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multiple
Alexey Brodoline, Nithin Rawat, Daniel Alexandre, Nicolas Cubedo, Michel
Gross
To cite this version:
Alexey Brodoline, Nithin Rawat, Daniel Alexandre, Nicolas Cubedo, Michel Gross. Imagerie 4D de la circulation sanguine chez la larve du poisson-zèbre par holographie numérique en illumination multiple. HOLOPHI5: 5ème rencontre francophone d’holographie numérique appliquée à la métrologie des fluides, Nov 2018, Montpellier, France. �hal-01927531�
Imagerie 4D de la circulation sanguine chez la larve du
poisson-zèbre par holographie numérique en illumination
multiple
Alexey Brodoline1 , Nithin Rawat1, Daniel Alexandre1, Nicolas Cubedo2, Michel Gross1 1 Laboratoire Charles Coulomb (L2C), Univ Montpellier, CNRS, Montpellier, France. 2 Mécanismes Moléculaires dans les Démences Neurodégénératives (MMDN), Univ
Montpellier, INSERM, Montpellier, France.
alexey.brodoline@umontpellier.fr, daniel.alexandre@umontpellier.fr, michel.gross@umontpellier.fr
MOTS CLÉS
Digital holographic Microscopy (DHM), multi illuminations imagerie 3D
RESUME
Une configuration de microscopie holographique qui utilise trois faisceaux d'illumination est
proposée. Elle permet d'imager en 3D la positions des globules rouges en mouvement à partir
d'un hologramme, ainsi que la structure 3D des vaisseaux sanguins perfusé à partir d'une
séquence d'hologrammes.
I. INTRODUCTION
Les techniques d'imagerie du flux sanguin des microvaisseaux sont largement utilisées
pour la recherche biomédicale et le diagnostic clinique. Cependant, la plupart des techniques
existantes sont invasives, car elles requièrent des agents de contraste. Les développements
récents des techniques d'holographie numérique et d'holographie laser Doppler permettent de
réduire ce problème. [1]. Il est également possible d'utiliser l'holographie laser Doppler dans
une géométrie de microscopie en transmission [2].
Nous proposons ici d'aller plus loin en effectuant une holographie laser Doppler en
transmission du flux sanguin, qui utilise trois faisceaux d'illumination orientés dans deux
directions différentes. Le dispositif proposé permet alors d'améliorer la résolution suivant z.
En effet, en sélectionnant numériquement les signaux correspondant à chacun des faisceaux
d'illumination, nous avons pu obtenir trois hologrammes à partir desquels nous avons pu
calculer, pour chaque illumination la carte 3D décrivant l'intensité du champ en tout point
(x,y,z). Les points correspondant aux maxima des produits des intensités des 3 cartes ont été
sélectionnés en utilisant un algorithme type "cleaning". Nous ainsi obtenu une carte 3D des
maxima que nous avons identifié aux diffuseurs en mouvement, c'est-à-dire aux globules
rouges. Cette procédure a été répétée pour chaque pas en temps t et a permis d'obtenir une
reconstruction 4D (x,y,z et t) des globules rouges en mouvement.
La technique a été validée en imageant la micro circulation sanguine des embryons de
poisson zèbre.
II. MATERIELS ET METHODES
Figure .1 (a: partie gauche) Dispositif de microscopie holographique avec une triple illumination de
l’objet. Les trois voies sont maintenues à des intensités égales avec un filtre à densité neutre ND. (b: partie droite) Transformée de Fourier d’un hologramme obtenu avec le dispositif à trois illuminations. Les ordres 0, +1 et 1 sont séparés grâce à la configuration hors-axe. L’interférence mutuelle entre les trois faisceaux d’illumination (E1;E2;E3) est à l’origine d’un ordre 0 très étendu spatialement. Si le hors-axe n’est pas suffisant les ordres croisés peuvent se chevaucher avec l’ordre +1. L’échantillon est de la poudre de lait diluée dans l’eau.
Le dispositif expérimental (voir Fig. 1 (a) est constitué d'un microscope droit, qui a été
modifié pour le transformé en dispositif de microscopie holographique. Le faisceau laser
principal est divisé par un séparateur de faisceau en deux bras (illumination et référence). Le
bras d'illumination (de champ E) est divisé à nouveau en trois faisceaux de manière à éclairer
l'échantillon suivant 3 directions différentes. L'échantillon imagé est un embryon de poisson
zèbre (48 HPF) placé entre lame et lamelle. Les trois faisceaux d'illumination traversent
l'échantillon et sont collectés par un objectif de microscope MO (d'ouverture numérique NA =
0.50 et de grandissement G = 20), comme le montre la Fig. 1 (b). Un second séparateur de
faisceau recombine le champ E, issu de l'échantillon, avec le champ de référence E
LO. Ce
second séparateur de faisceau est incliné angulairement de manière à réaliser une holographie
hors axe. La caméra (2560 x 2160 pixels;
CAM=50 Hz; 12 bits ou 1280 x 1024;
CAM=200
Hz; 10 bits suivant les cas) enregistre le motif d'interférence I = |E+E
LO|
2. La camera
enregistre des séquences de ~256 images I
navec n=0 à 255.
Les données enregistrées sont placées sur une grille de calcul plus grande (2560x2560
ou 1280 x 1280) initialement vide (zéro padding). Pour sélectionner le signal correspondant à
chaque illumination, nous avons reconstruit le champ dans le plan focal arrière de l'objectif
MO (plan de la pupille). Pour imager, lors des réglages, la lumière diffusée par tout
l'échantillon, la reconstruction est réalisée à partir d'hologrammes impliquant des différences
d'images, qui donnent H=0 si lorsque les images succesives sont identiques (par exemple H=
I
0+I
1-I
2-I
3).
A partir des hologrammes H, nous avons calculé le champ dans le plan de la pupille de
MO. L'image de la pupille est située en haut à gauche de la grille de calcul de poisson zèbre
(voir Fig 1 b). On observe 3 points lumineux qui correspondent aux pattern d'interférence des
Figure 2 – Quelques étapes de reconstruction dans le cas de l’illumination à trois faisceaux.
(a) Transformée de Fourier de l’hologramme. (b) Sélection de l’ordre +1. (c) Sélection des 3 illuminations. (b) Image reconstruite dans le plan objet conjugué de la caméra.
3 illuminations. Etant donné que ces 3 points lumineux sont bien séparés dans l'espace de
Fourier, il possible de séparer la contribution de chaque illumination en sélectionnant 3 zones
centrés sur chacun des points lumineux comme cela est illustré par la Fig.2. Ces zones sont
des hologrammes qui peuvent servir à reconstruire le champ de l'objet. Ils correspondent aux
zones rouge, verte et bleue de la fig.2 c. La reconstruction holographique est alors faite à
partir des hologrammes correspondant à chacune de ces 3 zones (rouge, verte et bleue). La
figure 2d montre par exemple
l'image reconstruite dans le plan objet conjugué de la caméra pour les 3 hologrammes.La reconstruction 3D de la position des globules rouges en mouvement est alors faite par un algorithme de type cleaning. A chaque itération nous effectuons, pour chacun des 3 hologrammes (rouge vert et bleu de la Fig 2c), 3 series de reconstructions pour tous les plans z qui entourent l'échantillon. Nous sélectionnons ensuite, dans les 3 cubes de données reconstruites, les points où le produit des 3 intensités est maximum. Les points sélectionnés sont sauvegardé dans un cube de données de résultats. A chaque itération, la contribution des points sélectionnés est enlevé des 3 hologrammes rouge vert et bleu, qui ont servi à faire la reconstruction dans tous les plans. L'hologramme est ainsi nettoyé, d'où le nom de cleaning pour l'algorithme de reconstruction. Ainsi, à chaque itération, l'énergie des trois hologrammes diminue alors que le cube de donné de résultats se rempli. Lorsqu'il ne reste plus que ~20% de l'énergie de départ dans les 3 hologrammes, les calculs sont arrétés.
Figure 3 – Image 3D de la position des globules rouges obtenue par l'algorithme de nettoyage à partir
La figure 3 montre une image 3D des globules rouges qui a été obtenue par l'algorithme de nettoyage à partir d'un seul hologramme. En effectuant la reconstruction 3D de cleaning avec une série d'images et d'hologramme et en sommant des images 3D d'intensité on peut obtenir l'image 3D des vaisseaux sanguins perfusés. La figure 4 montre un exemple d'image 3D obtenues ainsi.
Figure4 – Poisson-zèbre de 5 jours. Images réalisées avec la triple illumination et la caméra
Andor de 2560x2160 pixels. (a,b) Deux points de vue différents, (c) vue transversale. La visualisation 3D est faite avec ImageJ (plugin 3D Viewer).
CONCLUSIONS
Nous proposons une technique qui combine holographie numérique, microscopie en
transmission, triple illumination de l'échantillon et reconstruction par un algorithme de type
“Cleaning”. Cette technique nous a permis d'imager en 3D la positions des globules rouges en
mouvement à partir d'un hologramme, ainsi que la structure 3D des vaisseaux sanguins
perfusé à partir d'une séquence d'hologrammes.
REMERCIEMENTS
Nous remercions le Labex Numev (convention ANR-10-LABX-20) n. 2014-1-042 et le
CNRS (Micro Holo 4D, Défi Instrumentation aux limites 2018, CNRS) pour le financement
de ce travail.
RÉFÉRENCES
[1.] O. Sakurada, C. Kennedy, J. Jehle, J. Brown, G. L. Carbin, and L. Sokoloff, “Measurement of local cerebral blood flow with iodo [14c] antipyrine,” American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology 234, H59–H66 (1978).
[2.] M. Atlan, M. Gross, B. C. Forget, T. Vitalis, A. Rancillac, and A. K. Dunn, “Frequency-domain wide-field laser doppler in vivo imaging,” Optics letters 31, 2762–2764 (2006).
[3.] N. Verrier, D. Alexandre, and M. Gross, “Laser doppler holographic microscopy in transmission: application to fish embryo imaging,” Optics express 22, 9368–9379 (2014).
[4.] F. Le Clerc, L. Collot, and M. Gross, “Numerical heterodyne holography with two-dimensional photodetector arrays,” Optics letters 25, 716–718 (2000).
with dually oriented illumination beams,” in “Digital Holography and Three-Dimensional Imaging,” (Optical Society of America, 2015), pp. DTh2A–6.
[6.] M. Gross, N. Verrier, and P. Picart, “Fish embryo multimodal imaging by laser doppler digital holography,” in “Signal Recovery and Synthesis,” (Optical Society of America, 2014), pp. JTu4A–7.
[7.] D. Donnarumma, A. Brodoline, D. Alexandre, and M. Gross, “Blood flow imaging in zebrafish by laser doppler digital holography,” (2016). Manuscript submitted for publication.
[1] Zwick, S. A., & Plesset, M. S. (1954). On the dynamics of small vapor bubbles in liquid. J. Math. Phys, 33, 308-330.
