corrigée de ciclosporine inférieure à la valeur cible de 200 ng/ml que les patients n’exprimant pas le CYP3A5 (rapport des cotes, 7.2;

p=0.0009).

100 200 400 600

Temps depuis la transplantation [jours]

Concentration de ciclosporine [ng/ml]

7 14 30

*

Figure 5. Evolution de la moyenne géométrique avec intervalle de confiance à 95% des taux non corrigés de ciclosporine durant le premier mois après la transplantation selon le génotype CYP3A5.

Les triangles représentent les patients exprimant le CYP3A5 et les cercles représentent les patients ne l’exprimant pas. * p<0.03.

Les polymorphismes génétiques 61A>G et 3435C>T du gène ABCB1, codant la P-gp, n’influencent ni les taux corrigés de ciclosporine, ni les doses journalières. Par contre, le polymorphisme génétique 2677G>T influence les taux corrigés de ciclosporine ainsi que les doses journalières. Toutefois, ce polymorphisme étant lié au CYP3A7*1C (p=0.0003), son influence n’est que très faible sur les taux corrigés et disparaît sur les doses lorsque les porteurs du CYP3A7*1C sont exclus de l’analyse.

En conclusion, le génotypage des polymorphismes des CYP3A5 et CYP3A7 pourrait être utile pour optimiser de façon prospective la prescription de ciclosporine aux patients transplantés. Ces deux polymorphismes étant plus fréquents dans d’autres groupes ethniques, tels que les noirs américains, ce génotypage serait d’autant plus utile chez ces patients. Une étude prospective randomisée est nécessaire pour évaluer le bénéfice d’un ajustement prospectif de la dose de ciclosporine en fonction des génotypes CYP3A5 et CYP3A7.

RÉSUMÉ

- 18 -

Influence des polymorphismes génétiques de la P-gp sur la concentration intracellulaire de ciclosporine chez les patients transplantés

La ciclosporine est substrat de la P-gp qui est présente sur les lymphocytes. Celle-ci pourrait influencer la concentration intracellulaire de ciclosporine et donc son effet immunosuppresseur. Pour étudier l’influence des polymorphismes de la P-gp sur la concentration intracellulaire de ciclosporine, nous avons inclus 64 patients ayant reçu une greffe rénale (n=41), hépatique (n=20) ou pulmonaire (n=3) et recevant de la ciclosporine comme traitement immunosuppresseur. Lors d’une visite de routine, leurs concentrations intracellulaires et sanguines de ciclosporine ont été mesurées et leurs génotypes ABCB1 ont été déterminés.

Les concentrations intracellulaires de ciclosporine corrèlent modérément mais significativement avec les concentrations sanguines (r²=0.30, p<0.00005) et faiblement avec les doses journalières de ciclosporine (r²=0.14, p=0.003). Les polymorphismes génétiques ABCB1 61A>G, 1236C>T et 2677G>T n’influencent pas les concentrations intracellulaires et sanguines de ciclosporine. En revanche, les polymorphismes génétiques ABCB1 1199G>A et 3435C>T influencent tous les deux les concentrations intracellulaires de ciclosporine, mais dans une direction opposée. Les porteurs de l’allèle 1199A présentent des concentrations intracellulaires 1.8 fois inférieures à celles des non-porteurs de cet allèle (p=0.04) alors que les porteurs de l’allèle 3435T présentent des concentrations intracellulaires 1.7 fois supérieures à celles des non-porteurs de cet allèle (Figure 6; p=0.02). De plus, les porteurs de l’allèle 3435T présentent également des concentrations sanguines non corrigées par la dose et le poids légèrement augmentées (p=0.04). L’analyse des haplotypes n’apporte pas d’information supplémentaire.

RÉSUMÉ

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1199GG 1199GA/AA

0.1 1 5 10 20

ABCB1 1199G>A Concentrationintracellulaire deciclosporine[ng/106cellules]

A

p=0.044

3435CC 3435CT/TT 0.1

10

1 5 20

ABCB1 3435C>T Concentrationintracellulaire deciclosporine[ng/106cellules]

B

p=0.015

Figure 6.Comparaison des concentrations intracellulaires de ciclosporine selon le génotype ABCB1 1199G>A (A) et 3435C>T (B) pour 64 patients transplantés.

Le développement d’anticorps anti-HLA et/ou lymphocytotoxiques après la transplantation pourrait augmenter le risque de rejet aigu et chronique, et de ce fait, diminuer la survie du greffon. Parmi les patients inclus, 51 ont été testés pour la présence d’anticorps anti-HLA et/ou lymphocytotoxiques et deux d’entre eux ont été testés positivement. De façon intéressante, ces deux patients présentent des concentrations intracellulaires et sanguines de ciclosporine diminuée (p<0.03) et sont tous deux porteurs du génotype 3435CC (p=0.05).

En conclusion, ce rapport est le premier à démontrer une influence des polymorphismes génétiques du gène ABCB1 sur la concentration intracellulaire de ciclosporine, pouvant ainsi moduler l’action immunosuppressive de la ciclosporine.

GLYCOPROTEINE DE PERMEABILITE

Détermination in vitro du transport de la (R)-, (S)-, (R,S)-méthadone, du LAAM et de leurs métabolites par la P-gp

La méthadone et le lévo-α-acétylméthadol (LAAM) sont des agonistes synthétiques des opiacés utilisés dans le traitement de la dépendance aux opiacés. Les interactions entre les médicaments psychotropes et les transporteurs présents au niveau de la barrière hémato-encéphalique, en particulier la P-gp, sont particulièrement intéressantes.

RÉSUMÉ

- 20 -

Le but de cette étude est de déterminer, à l’aide d’un modèle cellulaire, si la méthadone, le LAAM et leurs métabolites sont substrats de la P-gp humaine et si ce transport est stéréo- sélectif. Pour mesurer l’activité de la P-gp, nous avons obtenu des cellules épithéliales de rein de porc transfectées avec la P-gp humaine et des cellules non transfectées servant de contrôle. Les cellules contrôles et les cellules transfectées ont été incubées avec différentes concentrations de méthadone, de son métabolite principal 2-ethylidene-1,5- dimethyl-3,3-diphenylpyrrolidine (EDDP), ainsi que du LAAM et de ses métabolites principaux lévo-α-acétylnorméthadol (NorLAAM) et lévo-α-acétyldinorméthadol (DiNorLAAM). Les concentrations intracellulaires et extracellulaires ont été mesurées par HPLC-MS ou GC-MS et les ratios des concentrations intracellulaires sur extracellulaires ont été calculés.

Les ratios des concentrations intracellulaires sur extracellulaires après incubation de méthadone, EDDP, LAAM, NorLAAM et DiNorLAAM sont tous diminués pour les cellules transfectées avec la P-gp humaine par rapport aux cellules contrôles non transfectées (n=6, p<0.004 pour la méthadone; n=3, p<0.05 pour EDDP, LAAM, NorLAAM et DiNorLAAM). Ceci démontre la présence d’un transport actif expulsant ces substances hors des cellules transfectées avec la P-gp humaine. Ces résultats indiquent que la méthadone, le LAAM et leurs métabolites principaux sont tous substrats de la P-gp humaine. En outre, une faible stéréo-sélectivité dans le transport de la méthadone est observée pour l’énantiomère (S)-méthadone, confirmant ainsi une étude sur des souris knock-out qui montrait une faible stéréo-sélectivité pour la P-gp murine vis à vis de la (S)- méthadone.

La P-gp, étant présente notamment au niveau de la barrière hémato-encéphalique, des intestins et des reins, pourrait affecter la pharmacocinétique de la méthadone, du LAAM et de leur métabolites, ainsi que leur activité pharmacologique.

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

L’étude pharmacogénétique sur la méthadone a permis de démontrer que les CYP3A4 et CYP2B6 sont les principales enzymes impliquées dans le métabolisme de la méthadone in vivo, le CYP2D6 ne participant que de façon minoritaire. En accord avec les résultats in vitro montrant une stéréo-sélectivité du CYP2B6, nous avons pu démontrer in vivo que le CYP2B6 métabolise préférentiellement la (S)-méthadone. Les polymorphismes génétiques du CYP3A4 ne reflétant pas bien son activité, un test de phénotypage au midazolam a

RÉSUMÉ

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permis de montrer l’implication du CYP3A dans le métabolisme de la méthadone et son absence de stéréo-sélectivité. De plus, les polymorphismes génétiques de la P-gp contribuent également faiblement à la variabilité interindividuelle de la pharmacocinétique de la méthadone. En revanche, nous n’avons pas observé de stéréo-sélectivité dans le transport de la méthadone par la P-gp in vivo.

En collaboration avec le département de Pharmacologie et de Toxicologie de l’Université de Lausanne, nous avons démontré que la (S)-méthadone bloque le canal cardiaque potassique hERG plus fortement que la (R)-méthadone. De plus, nous avons trouvé une association entre le statut de métaboliseur lent du CYP2B6 et la prolongation de l’intervalle QT à l’électrocardiogramme. Le risque de cardiotoxicité est donc augmenté chez les métaboliseurs lents du CYP2B6, et, si ces resultats sont confirmés par une étude prospective, ce risque pourrait être réduit par administration de (R)-méthadone à la place du mélange racémique.

Concernant la pharmacodynamique, nous n’avons pas observé d’influence des polymorphismes génétiques des récepteurs D1 de la dopamine, mu et delta aux opiacés Pour le récepteur D2 de la dopamine, nous n’avons pas trouvé d’influence du polymorphisme TaqI A, pour lequel des résultats contradictoires sur la réponse au traitement de méthadone ont été publiés. Par contre, nous avons trouvé une association entre la réponse au traitement de méthadone et le polymorphisme 957C>T, qui n’a pas encore été étudié dans ce cadre et qui est lié au TaqI A.

Pour compléter cette étude, il serait intéressant d’analyser des polymorphismes génétiques d’autres transporteurs, qui pourraient également transporter la méthadone et donc affecter sa pharmacocinétique. De plus, une étude récente a montré que les haplotypes de la P-gp influencent la dose de méthadone. L’analyse des polymorphismes inclus dans ces haplotypes pourrait donc permettre de confirmer/infirmer cette relation. Nous sommes actuellement en train de traiter ces données. D’autres polymorphismes des récepteurs aux opiacés et de la dopamine pourraient également être analysés en relation avec la réponse au traitement et la dépendance aux opiacés. Concernant la cardiotoxicité de la méthadone, deux études cliniques sont actuellement en cours pour confirmer la plus faible toxicité de la (R)-méthadone. La première s’intéresse à la variation de l’intervalle QT chez des patients en traitement de substitution présentant un QT prolongé et dont le traitement est remplacé par une dose équivalente de (R)-méthadone durant 2 semaines. Le protocole de la deuxième étude est similaire, mais concerne des patients qui commencent un traitement de substitution.

RÉSUMÉ

- 22 -

L’étude pharmacogénétique sur les immunosuppresseurs a permis de démontrer que, durant la première année après la transplantation, les taux sanguins corrigés par la dose et les doses journalières de ciclosporine sont influencés par les génotypes CYP3A5*3 et CYP3A7*1C, qui modifient l’expression de ces CYPs. En revanche, les polymorphismes génétiques de la P-gp n’ont qu’une faible influence sur les taux corrigés par la dose et sur les doses de ciclosporine.

Concernant les concentrations intracellulaires, seule une corrélation modérée est observée entre les concentrations intracellulaires et sanguines de ciclosporine. La concentration sanguine ne reflète donc que partiellement la concentration disponible pour l’action immunosuppressive. Les polymorphismes ABCB1 61A>G, 1236C>T et 2677G>T n’ont pas d’influence sur la concentration intracellulaire de ciclosporine alors que les polymorphismes 1199G>A et 3435C>T l’influencent tous les deux, mais dans des directions opposées. De plus, après la transplantation, seuls deux patients ont développé des anticorps anti-HLA et/ou lymphocytotoxiques, qui sont associés à une augmentation du risque de rejet. De façon intéressante, ces deux patients présentent des concentrations intracellulaires et sanguines de ciclosporine diminuées et sont porteurs du génotype 3435CC.

Une étude prospective randomisée est nécessaire pour déterminer si l’administration d’une dose de ciclosporine adaptée selon les génotypes CYP3A5 et CYP3A7 améliore l’issue de la transplantation, avec une immunosuppression adéquate et une toxicité diminuée.

L’importance clinique de la concentration intracellulaire de ciclosporine reste donc à confirmer par une étude prospective incluant le suivi après la greffe de l’immunosuppression et des effets secondaires. Il serait également intéressant d’inclure l’analyse de polymorphismes génétiques d’autres transporteurs. Lors de cette étude, des échantillons intracellulaires de tacrolimus ont également été récoltés, mais, suite à des problèmes de sensibilité analytique, ils viennent d’être mesurés et seront bientôt analysés.

Une influence des polymorphismes de la P-gp est également attendue sur les concentrations intracellulaires de tacrolimus, ce dernier étant substrat de la P-gp. De plus, l’expression de la P-gp sur les lymphocytes, ainsi que celle d’autres transporteurs, vont être mesurées pour une grande partie des patients inclus dans cette étude, des tubes spéciaux qui permettent de stabiliser l’ARN ayant été prélevés lors de la prise de sang. La relation entre les concentrations intracellulaires, l’expression des transporteurs et leurs polymorphismes apportera une meilleure compréhension de l’influence des transporteurs sur la pharmacocinétique des immunosuppresseurs.

Grâce aux cellules transfectées avec la P-gp humaine, nous avons pu confirmer que la méthadone, le LAAM et leurs métabolites sont substrats de la P-gp. De plus, nous avons

RÉSUMÉ

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observé une faible stéréo-sélectivité dans le transport de la méthadone in vitro. En utilisant ce modèle cellulaire, il serait intéressant de déterminer si d’autres psychotropes, et plus particulièrement des substances récemment commercialisées, sont également substrats de la P-gp.

C HAPTER 1

I NTRODUCTION

INTRODUCTION

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PHARMACOGENETICS

For all major classes of drugs given at standard doses, a substantial proportion of the patients do not respond, respond only partially, or experience adverse drug reactions (ADRs).¹ Although individual differences in drug response can result from the effects of age, gender, environmental factors, such as disease, drug interactions, nutritional and lifestyle factors (e.g. smoking, alcohol consumption), genetic factors also influence both the efficacy of a drug and the likelihood of an adverse reaction.^2,3 In general, it is estimated that genetic factors account for 15 to 30% of the interindividual variability in drug disposition and effects, but for certain classes of drugs, it can account for up to 95%.¹

Pharmacogenetics is the study of the role of inheritance in the individual variation of drug response.² Once a drug is administered, it is absorbed, partially metabolized in the intestine and distributed to its sites of action, where it interacts with targets (such as receptors and enzymes), undergoes metabolism in the liver, and is then excreted. Each of these steps could potentially involve clinically significant genetic variation.² Pharmacogenetics originated about 50 years ago from the clinical observation that some patients experienced severe ADRs and/or presented very high or very low plasma or urinary drug concentrations, and that the biochemical traits leading to this variation were inherited.^2,3 Only later were the drug-metabolizing enzymes identified, followed by the discovery of their genes and their DNA-sequence variation.² The discipline of pharmacogenetics now covers genetic variation in all the drug metabolizing enzymes, but also in the drug transporters and in the drug targets.³ Pharmacogenetics has the potential to identify the particular drug and its dose that is most likely to be effective and safe for each patient.³ However, the integration of pharmacogenetics into clinical practice has met considerable challenges.^3,4 Currently, some drug labels have information on pharmacogenetic data (e.g. atomoxetine, irinotecan, 6-mercaptopurine, voriconazole, etc.) but the necessary dose adaptation is usually not defined.⁴ Furthermore, the Food and Drug Administration is now encouraging the submission of pharmacogenomic data, with a pharmacogenetic test described as an assay intended to study interindividual variations in DNA sequence related to drug absorption and disposition (pharmacokinetics) or drug action (pharmacodynamics), including polymorphic variation in the genes that encode the functions of transporters, metabolizing enzymes, receptors, and other proteins.⁵

CHAPTER 1

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DRUG METABOLISM

Metabolism usually converts drugs into metabolites that are more water soluble and therefore more easily excreted. However in some cases, metabolites with potent biological activity or toxic properties are generated. Drug metabolism reactions are classified either as phase I (oxidation, reduction and hydrolysis) or phase II reactions (conjugation). The enzymes involved in the metabolism of drugs are mainly localized in the liver, although other organs have significant metabolic capacities, including the kidneys, gastrointestinal track, skin and lungs.⁶ Among all enzymes involved in drug metabolism, the cytochrome P450 (CYP) enzyme family is the most commonly involved enzyme system, followed by the uridine dinucleotide phosphate (UDP) glucuronosyltransferases (Figure 1).⁷

A B

Figure 1. Contribution of individual enzyme systems (A) and individual CYPs (B) to the metabolism of marketed drugs. UGT, uridine dinucleotide phosphate (UDP) glucuronosyltransferase; FMO, flavin-containing monooxygenase; NAT, N-acetyltransferase; MAO, monoamine oxidase; CYP, cytochrome P450. Picture from Guengerich FP. AAPS J 2006; 8:E101-11.

The CYP family, comprising of 57 members grouped into 27 families, is responsible for the metabolism of many endogenous and exogenous compounds.⁷ The nomenclature of the CYPs includes a number indicating the gene family (>40% identity of amino acid sequence), a letter for the subfamily (>55% identity of amino acid sequence) and a number for the gene.⁸ Within the CYP family, approximately 90% of drug metabolism can be accounted for by a few of its members, most of them belonging to families 1 to 3 (Figure 1B).⁷ As a result of the relatively low substrate specificity among the CYP enzymes, two or more individual enzymes can often catalyze the same reaction.⁶ Genetic, environmental and physiological factors are involved in the regulation of drug metabolism.⁶ A large number of CYP enzymes can be selectively induced or inhibited by drugs, cigarette

INTRODUCTION

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smoking and exposure to chemicals.⁹ Severe liver disease, diabetes and starvation may also affect drug metabolism.⁹ Furthermore, all CYP genes amongst families 1 to 3 are polymorphic, the mutations in the CYP genes sometimes causing enzyme products with abolished, reduced, altered or increased activity.⁸ The list of all CYP alleles resulting from these polymorphisms can be found on the Home Page of the Human Cytochrome P450 Allele Nomenclature Committee, along with information on their impact on protein sequence and enzyme activity.¹⁰

P-GLYCOPROTEIN

P-glycoprotein (P-gp) is an adenosine triphosphate (ATP)-dependent transmembrane drug efflux transporter belonging to the ATP-binding cassette (ABC) family and encoded by the ABCB1 gene (Figure 2). P-gp actively transports xenobiotics from the intracellular to the extracellular domain, resulting in a protective role against their potentially toxic accumulation, by enhancement of their elimination and limitation of their distribution in the body.^11,12

Figure 2. P-gp–mediated efflux transport of drug substrates can occur at the level of the plasma membrane or from the intracellular compartment. ATP, adenosine triphosphate; ADP, adenosine diphosphate; Pi, inorganic phosphate. Picture from Marzolini C et al. Clin Pharmacol Ther 2004;

75:13-33.

P-gp was first described in tumor cells where its over expression led to resistance to anticancer agents,¹³ and it was later established that P-gp is constitutively expressed in normal human tissues (Figure 3).¹¹ An important role of P-gp on the limitation of access for xenobiotics to the brain has been demonstrated in vivo by studies on P-gp-deficient

CHAPTER 1

- 29 -

mice.^14,15 A reduced oral absorption of drugs was also observed in P-gp-deficient mice, due to the extrusion of drugs from the enterocytes to the intestinal lumen.¹¹ Furthermore, the colocalization of P-gp with CYP3A4 in the intestine and liver could lead to a drug efflux- metabolism alliance, which increases the access of drug to metabolism by CYP3A4 through repeated cycles of absorption and efflux.¹² As P-gp is also expressed in lymphocytes,¹¹ its over expression has been hypothesized to result in multidrug resistance and to cause rejection episodes in transplant recipients.¹⁶ Moreover, inhibition and induction of P-gp by many drugs can have important clinical implications in terms of treatment efficacy and toxicity, with many drug interactions already reported.¹¹

Figure 3. P-gp tissue distribution. Picture from Marzolini C et al. Clin Pharmacol Ther 2004; 75:13- 33.

At least 29 single-nucleotide polymorphisms (SNPs) of the ABCB1 gene have been reported, 11 of them being non-synonymous (i.e., resulting in amino acid changes).¹¹ The secondary structure of P-gp with some of its SNPs is represented in Figure 4. Interestingly, the synonymous 3435C>T SNP was the first to be associated with lower duodenal P-gp expression.¹⁷ Since this first report, contradictory results have been published on the impact of several ABCB1 SNPs on P-pg expression and function and on the kinetics of different P-gp substrates (for a review see references 11,18). Furthermore, the synonymous 3435C>T SNP was shown to be in linkage disequilibrium with the non- synonymous 2677G>T/A (A893S/T) SNP and the synonymous 1236C>T SNP.¹¹ Interestingly, it has been recently shown that the 3435T allele is associated with a reduced P-gp expression due to a decrease in mRNA stability.¹⁹ However, these results were not confirmed in a recent study, where similar mRNA and protein levels were observed for the

INTRODUCTION

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wild-type and variant protein. On the other hand, an altered conformation was found for the variant protein, thereby altering the structure of substrate and inhibitor interaction sites.²⁰

Figure 4. Schematic representation of P-gp secondary structure, with several synonymous and non- synonymous SNPs. Non-synonymous substitutions are indicated by the corresponding amino acid changes. ATP, adenosine triphosphate. Picture from Ieiri I et al. Clin Pharmacokinet 2004; 43:553- 576

METHADONE

Methadone is a synthetic µ-opioid receptor agonist prescribed for maintenance treatment (MMT) in opioid-dependent patients and for pain treatment. Methadone has been demonstrated to be an effective treatment for opioid dependence, reducing illicit opioid abuse, criminality, HIV risks and mortality, and improving social rehabilitation.²¹ It is widely prescribed, with approximately 215’000 opioid-dependent patients and more than 275’000 patients treated for pain in the US,²² and these numbers will probably increase as methadone was introduced onto the World Health Organization (WHO) list of essential medicines in 2005.²³ Methadone is mainly administered as a racemic mixture of (R,S)-methadone even though the (R)-enantiomer accounts for the majority, if not all, of the opioid effect.^24,25

Pharmacokinetics. After oral administration, methadone peak plasma concentration occurs 2.5-4 hours after the dose intake.^26,27 Methadone metabolism is mediated by CYP

CHAPTER 1

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enzymes, and occurs mainly in the liver and the intestine. Its main metabolite, 2-ethylidene- 1,5-dimethyl-3,3-diphenylpyrrolidine (EDDP), is inactive.²⁸ For a given dose, methadone plasma levels can vary extensively between individuals, therefore contributing to a high interindividual variability in response to treatment.²⁹ Therapeutic response was found to be associated with (R)-methadone plasma concentrations at 250 ng/ml and (R,S)-methadone plasma concentrations at 400 ng/ml.³⁰ Interindividual variability of CYP activity accounts for a large part in methadone kinetics and observed plasma levels.²⁹ Various in vivo and in vitro studies have shown the involvement of different CYPs in methadone metabolism.

CYP3A4 is thought to be the main enzyme involved^31-34 with, to a lesser extent, CYP2D6.^29,35,36 Other CYPs like CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19 and CYP1A2 could also be involved in methadone metabolism but their clinical relevance in vivo remains to be demonstrated.29,31,32,34,37,38

Two recent in vitro studies have shown the implication of CYP2B6 in methadone metabolism.^37,38 In one study, the generation of EDDP from methadone was found to be due mainly to CYP2B6, followed by CYP2C19, CYP3A4 contributing equally or less than CYP2C19.³⁷ Interestingly, CYP2B6 preferentially metabolized (S)-methadone, CYP2C19 preferentially metabolized (R)-methadone, while CYP3A4 showed no preference.³⁷ The second study found that human liver microsomal methadone metabolism is catalyzed by both CYP3A4 and CYP2B6.³⁸ In vivo, the involvement of CYP3A4 is mostly suggested by interaction studies with CYP3A4 inducers and/or inhibitors,^29,38,39 with the exception of one study with a limited number of patients (n=32) showing a higher CYP3A4 activity (as measured by the midazolam phenotyping test) in patients receiving high methadone doses, this high activity possibly contributing to the need of high doses.⁴⁰ On the other hand, based on the lack of specificity of inducers and/or inhibitors used in interaction studies, it has been suggested that CYP3A4 plays only a minor role in methadone metabolism in vivo,³⁸ with a predominant role for CYP2B6 and a possible role of intestinal transporters.⁴¹

With regard to other proteins possibly involved in methadone kinetics, methadone has been shown to inhibit the glucuronidation of some drugs,^42-44 but it is not known whether methadone and/or its metabolites are substrates of UDP-glucuronyltransferase (UGT). In particular, UGT2B7 seems to be an interesting isoform to study as it is involved in the glucuronidation of several other opioids.⁴⁵

The interaction of methadone and P-gp has been studied with the use of different in vitro and in vivo models. Most in vitro studies found that methadone is a P-gp substrate and inhibitor,^46-48 with the exception of a transport study on Caco-2 cell monolayers (transwell