Dosage immunoenzymatique du virus de la mosaique du tabac dans differents tissus de tabac cultives in vitro

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Dosage immunoenzymatique du virus de la mosaique du tabac dans differents tissus de tabac cultives in vitro

Loïc Cardin, D. Salle, Alain Poupet, Michel Ponchet

To cite this version:

Loïc Cardin, D. Salle, Alain Poupet, Michel Ponchet. Dosage immunoenzymatique du virus de la mosaique du tabac dans differents tissus de tabac cultives in vitro. Agronomie, EDP Sciences, 1983, 3 (10), pp.983-988. �hal-02720580�

Dosage immunoenzymatique du virus de la mosaïque

du tabac dans différents tissus de tabac cultivés « in vitro »

Loïc CARDIN, Dominique ^{SALLE Alain POUPET} Michel PONCHET

1. N. R.A. , Station de Botanique ^{et de} Pathologie végétale, 62, boulevard du Cap, ^F 06602 Antibes

RÉSUMÉ Une méthode immunoenzymatique (méthode ^{ELISA de} type sandwich) ^{a été} appliquée ^au dosage du virus de la mosaïque du tabac dans trois types de tissus de tabac (Nicotiana ^{tabacum var. «} Samsun ») ^{infectés et}

cultivés « in vitro » : cals, bourgeons végétatifs ^en multiplication rapide ^et plantules enracinées. Les anticorps

anti-VMT sont couplés ^{avec la} (3D-glucose oxydase : ^la grande stabilité de cette enzyme, peu utilisée

jusqu’alors ^en virologie végétale, permet ^une conservation de longue ^{durée du} conjugué.

Il existe, pour la courbe étalon, ^{une linéarité} entre 7 et 125 ng/ml ^{de virus} purifié, déterminant ainsi la zone de

dosage. ^{Dans nos} conditions, ^la quantité ^minimale d’antigène que l’on peut ^{doser est} de l’ordre de 0,1 (ig de

virus/g de matière fraîche et la reproductibilité des résultats est estimée à 15 p. 100.

La teneur ^en antigène ^{viral est} respectivement ^{20 et 40 fois} plus élevée dans les bourgeons ^{et les} plantules que dans les cals.

Mots clés additionnels : ELISA, ^Nicotiana tabacum, (3D-glucose oxydase.

SUMMARY Immunoenzymatic assay of ^TMV from different ^{« in vitro » cultured} tobacco tissues.

An immunoenzymatic assay (ELISA) has been used to measure the level of virus synthesis ⁱⁿ callus, proliferating vegetative buds and rooted plantlets of tobacco (Nicotiana ^{tabacum var.} Samsun) ^{cultured « in}

vitro » and infected by tobacco mosaic virus.

The enzyme, coupled ^{with TMV} antibodies, ^was (3D-glucose oxidase : its high stability ^{allows a} long ^term

storage ^{of the} conjugate. ^{The tissue extracts were diluted so that the} virus concentration ranged ^{from 7 to}

125 ng/ml (for linear response of standard) and virus levels were estimated by comparison with this standard

curve.

The amount of virus in buds and plantlets ^was respectively ^{20 and 40} times that in callus. This method gave

reproducible ^results (variability less than 15 %), ^was very sensitive (down ^to 0.1 wg virus per gram fresh material is measurable) ; it could be a very helpful ^{tool to} study plant-virus interactions.

Additional key ^{woTds :} ELISA, Nicotiana tabacum, βD-glucose ^oxidase.

1. INTRODUCTION

L’étude de la multiplication virale dans les plantes

infectées

implique ’

^{la mise} en oeuvre d’une méthode de

dosage

^{du virus} simple, rapide, sensible, ^{fiable et}

applicable

à un nombre élevé d’échantillons.

Les méthodes proposées

utilisent

^{soit le} pouvoir ^infec-

tieux du virus (dosage biologique : HOLMES, 1929), ^{soit les} propriétés physico-chimiques ^ou antigéniques ^{de la} parti-

cule virale.

La méthode immunoenzvmatique ^de type « sandwich ^»

(méthode

ELISA ; CLARK & ADAMS,

1977)

réunit les critères précédents. Utilisée dans le

diagnostic

d’un nombre croissant de viroses (BOSSENEC ^& MAURY, 1977 ; DUNEZ, 1977 ; ^{BARBARA et} al., 1978 ; ^{DEVERGNE et} al., 1978...),

elle offre également ^des

possibilités

^de

dosage

^{des virus}

encore peu exploitées

(MEHRAD

^et aL, 1978 ; ^{MARCO &}

C OHEN

, 1979 ; CARDIN, 198! ; ^DEVASHet al., 1982).

L’objet ^{de cet article est de} préciser ^{les conditions}

d’utilisation de cette méthode (sensibilité, gamme de

dosages, précision) pour doser le virus de la mosaïque ^du

tabac dans des tissus de tabac cultivés « in vitro » infectés

par ^ce virus. Ce travail préliminaire s’inscrit dans le cadre d’une étude de la

cinétique

^{de la} synthèse ^{virale en} rapport

avec l’organogenèse.

II. MATÉRIEL ET MÉTHODES

A. Source d’inoculum et matériel végétal

Nous avons utilisé une souche commune du virus de la

mosaïque ^{du tabac} entretenue au laboratoire depuis plu-

sieurs années ; ^un lot de tabacs cultivés en serre (Nicotiana

tabacum var. « Samsun ») ^{est inoculé avec une} suspension

purifiée

^{de virus 25}

vg/ml

(Ricci,

1970).

Les prélèvements ^{de tissus ou} d’organes ^{destinés à être}

cultivés ^« in vitro » sont réalisés 15 j

après

l’inoculation. La

morphogenèse ^{est orientée vers} l’obtention de 3 types ^de matériel végétal :

- bourgeons végétatifs

(B)

^en multiplication rapide,

- plantules (P) enracinées,

- cals indifférenciés (C).

Les masses de microbourgeons

(B)

^{et les} plantules (P)

sont obtenues en utilisant comme explants primaires ^des bourgeons axillaires ; l’induction des cals

(C)

^est réalisée à

partir ^{de tissus} médullaires.

Les mêmes types ^{de tissus sont} cultivés à partir ^{de tabacs}

sains.

La composition ^{des milieux} de culture

spécifiques

^est

indiquée

dans le tableau I.

Les échantillons servant aux mesures proviennent ^de

cultures âgées ^{de 60} j, ayant ^{subi un} repiquage ^{sur chacun}

des 3 milieux de culture précédents.

B. Technique ^de dosage immunoenzymatique ^{du virus}

1. Préparation ^des réactifs

Les anticorps ^{anti-VMT sont} obtenus par immunisation d’un lapin ; l’animal subit une injection intramusculaire _par semaine pendant ^un mois,

puis

^une injection ^de rappel

mensuelle pendant ⁸ mois ; chaque injection contient 1 mg de virus purifié dissous dans 1 ml d’eau distillée additionné de

formaldéhyde

^à 0,4 p. 100, mélangé ^{à un volume} égal d’adjuvant complet ^{de Freund.}

Les immunoglobulines ^sont purifiées par précipitation ^au

sulfate de sodium (18 p. 100) ^à partir de sérum correspon- dant à plusieurs prélèvements ^effectués après ^{le 3emois}

d’immunisation. Leur couplage (5 mg) ^{avec la} !iD-glucose oxydase (10 mg 210

U/mg,

grade ¹ Boehringer) ^{est réalisé à}

l’aide du m-periodate ^{de sodium, selon le} principe ^décrit

pour la peroxydase par ^NAKANE & KAWAOI (1974), (F

ERRUA^et a!., 1980). ^Une chromatographie ^{sur colonne de} Séphacryl S200, équilibrée ^{avec du} tampon phosphate ^de

sodium (0,01 M)-chlorure de sodium

(1

p. 100) permet d’isoler les immunoglobulines marquées. Après ^concentra-

tion par dialyse ^{sous vide et} adjonction de sérum albumine

(10 mg/ml), ^le conjugué ^{est conservé à - 20°C en} présence

de glycérol (50 p. 100) ; ^il peut également être directement

congelé ^sous forme de fractions aliquotes.

Lors de chaque essai, la courbe étalon est établie en

utilisant une suspension ^{de VMT} (1 mg/ml ^{en solution}

aqueuse ⁺ 0,4 p. ¹⁰⁰ formaldéhyde) ; ^on emploie ^une

gamme de dilutions de 7,8 ^{à 250} ng/ml ^{dans le} tampon phosphate-chlorure de sodium-Tween 20 à 0,5 p. 100 (PBS- T) ^contenant 2 p. ^{100 de} polyvinylpyrrolidone (P.M.

25 000, Merck) ^et 0,2 p. 100 de sérum albumine bovine

(fraction

V,

IBF), (pH

ajusté ^à 7,2) ; cependant, ^lors

d’essais préliminaires, ^une gamme de dilutions plus ^étendue

a été utilisée (2 ^{à 500} ng/ml), (fig. 1).

Les échantillons sont obtenus en broyant ¹ g de matière fraîche de chacun des trois types ^{de tissus dans 4 ml de} K

2

HPO, 0,01 ^M pH 7 ; ^on centrifuge à 5 000 g pendant

10 _{mn ;} les surnageants, après ^dilution adéquate ^{dans le} tampon précédent, constituent les extraits bruts à éprouver.

2. Mode opératoire

L’utilisation d’un appareil ^{GILFORD EIA PR 50 assure}

l’automatisation de toutes les opérations. ^Le protocole ^de

base est celui décrit par CLARK & ADAMS, (1977). ^Les

cuvettes en polystyrène (groupes de 5 barrettes contenant 10 alvéoles) ^{sont «} sensibilisées » pendant 16 h par dépôt ^de 0,25 ml par alvéole d’une solution d’immunoglobulines ^anti-

VMT (4

wg/ml)

^{dans un} tampon carbonate-bicarbonate de sodium pH 9,6. ^Les différentes dilutions des extraits sont

immédiatement déposées à raison de 3 répétitions par

dilution, ^{selon un schéma} adopté pour atténuer les

inégali-

tés de réaction des supports. L’incubation de l’antigène, puis ^du conjugué

(dilué

^à

1/1000)

dure 2 h 30 à 37°C. On

pratique

⁴

lavages

^{de 4 s entre}

chaque

opération.

La lecture est effectuée après ^une incubation du substrat de 3 h à 37°C, ^{de sorte} que la concentration la plus ^{élevée en}

virus

purifié

(250

ng/ml)

fournisse, ^{dans nos conditions}

expérimentales,

^{une densité} optique voisine de 1,8.

3. Mesures

La courbe étalon est tracée en utilisant la moyenne des densités optiques

(D.O.)

relatives à chaque concentration de la

suspension purifiée

(3

répétitions).

^{Il en est de même}

pour

les courbes afférentes aux 3 types d’extraits à éprou-

*

Dilutions conservées en fonction de la zone de dosage ^{et du} parallélisme ^{avec la droite de} régression (R) ^{de la courbe étalon.}

ver ; dès lors, ^{il est} possible, ^à partir de la D.O. mesurée pour chaque dilution d’un extrait, ^d’estimer graphiquement

sa concentration en antigène ^{viral, en se} référant à la courbe étalon. Il est cependant plus avantageux d’établir la droite de régression relative à la courbe étalon afin, ^d’une part, d’obtenir des résultats plus précis, ^d’autre part, de comparer les résultats de différents essais

compte

^tenu des caractéristi- ques de ^cette droite

(pente,

ordonnée à l’origine).

III. RÉSULTATS

Les résultats du dosage

immunoenzymatique

^{du virus}

dans les 3 types de tissus de tabac, relatifs à un essai, ^sont indiqués dans les tableaux 2, ^{3 et 4. La teneur} moyenne ^en

antigène ^{viral des} plantules, bourgeons ^et cals, ^est respecti-

vement de 4,60, 2,30 ^et 0,12

mg/g

de matière fraîche.

La représentation graphique de la courbe étalon et des courbes de dilution des extraits à éprouver apparaît ^{dans la} figure ^{1. Les} points correspondants ^{aux valeurs} 7,8 ; 15,6 ;,

31,2 ; 62,5 ^{et 125} ng/ml de la courbe étalon sont alignés. ^En deçà ^et au-delà de cette portion de droite la courbe s’infléchit pour former ^{un «} plateau ^».

Nous avons effectué les dosages ^{dans la} partie ^centrale

des courbes de dilution des extraits expérimentaux

(courbes

P, B, C) ^{où la} pente ^est voisine de celle de la courbe étalon.

La reproductibilité d’un essai est estimée à l’aide du coefficient de variation, ^{calculé à} partir des valeurs pondé-

rales (6

répétitions)

^fournies

après

conversion des densités

optiques, grâce à la courbe étalon, ^{ce dernier est} inférieur à 15 p. 100 pour la

portion

de la courbe

comprise

^entre 7,8 ^et 62,5

ng/mI.

La reproductibilité inter-essai est appréciée ^{en dosant le}

virus dans le même extrait à 4 dates différentes

(tabl. 5) ;

dans nos conditions, ^le coefficient de variation est

égale-

ment de l’ordre de 15 p. 100. Nous avons vérifié à cette

occasion que les droites de régression des courbes standard

représentaient

^une pente pratiquement

identique.

Enfin,

l’incorporation

^{de masses} croissantes de cal sain lors du broyage de cal infecté a permis ^de déterminer la limite du dosage qui ^est de l’ordre de 0,1 vg d’antigène/g ^de

matière fraîche.

IV. DISCUSSION - CONCLUSION

Les résultats obtenus suggèrent quelques observations.

Les valeurs absolues de la concentration en virus dans les 3 types de tissus de tabac confirment les résultats antérieurs de nombreux auteurs : dans les cals, ^{on note une faible}

teneur en virus (AUGIER ^DE MONTGREMIER & MOREL, 1948 ; ^{HIRTH &} DURR, 1970 ; SVOBODOVA, 1971) ; ^{dans les} plantules enracinées, la concentration en virus (4-5 mg/g ^de

matière

fraîche)

^est du même ordre que celle observée dans les feuilles de tabac infecté cultivé en serre (MAIA et ^al., 1976) ; ^{dans les} bourgeons ^en multiplication rapide, ^on

remarque ^{une teneur} intermédiaire

(2-3 mg/g

de matière

fraîche) que l’on peut ^{sans doute} attribuer à un état

« juvénile ^{» de} type ^« pseudo-méristématique » des tissus

(L

IMASSET^et al.,

1949).

Nous avons indiqué que la courbe étalon, ainsi que les courbes relatives ^aux extraits à éprouver, comprenaient

dans leurs parties ^{extrêmes une} modification de pente

(fig. 1).

^{Il en résulte une}

imprécision

croissante des mesu-

res, à cause de la non-proportionnalité ^entre les valeurs de la D.O. et les concentrations correspondantes ; ^{en consé-}

quence, seule la partie linéaire doit être conservée pour le

dosage. ^{Dans notre} modèle, ^{cette zone est} comprise ^{entre 7}

et 125

ng/ml ;

^utilisant la méthode ELISA de type indirect, DEVASH et al.

(1982)

indiquent ^{une linéarité entre 2 et}

200

ng/ml.

Les tableaux 2, ^{3 et 4 montrent en} effet que 2 à 4 dilutions conduisent à des valeurs de concentrations très proches,

alors que, pour les autres, les valeurs calculées divergent, ^en plus ^{ou en} moins, ^{très nettement.}

Il est donc nécessaire de réaliser plusieurs dilutions d’un extrait de façon ^{à se} placer ^{dans la zone} appropriée ^au dosage ^et de vérifier le parallélisme ^{entre les} courbes des extraits et la courbe étalon.

En outre, la méthode immunoenzymatique ^{ELISA, de}

même que ^toute technique imrnunologique, permet ^seule-

ment de doser l’antigène ^viral présent ^{dans l’extrait} éprouvé, ^sans

préjuger

^du

pouvoir

infectieux de celui-ci.

Ainsi, ^{LOEBENSTEIN & GERA} (1981), ^{dans une étude}

concernant un inhibiteur de la

replication

^{du VMT} présent

dans des protoplastes ^de tabac, indiquent ^une inhibition de 60 p. 100 ^ou de 70 à 80 p. 100 selon

qu’elle

^est mesurée par

une méthode biologique ^ou par la méthode ELISA. Compte

tenu de cette réserve et des limites

indiquées précédemment

dans la

pratique

^du dosage, la facilité d’exécution et la

rapidité

d’acquisition

^des résultats constituent des argu- ments notables en faveur de cette méthode, ^notamment lorsqu’il s’agit d’éprouver ^un nombre élevé d’échantillons.

De plus, ^la possibilité ^{de mesurer} de faibles teneurs en

antigène viral, ^{alliée à une}

reproductibilité acceptable,

^en

fait une méthode de choix dans une étude de la

cinétique

^de

la multiplication ^virale. L’usage ^{de la} j3D-glucose oxydase présente l’intérêt de la grande ^{stabilité de cette} enzyme qui permet ^la préparation ^de conjugués utilisables pendant ^un laps ^de temps

important (plus

^de

2 ans),

^sans perte d’activité.

Enfin, le fait que dans les

plantules

entières enracinées cultivées ^« in vitro », la teneur en virus soit voisine de celle observée dans les tabacs cultivés en serre permet ^d’envisa- ger ^une détection très précoce ^de l’infection virale

(KONATE

et al.,

1982).

^Par contre, ^{celle-ci est} plus aléatoire lors du processus de

propagation

^par bourgeonnement ^axillaire.

Reçu le 13 décembre 1982.

Accepté le ¹⁸ juin ^1983.

REMERCIEMENTS

Nous tenons à remercier Monsieur le Professeur R. MASSEYEFF, Messieurs B. FExRU.a et G. PE’rrnzzi (Laboratoire d’Immunologie,

CHU de Nice) pour leur aide ^et leurs conseils.

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