Détection de la méthylation du promoteur du gène MGMT dans les tumeurs cérébrales

Correspondances en Onco-Théranostic - Vol. V - n° 3 - juillet-août-septembre 2016 129

F I C H E t e c h n i q u e

- A T G - T C G - G C A -

- A T G - T U ^{G - G} U ^{A -}

- A T G - T T ^{G - G} T ^{A -}

- A T G - T C G - G C A -

- A T G - T C ^{G - G} U ^{A -}

- A T G - T C ^{G - G} T ^{A -}

Me Me

Me

Figure 1. Effet du traitement de l’ADN par le bisulfit e de sodium (il convient de tr aiter 100 à 300 ng d’ADN).

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Intérêt

Les gliomes diffus de l’adulte ont une incidence estimée, en Europe et aux États-Unis, de 4 à 5 pour 100 000. Leur terme évolutif est le glioblastome multi- forme (GBM), tumeur cérébrale primitive la plus fré- quente de l’adulte. En dépit du recours à la chirurgie (leur pouvoir infiltrant rendant la résection complète impossible), à la radiothérapie et à la chimiothérapie, ces tumeurs restent d’évolution fatale, et la récurrence tumorale se manifeste invariablement au niveau de la localisation primaire.

Le traitement standard actuellement préconisé pour un GBM nouvellement diagnostiqué est une résection chirurgicale aussi large que possible, suivie d’une radio- thérapie avec une chimiothérapie concomitante par témozolomide et de 6 cycles de traitement adjuvant, toujours avec du témozolomide (1).

Le témozolomide est un agent alkylant qui ajoute des groupements méthyl sur les bases puriques de l’ADN.

La conséquence de la méthylation sera l’apparition de sites O ⁶ mG:T reconnus par le système de réparation des mésappariements (mismatch repair), engendrant des cassures de l’ADN lors du cycle cellulaire suivant et induisant l’apoptose. L’efficacité du témozolomide est diminuée en présence de l’enzyme de réparation de l’ADN, la MGMT (O6-methylguanine-DNA methyltrans- ferase), spécialisée dans l’élimination des groupements méthyl de la base O ⁶ mG.

Le gène MGMT est localisé en 10q26 et possède une région riche en CpG qui englobe une large partie du promoteur et l’exon 1. Deux régions distinctes, l'une comprenant les CpG25 à 50 et l’autre les CpG73 à 90, sont importantes pour la régulation de l’expression du gène MGMT (2). De nombreuses études ont montré qu’une hyperméthylation du gène MGMT, qui entraîne la perte d’expression de l’enzyme dans la tumeur, est un facteur prédictif de réponse au témozolomide chez les patients atteints d’un glioblastome (3-5). Les patients dont les tumeurs présentent un promoteur de MGMT méthylé répondent beaucoup mieux à la chimiothérapie alkylante et ont une médiane de survie globale significativement augmentée.

Détection de la méthylation du promoteur du gène MGMT dans les tumeurs cérébrales

L. Karayan-Tapon ^{1, 2} , V. Quillien ³

1. Laboratoire de cancérologie biologique, CHU de Poitiers.

2. UMR 1084, Inserm, Poitiers.

3. Département

de biologie, centre de lutte contre le cancer Eugène- Marquis, Rennes.

Indications

Le statut MGMT est actuellement fréquemment utilisé pour stratifier ou sélectionner les patients dans les essais cliniques. Dans la pratique quotidienne, il est prescrit pour guider le choix du traitement des patients de plus de 65-70 ans atteints d’un glioblastome : en l’absence de méthylation, on privilégiera la radio- thérapie seule, alors qu’en présence d’une méthyla- tion, on préférera un traitement par témozolomide (6).

Pour les patients plus jeunes, il n’y a actuellement pas d’alternative au traitement standard de Stupp ; celui-ci est donc prescrit indépendamment du statut de méthylation. La méthylation de MGMT est également un facteur prédictif de réponse aux agents alkylants pour les gliomes de grade III (7), notamment pour les patients ne présentant pas de mutation d’IDH1 (8). Des études complémentaires sont nécessaires afin d’établir l’éventuel intérêt de sa détermination pour ces patients.

Techniques

Le statut de méthylation du promoteur du gène MGMT est mis en évidence sur de l’ADN traité par du bisulfite de sodium. Ce dernier désamine la cytosine en uracile, alors que la cytosine méthylée (5-MeC) est réfractaire au traitement par le bisulfite de sodium. Les cytosines méthylées ne seront donc pas converties en uraciles. Lors de l’amplification par PCR, l’uracile est remplacé par une thymidine, alors que la 5-MeC sera remplacée par une cytosine. Cela permet de faire la distinction entre les îlots CpG méthylés et les îlots CpG non méthylés par la présence d’une cytosine (C) à la place de la thymine (T) (figure 1).

0129_COO 129 22/09/2016 12:30:53

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400 300 200 100 0 -100

E S G T C G T T A G T C A G T T C G T A T C A G T C G T C A Séquence à analyser :

YGTTTTGYGTTTYGAYGTTYGTAGGTTTT

10 15 20 25

5

9 % 12 % 29 % 47 % 31 %

Moyenne de méthylation = 26 % A

Position 1 2 3 4 5

Qualité Validée Validée Validée Validée Validée

Méthylation (%) 9 12 29 47 31

Pas d’alerte

Figure 2. Pyrogrammes de 2 tumeurs, l’une méth ylée (A) , l’autre non méthylée (B) . Il convient de passer dans chaque série d’ analyse un contrôle positif et un c ontrôle négatif.

En bleu : les sites CpG 74 à 78 ; en jaune : le témoin de bisulfitation.

400 300 200 100 0 -100

E S G T C G T T A G T C A G T T C G T A T C A G T C G T C A

10 15 20 25

5

1 % 2 % 2 % 1 % 2 %

Moyenne de méthylation = 2 % B

Séquence à analyser :

YGTTTTGYGTTTYGAYGTTYGTAGGTTTT

Position 1 2 3 4 5

Qualité Validée Validée Validée Validée Validée

Méthylation (%) 1 2 2 1 2

Pas d’alerte

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0130_COO 130 23/09/2016 12:04:30

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L. Karayan-Tapon déclare ne pas avoir de liens d’intérêts en rapport avec cet article.

V. Quillien n’a pas précisé ses éventuels liens d’intérêts.

1. Stupp R, Mason WP, van den Bent MJ et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med 2005;352(10):987-96.

2. Malley DS, Hamoudi RA, Kocialkowski S, Pearson DM, Collins VP, Ichimura K. A distinct region of the MGMT CpG island critical for transcriptional regulation is preferentially methylated in glioblastoma cells and xenografts. Acta Neuropathol 2011;121(5):651-61.

3. Esteller M, Garcia-Foncillas J, Andion E et al. Inactivation of the DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas to alkylating agents. N Engl J Med 2000;343(19):1350-4.

4. Hegi ME, Diserens AC, Gorlia T et al. MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. N Engl J Med 2005;352(10):997-1003.

5. Wick W, Weller M, van den Bent M et al. MGMT testing—the challenges for biomarker-based glioma treatment. Nat Rev Neurol 2014;10(7):372-85.

6. Weller M, van den Bent M, Hopkins K et al. EANO guideline for the diagnosis and treatment of anaplastic gliomas and glioblastoma. Lancet Oncol 2014;15(9):e395-403.

7. Van den Bent MJ, Erdem-Eraslan L, Idbaih A et al. MGMT-STP27 methylation status as pre- dictive marker for response to PCV in anaplastic oligodendrogliomas and oligoastrocytomas.

A report from EORTC study 26951. Clin Cancer Res 2013;19(19):5513-22.

8. Wick W, Meisner C, Hentschel B et al . Prognostic or predictive value of MGMT promoter methylation in gliomas depends on IDH1 mutation. Neurology 2013;81(17):1515-22.

9. Quillien V, Lavenu A, Karayan-Tapon L et al. Comparative assessment of 5 methods (methy- lation-specific polymerase chain reaction, MethyLight, pyrosequencing, methylation-sensitive high-resolution melting, and immunohistochemistry) to analyze O

⁶

-methylguanine-DNA- methyltranferase in a series of 100 glioblastoma patients. Cancer 2012;118(17):4201-11.

10. Quillien V, Lavenu A, Sanson M et al. Outcome-based determination of optimal pyro- sequencing assay for MGMT methylation detection in glioblastoma patients. J Neurooncol 2014;116(3):487-96.

R é f é r e n c e s

Une étude bénéficiant du soutien aux techniques innovantes et coûteuses (STIC), intitulée ECOM, a été réalisée en France afin de valider une technique d’ana- lyse de la MGMT pour la prise en charge des patients atteints d’un glioblastome. Lors d’une première phase rétrospective, 100 échantillons provenant de patients ayant reçu le protocole Stupp ont été testés de manière centralisée par 5 techniques : immunohistochimie, MethyLight, MS-PCR (PCR spécifique de méthylation), pyroséquençage et MS-HRM (fusion à haute résolution spécifique de méthylation). Les meilleures valeurs pré- dictives de la réponse au traitement (survie globale) ont été obtenues pour le pyroséquençage (HR = 0,32 ; p < 0,0001) et la MS-PCR (HR = 0,37 ; p < 0,0001) [9].

Ces 2 techniques ont donc été retenues pour la phase prospective de l’étude, durant laquelle les 8 centres participants ont analysé leurs propres échantillons.

L’étude prospective a permis de confirmer la supé- riorité de la détermination du statut MGMT par pyro- séquençage pour discriminer les patients répondeurs au témozolomide et a également mis en évidence la bonne reproductibilité interlaboratoire du test.

Le pyroséquençage a pour avantage de permettre une quantification précise du degré de méthylation de dif- férents sites CpG. Après bisulfitation de l’ADN tumoral, une PCR est réalisée avec des amorces (une étant bio- tinylée), permettant l’amplification des brins méthylés

et non méthylés. Le produit de PCR est ensuite purifié sur des billes de Sepharose® liées à la streptavidine, puis analysé par pyroséquençage : après fixation d’une amorce de séquençage, les 4 nucléotides sont ajoutés de manière séquentielle, l’incorporation se traduisant par une émission lumineuse proportionnelle à la quan- tité incorporée. Au niveau des îlots CpG, le pourcentage de méthylation est calculé par le rapport de l’émission due à l’incorporation du nucléotide C (brin méthylé) sur l’émission due à l’incorporation du nucléotide T (brin non méthylé). Le résultat est rendu par l’appareil sous forme d’un pyrogramme (figure 2). La société Qiagen propose un kit analysant les CpG 74 à 78 (référence 972032, pour le PyroMark Q96 ; référence 970032, pour le PyroMark Q24).

Est également proposé un kit de type Therascreen® mar- qué CE IVD analysant les CpG 76 à 79. La valeur prédictive moyenne de méthylation des CpG 74 à 78 est une des meilleures pour prédire la réponse au témozolomide chez les patients atteints d’un glioblastome (10).

Il convient de préciser sur le compte-rendu les numéros de chaque CpG ainsi que leur pourcentage de méthy- lation et celui de la moyenne des CpG. L’interprétation des résultats est la suivante :

1. Moyenne inférieure ou égale à 8 % : non méthylé.

2. Moyenne supérieure à 12 % : méthylé.

3. Moyenne entre 9 et 12 % : faiblement méthylé – zone grise.

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