Disponible à / Available at permalink :

288  Download (0)

Texte intégral

(1)

- - -

- - -

Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Duchateau, J. (1981). Effets du zinc sur la réponse immunitaire chez l'homme: signification du rôle de la transferrine à l'échelon lymphocytaire (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.

Disponible à / Available at permalink : https://dipot.ulb.ac.be/dspace/bitstream/2013/213997/1/774b8cf4-842c-408a-a9c8-9c9aa668f609.txt

(English version below)

Cette thèse de doctorat a été numérisée par l’Université libre de Bruxelles. L’auteur qui s’opposerait à sa mise en ligne dans DI-fusion est invité à prendre contact avec l’Université (di-fusion@ulb.ac.be).

Dans le cas où une version électronique native de la thèse existe, l’Université ne peut garantir que la présente version numérisée soit identique à la version électronique native, ni qu’elle soit la version officielle définitive de la thèse.

DI-fusion, le Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles, recueille la production scientifique de l’Université, mise à disposition en libre accès autant que possible. Les œuvres accessibles dans DI-fusion sont protégées par la législation belge relative aux droits d'auteur et aux droits voisins. Toute personne peut, sans avoir à demander l’autorisation de l’auteur ou de l’ayant-droit, à des fins d’usage privé ou à des fins d’illustration de l’enseignement ou de recherche scientifique, dans la mesure justifiée par le but non lucratif poursuivi, lire, télécharger ou reproduire sur papier ou sur tout autre support, les articles ou des fragments d’autres œuvres, disponibles dans DI-fusion, pour autant que :

Le nom des auteurs, le titre et la référence bibliographique complète soient cités;

L’identifiant unique attribué aux métadonnées dans DI-fusion (permalink) soit indiqué;

Le contenu ne soit pas modifié.

L’œuvre ne peut être stockée dans une autre base de données dans le but d’y donner accès ; l’identifiant unique (permalink) indiqué ci-dessus doit toujours être utilisé pour donner accès à l’œuvre. Toute autre utilisation non mentionnée ci-dessus nécessite l’autorisation de l’auteur de l’œuvre ou de l’ayant droit.

--- English Version ---

This Ph.D. thesis has been digitized by Université libre de Bruxelles. The author who would disagree on its online availability in DI-fusion is invited to contact the University (di-fusion@ulb.ac.be).

If a native electronic version of the thesis exists, the University can guarantee neither that the present digitized version is identical to the native electronic version, nor that it is the definitive official version of the thesis.

DI-fusion is the Institutional Repository of Université libre de Bruxelles; it collects the research output of the University, available on open access as much as possible. The works included in DI-fusion are protected by the Belgian legislation relating to authors’ rights and neighbouring rights.

Any user may, without prior permission from the authors or copyright owners, for private usage or for educational or scientific research purposes, to the extent justified by the non-profit activity, read, download or reproduce on paper or on any other media, the articles or fragments of other works, available in DI-fusion, provided:

The authors, title and full bibliographic details are credited in any copy;

The unique identifier (permalink) for the original metadata page in DI-fusion is indicated;

The content is not changed in any way.

It is not permitted to store the work in another database in order to provide access to it; the unique identifier (permalink) indicated above must always be used to provide access to the work. Any other use not mentioned above requires the authors’ or copyright owners’ permission.

(2)

- HOPITAL UNIVERSITAIRE SAINT-PIERRE Service d'immunologie et de Transfusion

EFFETS DU ZINC SUR LA REPONSE

IMMUNITAIRE CHEZ L'HOMME : SIGNIFICATION DU ROLE DE LA TRANSFERRINE A

L'ECHELON LYMPHOCYTAIRE

Travail présenté en vue de l'obtention du titre d Agrégé de l’Enseignement Supérieur

1981

(3)

In vitro imago, in vivo veritas

A Macha, Philippe et Michel

(4)

Je tiens de mon père la curiosité, le goût de l'expérimentation et le désir de soigner, et de ma mère l'optimisme et la persévérance. Je les remercie profondément de ce qu'ils m'ont donné et permis, et continuent encore à faire pour moi.

Ma formation médicale a bénéficié d'un large concours de grands talents.

Je dois particulièrement aux Professeurs P.A. BA5TENIE et P. DUSTIN la découverte qu'il existe un ordre derrière le chaos des plaintes, que l'observation et l'écoute du patient sont primordiales et que le charme de la nouveauté d'un concept ou d'une pratique ne peut les rendre

acceptable qu'à la condition d'être fondés sur l'expérience et la raison.

Le Professeur H. TAGNON m'a gagné de sa foi dans les progrès de la con­

naissance scientifique et l'esprit d'équipe, et m'a montré que la soli­

darité avec les malades n'est pas une attitude passive.

J'ai toujours l'avantage de recevoir du Professeur A. DE C05TER le très vivant exemple du sens clinique aigu au service d'une connaissance irrem­

plaçable qui lui fait si souvent précéder les autres moyens diagnostiques.

J'ai eu la chance exceptionnelle de pouvoir travailler depuis 11 ans avec le Docteur G. DELESPESSE qui a bien voulu diriger ce travail. Il m'a fait découvrir l'immunologie en lui donnant des horizons insoupçonnés.

Il m'a enseigné, outre mon métier de médecin et de chercheur, une attitude

morale qui fonde le comportement sur le respect de la personne, la joie

de donner et l'aptitude à recevoir, une très grande dignité et le fait

qu'une idée si belle ou si grande qu'elle soit n'est qu'un rêve de fumée,

si elle ne se traduit pas en actes.

(5)

Travailleur infatigable, il m'a guidé en mettant de la lumière et du coeur là où on n'en trouve plus ou pas encore. Qu'il veuille bien recevoir ici le témoignage de ma plus profonde gratitude et admiration.

J'ai été très touché de la confiance et de la collaboration généreuse de tant de patient, collègues, collaborateurs, amis et connaissances qui se sont prêtés si volontiers aux études in vivo en subissant les examens et les traitements que je leur ai demandé. Je les en remercie très vivement.

Je remercie aussi le Professeur L. MOLLE pour son accueil chaleureux, ses remarques et son intérêt ainsi que pour les dosages de zinc et cuivre sériques réalisés dans son laboratoire, ainsi que le Docteur Ph. 5MET5 pour ses conseils statistiques.

Mes collègues, les Docteurs CARPENTIER, DRUART, GAUSSET, GOYENS et CLUMECK, m'ont apporté un concours occasionnel qui fut très précieux, ainsi que le Docteur VREYEN5, Monsieur Jacques DE KOSTER et Madame Danièle MAJERUS, pharmacienne à la Banque de Sang.

J'ai pu mener les investigations in vitro grâce aux aides très compétentes et au dévouement patient de Messieurs Henri COLLET, Manuel RUBIO TRUJILLO et Paul VEREECKE, techniciens du service d'immunologie et de Transfusion.

Je tiens à leur témoigner ici toute mon estime et ma reconnaissance. Mes remerciements s'adressent aussi à leurs collègues. Mesdames Chantal DENYS, Lieve DE VETTER, Myriam DEGIVE, Muriel DUBl, Francine EVRARD, Isa MELKEBEKE, ainsi qu'à Madame DELSINNE et Monsieur DE5TEXHE, infirmière de la consul­

tation des Voies Respiratoires et infirmier chef de la Banque de Sang respectivement.

J'ai pu bénéficier depuis 1971 d'une information très complète grâce à une

importante bibliographie régulièrement mise à jour et procurée par la

firme Upjohn.

(6)

Ce travail n'aurait pas été possible sans le dévouement incessant, la compréhension et la confiance de Macha, mon épouse, qui a partagé mon enthousiasme, soutenu mes hésitations, suscité le recrutement de volon­

taires et entouré d'une affection généreuse la marche de ce travail.

Elle a su préserver la sérénité de l'atmosphère familiale, au milieu des tâches journalières, malgré son travail et en accueillant aussi merveilleusement notre petit Michel. Je l'en remercie de tout coeur.

Je remercie aussi mon fils aîné, Philippe, de sa contribution et de sa tolérance à l'égard d'un père parfois irrité ou absent.

Je tiens enfin à exprimer ma gratitude à l'égard de Mademoiselle Brigitte VAN BELLEGHEM pour son aide très précieuse et dévouée à l'élaboration de ce manuscript ainsi qu'à Monsieur FAUCONNIER pour la réalisation de toutes

les figures.

(7)

TABLE DES MATIERES

PP.

Chapitre 1 Introduction et buts du travail i.

Chapitre 2 Méthodologie 23,

Première partie Suppléments de zinc in vivo et réponse

immunitaire 40,

Chapitre 3 Effet d'un supplément oral de zinc sur la réponse

lymphocytaire de sujets normaux 41,

Chapitre 4 Effets de suppléments oraux de zinc sur la

réponse immune de sujets âgés 58,

Chapitre 5 Effet de l'application locale de zinc sur les réactions cutanées d'hypersensibilité retardée :

comparaison des sujets jeunes et âgés 90, Deuxième partie Zinc et réponse lymphocytaire in vitro 103, Chapitre 6 Approche dynamique des besoins lymphocytaires en

zinc au cours d'une activation in vitro : variations avec L'âge, influence de suppléments

in Vivo 106,

Chapitre 7 Effet pharmacologique du zinc in vitro sur

l'activation lymphocytaire 123,

(8)

T roisième

Chapitre '

Chapitre

Chapitre

Chapitre Annexe 1

Annexe 2

laire du zinc

partie Récepteurs lymphocytaires pour la transferrine et la transferrine-zinc

9

Détection et caractérisation des lymphocytes

pourvus de récepteurs de membrane pour la transferrine et le complexe transferrine-zinc 10 Induction de récepteurs lymphocytaires pour la

transferrine et la transferrine-zinc

11 Variations physiologiques selon l'âge et le sexe et signification clinique de la détection de

lymphocytes circulants formant des rosettes transferrine et des rosettes transferrine-zinc 12 Conclusion

Traitement par suppléments de zinc d'un cas d'herpès génital associé à un déficit de l'immunité cellu­

laire

Effet du zinc sur les lymphocytes circulants et la réponse au vaccin antitétanos de sujets jeunes

164.

165.

189.

229.

253.

268.

143.

270.

(9)

Annexe 3

Annexe 4

III.

Spécificité de la sensibilisation par transferrine et transferrine-zinc des hématies par la technique

au chlorure de chrome 274

Effet du zinc in vitro sur la formation de rosettes en présence d'hématies de mouton et d'hématies humaines sensibilisées à la transferrine et à la

transferrine-zinc 277

(10)

I. Origine du présent travail

PP- 3.

II. Aperçu général du métabolisme du zinc : aspects physiopatho­

logiques 3.

1. Distribution corporelle du zinc 2. Absorption et transport

3. Elimination

4. Sources et besoins alimentaires 5. Les états de carence

6. Régulation de la zincémie 7. Rôle biologique du zinc 8. Diagnostic de carence en zinc 9. Rôle pharmacologique du zinc 10. Conclusion

II. Aperçu général de la relation entre la réponse immunitaire et

le métabolisme du zinc 12.

1. Carence expérimentale en zinc et réponse immune 2. Données cliniques

3. Effets immunologiques de suppléments de zinc en l'absence de carence en zinc

4. Autres effets immunologiques du zinc

5. Enzymes zinc dépendantes d'intérêt immunologique potentiel 6. Récepteurs cellulaires pour la transferrine-zinc

7. Conclusion

(11)

2.

IV. Buts du travail 18.

1. Etablir l'effet immunologique d'un traitement par le zinc chez des adultes normaux en fonction de l'âge

2. Analyser le mode d'action de ce traitement

3. Etablir la signification immunologique des récepteurs lymphocytaires pour la transferrine et la transferrine- z inc

Références 19.

(12)

Chapitre 1

INTRODUCTION ET BUTS DU TRAVAIL

I. ORIGINE DU PRESENT TRAVAIL

Notre projet d'investigation est issu d'une observation clinique originale, rapportée en annexe dans le détail.

En bref, une Jeune patiente, souffrant d'un herpès génital sévère et récidivant, présentait une dépression de l'immunité cellulaire. Après l'échec des autres traitements, une tentative expérimentale de cure par suppléments oraux de zinc fait disparaître totalement les symptômes et corrige peu à peu l'anomalie immunologique, après 4 mois. Aucune récidive n'apparaît dans les 3 années utlérieures.

Cette observation fait soulever de nombreuses questions et pose en particulier celle des relations entre le métabolisme du zinc et la réponse immunitaire.

II. APERÇU GENERAL DU METABOLISME DU ZINC ; ASPECTS PHYSIOPATHOLOGIQUES Le rôle clinique, biochimique et pharmacologique du zinc a été revu récemment de façon fort complète par A.S. Prasad (1). Nous y référons le lecteur pour plus de détail.

Le zinc est un oligo-élément essentiel. L'organisme d'un individu de 70 kg en contient de 1,5 à 2 grammes. Il se trouve principale­

ment dans le foie, les reins, les os, la rétine, la prostate et

les muscles.

(13)

4.

Le plasma contient environ un pour cent du zinc total principalement sous forme liée à des protéines : a2-macroglobuline, albumine, trans- ferrine, céruloplasmine, haptoglobine et gammaglobulines. De 2 à 3 ^ du zinc plasmatigue est ultrafiltrable. Il s'agit essentielle­

ment du zinc lié à des acides aminés : histidine, glutamine,

thréonine, cystine et lysine principalement. Le plasma ne contient donc que des traces de zinc ionisé libre.

2 • Ô˧2IEii2Q_ËÎ_l!IËQ5Q2Ei

L'absorption de zinc alimentaire a lieu principalement dans le jéjunum et porte de façon variable sur 20 à 30 ^ de la quantité

ingérée. La régulation en est mal connue. Elle est compromise par la présence de phytates (végétaux crus), de certains chélateurs du calcium ou par précipitation (géophagie). Elle est facilitée par un ligand d'origine pancréatique qui pourrait être de l'acide pico- linique : un dérivé métabolique du tryptophane. Le zinc se lie également aux prostaglandines E2 qui facilitent son transport à travers la muqueuse intestinale.

Les réserves intracellulaires du zinc se font par liaison à des métalloprotéines : les métallothionéinés (intestin, foie, lymphocy­

tes). Leur concentration est en équilibre avec celle du zinc intra­

cellulaire. La présence de zinc libre induit la synthèse de ces

protéines par dérépression d'ADN, synthèse d'ARN messager. Elle est

également contrôlée par le cortisol et le LEM (leukocyte endogenous

mediator), un facteur probablement dérivé du métabolisme de l'acide

arachidonique (cf. plus bas).

(14)

liiü!iQ§ii2Q

Les pertes de zinc sont principalement fécales. La sortie du zinc des muqueuses intestinales est facilitée par les prostaglandines F.

Les pertes urinaires ne concernent que quelques pour cent des pertes totales. Elles augmentent dans le syndrome néphrotique et lorsque la fraction plasmatique ultrafiltrable s'accroît. C'est le cas dans la cirrhose hépatique, l'hépatite virale, dans les traitements par chélateurs (EDTA, pénicillamine) et dans l'histidinémie, la cysti- nurie, les porphyries, l'hémoglobinurie (anémie hémolytique par exemple) en raison de la liaison de zinc à ces ligands.

L'apport de zinc est exclusivement nutritionel. Les aliments les plus riches en zinc sont : la viande, les fruits de mer, les produits de ferme sauf le fait. Les besoins journaliers sont estimés à

12-15 mg de zinc par jour. Ils augmentent pendant la grossesse et l'alaitement et durant la croissance. Le lait humain est une source profitable de zinc en raison de la présence d'un ligand (acide pico­

lin i que).

^ • L®2_Éi§l§_˧_2Ë!I®Q2§

Les déficits en zinc sont le plus souvent d'origine nutritionnelle,

et de nombreuses enquêtes ont montré des carences marginales dans

diverses populations non seulement au Moyen Orien (Iran, Egypte)

mais aussi en Turquie, au Maroc et au Portugal où la consommation

de protéines surtout d'origine céréalière a été incriminée.

(15)

6.

De même, aux Etats-Unis, une carence marginale a été illustrée par enquêtes diététiques chez des vieillards et des personnes à revenus modestes ainsi que chez des enfants de classe moyenne dont la con­

sommation protéique était pauvre. A noter également des taux de zinc plasmatiques bas chez des bébés nord-américains attribués à la faible teneur en zinc des poudres de lait artificiel.

Il existe une maladie rare héréditaire autosomique et récessive caractérisée par une anomalie de l'absorption du zinc : l'acroder- matite entéropathique. Les symptômes surviennent après le sevrage et comportent une dermatite pluriorificielle rapidement compliquée d'une candidose, une entérite et un retard de croissance. L'affection est fatale si elle n'est pas reconnue, mais régresse très rapidement par supplémentation de zinc à forte dose. Pendant longtemps, le seul traitement disponible était l'administration de lait humain, relayé par celle d'hydroxyquinoléine. On sait maintenant que leur efficacité tenait à la facilitation du transport du zinc ; par un

ligand présent dans le lait maternel et absent du lait de vache ou par le rôle de chélateur du second servant d'ionophore. Le même effet peut s'obtenir avec des extraits pancréatiques (Viokase) qui contient de l'acide picolinique.

Depuis l'introduction de l'alimentation totale parentérale (ATP),

un tableau clinique tout à fait superposable est apparu chez des

adultes en raison de l'inadéquation de l'apport de zinc par les

perfusions alimentaires.

(16)

Les états de carence marginales se traduisent chez les enfants par un retard de croissance et de la maturation sexuelle, et chez

l'adulte par des troubles du goût et de l'odorat.

La carence marginale en zinc pendant la grossesse paraît augmenter les proportions d'anomalies congénitales du système nerveux.

D'autres causes de déficit en zinc sont reconnues et sont mentionnées dans le tableau 1.

6 ■ BÉ9yi§il2Q_Ë®_iÊ_?lQ9ÉÎ!iË

La concentration sérique du zinc s'élève dans les heures gui suivent un repas. Elle s'abaisse rapidement sous l'effet du LEM, d'une façon parallèle à celle du fer. Le LEM est sécrété par les polynucléaires et les macrophages stimulés (phagocytose, réponse d'immunité cellu­

laire). Il se produit alors une accumulation hépatigue du zinc pro­

bablement en rapport avec la production de protéines inflammatoires de la phase aiguë. Ceci rend compte de l'hypozincémie observée dans un grand nombre d'états inflammatoires (infections, nécroses tissu­

laires comme dans l'infarctus du myocarde). L'administration de corticoïdes, d'ACTH, d'alcool réduit le niveau de la zincémie en accroissant les pertes rénales par des mécanismes encore inconnus.

7. RôJ^e bJ_o^ogj_gue du_zj_nc

Le zinc est un constituant de plus de 70 métallo-enzymes comportant

des phosphatases, des aldolases, des carboxypeptidases, des poly-

mérases d'ADN, etc. Nous envisageons le rôle potentiellement clef

de certains d'entre eux au cours de la réponse immunitaire dans la

section III.

(17)

8,

Tab]^eau_l

ETIOLOGIES PRINCIPALES DES CARENCES EN ZINC

'• ÜÉEÉËliËlLÊË

- Acrodermatite entéropathique.

- Trisomie 21 (?) : carence marginale.

2. Défauts_d^aggort

- Malnutrition : - quantitative.

- qualitative : - trop peu de protéines animales.

- excès de phytates.

- Alimentation parentérale totale : perfusions inadéquates.

- Grossesse : besoins accrus.

- Maladies gastro-intestinales : Crohn, colite ulcéreuse.

- Syndrome néphrotique, histidinémie, cystinurie, porphyries.

- Parasitoses : compétition (?), pertes de sang.

- Brûlures étendues, psoriasis (la peau contient 20 % du zinc corporel).

- Hémolyse : pertes rénales.

4. Mj_xtes

- Collagénoses : catabolisme tissulaire, excès de LEM, pertes rénales.

- Néoplasies : - malnutrition (anorexie).

- nécrose tissulaire, excès de LEM.

traitements par corticoïdes.

(18)

5. lairogènes

Traitement par : corticoïdes, ACTH : augmentent les pertes rénales, chélateurs : EDTA, pénicillamine, éthambutol.

anti-inflammatoires : Aspirine et Indocid déplètent

la teneur tissulaire en zinc.

(19)

10.

QiÊ9Q9ËÎi£_˧_^ËE®D9®_®D_5iQ2

Les manifestations cliniques de carence en zinc n'apparaissent que lorsque le déficit est important. Les états de carence marginale sont plus difficiles à caractériser. Ils requièrent des études de bilan comportant les mesures des pertes fecales et urinaires. La zincémie est un mauvais reflet du status en zinc en raison de ses multiples facteurs de variation. La teneur capillaire en zinc

témoigne d'une carence chronique lorsqu'elle est abaissée, pour autant que la pousse des cheveux soit normale et qu'on puisse éli­

miner l'influence, mal connue, de l'environnement (poussières industrielles, détergents, cosmétiques, ...). La concentration tissulaire de déoxythymidine synthétase s'abaisse et celle de la ribonucléase sérique s'élève dans la carence en zinc. Ces mesures ne sont pas encore retenues de façon unanime.

5 • B°i§_EtËEQ]§£2i:29l9y®_9ü_ËiQ9

Des suppléments de zinc ont été administrés dans une série de conditions cliniques, chez l'adulte, pour hâter la guérison des plaies, des ulcères gastriques, mais aussi dans l'acné, la furon­

culose, pour réduire les troubles du foût et de l'adorat ainsi

que dans l'acrodermatite enteropathique (25). A raison de 150 mg

de zinc élémentaire par jour (soit 220 mg de sulfate de zinc,

3 fois par jour en fin de repas), le traitement est bien toléré

hormis quelques cas de nausées, de diarrhées qui sont spontanément

résolutives.

(20)

La forme d'acé+ate ou de gluconate paraît mieux tolérée (1). Ce traitement entraîne une élévation de la zincémie qui se stabilise vers la 4e semaine. A long terme, il provoque une hypocuprémie (par compétition de résorption intestinale) qui, méconnue, peut devenir sévère. Administré pendant 4 mois à des vieillards, il ne provoquait aucune alteration du poids, de la tension artérielle, de la formule sanguine et de nombreux paramètres biologiques usuels.

Ce traitement est donc reconnu inoffensif (2, 27).

10. Conclusion

Les données épidémiologiques et cliniques indiquent que les états déficitaires en zinc sont davantage répandus qu'il n'y paraît.

Avant tout d'origine alimentaire, la carence en zinc atteint non seulement des populations de pays pauvres où règne la malnutrition mais aussi des classes plus ou moins défavorisées de pays riches où la consommation de protéines animales est faible. Certaines estimations portent à 10 ou 15 % la proportion de sujets souffrant d'une carence marginale en zinc aux Etats-Unis (3). Diverses affections et traitements peuvent induire une carence en zinc à la fois par réduction des apports (anorexie), par augmentation des besoins et des pertes (hypercatabolisme).

On ne dispose encore que d'estimations sur les besoins normaux de

zinc, qui restent mal définis tant en fonction de l'âge que de

situations cliniques. Ceci est dû entre autre à la difficulté

de l'évaluation du status en zinc faute de paramètre à la fois

sensible et facile à mesurer.

(21)

12.

La participation du zinc à La structure de nombreux enzymes, en particulier engagés dans La réplication cellulaire explique son influence sur la croissance, sur Les processus de cicatrisation et sur l'intégrité de certains tissus comme les organes lymphoïdes

(cf. section III). IL n'est donc pas surprenant d'observer une relation entre Le métabolisme du zinc et La réponse immunitaire qu'il s'agisse d'individus sains ou de circonstances pathologiques.

III. APERÇU GENERAL DE LA RELATION ENTRE LA REPONSE IMMUNITAIRE ET LE METABOLISME DU ZINC

Le sujet a été extensivement revu par Chvapil (2) et Good (3). L'abon­

dance des données ne permet ici qu'un survol rapide. Elles seront présentées dans Le détail dans les chapitres suivants.

' • ÇÊE§QÇ®_ËÎEÉEi[!!®[!lËi§_§Q_?iQ9_®^_EiE2n˧_lî!î!yQ®

La carence expérimentale en zinc d'animaux en période de croissance induit un déficit immunitaire. Elle provoque une atrophie thymique atteignant Le cortex puis la médullaire, chez le porc, le rat et la souris (4, 5, 6, 7). L'atrophie s'étend aussi aux différents organes Lymphoïdes touchant Les territoires thymodépendants péri­

phériques. Les animaux carencés ont une susceptibilité accrue

à certaines infections normalement contrôlées par Les réactions

d'immunité cellulaire : tularémie chez le rat (6), herpès simplex

chez La souris (8).

(22)

La sécrétion d'anticorps est altérée en réponse primaire ou secon­

daire, ce qui provient principalement d'une atteinte des cellules T helper et non des lymphocytes B (9), La fonction des cellules T suppressives est ainsi qu'en témoigne la production accrue et per­

sistante d'anticorps dirigés contre des antigènes thymo-indépendants, dont la synthèse est normalement inhibée par les cellules T suppres­

sives (10). L'altération dés lymphocytes T s'observe également in vitro sur la réponse à la PHA (6) sur la cytotoxicité T et NK vis- à-vis de cellules tumorales (11). Enfin, s'ajoute une réduction de

la production de facteur thymique sérique (12) et une anomalie de recirculation des lymphocytes (10). Cette anomalie de la recircula­

tion s'explique par une altération des populations lymphocytaires d'animaux carencés dont la proportion qui migre vers les ganglions est augmentée quel que soit le status en zinc de l'animal où elles migrent.

Fait remarquable, toutes ces anomalies sont réversibles par restau­

ration d'une alimentation à teneur normale en zinc (7, 11). Notons que la récupération est plus rapide pour les cellules T helper que suppressives. Une souche de bovins frisiens présente une mutation autosomique récessive (trait léthal A 46) qui produit des veaux

incapables d'absorber normalement le zinc par voie digestive, ils présentent une hypoplasie du thymus et des plaques de Peyer.

il faut noter que les souris porteuses de la mutation "nue" (auto­

somique et récessive) qui sont athymiques congénitalement ont une

distribution anormale du zinc dans leurs tissus (13).

(23)

14.

Bien que Leur teneur corporelle totale soit identique ê leurs semblables hétérozygotes de la même nichée, la concentration intes­

tinale relative est double à la naissance, différence qui se déplace vers la carcasse et le foie après 1 mois. Cette anomalie est

peut-être liée à une infiltration plus abondante des tissus en mastocytes chez la souris nue (T. Ishizaka, comm. pers.) lesquels sont très riches en zinc.

?9[![!if^_SilQl9y§§

a) L'acrodermatite enteropathique (AE) est associée à une atrophie thymique et un déficit de la fonction des lymphocytes T péri­

phériques. Un apport adéquat en zinc guérit les patients et corrige ces anomalies (14,15).

b) Durant une période d'alimentation parentérale totale, un patient a présenté un syndrome évocateur d'AE, avec une hypozincémie et une réponse lymphocytaire à la PHA effondrée. L'ensemble des anomalies s'est corrigé par suppléments de zinc (16).

c) Une étude portant sur des sujets atteints de mongolisme (Syndrome de Down, trisomie 21) a montré qu'ils présentaient à la fois une valeur basse du zinc sérique, une anomalie de l'immunité cellulaire illustrée par une réponse abaissée des lymphocytes à la PHA et une mauvaise réponse des tests cutanés d'hypersensibilité retardée au DNCB ainsi qu'une réduction du chimiotactisme des polynucléaires neutrophiles (17). Ces anoma­

lies étaient corrigées par une supplémentation orale de zinc.

(24)

d) Enfin, des enfants souffrant de malnutrition récente gardaient une valeur basse de la zincémie après une réalimentation qui leur avait fait rattraper le poids correspondant à leur taille.

Après 10 jours de supplémentation orale en zinc, la taille de leur thymus avait augmenté (18). D'autre part, des enfants en état de malnutrition associé pour la plupart à une hypozincémie présentaient une augmentation de la taille des réponses d'hyper­

sensibilité cutanée retardée sous l'effet d'une application locale d'un onguent au zinc (19).

3. Effets i[!l[][!unolog£gues_de_suQgJ^éments de_zmc_en_l^absence_de carence_en_zmc

a) Avec l'âge, le thymus involue et la production de facteur thymique sérique s'abaisse. Cette évolution est retardée chez les souris lorsqu'on double à peu près la teneur alimentaire en zinc géné­

ralement considérée comme suffisante (50 parts par million (PPM) au lieu de 20) (12).

b) D'autres auteurs ont montré qu'une alimentation où les protéines étaient remplacées par des acides aminés retardait l'apparition spontanée d'autoanticorps anti-ADN chez des souris NZB/NZW.

Cet effet protecteur était accentué par adjonction d'histidine et/ou de zinc (160 PPM) qui prolonge leur survie (20).

c) A 250 et 2,000 PPM, d'autres souris ont une élévation de leur

réponse lymphocytaire à la PHA, un effet dépendant de la dose

et de la durée du traitement (21, 2), L'influence de suppléments

de zinc sur la réponse immunitaire de sujets normaux n'est pas

documentée dans la littérature.

(25)

16.

4. Aut res_effets in]niuQ2io3i9ues_du_z|nc

Le zinc est mitogène pour Les Lymphocytes in vitro (22) et peut activer Les Lymphocytes B de façon poLycLonaLe. IL inhibe Le reLargage d'histamine par Les basophiLes humains. Les mastocytes, . et ceLui de sérotonine par Les pLaquettes chez L'homme (2).

5. Enzymes_z|nc dégendantes_d'mtérêt_j_mmunoJ^og|gue_potent£e]^

PLusieurs enzymes zinc dépendantes sont susceptibLes d'infLuencer Le dérouLement d'une réponse immunitaire :

a) La déoxynucLéotidyL transférase terminaLe (25) : enzyme membra­

naire des prothymocytes, présente en abondance dans Le thymus sur Les Lymphocytes corticaux. ELLe disparaît au cours de La maturation thymique.

b) Les carboxypeptidases :

- La carboxypeptidase N du sérum ou kininase I inactive Les fractions C3a et C5a du compLément (anaphyLatoxinés).

- Le facteur sécrété par Les macrophages et permettant La sti­

mulation des Lymphocytes T in vitro a Les caractéristiques de substrat, d'inhibition et d'activation de La carboxypeptidase B (égaLement zinc dépendante).

- une enzyme anaLogue est sécrétée par Les basophiLes pendant La Libération d'histamine.

c) La déoxythymidine kinase et Les DNA poLymérases interviennent dans La synthèse d'ADN. Leur carence peut réduire L'aptitude proLiférative des Lymphocytes. CeLLe-ci est d'aiLLeurs inhibée

in vitro par divers chéLateurs, effet aboLi séLectivement par un

excès de zinc.

(26)

d) La superoxyde dismutase : catalyse La dismutation d'anion super­

oxyde O2 et protège Les ceLLul.es des effets délétères de ce radical Libre. Les Lymphocytes T en contiennent environ 4 fois plus que Les granulocytes et 2 fois plus que les Lymphocytes B (28).

6. Récepteurs_ceL^ulai res_pour_La_transferrj_ne2zj_nc

Les Lymphocytes circulants expriment un récepteur de membrane pour La transferrine-zinc (29) qui permet d'augmenter La synthèse d'ADN et L'accumulation intracellulaire de zinc in vitro après stimulation par la PHA. Au moment où nous commencions notre travail, aucun rôle ou fonction de ce (s) récepteur (s) n'était connu in vivo et chez

L'homme. Seul un rôle, encore théorique, était proposé par M. De Sousa : Les récepteurs pour Les protéines Liant Les métaux (transfer-

rine, Lactoferrine, ferritine) présents sur différentes cellules, orienteraient Leur Localisation dans Les différents organes riches en fer, selon Leur saturation métallique (30).

7. Conclusion

Ces données illustrent L'exquise sensibilité de la réponse immunitaire et, principalement, de sa composante thymodépendante, à La carence en zinc. En outre. L'apport de suppléments de zinc entraîne chez

L'animal d'expérience des effets bénéfiques dont La transposition en clinique humaine est potentiellement très intéressante. Le rôle du zinc comme facteur nutritif, composant d'enzymes divers engagés dans les processus de maturation, réplication et activation lympho­

cytaire désigne cet élément comme cible de manipulations destinées à

modifier favorablement l'équilibre de la réponse immunitaire.

(27)

18.

IV, BUTS DU TRAVAIL

Nous avons poursuivi Les objectifs suivants :

1. EtabL]_r_L^effet_mmunolog|gue_d^un_tra|t^ent_gar_^e_z mc_chez_des ËËyii§§_D2E2!5yï_§Q_f2[!£il2[!_ËË_Lll3®

En effet, La possibiLité d'une carence marginaLe et Les besoins en zinc ne sont pas encore définis seLon Les cLasses d'âges aduLtes et

Le vieiLLissement est associé à un état d'immunodéficience.

2. AnaLYser_Le_mode_d^act|on_de_ce_tra|tement

Ceci impLique L'étude des composantes ceLLuLaires et humoraLes de La réponse immunitaire tant in vivo qu'in vitro pour mesurer L'effet sur La réguLation dans ses aspects à La fois spécifiques et non spécifi­

ques. De pLus, nous avons recherché Le Lien entre Les effets obser­

vés et Le status en zinc des individus ainsi que Les effets pharma- coLogiques de cet éLément.

3. EtabL]_r_La_sj_gn|f|cat|on_|mmuno]^og|gue_des_récegteurs_]^YmghocytaJ_res 222E_iË_iEËQ2f®E''lQ®_®i_iË_iE§Q2£§EEiQÊlElQ2

L'anaLyse des effets du zinc à L'écheLon ceLLuLaire nous a amené à préciser Le rôLe de La transferrine au cours de L'activation Lympho­

cyte i re.

Ces travaux ont eux-mêmes débouché sur ;

a) La mise en évidence de récepteurs Lymphocytaires pour La trans­

ferrine et La transferrine-zinc.

b) La caractérisation des Lymphocytes qui Les expriment et Leur

reLation avec Les conditions d'activation in vitro et in vivo

d'une réponse immunoLogique.

(28)

REFERENCES

1. PRASAD, A.S. (1979). Clinical, biochemical and pharmacological rôle of zinc. Ann. Rev. PharmacoL. ToxicoL. 20, 393-426.

2. CHVAPIL, M. (1976). Effect of zinc on ceLls and biomembranes.

Med. Clin. N. Am. 60, 799-812.

3. GOOD, R.A., FERNANDES, G. & WEST, A. (1979). Nutrition, immunologie aging and disease. In Aging and immunity. Ed. by SINGHAL, SINCLAIR

& STILLER. Elsevier publ., Amsterdam.

4. SHANKLIN, S.H., MILLER, E.R., ULLREY, D.E., HOEFER, J,A. & LUECKE,. R.W.

(1968). Zinc requirements of baby pigs on casein diets. J. Nutrition, 96, 101-108.

5. QUARTERMAN, J. (1974). The effects of zinc défieiency or excess on the adrenals and the thymus in the rat. In Trace éléments metabolism

in animais - 2. Ed. by HOEKSTRA, W.C., SUTTRE, J.W. & MENTZ, W.

University Park Press, Baltimore, pp. 742-748.

6. PEKAREK, R.S., HOAGLAND, A.M. & POWANDA, M.C. (1977). Humoral and cellular immune responses in zinc déficient rats. Nutr. Rep. Intern.

16, 3, 267-277.

7. FRAKER, P.J., DEPASQUALE-JARDIEU, P., ZWICKL, C.M. & LUECKE, R.W.

(1978). Régénération of T-cell helper fonction in zinc déficient adult mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 11, 5660-5664.

8. VAN EECKHOUT, M., VARANI, J., PEKAREK, R.S. & KELLEHER, J.J. (1976).

Effects of nutritional deficiency on herpes simplex virus infection

in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 30, 47.

(29)

20.

9. FRAKER, P.J., HAAS, S.M. & LUECKE, R.W. (1977). Effect of zinc deficiency on the immune response of the young adult A/J mouse.

J. Nutr. 107, 1889-1895,

10. FROST, Ph., CHEN, J.G., RABBANI, I., SMITH, J. & PRASAD, A.S. (1977).

The effect of zinc deficiency on the immune response. In Zinc

metaboLism in health and disease, A.R. Liss publ. New York, pp. IIS- ISO,

11. FERNANDEZ, G., NAIR, M., ONOE, K., TANAKA, T. & GOOD, R.A. (1979), Impairment of cell-mediated immunIty functions by dietary zinc deficiency in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 457-461,

12. IWATA, T., INCEFY, G.S., TANAKA, T., FERNANDES, G., MENENDEZ-BOTET, C.J., PIH, K. & GOOD, R.A. (1979). CircuLating thymie hormone levels

in zinc deficiency. CeLL. Immunol. 47, 100-105.

13. MONTGOMERY, D.W., McMAHON, L.J,, ZUKOSKI, Ch. F, & LINDBERG, R. (1978).

Higher tissue zinc Levels in athymie "nude" mice than in normal hete- rozygous littermates. Fed. Proc. 37, 3, 585.

14. ENDRE, L., DATONA, Z. & GYURKOWITS, L. (1975). Zinc deficiency and cellular immune deficiency in acrodermatitis enteropathica. Lancet 7917, 1196.

15. JULIUS, R., SHULKING, M., PSRINKLE, T. & RENNERT, 0. (1973).

Acrodermatitis enteropathica with immune deficiency. J. Pediat, 83,

1007-1011.

(30)

Am. J. Clin. Nutr. 32, 1466-1471.

17. BJORKSTEN, B., BACK, 0., GU5TAV50N, K.H., HALLMANS, G., HAGGLOF, B.

& TARNVIK, A. (1980). Zinc and immune function in Down's syndrome.

Acta Paediat. Scand. 69, 183-187.

18. GOLDEN, M.H.N., JACKSON, A.A. & GOLDEN, B.E. (1977). Effect of zinc on thymus of recently malnourished children. Lancet 8047, 1057-1059.

19. GOLDEN, M.H.N., GOLDEN, B.E., HARLAND, P.5.E. & JACKSON, A.A. (1978).

Zinc and immunocompétence in protein-energy malnutrition. Lancet 8076, 1226-1228.

20. 5CHWERDTFEGER, M., BATSFORD, S., VOGT, A. & KLUTHE, R. (1980). The effect of dletary histidine and zinc supplémentation on the course of spontaneous autoimmune disease in NZB/W mice. In Histidine II.

Ed. by PARTSCH, G. & BATSFORD, S,, G. Thieme Verlag publ., New York.

21. GAWORSKI, C.L. & SHARMA, R.P. (1978). The effect of heavy metals on thymidine uptake in lymphocytes. Toxicol. Appl. Pharmacol. 46, 305-313.

22. RUHL, H. & KIRCHNER, H, (1978). Monocyte dépendant stimulation of human T cells by zinc. Clin. Exp. Immunol. 32, 484-488.

23. CHO, C.H., DAI, S. & OGLE, C.W. (1977). The effect of zinc on ana-

phylaxis in vivo in the guinea pig Br. J. Pharmacol. 60, 607-608.

(31)

22.

24. WALKER, R.I., SUYDER, 5.L., 50B0CINSKI, P.Z., McCARTHY, K.F. &

EGAN, J.F. (1978). Possible association of granulocyte mobilisation to the peritoneal cavity with Zn Cl2-induced protection against endotoxin. Can. J. Microbiol. 24, 834-838.

25. CHANG, L.M.S. & BOLLUM, F.J. (1970). Deoxynucleotide polymerizing enzymes of calf thymus gland. iV. Inhibition of terminal deoxynucléo­

tidyl transferase by métal ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 65, 1041-1048.

26. MARTINDALE (1977). In The extra pharmacopia, 27th ed. Ed. by Ainley WADE, The Pharmaceutical Press, London, pp. 220-223.

27. CZERINSKY, A.W., CLARK, M.L., 5ERAFETINIDES, E.A., PERRIER, C.B.A. &

HUBER, W.H. (1973). Safety and efficacy of oral zinc sulfate in gériatrie patients. Clin. Pharmacol. Therap. 15, 436-441.

28. KOBAYASHI, Y., OKAHATA, S., SAKANO, T., TANABE, K. & USUI, T.

Superoxyde dismutase activity of T lymphocytes and non T lymphocytes.

FEBS Letters 98, 391-393.

29. PHILIPPS, J.L. (1978). Uptake of transferrin bound zinc by human lymphocytes. Cell. Immunol. 35, 3i8-329.

30. DE SOUSA, M. (1978). Lymphoid cell positioning : a new proposai for the mechanism of control of lymphoid cell migration. Symp. Soc. Exp.

Biol. 32, 393-410.

(32)

Chapitre 2

METHODOLOGIE

--- ££_^

I. Séparation des Lymphocytes 25.

1. Sang

2. Organes lymphoïdes 3. Sous-popuLations

a) Epuisement en cellules adhérentes b) Purification des lymphocytes T ;

- par rosettage

- par adsorption sélective sur colonne de laine de nylon c) Purification de lymphocytes Ty et Ty

- préparation des hématies - séparation des Lymphocytes Ty - séparation des lymphocytes Ty

II. Caractérisation des lymphocytes 29.

1. Les lymphocytes T

2. Les lymphocytes Ty et Ty 3. Les Lymphocytes B

4. Les monocytes et les polynucléaires

IM. Cultures lymphocytaires 31.

1. Mitogènes 2. Antigènes

3. Culture lymphocytaire mixte : a) Bidirectionnelle

b) Unidirectionnelle

4. Sécrétion d'anticorps in vitro

(33)

24.

IV. Dosage des anticorps IgG antitoxine tétanique V. Tests cutanés

VI. Rosettes transferrine et transferrine zinc 1. Couplage des hématies au chlorure de chrome 2. Couplage de la transferrine au zinc

3. Test des rosettes 4. Lecture

VII. Divers

1. Albumine bovine dialysée 2. Sérum humain normal VIII. Calculs statistiques

1. Tests utilisés

2. Transformation des données 3. Interprétation des résultats

33 34 34

36

36

Références 38

(34)

Chapitre 2

METHODOLOGIE

I . SEPARATION DES LYMPHOCYTES : Méthode de Boyum (1) 1. Sang

20 à 50 ml de sang héparine (CaLparine 100-500 LH) sont prélevés en seringues stériles, dilués 2 x par solution de Hanks sans calcium ni magnésium (HK) et déposés par fraction de 20 à 30 ml sur une couche de 15 ml de Ficoll-Urographine (densité 1,077 - pH 7 - 20° C) dans des tubes de 50 ml (Falcon). Après centrifugation à 800 g pendant 30 minutes, l'anneau lympho-mononucléé présent à l'interphase est recueilli avec précaution, lavé 3 fois en HK. La première centri­

fugation a lieu à 400 g, ce qui élimine l'essentiel des plaquettes.

Les cellules sont resuspendues en milieu de culture (MC) (RPMI 1640 - tamponné par Hepes 20 à 25 mM - et bicarbonate 1 g - gentamycine 40 yg/ml - glutamine 2 mM) avant numération.

2, Organes tymghoTdes

Les amygdales, ganglions, échantillons de thymus, de rate sont prélevés au cours d'interventions chirurgicales ou sur matériel d'autopsie dans les 24 heures du décès. Les fragments sont fine­

ment découpés aux ciseaux, et broyés doucement en boîte de Pétri,

dans du HK à l'aide d'un tube en verre, La suspension recueillie

est décantée en tubes pendant environ 5 minutes, les surnageants

graisseux (thymus uniquement) sont écartés ainsi que les débris qui

ont sédimenté.

(35)

26,

La suspension est Lavée en HK jusqu'à neutralisation de L'acidité et passée ensuite sur gradient de FicolL-Urographine comme décrit plus haut.

5 • l9yËlE9EüLÊii9[!§

i2yli§ül§0i-§D_Ç©iiLyJi§§-idhérentes (Selon Delespesse (2)) IL a Lieu en boîtes de Pétri (6 cm de diamètre) en plastique (FaLcon) où L'on dépose 15.10^ cellules dans 5 ml de MC additionné de 15 ^ de sérum humain normal. Après incubation de 2 à 4 h à 37° C, Les cellules non adhérentes sont recueillies par resus­

pension douce à la pipette Pasteur. La récupération est d'environ 50 à 60 ^ des cellules d'origine.

b) Pynlfi9iiion^de|_lymghoçytes_T

- Par rosettage ; (Selon la technique de PelLegrino (3))

Un mélange de suspensions de lymphocytes (3.10^/ml) et de GR de mouton (suspension mère, cf. plus bas) sensibilisés par AET

(aminoethyl isothiouronium bromide hydrobromide) dans Le

rapport de 0,1 ml de suspension de GRM pour 1 ml de Lymphocytes en MC additionné de 20 % de sérum de veau foetal (SVF) est centrifugé à 4° C et 400 g pendant 30 minutes. L'anneau lympho- mononucléé recueilli à l'interphase est Lavé et resuspendu en MC. Les cellules sont enrichies en lymphocyte B et monocytes.

Le culot riche en hématies est lysé par NH^Cl 0,85 % pendant

5 min à 37° C et libère les lymphocytes T après lavage.

(36)

Préparation des GRM-AET : 1 ml de culot de GRM lavés en Hanks sont incubés 30 min à 37° C en présence de 12,5 ml d'une solu­

tion d'AET (0,5 g AET - eau distillée - pH ajusté à 9 par NaOH 1 M) puis lavés 6 fois en RPMI jusqu'à disparition des traces d'hémolyse. Les GRM-AET sont resuspendus dans 8 ml de MC avec 20 % de 5VF et constituent la suspension mère.

Par adsorption sélective sur colonne de laine de nylon (Selon la technique de Delespesse et al. (2, 4))

Deux mililitres de suspension lymphocytaire (50 à 200.10^) sont déposés sur une colonne verticale de laine de nylon (cf. plus bas) et leur pénétration sous le niveau supérieur de la laine assurée par un écoulement très lent, suivi du recouvrement par 2 cc de MC enrichi de 10 % de sérum humain normal (SHN). La colonne est incubée à 37° C pendant 30 min, puis éluée stéri­

lement à la vitesse de 15 gouttes par minutes. L'apport de milieu préchauffé à 37 ° C sur la colonne doit maintenir un niveau de liquide qui n'atteint jamais celui de la laine. La première fraction de 20 ml élue 15 à 20 ^ des cellules et est suivie d'une deuxième fraction de 20 ml à débit rapide (robinet ouvert complètement) qui emporte cette fois 20-25 % du total.

Ces fractions sont enrichies en cellules T (85-95 ^). Une

troisième fraction est obtenue par éjection forcée comprimant

la laine avec le piston de la seringue qui sert de colonne

et offre une suspension de cellules enrichies en lymphocytes

B et pauvre en lymphocytes T. Le rendement du procédé atteint

50 à 60 ^ des cellules déposées.

(37)

28.

Préparation de La colonne :

5 grammes de Laine de nylon (Leucopak) sont dégraissés en HCL 0,2 N puis Lavés abondamment en eau distillée stérile, placés dans une seringue de 20 ml et tassés, sous niveau

liquide (pour éviter la formation de bulles) jusqu'à environ La graduation de 5 ml. De nouveaux Lavages en HK assurent la neutralisation de La colonne, suivi de lavages en MC et fina­

lement incubation à 37° C pendant au moins 30 min en présence de MC et 10 t de 5HN.

c) PynlfIçaiiQn_de_lymphocytes_Ty_|t_TY (Selon la technique de Moretta et al, (5))

L'enrichissement des lymphocytes T en sous-populations Tp et Ty est obtenu par sélection réciproque après rosettage en présence d'hématies sensibilisées par IgM (Ty) ou IgG (Ty),

- Préparation des hématies

1 cc de culot de GR de boeuf lavés est incubé en présence d'une solution d'IgM ou d'IgG de lapin anti GR de boeuf à un titre

immédiatement inférieur à celui qui permet encore une aggluti­

nation microscopique, pendant 30 min à 37° C (titre 1/1 à 1/16 pour 1 mg/ml). Après lavage. Les GR sont resuspendus dans 8 ml de MC et constituent la suspension mère.

- Séparation des lymphocytes Ty

Un mélange (volume par volume) de Lymphocytes T (3.10^/ml) et

de GR sensibilisés par IgG (GRSg) est centrifugé à 250 G pendant

5 min puis incubé 1 heure à 0° C (glace fondante).

(38)

Le cuLot est alors resuspendu doucement et centrifugé sur FicoLL-Urographine à 4° C. L'anneau de l'interphase est appauvri en lymphocytes Ty (T-Ty) et le culot en est enrichi.

Ils s'obtiennent après une lyse des GR par NH^Cl.

- Séparation de lymphocytes Tp

Les lymphocytes T doivent séjourner 1 nuit à 37° C en présence de SVF. Ensuite, ils sont traités comme pour la préparation de Ty mais avec des GR sensibilisés par IgM. Les cellules à l'inter­

phase du gradient de Ficoll-Urographine sont appauvries en Tp (T-Tp) qui se retrouvent dans le culot d'hématies, libérées après lyse des GR au NH^Cl.

I I . CARACTERISATION DES LYMPHOCYTES

• P^'' formation de rosettes avec des GR de mouton

selon la technique de Jondal et al. (6). 0,2 ml d'une suspension

de GR de mouton à 2 ^ en HK et 0,2 ml d'une suspension lymphocytaire

(4.10^/ml) sont mélangés et incubés 15 minutes à 37° C. Après

centrifugation (100 g - 3 minutes), la préparation est incubée dans

la glace fondante puis à 4° C pendant une nuit. Le culot cellulaire

est resuspendu avec douceur et une goutte (10 pl) d'acridine orange

est ajoutée pour révéler la présence des lymphocytes parmi les GR

de mouton. La proportion de lymphocytes fixant plus de 3 hématies

est mesurée sur 200 cellules dans une cellule de Bürker examinée

au microscope à fluorescence en lumière blanche et U.V.

(39)

30.

2- L:ËI_iïü!Eb29ïl®E_Iy_§i_Iï • formation de rosettes à L'aide de GR de boeuf sensibilisés par IgM et IgG de Lapin, respectivement

(et. supra). La technique de Lecture est La même que pour les rosettes aux GR de mouton.

3. Les_]^^mQhoc^tes_B : par immunofluorescence de membrane (adaptée selon La technique de Preud'homme et al. (7).

Trois millions de lymphocytes sont incubés pendant 30 minutes à 4° C dans une solution de fragments Fab d'IgG de Lapin anti-immunoglobu­

lines humaines conjugués à l'isothiocyanate de fluorescéine (Nordic).

Les cellules sont lavées en tampon de Coons contenant 3 % d'albumine bovine et 0,1 t d'azide de sodium. Les cellules sont déposées sur une lame, étalées en spirale et séchées, fixées au méthanol et La préparation montée sous glycérine (pH 8). 250 cellules sont examinées au microscope à fluorescence, pour établir La proportion de celles qui possèdent une fluorescence de membrane caractéristique.

4. Le§_îîlonocytes_et_goJ^ynuc^éa|res : par la présence de péroxydase,

révélée par Le brunissement du cytoplasme cellulaire sur frottis

imprégné de benzine et d'une goutte de perhydrol (eau oxygénée :

dilution 1/100).

(40)

III. CULTURES LYMPHOCYTAI RES 1. M|+ogènes

- Les Lymphocytes sont cuLtivés à 10^/mL en MC enrichi de 2,5 % de sérum humain décompLémenté.

- Les mitogènes sont ajoutés aux concentrations suivantes ; PHA (PHA-P-WeLLcorne)

1 yg/mL dose suboptimaLe 0,2 yg/mL dose sous-optimaLe Con A (Sigma grade III)

25 yg/mL dose optimaLe

PWM (Gibco) diLution 1/100, doseoptimaLe

- Les aLiquots de 200 microLitres (yL) sont déposés par série de 3 répLigues, en boîtes de cuLture en pLastique, muLtipuits (FaLcon) à fond pLat et pLacés en incubateur à 37° C en atmos­

phère humide (Air/C02 95 %-b %).

- après 48 h, 25 yL de mi Lieu contenant 5 yc de thymidine méthyL

tritiée (3,6 C/mM - Institut des RadioéLéments, FLeurus) sont ajoutés à chaque microcuLture. Après 18 h d'incubation nouveLLe,

Les cuLtures sont aspirées par un appareiL (MuLti-sampLe Harvestor - Mash II) qui retient Les ceLLuLes sur un fiLtre, après Lavage. Les confettis découpés et séchés sont pLongés dans du Liquide scin- tiLLant au toLuène (Packard) et La radioactivité mesurée par comp­

teur béta (Tribarb - Packard). Le résuLtat de La moyenne de 3

répLiques est exprimé en coups par minute (CPM).

(41)

32.

2. Ant]_gènes

La méthode de stimulation de cultures lymphocytaires par antigène est une variante de La précédente.

Diffèrent :

i° la concentration cellulaire : 3.10^/ml 2° la teneur en sérum ; 10 % SHN décomplémenté 3° la durée d'incubation : 5 jours

4° l'ajoute de thymidine : 0,5 yC à 2 C/mM

Les antigènes habituels sont ; La candidine : 500 yg/ml

la streptokinase-streptodornase (Varidase : Lederle) 100 y/ml.

Les solutions d'antigènes sont dialysées contre une solution de HK puis filtrées sur filtre Millipore 0,22 y, pour ôter les traces de conservant, stabilisateur, sels de mercure qui sont mitogènes ou inhibiteurs.

3) ildlrectjgnneUe ; cultures de 10 cellules de chaque paire 5 d'individu dans 0,2 ml par puits en boîtes à fond rond (Sterllin, Limbro) en MC contenant 10 % de SHN pendant 5 jours. La thymidine est ajoutée au 4e jour (10 yC - 10 C/mM).

b) yQidjreçtjgnnelLe : une des deux suspensions lymphocytaires est

bloquée par incubation de 30 min à 37° C (4.10^/ml) en l'absence

de sérum à l'aide de mitomycine C (50 yg/ml ) suivi de 3 Lavages,

resuspension et numération. Une perte de 50 % des cellules est

courante.

(42)

2. Çouglage_de_l[a_traQsferrj_ne_au_zmc (Selon Philipps (9))

0,1 cc de chlorure de zinc à 0,27 mg/ml et 0,9 cc de transferrine à 10 mg/ml sont mélangés et incubés 30 minutes à température ordinaire.

Les réactifs a, b et c sont mélangés rapidement et incubés pendant 4 minutes, puis les hématies sont lavées 4 fois en eau physiologique et resuspendues en HK contenant 2 % d'albumine bovine ou humaine,

la concentration est ajustée à 3 ^ (vol./vol.).

I§§i_Ë®§

0,2 ml de la suspension d'hématies sensibilisées sont mélangés à 0,2 ml de lymphocytes (10^/ml).

- Ro|ettes^tr§nsffrr;

Le mélange est incubé 5 minutes à 37° C, centrifugé 2 minutes à 200 g et réincubé à 37° C 5 minutes avant d'être plongé dans de

la glace fondante.

- Rosettes_transf§rrme-zinç ;

Procédure analogue où les incubations décrites à 37° C sont réalisées à 0° C.

4. Lecture

10 yX d'acridine orange sont ajoutés à la préparation immédiatement avant sa resuspension complète de façon très douce. Un prélèvement par pipette Pasteur est déposé entre lame et lamelle d'une cellule de Burker et examiné au microscope à fluorescence en contraste de phase. L'éclairement est réglé pour permettre à la fois de recon­

naître les cellules en lumière blanche et la fluorescence des lympho­

cytes en lumière U.V. Une rosette est comptée à partir de l'acco-

lement de 3 hématies par lymphocyte. La proportion de rosettes est

estimée sur 200 lymphocytes.

(43)

34.

Le point Le plus élevé de La courbe standard correspond arbitrairement à un titre de 10.000 unités.

Les sérums sont dilués à 1/50, Les surnageants de culture à 1/5.

V. TESTS CUTANES

ILs comportent 3 injections intradermiques dé 0,1 ml de solution antigé­

nique sur L'avant-bras :

a) Tuberculine : 2 unités (Purified Protein Dérivative : Statens Sérum Institutet; Denmark).

b) Candidine (Beecham - 0,5 M).

c) Streptokinase-Streptodornase : 10 unités (Varidase, Lederle).

Les Limites de L'induration, après 48 heures, sont dessinées sur La peau au marqueur fin et L'empreinte relevée par application d'un papier autocollant transparent qui est fixé ensuite sur une feuille de papier.

La surface est alors mesurée par planimétrie et l'on calcule le diamètre du cercle correspondant.

VI. ROSETTES TRANSFERRINE ET TRANSFERRINE-ZINC

Réactifs : tous préparés en eau physiologique (NaCl 9 ) et extemporanément :

a) 1 ml de GR humains 0 Rh* à 50 ^ (vol./vol.).

b) 1 ml de chlorure de chrome à 1 mg/ml, pH ajusté à 7,2 par NaOH.

c) 1 ml de solution de transferrine purifiée (Behring) à 1 mg/ml

ou transferrine couplée au zinc.

(44)

^ • iÉ9£Éil2Q_ËlËQil92iIE5_i[!_ïliü2

La culture Lymphocytaire à 10^/mL est stimulée par PWM (1/10) en présence de 10 % de SVF pendant 7 jours. Les surnageants (0,1 ml) de chaque triplicata sont recueillis et conservés a - 20° C. La sécrétion d'anticorps est mesurée par radioimmunoessai. Le SVF a été sélectionné parmi plusieurs lots, en écartant ceux qui sont mitogènes ou suppresseurs. Ceci se contrôle dans nos conditions en comparant l'incorporation de thymidine qu'ils permettent à 7 Jours à celle d'un Lot de sérum humain. Le SVF, dont les résultats sont Les plus proches du SH, est retenu.

IV, DOSAGE DES ANTICORPS IgG ANTITOXINE TETANIQUE

Nous avons utilisé un radioimmunoessai en phase solide. L'antigène (toxine tétanique 50 pg/ml) est fixé sur La face interne de microtubes en polystyrène et Les sites persistants saturés par albumine humaine

(100 mg/ml) par absorptions successives durant une nuit, entrecoupées de lavages abondants. La solution à tester (200 pL) est déposée pour une nouvelle incubation et Les anticorps IgG fixés sur l'antigène sont révélés par la protéine A (Staphylocoque doré, Pharmacia) radiomarquée.

Après une nuit d'incubation suivie de Lavages, la radioactivité résiduelle, proportionnelle à la quantité d'IgG retenue, est mesurée par compteur gamma. Toutes les solutions sont préparées en tampon Tris-HCL pH 7,2, Les mesures sont faites en double et les résultats comparés à une courbe standard obtenue à l'aide d'un sérum de sujet hyper immunisé. Celui-ci est dilué de 1/50 à 1/3,200 de 2 en 2 en présence d'une dilution constante à 1/40 d'un sérum de sujet non

immunisé et qui présentait lors d'essais précédents La plus faible rétention de radioactivité (bruit de fond) considérée comme non spéci­

fique.

(45)

36,

VII. DIVERS

ôiËyü!i!2®_Ë2^iQ® (Poviet, solution à 30 %)

L'albumine bovine est dialysée extensivement contre de l'eau physio­

logique, puis au HK pendant 48 heures et son pH ajusté par NaOH à 7,2, Elle est ensuite filtrée sur filtre Millipore 0,22 y et des parties aliquotes de 5 ml sont conservées au congélateur à - 20° C.

2 • §§iyî!_!}2[DËiD_!22!IÜ!Ëi

Les lots de sérum humain utilisés pour La culture Lymphocytaire pro­

viennent de La collecte de 80 à 150 échantillons de sérum; de 5 à 10 ml, provenant de donneurs de sang. Un litre environ de mélange est dégelé complètement, décomplémenté à 56° C pendant 45 minutes, centrifugé à 1.000 g et le surnageant stérilisé par passage sur filtre 0,22 y (Millipore). Le sérum est répartis en tubes de 5 ml en plastique qui sont conservés à - 20° C,

VIII. CALCULS STATISTIQUES

Les calculs statistiques ont été réalisés à L'aide d'une calculatrice

Hewlett-Packard modèle HP 41-C et de son module statistique. L'analyse

de variance à 2 voies par bloc casualisés a été pratiquée sur le modèle

HP 65 par Les programmes de la série Stat-Pack 1.

(46)

1, I§sts_ut|l|sés a) test T de Student.

b) test T pairé.

c) test du chi carré.

d) Le test non paramétrique de Wilcoxon pour Les données pairées.

e) La régression Linéaire et Le test T de comparaison des pentes.

2 . lEË[!Ëf2IIÜ[!Ëll2[!_^§§_Ë°QQɧ§

a. Les données exprimées en pour cent ont été comparées après transformation en arc sin

b. Les titres d'anticorps ont subi La transformation Log^Q.

lQi2EEEÉiËli2D_˧5_E2§2ilii2

SeLon Les tabLes scientifiques Geigy (10) et ceLLes de Lison (11).

(47)

38,

REFERENCES

1. BOYUM, A. (1968). Séparation of Leucocytes from blood and bone marrow.

Scand. J. Clin. Lab, Invest. 21, suppL. 97, 1-7.

2. DELESPESSE, G., DUCHATEAU, J., GAUSSET, Ph, & GOVAERTS, A. (1976).

In vitro response of subpopulations of human tonsil lymphocytes, I. Cellular collaboration in the proliférative response to PHA and Con A. J. Immunol. 116, 437-445.

3. PELLIGRINO, M.A., FERRONE, S., DIERICH, M.P, & REISFELD, R,A. (1975).

Enhancement of sheep red blood celL human Lymphocyte rosette formation by the sulfhydryl compound 2-aminoethylisouronium bromide. Clin. Immunol.

ImmunopathoL. 3, 324-333.

4. DUCHATEAU, J., DELESPESSE, G., GAUSSET, Ph. & GOVAERTS, A. (1976).

Cellular interactions in the proliférative response of human circuLating Lymphocytes to PHA. Analysis of the impaired response in old âge.

Acta Endocr. (KBh) suppL. 205, 35-47.

5. MORETTA, L., FERRARINI, M., MINGARI, M.C., MORETTA, A. & WEBB, S.R.

(1976). SubpopuLations of human T celLs identified by receptors for immunoglobulins and mitogen responsiveness. J. Immunol, 117, 2171-2174.

6. JONDAL, M., HOLM, G. & WIGZELL, H.J. (1972). Surface markers on

human T and B Lymphocytes. I. A Large population of Lymphocyfes forming non immune rosettes with sheep red blood celLs. J. Exp. Med, 136,

207-212.

(48)

7. PREUD'HOMME, J.L. & FLANDRIN, G.J, (1974). Identification by peroxydase staining of monocytes in surface immunofluorescence tests. J, Immunol,

113, 1650-1658.

8. JOHNSON, J, (1979). The use of protein A rosettes to detect ceLl surface antigens. In Immunol. Meth, Ed. by I. LEFKOVITS, B. PERNI5, Acad. Press, New York, pp. 261-267.

9. PHILIPPS, J.L. (1978). Uptake of transferrin-bound zinc by human lymphocytes. Cell. Immunol, 35, 318-329,

10, DIEM, K. & LENTNER, C, (1972). Tables scientifiques, 7e ed.

Ciba Geigy publ., Basel.

11. LI50N, L. (1968). Statistique appliquée à la biologie expérimentale.

Gauthiers-Villars publ., Paris,

(49)

40.

PREMIERE PARTIE

SUPPLEMENTS DE ZINC IN VIVO ET REPONSE IMMUNITAIRE

(50)

Chapitre 5

EFFET D'UN SUPPLEMENT ORAL DE ZINC SUR LA REPONSE LYMPHOCYTAIRE DE SUJETS NORMAUX*

PP.

1. Introduction 42.

1 1 . But du travaiL 42.

II. Schéma expérimental 43.

VI. Analyse des résultats 45.

1. Réponse lymphocytaire

2. Effet du traitement au zinc sur Les interactions entre Lymphocytes et monocytes in vitro

3. Concentrations sériques du zinc et du cuivre

V. Discussion 50.

V 1 . Conclusion 54.

Références 56.

Une partie des données de ce chapitre a fait l'objet d'une publication :

Duchateau, J., Delespesse, G. & Vereecke, P. (1981). Influence of oral

zinc supplémentation on the lymphocyte response to mitogens of normal

subjects. Am. J. Clin. Nutr. 34, 88-93.

(51)

42.

Chapitre 5

EFFET D'UN SUPPLEMENT ORAL DE ZINC SUR LA REPONSE LYMPHOCYTAIRE DE SUJETS NORMAUX

I. INTRODUCTION

Les seules données disponibles ont été obtenues chez l'animal.

Gaworski et Sharma (1) ont mesuré la réponse proliférative de cellules spléniques de souris stimulées par la phytohémagglutinine (PHA) et le pokeweed mitogène (PWM) alors que les animaux recevaient des suppléments de sels de zinc, de plomb, de mercure ou de cadmium dans l'eau de

boisson. Seules les souris recevant du zinc présentaient une élévation de leur réponse lymphocytaire, cette facilitation était dépendante de :

1) la dose (250 et 2.000 parts par million (PPM) correspondant respec­

tivement à 5 et 40 fois le besoin reconnu pour la souris (= 50 ppm)).

2) la durée d'exposition (2 à 4 semaines).

L'adsorption d'autres métaux provoquait tout au plus une inhibition parfois sévère de la réponse. Un effet analogue de suppléments de zinc sur la réponse mitogénique a été décrit par Chvapil, Zukoski et Hattler (cité dans 2).

II. BUT DU TRAVAIL

Nous avons étudié l'influence de suppléments oraux de zinc sur la

réponse proliférative de lymphocytes humains stimulés par la PHA et la

Con A, réponse considérée comme un paramètre in vitro de l'immunité

cellulaire (3).

(52)

IL nous faUait tenir compte de L'âge, du sexe et de L'existence d'une contraception oraLe (CO), facteurs connus pour faire varier cette

réponse (4). En outre, La contraception oraLe a été associée à une hypozincémie et à une hypercuprémie (5).

Nous avons recherché Les reLations possibLes entre Le niveau initiai de La réponse des Lymphocytes, L'effet du traitement et La teneur sérique en zinc et en cuivre. FinaLement, nous avons investigué L'infLuence de ce traitement au zinc sur Les interactions ceLLuLaires conditionnant

La réponse des Lymphocytes aux mitogènes et pLus particuLièrement sur Le rôLe moduLateur joué par Les ceLLuLes adhérentes. CeLLes-ci contrô- Lent La réponse Lymphocytaire notamment en sécrétant des prostagLandinés qui ont un effet inhibiteur (revu dans 6).

III. SCHEMA EXPERIMENTAL

ÇËEii9lEËQi§ • sujets aduLtes, en bonne santé sont répartis en 4 groupes seLon L'âge et Le sexe :

I de 20 à 40 ans : 20 hommes

il de 20 à 40 ans : 20 femmes sans CO III de 20 à 40 ans : 23 femmes sous CO IV de 40 à 60 ans : 20 femmes

Iémo|ns : 20 sujets de 20 à 40 ans : 12 femmes et 8 hommes ont été testés 2 fois, à un mois d'intervaLLe.

Iraj_tement : absorption de 3 geLLuLes par jour de 220 mg de suLfate

de zinc, per os, en fin de repas pendant un mois.

(53)

44. Tableau 1 REPONSE AUX MITOGENES

PHA 1 pq PHA 0,2 pg Con A 25 pg

Su.jets traités A B A B A B

Ensemble m 261-305** 156-187 163-209

D.S. 106 95 73 79 83 92

n 83 71 73

Groupes

Hommes 20-40 m 287-333 159-194 165-224

D.S. 107 94 81 96 80 85

n 20 15 20

Femmes 20-40 sans CO

m 275-301 161-165 177-194

D.S. 106 76 71 58 86 78

n 20 19 20

Femmes 20-40 m 270-329 174-233 181-237

+ CO

D.S. 124 98 81 76 103 129

n 23 20 14

Femmes 40-60 m 213-244 124-140 133-184

D.S. 63 107 53 73

n 20 17 19

Sujets contrôles

12 femmes m 307-320 182-181 202-205

8 hommes

20-40 D.S. 104 111 85 65 95 82

n 20 15 20

Les résultats sont exprimés en CPM x 10 .„-3 A : valeur initiale.

B : valeur après 1 nnois.

Abréviations : m : moyenne

D.S. : déviation standard n : nombre de sujets CO : contraception orale

« : P < 0,05

*• : P < 0,01

*** : P < 0,001 (test t pairé)

Figure

Updating...

Références

Updating...

Sujets connexes :