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Submitted on 6 Jun 2020
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Développement d’un nouveau procédé de production d’actifs pharmaceutiques à partir de plantes
médicinales : la technologie des plantes à traire
Frederic Bourgaud, Benoit Mignard, Paul Hannewald, Jean-Marc Laine, Eric Gontier, Jean-Paul Fevre
To cite this version:
Frederic Bourgaud, Benoit Mignard, Paul Hannewald, Jean-Marc Laine, Eric Gontier, et al..
Développement d’un nouveau procédé de production d’actifs pharmaceutiques à partir de plantes médicinales : la technologie des plantes à traire. Les Rencontres du Végétal, Jan 2013, Angers, France.
�hal-02811231�
Prof. F. Bourgaud
Dir. Laboratoire Agronomie et Environnement (UMR INRA – Univ. de Lorraine) VP Recherche Plant Advanced Technologies PAT
frederic.bourgaud@plantadvanced.com
Plantes médicaments
Plantes à traire
Métabolisme secondaire des végétaux
Métabolisme primaire = métabolisme de base
Métabolisme secondaire = métabolisme de l’adaptation Réponse/tolérance aux stress biotiques ou abiotiques
Polyphénols
- Flavonoïdes
- Stilbènes
Terpènes
- Composés à HE
- Caroténoïdes
Alcaloïdes
- Indoliques
- Tropaniques
Les plantes comme sources de médicaments
3
Vinblastine
Taxol
Camptothécine Catharanthus roseus
Taxus baccata
Camptotheca acuminata
Quelle ressource végétale pour répondre
aux besoins en ingrédients actifs végétaux ?
Des plantes facilement disponibles
Biodiversité végétale concentrée dans les zones équatoriales
Comment rationaliser l’approvisionnement ?
Technologie des bioréacteurs de cellules végétales
Des succès (Taxol® BMS-Phyton) mais d’une portée limitée
Réacteurs (Protalix)
4
Une matière végétale fortement titrée en principes actifs La teneur en M2 résulte d’une interaction complexe G x E
Cultures/récoltes conventionnelles
Ruta graveolens
0%
25%
50%
75%
100%
root stem leaf fruit
furanocoumarins %
Compartment
psoralen xanthotoxin isopimpinellin bergapten
O O O
OCH3 OCH3
O O O
OCH3
O O O O O O
OCH3
Milesi et al., Plant Sci. 161 (2001) 189-199
Spécifique aux racines
Plantes de 6 mois :
3.8 mg (+/- 1.7 mg) de furanocoumarines Exsudé par les racines en 24h
Gontier et al., Plant Sci. 163 (2002) 723-732 Plants de 3 ans :
0.20 mg (+/- 0.16 mg) de paclitaxel Exsudé par les racines en 24h
Cultures hydroponiques
Plantes de 2 mois:
0.7 mg (+/- 0.17 mg) d’alcaloïdes tropaniques Exsudé par les racines en 24h
Ruta graveolens Taxus baccata Datura innoxia
Après permeabilisation
4.5 mg (+/- 1.2 mg) de furanocoumarines Exsudé par les racines en 24h
2.1 mg (+/- 1.0 mg) de paclitaxel Exsudé par les racines en 24h
5.0 mg (+/- 1.5 mg) d’alcaloïdes tropaniques Exsudé par les racines en 24h
Observations de laboratoire
Alcaloïdes tropaniques de Datura
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Alcaloïdes par plante (mg/plant)
Alcaloïdes dans le milieu (mg) Alcaloïdes dans la plante (mg)
6
Amélioration du rendement en métabolites secondaires
Composante Génétique
7
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 1,00
A B C D E
Teneur en dérivé d’acide caféique (mg/g MS de racine)
Variétés, plante X
a a
b b
c
Variabilité intra-spécifique
Amélioration du rendement en métabolites secondaires
8
Composante Environnement
Nutrition
Le Bot et al., J Exp Bot 2009
Facteurs abiotiques
Suivi de l’expression de l’orf c2’h Vialart et al., Plant J 2012
Facteurs biotiques
Larbat et al., JBC 2007 Ajout d’éliciteurs (Pmg)
PAT plantes à traire ®
Un nouveau procédé de production d’actifs naturels à partir de végétaux
Brevet WO0133942 9
Société & objectifs
10
Objectifs:
Développer des plateformes végétales innovantes Produire des molécules naturelles rares à destination des marchés cosmétiques et pharmaceutique Préserver et valoriser les ressources végétales• Récompensée : Concours du Ministère de la Recherche, tremplin
Entreprise (Sénat-ESSEC), Lauréat 2006 Prix Pierre Potier « L'innovation en chimie au bénéfice de l'environnement »
•
Société créée en 2005 à Nancy - France (essaimage de l’INPL-ENSAIA/INRA)•
Cotée sur NYSE Euronext depuis juillet 2009•
Aujourd’hui composée de 25 personnes11 Solvent
Cuve d’exsudation Culture
Culture ExudationExudation
Choix des espèces Choix des espèces
Ingrédient actif
Ingrédient actif
Stimulation Stimulation Développement
des plantesCulture aéroponique Tablettes
mobiles
Système d’irrigation
Eliciteur, precurseur, optimisation des conditions de culture
Recyclage des plantes pour un nouveau cycle de
production (3 à 8 /an)
Procédé PAT Plantes A Traire ®
12
0,125
0,25
0,75
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
récolte traditionnelle*
récolte après optimisation*
PAT
Rendement en polyphénols (g/m²/an)
PAT plantes à traire ® : Exemples de rendements
Dans ces conditions de rendement
1000m² de production = 6000 m² en champ ! Acide gallique et dérivés
x2
x3 x6
par élicitation
13
0,06
0,15
0,45
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5
récolte traditionnelle*
récolte après optimisation*
PAT
Rendement en alcaloïdes (g/m²/an)
PAT plantes à traire ® : Exemples de rendements
Dans ces conditions de rendement
1000m² de production = 7500m² en champ ! Scopolamine et apparentés
x2,5
x7,5 x3 Datura innoxia
par ajout de précurseurs phenylalanine et ornithine
14
0,02 0,6
3
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
récolte traditionnelle*
récolte après optimisation*
PAT
Rendement en dérivés d'acide caféique (g/m²/an)
PAT plantes à traire ® : Exemples de rendements
Dans ces conditions de rendement : 1000m² de production = 15 ha en champ !
x30
x5 x150
Acide chlorogénique et dérivés
par optimisation du milieu nutritif
PAT plantes à traire ®
Avantages
15
Procédé écologique : préservation des plantes et production durable
Accès à des composés à haute valeur ajoutée issus de plantes rares ou difficiles à cultiver (>200 espèces)
Haut rendement par la stimulation
La racine est la partie la plus riche de la plante et la moins étudiée
Accès au profil phyto-chimique unique et meilleure pureté
Echelle de production facile et rapide à adapter Sécurité d’approvisionnement
Processus de production (4000m² de serre instrumentée en 2012) incluant le management de la qualité selon ISO9001
Une opportunité pour produire ou revisiter des « hits » issus de végétaux
Nouvelles approches : ingénierie métabolique
D’après Aharoniet al., 2006, Trends in Plant Sci.
Consortium européen Smartcell (FP7)
16
Synthèse de monoterpènes chez le tabac (Projet EU SMARTCELL)
O P
O
O-
O P
O O- O-
Geranyl diphosphate
OH
Geraniol
OH
OH
10 hydroxy-geraniol
Geraniol synthase (Veronica officinalis)
Geraniol 10 hydroxylase (Arabidopsis / Catharanthus) P450 reductase (Arabidopsis)
Néosynthèse de monoterpènes chez le tabac
N
N H
H3C H3CO
CH3
O O
CH3 OH H O
OCH3 N
NH
O OCH3
CH3 OH
17
Nouvelles approches : ingénierie métabolique
Production de protéines recombinantes par des végétaux
Procaryotes
• Bactéries
Eucaryotes
• Levures
• Cellules animales
Cellules de hamster (CHO)
Cellules d’insectes (baculovirus)
• Plantes
18
Quelles plantes modèles chez PAT pour la production de protéines thérapeutiques ?
19
PAT Vendredi ®
Un nouveau système d’expression
pour la production de protéines recombinantes végétales
Patent WO/2008/040599 20
Le modèle Drosera
Le modèle Nepenthes
Technologie PAT Friday®
21
Tests GUS
Preuve de concept PAT Friday®
22
Interferon Y humain
Drosera Protéines humaines
recombinantes
Facteur intrinsèque de Castle humain
Témoin FI Plante
transformée Plante témoin
WT Plante témoin
WT
Plantes transformées
Témoin IFN Y
Modèle Nepenthes
Production des premières protéines recombinantes PAT Friday®
23
Récolte aisée
Purification & downstream process simplifiés
Stérilité possible
Montée en echelle facile Activité Protease controlée
PAT Friday
®Avantages
24
Merci de votre attention
Remerciements à tous nos collaborateurs :
Dr. Flore Biteau Sissi Miguel Benoit Mignard Jean-Marc Lainé Dr. Paul Hannewald Estelle Muller
Cindy Michel Jean-Paul Fèvre Dr. Alain Hehn Prof. E. Gontier Alain Clément Prof. Guckert
Audray Dugrand 25
Comparaison des systèmes d’expression hétérologue
Sécurité sanitaire Maturation des protéines
Immunogenicité Sécurité
technologique (confinement)
Coût
économique
E. Coli Pyrogénicité (endotoxines)
NON NON OUI €€€
Levure Pyrogenicité
(endotoxines)
OUI OUI OUI €€€
CHO Risques
théoriques liés aux maladies (prions, virus) , ADN oncogénique
OUI NON OUI €€€€€€
Cellules végétales en réacteur
Pas de risques théoriques
OUI OUI parfois OUI €€€
Plantes entières Pas de risques théoriques
OUI Oui parfois OUI si serres
NON si plein champ
€
27
Expression de GFP
Drosera Gènes marqueurs
(GFP et GUS)
Trichome
Papier filtre avec des taches fluorescentes
Preuve de concept PAT Friday®
28
Marqueur de poids (KDa) Fluid e issu de N. rafflesiana Fluid from N. ventricosa Fluide issu de N. alata
20 26 34 47 12086
20 26 34 47 12086
20 26 34 47 12086
34
SDS-Page sur des fluides de feuilles de Nepenthes pitcher
PURIFICATION facilitée (sterilité possible)
Marqueur de poids (KDa)
Etude des protéines foliaires de Népenthes
29
30
Zymogramme
pH5
Fluide d’urne fermée
Fluide d’urne ouverte
Zymogramme
pH7
Fluide d’urne fermée
Fluide d’urne ouverte
Zymogramme,
pH3
Fuilde d’urne fermée
Fluid d’urne ouverte
Nepenthacine
Zymogramme
Gel + Gelatine +
pH 3 / 5 / 7 à 37 ° C pendant 12H
Evaluation de l’activité protéase chez Nepenthes
31
