i
Thèse présentée pour obtenir le diplôme de Docteur en Sciences
Par
Arnaud Peliace Lemoge Azonpi
Année académique 2019-2020
Promoteur : Jacob SOUOPGUI
Co-Promotrice : Léa Olive TCHOUATE GAINKAM
ETUDE DE LA FONCTION DU FACTEUR DE
TRANSCRIPTION ZIC2 DANS LA FORMATION DE
L’ORGANISATEUR ET DANS LES MOUVEMENTS
MORPHOGENETIQUES AU COURS DU
ii
MEMBRES DE JURY
Président : Professeur Luc Vanhamme Institut de biologie et de médecine
moléculaires, Gosselies, Belgium Universite Libre de Bruxelles
Sécrétaire : Professeure Anna Maria Marini Institut de biologie et de médecine
moléculaires, Gosselies, Belgium Universite Libre de Bruxelles
Superviseur : Professeur Jacob Souopgui Institut de biologie et de médecine
moléculaires, Gosselies, Belgium Universite Libre de Bruxelles
Commité d’accompagnement :
Professeur Guillaume Oldenhove, Institut de biologie et de médecine
moléculaires, Gosselies, Belgium Université Libre de Bruxelles
Professeur Benoit Vanhollebeke, Institut de biologie et de médecine
moléculaires, Gosselies, Belgium Universite Libre de Bruxelles
Membres externes :
Professeur Luc Leyns, Laboratory of Cell Genetics, Department of Biology,
VUB, Brussels, Belgium
iii DÉDICACE
A mon feu Papa, LEMOGE Jean Léon et à Ma maman Toumbou Marie pour tout vos sacrifices et votre amour indefectible. Ce travail est le votre.
iv
CERTIFICATION
Je certifie par la présente que la thèse doctorat intitulée-Etude de la fonction du facteur de transcription Zic2 dans la formation de l’Organisateur et dans les mouvements morphogénétiques au cours du dévéloppement embryonnaire précoce chez le xénope "présentéé par M. Arnaud AZONPI LEMOGE dans le cadre des exigences pour l’obtention du diplôme de docteur en Biologie Moléculaire à l’Université Libre de Bruxelles est le travail de recherche réalisé par lui au Laboratoire d’Embryologie et de Biotechnologie (IBMM-ULB,Gosselies) sous ma surpervision pour la période de Septembre 2014 -Avril 2019 En outre, je déclare que les résultats de ces travaux n’ont pas encore été soumis, ni partiellement ou totalement pour l’obtention de tout autre diplôme ou bourse.
P Prof Jacob SOUOPGUI
v DÉCLARATION
Moi, Arnaud AZONPI LEMOGE, déclare sur l'honneur que tout le travail présenté dans cette thèse ainsi que les méthodes décrites ont été fait d’une part par moi et d’autre part en colaboration avec membres de notre équipe. Ce travail n'a pas été précédemment soumis ailleurs pour l’obtention d’un diplôme.
Arnaud LEMOGE AZONPI 06/12/2019
vi Table des matières
LISTES DES ABREVIATIONS ... xii
ABSTRACT ... xv
RÉSUMÉ ... xvi
REMERCIEMENTS ... xviii
CHAPITRE I : INTRODUCTION GENERALE ... 19
I.1 Xénope comme modèle d'étude en embryologie moléculaire ... 20
I.2 Développement de l'axe dorso-ventral et de l'Organisateur... 24
I.2.1 Contrôle maternel du développement embryonnaire ... 24
I.2.2 La spécification de l'axe dorso-ventral : de la fécondation avant le stade 32 cellules ... 25
I.2.3 De la transition mi-blastula (MBT) à la gastrulation : induction du méso-endorme et dorsalisation des feuillets embryonnaires ... 29
I.2.3.1 Induction du mésoderme ... 29
I.2.4 La régionalisation et la formation des axes de l'embryon : Rôles des antagonistes ... 35
I.2.4.1 Le centre de signalisation ventrale ... 35
I.2.4.2 Inhibiteurs de BMPs ... 36
I.2.4.3 Inhibiteurs de Wnt ... 37
I.3 Mouvements de gastrulation chez les vertébrés ... 38
I.3.1 Les mouvements d'épibolie ... 39
I.3.2 Mouvements d'involution ou d'embolie ... 41
I.3.3 Mouvement de convergence-extension (CE) ... 43
I.4 Mécanisme de la transition épithélio-mésenchymateuse au cours de l'embryologie .. 45
I.4.1 Définition de la transition épithélio-mésenchymateuse ... 45
I.4.2 Mécanisme cellulaire des mouvements de la gastrulation et la formation des crêtes neurales . 47 I.4.2.1 La transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) dans l'embryogenèse ... 47
I.4.2.2 Régulation transcriptionnelle de la TEM ... 47
I.5 Les protéines de la famille des ZICs ... 50
I.5.1 Généralité sur les ZICs ... 50
I.5.1.1 Organisation génomique des gènes de la famille des ZICs ... 51
I.5.1.2 Structure de la famille des protéines ZICs ... 51
vii
I.5.1.4 Fonctions biologiques des protéines Zic au cours du développement embryonnaire ... 54
I.5.2 Zinc finger of Cerebellum 2 (Zic2) ... 56
I.6 Régulation épigénétique du développement embryonnaire chez le xénope ... 58
I.6.1 Le nucléosome et les différentes formes de chromatine ... 59
I.6.2 Les modifications épigénétiques ... 60
I.6.2.1 La méthylation l'ADN ... 60
I.6.2.2 Les modifications des histones... 61
I.6.3 L’épigénome durant le développement embryonnaire précoce chez le xénope ... 63
I.6.4 Rôle de Wnt/β-caténine et de Zic2 dans la régulation épigénétique des gènes ... 64
I.7 Rationnel et objectif des travaux de recherche ... 67
CHAPITRE II : RESULATS ... 69
II.1- Zic2 régule épigénétiquement l'activation des gènes cibles directs de wnt/β-caténine au cours de la formation de l’Organisateur chez le xenope ... 70
II.1.1 Zic2 est indispensable dans la formation de l’axe embryonnaire dorso-ventral chez le xénope ... 70
II.1.2 - Zic2 est impliqué dans la répression des facteurs ventraux dans le centre Organisateur ... 76
II.1.3 - La déplétion du gène Zic2 affecte la régulation des gènes de l'Organisateur qui sont des cibles des voies de signalisation Wnt/β-caténine et TGF-β ... 79
II.1.4 - Zic2 zygotique favorise l'activation unidirectionnelle de la voie de signalisation Wnt/β-caténine vers la voie TGF-β ... 82
II.1.5 Zic2 maternel joue un rôle crucial dans la signature épigénétique de Wnt/β-caténine ... 85
II.2 Rôle(s) de Zic2 dans les mouvements morphogénétiques de la gastrulation ... 89
II.2.3 Zic2 régule l’expression de l’E-cadhérine indépendamment de slug/snail2 et twist1 ... 96
CHAPITRE III : DISCUSSION ... 100
III .1 Régulation de l’activation de l’expression transcriptionnelle des gènes par Zic2 maternel au cours du développement précoce chez le xénope. ... 102
III.2 Coordination de l’interaction Wnt/β-caténine et TGF-β par Zic2 ... 106
III.3 Zic2 intervient dans les mouvements cellulaires de la gastrulation ... 107
CHAPITRE IV : METHODOLOGIE ... 113
IV.1-Matériels ... 114
IV.1.1 Réactifs ... 114
viii
IV.1.2.1 Les embryons et explants et leurs milieux ... 116
IV.1.2. 2 Solution d'hybridation ... 117
IV.1.2.3. Gel d'agarose pour l'ADN et autres tampons ... 122
IV.1.2.4 Solution de Chromatine Immuno-Precipitation ... 122
IV.1.2. 5 Milieux et antibiotiques ... 124
IV.1.3 Kits de réaction ... 125
IV.1.4 Les anticorps. ... 125
IV.1.5. Souches bactériennes et vecteurs ... 125
IV-2 Méthode ... 127
IV.2.1 Expérience en embryon ... 127
IV.2.1.1 Constructions d'ADN, synthèse d'ARN ... 127
IV.2.1.2 Xenopus laevis : Ponte des œufs et fécondation ... 128
IV.2.1.3 Manipulation des embryons et micro injection ... 128
IV.2.1.4 Fixation des embryons de xénope au MEMFA ... 131
IV.2.1.5 Whole Mount in situ hybridation (WMISH) ... 131
IV.2.1.6 Chromatine immunoprécipitation pour xénope ... 137
IV.2.1.7 Extraction d'ARNm ... 139
IV.2.1.8 Test luciférasiques ... 143
IV.2.2 Test statistique ... 143
BIBLIOGRAPHIE ... 144
ix LISTE DES FIGURES
Figure 1: Cycle de developpement de xénope à 25°C ... 23
Figure 2: Importance de la rotation corticale et de la voie Wnt/β-caténine dans la formation de l'axe dorso-ventral ... 28
Figure 3: Composantes de la voie TGF-B/Activine/Nodal/BMP ... 31
Figure 4:Modèle de formation de l'Organisateur, du mésoderme au stade blastula par le gradient dorso-ventral de molécules de Xnr sécrétées par l'endoderme ... 33
Figure 5: Protéines sécrétées par les centres de signalisation dorsale (Organisateur) et ventrale dans la gastrusla.. ... 36
Figure 6: L'Organisateur est une source d'antagonistes des facteurs de croissance sécrétées . 38 Figure 7:Les bases cellulaires du mouvement d'épibolie ... 41
Figure 8:Réarrangement des tissus dans l'embryon de Xenopus au cours de la gastrulation à différents stades ... 42
Figure 9 : Le mouvement de convergence-extension comprend deux types de mouvements cellulaires ... 45
Figure 10:Transition épithélio-mésenchymateuse et ses marqueurs clés ... 46
Figure 11:Facteurs de transcription induisant la TEM ... 48
Figure 12:Organisation structurale des membres de la famille Zic ... 53
Figure 13:Organisation et modifications de la chromatine ... 59
Figure 14:Méthylation de l'ADN et répression génique au cours de l'embryogénèse chez les mammifères ... 61
Figure 15: Rôle des modifications post-traductionnelles des histones sur la régulation épigénétique des gènes ... 63
Figure 16: Activité de remodelage de la chromatine de Zic2 ... 66
Figure 17:Zic2 maternel est nécessaire pour la formation de l'axe dorso-ventral induit par Wnt/β-caténine chez le Xenopus laevis ... 74
Figure 18:Zic2 est impliqué dans les mouvements de gastrulation et dans la répression des gènes ventraux dans l'Organisateur par la voie Wnt/B-caténine ... 78
Figure 19:Zic2 est requis pour l'intereaction entre les voies de signalisation TGF-B et Wnt canonique pendant la formation de l'Organisateur ... 82
x
xi LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1:Listes des gènes les plus importants de l'ontologie des gènes d'un ensemble (GO)
de la β-caténine+ Zic2MO1H ... 75
Tableau 2: Solution de coloration x-gal ... 118
Tableau 3:Liste des ARNm et oligonucléotides injectés ... 130
Tableau 4:Protocole de réhydratation des embryons ... 132
Tableau 5:Conditions de traitement des embryons à la protéinase K en fonction du stade de développement ... 133
Tableau 6:Protocole d'acétylation et de fixation des embryons ... 133
Tableau 7:Refixation ... 134
Tableau 8: Etapes d'hybridation des embryons ... 134
Tableau 9: Etapes de lavages des embryons ... 135
Tableau 10:Blocage des embryons et incubation des anticorps ... 136
Tableau 11: Coloration et clarification des embryons ... 136
Tableau 12: Protocole de blanchiment des embryons ... 137
Tableau 13: Listes des amorces utilisées pour la qPCR ... 141
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LISTES DES ABREVIATIONS
ADN : acide désoxyribonucléique ADNc : ADN complémentaire APB : tampon alkalin-phosphatase
APC : le suppresseur de tumeur Adenomous Polyposis Coli APS : ammonium peroxodisulfate
ARNm : Acide ribonucléique messager ATP : Adénosine triphosphate
BCIP : 5-bromo-4-choro-3-indolyl-phosphate BMB : Block Boehringer
BMP : protéine morphogénétique osseuse ou Bone Morphogenetic protein bp : base pairs
BSA : sérum albumine bovin CE : convergence et extension
CHAPS 3 : 3-cholamidopropyl dimethylammonio-1-propansulfate CREB : cAMP response element-binding protein
dH2O : H2O distillée
DIG : Digoxigenine-11-2´-deoxyuridine-5´-triphosphate DKKs : Dickkopf-1
DMSO : Dimethylsulfoxide Dnase : Deoxyribonuclease
Dnmt : ADN méthyltransférase (DNA methyltransferase)
dNTP : desoxyribonucleotide triphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) DTT : dithiotreitol
DV : dorso-ventral Dvl : Dishvelled
ECM : matrice extracellulaire (Extracellular matrix) EDTA : ethylene diamine tetraacetate
EGTA : ethylenglycol-bis(2-aminoethylether) -N, N'-tetraacetate F : forward (Amorce)
Fz : Frizzled
GSK-3β : protéine sérine/thréonine kinase Glycogène synthase kinase-3β
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HDAC : Enzyme histone déacetylase
HEPES : acide N-(-hydroxymethyl) piperazine, N'-3-propansulfone HPE : Holoprosencéphalie
HMT : histone methyltransferase IP : Immunoprécipitation
IPTG : isopropyl-ß-D-thiogalacto-pyranoside LB : Luria-Bertrani medium 023761110
MBT : transition mi-blastula (Mid-blastula transition) MEM : MOPS-EGTA-MgSO4
MEMFAMOPS-EGTA : MgSO4-Formaldehyde-Buffer MOPS : 3-(N-Morpholino) propanesulfonic acid
MO : morpholino oligonucleotide NBT : nitro-blue-tetrazolium PCR : polymerase chain reaction
pH : Prepondirance of hydrogen ions (potentiel d’hydrogène) PRP : protéines riches en proline
R : amorce reverse
RT-PCR : Reverse transcriptase –PCR SDS : sodiumdodecylsulfate
sFRPs : Secreted Frizzled–related proteins SSC : tampon citrate salin standard
TBE : Tris-Borate-EDTA-Electrophoresis
TBP : Proteine de liaison à la boite TATA (TATA box protein)
TCF/LEF : T cell factor /Lymphoid Enhancer facteur TEMED : N, N, N’N'-tetramethyl-ethylenediamine
TGF-β : facteur de croissance transformant béta (Transforming growth factor beta) Tris : trihydroxymethylaminomethane
U : units
UTR : Unstranlated region UV : ultraviolet
X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactoside Xnr : xenopus nodal-related
ZIC : Zinc finger of cerebellum
xiv
ZF-NC : Zinc finger N-flanking conserved ZMI : zone marginale involutive
xv ABSTRACT
xvi RÉSUMÉ
xviii REMERCIEMENTS
Ce long parcours de thèse s'est fait avec le soutien de plusieurs personnes et je saisis cette occasion pour leur manifester toute ma reconnaissance, notamment
Prof. Jacob SOUOPGUI qui m’a donné l’opportunité de mener des recherches sous sa tutelle et pour son soutien indéfectible, sa compétence et disponibilité dans tous les aspects de cette étude. Les innombrables heures d'échanges tant théoriques que pratiques passées dans son bureau ont été une très grande source d'inspiration.
Ce fut également un plaisir absolu de travailler si étroitement avec Dr Olive TCHOUATE, ma co-promotrice.
Par ailleurs, je voudrais remercier les collègues et amis du Laboratoire de Prof J. SOUOPGUI pour leur amitié et précieux conseils. Merci aux Dr Robert SHEY, Ferdinand Ngale et Jean-Claude TOMANI, pour la convivialité ainsi que les encouragements reçus durant mon séjour au laboratoire
Ma gratitude va également à tous les participants qui ont accepté d'être collaborateurs de ce projet et nous ont aidé à faire de RNA-seq, CHIP sans oublier ceux qui nous ont fourni des constructions plasmidiques. Merci à Rob Houtmeyers du Laboratoire de Sabien Taijar (KUL) pour des nombreuses discussions et expériences faites ensemble.
Je remercie également mes ami(e)s qui ont été autours de moi tout le long de ce parcours et qui n’ont jamais céssés de me soutenir et de m’encourager. Il s’agit de Omer SEUWA, Marc TEKAM, Vanessa NANA, Lise FEPI, Michel NGOUOH, Arnaud TELEFO, Boris KENGUE et Emmanuel ZEMAGO (RIP). Je vous serais toujours reconnaissant.
Ma gratitude va vers mes frères/oncles Calvin LEMOGE, Didier TAKAFO, Leon TAKAFO, Olive MALABONG, Thomas FOUEFACK, Emile TAKAFO, SM Aristide TAGUIMDJEU II et Michel TADONTSA (RIP) pour vos encouragements.
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I.1 Xénope comme modèle d'étude en embryologie moléculaire
La génétique du développement est un domaine d’investigation de l'embryologie dont l’objectif principal est de comprendre les réseaux et la régulation des gènes impliqués dans la formation d’un organisme adulte complexe à partir d’une seule cellule, le zygote. De nombreuses études en embryologie ont permis de définir certains objectifs pertinents, notamment le développement des protocoles expérimentaux pour la génération de types de cellules spécifiques à partir de cellules précurseurs pluripotentes in vitro à utiliser dans les applications médicales pour le traitement de maladies associées à la dégénérescence cellulaire. En outre, la biologie du développement peut constituer une base pour le développement ciblé de médicaments et une meilleure compréhension des maladies associées aux troubles génétiques. L’utilisation des modèles animaux appropriés pour analyser de nombreuses questions a été l’une des préoccupations majeures dans ce domaine.
La grenouille africaine à griffe, Xenopus laevis dont le cycle de développement est décrit dans la figure 1, a été longtemps considérée comme un outil inestimable en biologie pour étudier l'embryologie et le développement des vertébrés, notamment les processus cellulaires et moléculaires de la gastrulation. Le xénope et l'humain présentent plusieurs similarités au point de vue anatomique, physiologique et, par conséquent, génétique (Schmitt et al., 2014; Wheeler and Brandli, 2009). Le séquençage et l'annotation du génome de xénope montrent un grand niveau de synténie avec le génome humain et près de 90% des gènes des maladies humaines sont retrouvés chez le xénope. De plus, le degré de conservation de leurs séquences est élevé (Blum and Ott, 2018; Hellsten et al., 2010). Les réseaux de régulation de l'expression des gènes chez le xénope sont similaires à ceux retrouvés chez l'humain (Blitz et al., 2006).
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humaine (HGC). La fécondation chez le xénope peut se faire naturellement ou artificiellement par simple addition des spermatozoïdes contenus dans des suspensions provenant des testicules. Le développement embryonnaire est externe, rapide et permet d'observer facilement toutes les étapes du développement.
La grande taille des œufs/embryons permet aux scientifiques d'effectuer aisément des micro-injections dans les blastomères (cellules progénitrices) d’intérêts ou des microdissections de région bien définie de l'embryon ; ce qui permet d'observer les différentes étapes de l'embryogénèse et d'étudier au niveau moléculaire les mécanismes qui y sont impliqués. L'une des caractéristiques qui fait aussi du xénope un modèle unique pour l'étude des maladies génétiques humaines est la possibilité d’exploiter son caractère bilatéral pour injecter l'embryon d’un côté et d’utiliser le côté controlatéral comme contrôle interne. Ceci est très important lors de l’évaluation des conséquences phénotypiques des manipulations expérimentales car la variation de l’expression du gène type sauvage peut parfois être considérable en fonction des différents embryons (Blum and Ott, 2018).
22
Les expériences de gain et/ou de perte de fonction peuvent être effectuées dans les embryons entiers ou dans des explants de calotte animale de xénope. Les mutations de gain de fonction, beaucoup moins fréquentes, confèrent une activité anormale à une protéine. C’est pour cette raison que la perte de fonction est mieux indiquée pour étudier la fonction endogène d’un gène. La perte de fonction peut aussi être une conséquence d’une délétion du gène ou d’une inhibition de la traduction de l’ARN messager par des oligonucléotides antisens tels que les shRNA, le ARNi et les oligonucléotides morpholino (MO oligo). Les morpholinos sont très utilisés chez le xénope pour induire une perte de fonction ou knock down(Heasman, 2002). Les morpholinos sont des analogues synthétiques de nucléotides (Summerton, 1999) qui reconnaissent et lient de courtes séquences (environ 25 nucléotides) et bloquent ainsi la traduction ou l'épissage correct de l’ARN (Draper et al., 2001; Heasman, 2002). En raison de leur squelette complètement non naturel, les morpholinos ne sont pas reconnus par les protéines cellulaires. Les nucléases ne dégradent pas les morpholinos ni dans le sérum ni dans les cellules (Hudziak et al., 1996). Les morpholinos ciblent simultanément les ARNm maternels et zygotiques, sauf cas d’épissage alternatif des ARNm zygotiques, offrant une situation avantageuse pour l'étude du développement précoce. L’un des principaux avantages de l’utilisation de MO réside dans sa capacité à cibler facilement plusieurs produits géniques, ce qui est important pour l’analyse de la redondance fonctionnelle des gènes, qui sont beaucoup plus difficiles à analyser génétiquement (Blum et al., 2015). Un autre grand avantage des MOs est que l’on peut combiner plusieurs MO simultanément pour inhiber plusieurs gènes ayant une fonction similaire (Blum et al., 2015). Par exemple Harland et ses collègues ont montré que la déplétion simultanée (par injection des MOs) des gènes noggin, follistatin et chordin qui codent pour des antagonistes de BMP entraine une ventralisation de l’embryon (Khokha et al., 2005). Il est fréquent que des gènes soient exprimés dans de nombreux tissus au cours du développement et, par conséquent, il est souhaitable de réaliser des expériences de perte de fonction de ces gènes d'une manière spécifique au tissu, ce qui peut souvent surmonter ou retarder la létalité embryonnaire (Blum et al., 2015).
Par ailleurs, les morpholinos ont également des inconvénients, notamment un masquage incomplet et des effets délétères non spécifiques occasionnels et non ciblés. Bien que relativement stables, les morpholinos se diluent dans l'animal avec le temps, ce qui signifie que leur efficacité diminue à un stade ultérieur.
23 Figure 1: Cycle de developpement de xénope à 25°C
Le processus de gastrulation se produit autour de 8 heures suivant la fécondation, alors que la neurulation est terminée après environ 12 heures. Le stade bourgeon caudal démarre. Le têtard est obtenu après 3jours. En fonction du type d'aliments, un adulte peut être élevé durant un an ou plus. Source :https://www.xenbase.org/anatomy/intro.do
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ou autre région d’intérêt du génome de xénope et de procéder à une coupure les doubles brins d’ADN, laquelle coupure entraine une mutation associée à une perte de fonction. Également, des expériences de gain de fonction peuvent être pratiquées. Dans ce cas la réparation des doubles brins d’ADN coupés de manière ciblée par les nucléases s’accompagne de l’insertion par recombinaison homologue du fragment d’ADN (transgène) d’intérêt (Banach et al., 2017; DeLay et al., 2018; Feehan et al., 2019; Miyamoto et al., 2015; Ratzan et al., 2017) .
I.2 Développement de l'axe dorso-ventral et de l'Organisateur
I.2.1 Contrôle maternel du développement embryonnaire
Au cours de l'oogenèse chez le xénope, l'ovocyte est caractérisé par une intense activité transcriptionnelle qui s'arrête à la maturation (Wormington and Brown, 1983). Les déterminants maternels ainsi que les composantes du cytosquelette ont une distribution qui suit la polarité animale-végétative déjà présente dans l'œuf (Chang et al., 1999; Sardet et al., 2004). La fécondation permet l'activation des évènements cellulaires notamment le remodelage du cytosquelette, et la rotation corticale. Cette dernière est un processus par lequel le cytoplasme cortical ou le plus externe tourne par rapport au cytoplasme interne, entraînant la translocation des déterminants maternels initialement localisés au pôle végétatif sur la future face dorsale du zygote (Fig. 2) (Houston, 2012; Moon and Kimelman, 1998), ce qui permet aux embryons d'acquérir des axes dorso-ventral (DV) et antéro-postérieur (Moon and Kimelman, 1998; Sardet et al., 2004).
Une fois la fécondation terminée, les cellules subissent une série de division synchrone qui se ralentit à partir de la 12ème division de clivage quand la transition mi-blastula (MBT) débute. La transition mi-blastula (MBT) est le stade développement au cours duquel le génome zygotique s'active avec à la clé une dégradation des transcrits maternels par les microARN (miR) (Rosa and Brivanlou, 2017; Schier, 2007) dans l'embryon après une série de clivages rapides et synchrones de l’œuf (Audic et al., 2002; Newport and Kirschner, 1982). Le stade MBT marque aussi le début de la mobilité cellulaire au niveau des progéniteurs de l'ectoderme et ce qui correspond chez le xénope au stade 4000 cellules (Heasman, 1997; Heasman, 2006).
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miR-309 représentent respectivement les orthologues de la miR-427. La fonction des microRNAs dans l'embryon est de dégrader les transcrits maternels pour favoriser une meilleure transition maternelle-zygotique (Bushati et al., 2008; Giraldez et al., 2006).
Le développement de l'axe DV chez de nombreuses espèces telles que le xénope, le poisson zèbre, etc. est indissociable de la formation au côté dorsal du premier tissu embryonnaire qu'on appelle l'Organisateur ; il s'agit de l'équivalent du nœud embryonnaire chez la souris et l'humain (Hikasa and Sokol, 2013). L'Organisateur est un tissu transitoire qui se forme dans la partie équatoriale dorsale de l'embryon des amphibiens au stade blastula et qui agit au stade gastrula en secrétant des inducteurs aux cellules environnantes dans le but de favoriser la spécification des axes et la régionalisation embryonnaires (Harland and Gerhart, 1997).
I.2.2 La spécification de l'axe dorso-ventral : de la fécondation avant le stade 32 cellules
Il n'existe aucune indication au sujet de la polarité DV dans l’ovocyte non fécondé (Heasman, 2006; Moon and Kimelman, 1998). L'entrée du pronucléus mâle dans l'ovocyte via le pôle animal active ce dernier et déclenche une cascade d'évènements qui concourent à l'établissement d'une activité de dorsalisation du côté opposé au point d'entrée du spermatozoïde (Moon and Kimelman, 1998; Weaver and Kimelman, 2004). En effet, une fois le spermatozoïde entré dans l'ovocyte, les microtubules du cytoplasme cortical subissent un réarrangement du pôle animal vers le pôle végétatif, ce qui provoque une rotation corticale par rapport à la surface de l'embryon (Fig. 2). Ce processus de rotation corticale, est conduit par un appareil de microtubules parallèles localisés sur la surface végétative de l'embryon. Ils apparaissent au début de la rotation et disparaissent une fois celle-ci terminée (Elinson and Rowning, 1988). Cette rotation a lieu au cours du premier cycle cellulaire (Houliston and Elinson, 1992; Houston, 2012), vers le point d'entrée du spermatozoïde laissant, à l'opposé du point d'impact du spermatozoïde, une région dépigmentée dont la forme ressemble à un croissant d'où le nom croissant gris (Houston, 2012; Weaver and Kimelman, 2004). Le côté dépigmenté marque le futur côté dorsal tandis que le côté pigmenté marque le futur côté ventral (De Robertis et al., 2000).
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la rotation corticale est l'initiation de la formation de l'axe DV (De Robertis et al., 2000; Houston, 2012; Moon and Kimelman, 1998).
Chez le xénope, le poisson zèbre et la drosophile, il existe une répartition des facteurs maternels dans l'ovocyte avant la fécondation qui contrôlent les événements précoces de l'embryogenèse depuis la formation de l'axe DV jusqu'à l'activation du génome zygotique à la transition mi-blastula (MBT) (Etkin, 1988; Heasman, 2006).
La plupart des déterminants maternels sont localisés au pôle végétatif (Holowacz and Elinson, 1993). Une inhibition des microtubules par irradiation aux rayons ultraviolet (UV) du pôle végétatif de l'embryon ou par un traitement au nocodazole ou encore par la baisse de température inhibe la rotation corticale (Fig. 2b) et entraîne une ventralisation de l’embryon (Fujisue et al., 1993; Holowacz and Elinson, 1993; Kikkawa et al., 1996; Sakai, 1996).
Chez le xénope, les déterminants maternels, sont entre autres : les facteurs de transcription tels le facteur T-cell Xtcf3 qui est membre de la famille des LEF/TCF (Houston et al., 2002), la protéine T-box VegT qui est localisée au pôle végétif (Zhang et al., 1998) et Vg1 qui est plus enrichi dans le quadrant végétatif-dorsal de l'embryon (Birsoy et al., 2006), les cAMP response element-binding protein (CREB) (Sundaram et al., 2003). Les protéines de liaison à la boite TATA (TBP), notamment la TBP1 et TBP2, sont aussi indispensables pour le développement normal avant la MBT (Heasman, 2006). Le ligand wnt11 est aussi maternellement exprimé et il joue aussi un rôle dans la formation des structures dorsales (Ku and Melton, 1993).
Le mouvement du cytoplasme cortical entraîne l'accumulation des composantes de la voie Wnt/β-caténine notamment dishvelled (Dvl) du côté dorsal (Fig. 2a), avec pour conséquence directe la stabilisation cytoplasmique de la β-caténine du côté dorsal suivie de sa translocation dans le noyau cellulaire (Fig. 2a) (Larabell et al., 1997; Schneider et al., 1996). En fait La liaison du ligand Wnt à son complexe récepteur composé du Frizzled et de LRP5/6 déclenche une série d'événements qui perturbent le complexe APC/Axin/GSK3 nécessaire à la destruction ciblée de la β-caténine par le protéasome (Gordon and Nusse, 2006).
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membranaires qui activent les protéines dishvelled (Dvl) cytoplasmiques. Chez le xénope, l'expression ectopique de Dvl cause la formation de l'axe dorsal du fait de la fonction active de cette protéine (Rothbacher et al., 1995; Sokol et al., 1995), mais son mutant dominant négatif n'empêche aucunement la formation de l'axe dorsal endogène (Sokol, 1996), ce qui montre que la stabilisation de la β-caténine se fait en aval de Dvl. La translocation de Dvl antagonise l'activité de la protéine sérine/thréonine kinase glycogène synthase kinase-3β (GSK-3β), un régulateur négatif de la voie Wnt/β-caténine. L'expression ectopique du mutant dominant négatif de GSK-3β entraîne la formation des structures dorsales ectopiques tandis que l'expression de la GSK-3β sauvage produit un effet opposé (Dominguez et al., 1995; He et al., 1995). En effet, la GSK-3β est une enzyme ubiquitaire qui fait partie du complexe de dégradation de la β-caténine (Peifer and Polakis, 2000), avec l'axine et le suppresseur de tumeur Adenomous Polyposis Coli (APC) (Hikasa and Sokol, 2013). En absence de la transduction du signal de la voie Wnt/β-caténine, la GSK-3β phosphoryle la β-caténine par l'β-Trcp de l'ubiquitine ligase E3, qui cible la β-caténine et entraîne sa dégradation protéolytique par le complexe de protéasome (MacDonald et al., 2009; Nakamura and Hoppler, 2017; Verras and Sun, 2006). La protéine Dvl interagit avec le récepteur Frizzled pour inhiber le protéasome et favoriser la stabilisation cytoplasmique de la β-caténine cytoplasmique (Hikasa and Sokol, 2013). Le traitement des embryons au chlorure de lithium entraine l’inhibition du protéasome et une accumulation de la β-caténine cytoplasmique (De Robertis, Larrain et al. 2000). Ce dernier migre dans le noyau cellulaire au cours des clivages d'où il forme un complexe hétérométrique avec le facteur de transcription TCF3 (Nakamura and Hoppler, 2017; Verras and Sun, 2006), membre de la famille High mobility group-box protein pour activer précocement les gènes zygotiques dorsaux tels que Xnr5 et Xnr6 (au stade 256 cellules), siamois, twin et le Xnr3 dans les blastomères dorsaux au stade MBT (Bouwmeester, 2001; De Robertis et al., 2000; Heasman, 2006; Heasman et al., 2000; Schneider et al., 1996; Yang et al., 2002). Les facteurs de transcription Twin et Siamois vont à leur retour activer certains gènes zygotiques en aval de la β-caténine dans les embryons au stade 4000 cellules (Bouwmeester, 2001).
28 Figure 2: Importance de la rotation corticale et de la voie Wnt/β-caténine dans la
formation de l'axe dorso-ventral
a) Une fois l'ovocyte fécondé, les réseaux de microtubules parallèles de microtubules corticaux
29 I.2.3 De la transition mi-blastula (MBT) à la gastrulation : induction du méso-endorme et dorsalisation des feuillets embryonnaires
À la transition mi-blastula, les facteurs de transcription Siamois et Twin induisent l'activation des gènes tels que goosecoid et des nodals. Ces derniers à leur tour vont activer une série de gènes cibles en aval. Cette activation des gènes zygotiques par la voie Wnt/β-caténine se fait en synergie avec la voie TGF-β. Les signaux qui régulent l'induction du mésoderme peuvent être classés en deux catégories, notamment les signaux inducteurs et de de régionalisation de mésoderme.
I.2.3.1 Induction du mésoderme
L'endoderme est la source des signaux d'induction du mésoderme. Il secrète les signaux qui contribuent à la formation du mésoderme ventral et dorsal via l'activation de la voie de signalisation TGF-β/Activin/Nodal (Fig. 3). Dans l'embryon, il existe un gradient de l'activité de nodals le long des axes animal-végétatif et dorso-ventral (Kimelman, 2006). À la mi-blastula, les molécules maternelles du pôle végétatif telles que le facteur de transcription T-box VegT et la protéine Vg1 (membre de la famille TGF-β) activent l'expression des Xnr1, Xnr2, Xnr4 et derrière dans les cellules mésendodermiques selon le gradient dorsal à ventral et initient ainsi la formation du mésoderme (Fig. 3) (Birsoy et al., 2006; Clements et al., 1999; De Robertis et al., 2000).
I.2.3.1.1 VegT
30 siamois dans le pôle végétatif dorsal et contribue ainsi à la formation de l'Organisateur (Li et al., 2015; Xanthos et al., 2002; Xanthos et al., 2001). VegT contribue également à l'induction du mésoderme en activant aussi l'expression des gènes tels que Xnr1, Xnr2, Xnr4, Xnr5, Xnr6 et derrière, selon un gradient dorso-ventral. Ces molécules sont aussi très importantes pour les mouvements de gastrulation dans l'embryon (Clements et al., 1999; Kofron et al., 1999; Luxardi et al., 2010). La superfamille des ligands TGF-β comprend : les protéines morphogénétiques osseuses (BMPs), les facteurs de croissance et de différenciation (GDF), l’hormone anti-Müllerien (AMH), l’activine, les nodals et le TGF-β ainsi que la lefty (Gaarenstroom and Hill, 2014; Liu et al., 2018).
I.2.3.1.2 Composantes maternelles de la voie TGF-β/Activin/Nodal/Vg1
La famille TGF-β peut être divisée en fonction des récepteurs de type I et des récepteurs utilisés par les membres de la famille. Les signaux BMP utilisent généralement les récepteurs Alk 3 et 6 de type I, et les adaptateurs Smad 1, 5 et 8, alors que les TGF-β, nodals, Activin et certains GDF utilisent les récepteurs Alk 4, 5 et 7 de type I et les adaptateurs Smad 2 et 3 (Pauklin and Vallier, 2015). Il a été démontré que certaines modifications pouvaient rendre ces récepteurs constitutivement actifs. Par exemple, les mutations du récepteur Alk4 où la thréonine 206 est remplacée par l’aspartate - ALK4(T206D), ou par le glutamate – ALK4(T206E) imitent la forme phosphorylée du récepteur normal, rendant ainsi ces mutants constitutivement actifs (Bernard et al., 2006; Chang et al., 1997).
Les ligands extracellulaires activine et nodals se lient aux récepteurs transmembranaires de type I (ACVRIIA/IIB) et de type II (ALK4/7), alors que les facteurs de croissance TGF-β se lient à TGFBRI et TGFBRII/ALK5. Les nodals ont besoin de la liaison supplémentaire du co-récepteur transmembranaire CRIPTO1 pour former un complexe récepteur activé avec les récepteurs de type I et de type II (Pauklin and Vallier, 2015).
31 Figure 3: Composantes de la voie TGF-B/Activine/Nodal/BMP.
32
Cette liaison TGFβ-récepteurs va induire une activation par phosphorylation des protéines Smad ou R-smad (Smad1, 2, 3, 5 et 8) intracellulaires. Les R-smads se lient au co-smads tel que smad4. Les complexes R-SMAD/coSMAD s'accumulent dans le noyau où ils agissent en tant que facteurs de transcription et participent à la régulation de l'expression du gène cible (Pauklin and Vallier, 2015; Weiss and Attisano, 2013). Les smads inhibiteurs (6 et 7) sont capables de bloquer la formation du complexe R-smad/co-Smad et d’inhiber ainsi la voie de signalisation TGF-β (Pauklin and Vallier, 2015).
Les ligands nodals et les activine-like sont les membres de la grande famille des molécules TGF-β et ils jouent un rôle dans la spécification et régionalisation du mésoderme dans la blastula ainsi que dans les mouvements de gastrulation (Agius et al., 2000; McDowell and Gurdon, 1999; Pauklin and Vallier, 2015; Syed, 2016). Les ligands de cette voie chez le xénope incluent les protéines maternelles Vg1 et activine, ainsi que le Derrière zygotique, et cinq ligands nodal-related, Xnr1, Xnr2, Xnr4, Xnr5 et Xnr6. Le Xnr3 diffère des autres ligands nodals chez le xénope dans la mesure où il n’est pas impliqué dans l'induction du mésoderme, mais plutôt dans la formation de l'Organisateur parce qu'il est capable d'antagoniser le BMP (Hansen et al., 1997; Smith et al., 1995). Les nodals ont besoin de la liaison supplémentaire du co-récepteur transmembranaire CRIPTO1 pour former un complexe récepteur activé avec les récepteurs de type I et de type II (Pauklin and Vallier, 2015).
Le Vg1 est maternel et est localisés au pôle végétatif. La perte de fonction de Vg1 suggère qu’il joue effectivement un rôle dans la signalisation des nodals et la formation du mésoderme (Birsoy et al., 2006; Shah et al., 1997). La déplétion de Vg1 entraine une perturbation des mouvements de gastrulation, des défauts dans la formation des structures antérieures et une perte du signal de P-Smad2 dans l'embryon (Birsoy et al., 2006). Vg1 et la β-caténine contribuent ensemble à la formation de la ligne primitive dans l'embryon de poussin (Skromne and Stern, 2001).
33
La faible concentration de nodal du côté ventral conduit à la formation du mésoderme ventral (Fig. 4).
Figure 4: Modèle de formation de l'Organisateur, du mésoderme au stade blastula par le gradient dorso-ventral de molécules de Xnr sécrétées par l'endoderme
Au stade de blastula, la β-caténine accumulée au côté dorsal, et le facteur de transcription VegT et la Vg1(ligand de la famille de TGF-β) situés au pôle végétatif s’associent pour générer un gradient de molécules nodal-related (Xnrs) exprimées dans l'endoderme dorsal. En retour, ce gradient induit la formation du mésoderme dorsal : de faibles doses de molécules nodal-related (Xnrs) conduisent à la formation du mésoderme ventral, alors que des doses élevées entraînent la formation du mésoderme dorsal y compris l'Organisateur. Le centre de Nieuwkoop est la région de l’endoderme dorsal responsable de l’induction de l’organisateur. Au stade gastrula, l’organisateur sécrète un cocktail de molécules qui intervient dans la régionalisation de l’embryon. Il est à noter que la β-caténine est largement distribuée sur le côté dorsal des trois feuillets embryonnaires. CNS, système nerveux central) (De Robertis et al., 2000).
34
I.2.3.1.3 Intégration de la voie TGF-β et Wnt /β-caténine
Les voies TGF-β/Activin/Nodal et Wnt/β-caténine sont deux voies de signalisation distinctes indispensables pour le développement. La diaphonie entre les voies TGF-β et Wnt/β-caténine a été considérée comme une transrégulation réciproque dans laquelle une voie régule les composantes de l’autre ou une interaction qui fait référence à la communication croisée entre les composantes moléculaires de la voie embryonnaire (Minoo and Li, 2010). À titre d’exemple, la composante de la voie Wnt/β-caténine actine intervient dans la stabilisation des Smads dans la voie TGF-β (Furuhashi et al., 2001). Par ailleurs, il a été reporté que LEF-1 et les Smads agissent ensemble pour activer directement l'expression de twin en se liant à son promoteur (Labbe et al., 2000; Nishita et al., 2000). Les voies TGF-β et Wnt/β-caténine coopèrent pour activer le promoteur de la gastrine murine (Lei et al., 2004). twin et siamois sont deux gènes redondants précocement exprimés dans l'Organisateur dès la MBT chez le xénope (Bae et al., 2011). De plus, les facteurs de transcription Siamois et Twin, cibles directes de la voie Wnt/β-caténine, et les Smads s'intègrent au niveau des promoteurs de certains gènes de l'Organisateur tels que goosecoid, Cerberus etc. pour les activer (Agius et al., 2000; Crease et al., 1998; Engleka and Kessler, 2001; Reid et al., 2012; Watabe et al., 1995). Le promoteur de goosecoid chez le xénope contient deux parties, une partie proximale sur laquelle se lient Siamois et Twin (Bae et al., 2011) et une partie distale qui comportent les sites de liaison pour le complexe hétérodimère smad2-smad4 (Watabe et al., 1995). Le facteur de transcription Goosecoid une fois activé va induire en retour l'expression de plusieurs gènes dorsaux, notamment Chordin (Sasai et al., 1994). Le centre Organisateur exprime d'autres gènes qui codent pour les protéines telles que la protéine morphogénétique anti-dorsalisation (ADMP), sonic heghog (Shh) et l'insulin like growth factor binding protein 5 (IGFBP5). L’IGFBP5 est une protéine de liaison au facteur de croissance analogue à l'insuline qui augmente l'activité de l’IGF (Insulin like growth factor).
35
Dans l’endoderme, l’inhibition de la signalisation de la β-caténine par le rayonnement ultraviolet bloque l'induction de la XlHbox-8, un marqueur de l'endoderme dorsal (Henry et al., 1996). Cette perte d’expression de XlHbox-8 peut être restaurée par microinjection des facteurs TGF-β (Henry et al., 1996). La sécrétion des facteurs TGF-β tels que Xnrs sont nécessaires à la différenciation endodermique (Yasuo and Lemaire, 1999). En outre, la première expression de Xnr1, Xnr2 et Xnr4 dans l'endoderme nécessite la voie de la signalisation Wnt/ β-caténine (Agius et al., 2000).
I.2.4 La régionalisation et la formation des axes de l'embryon : Rôles des antagonistes
I.2.4.1 Le centre de signalisation ventrale
Il y a de nombreuses preuves indiquant qu’il existe un centre de signalisation ventral dans la blastula et la gastrula. En fait, plusieurs gènes codant pour des protéines sécrétées ou de surface cellulaire sont exprimés dans le mésoderme et l’ectoderme ventral, à 180° de l'Organisateur (Fig. 5) (De Robertis and Kuroda, 2004). Les analyses ont montré qu’il s’agit de membres du groupe de synexpression protéine morphogénétique osseuse ou bone morphogenic protein 4 (BMP4). Le groupe de synexpression est une famille de gènes physiquement liés ou pas qui interviennent ensemble dans la même voie de signalisation cellulaire. La plupart des gènes du centre de signalisation ventral ont des activités et fonctions biologiques similaires à celles des gènes de l'Organisateur mais sous une régulation transcriptionnelle opposées (De Robertis and Kuroda, 2004). Parmi ces nombreux gènes du groupe de la synexpression BMP4, il y a des gènes suivants :
- Les homeobox Vent1/Vent2/Vox ;
- Xolloid-related (Xlr), qui codent pour une métalloprotéine qui dégrade chordin (Dale et al., 2002) ;
- Sizzled qui code pour la protéine sécrétée apparentée à Frizzled (sFRP) et qui agit en tant qu'inhibiteur de la réaction protéolytique extracellulaire qui contrôle la signalisation des BMP au cours de la gastrulation chez le xénope (Lee et al., 2006a) ;
36 Figure 5: Protéines sécrétées par les centres de signalisation dorsale (Organisateur) et ventrale dans la gastrusla
Dans l'embryon au stade post -MBT, il existe un centre de signalisation dorsale et un centre de signalisation ventrale. Ces deux centres secrètent des antagonistes et des facteurs de croissance requis pour la régionalisation D-V. La plupart de ces facteurs sont décrits dans le texte. ADMP (protéine morphogénétique anti-dorsalisation) est une famille de BMP qui, paradoxalement, s'exprime dans le centre dorsal. IGFBP5 est une protéine de liaison au facteur de croissance analogue à l'insuline qui augmente l'activité de l'IGF (De Robertis and Kuroda, 2004).
I.2.4.2 Inhibiteurs de BMPs
37
BMPs activent les gènes ventraux tels que Xvent et vox qui sont capables d'inhiber l'expression ventrale de chordin et noggin (Melby et al., 1999; Onichtchouk et al., 1996). Ainsi, l'inhibition de la BMP est suffisante pour induire la formation du mésoderme somitique paraxial (Miura et al., 2006).
I.2.4.3 Inhibiteurs de Wnt
38 Figure 6: L'Organisateur est une source d'antagonistes des facteurs de croissance
sécrétées
a) L’Organisateur secrète un ensemble de facteurs dorsaux tels que Noggin, Chordin, Cerberus, Xnr3,
Frzb et Follistatin. Ces protéines ont pour rôle d'antagoniser les protéines du centre inducteur ventral, notamment les BMPs et les Wnts. Ces antagonismes sont indispensables à l'établissement des axes dorso-ventral et antéropostérieur. b) L’Organisateur sécrète des protéines qui se lient à différents facteurs de croissance dans l'espace extracellulaire et bloquent la signalisation au moyen de leurs récepteurs apparentés. Crescent, Frzb-1 et Dickkopf-1 sont Wnt antagonistes. Cerberus est un inhibiteur multivalent antagoniste des Xwnt-8, Xnrs et des BMP. Chordin, Noggin et Follistatin se lient aux protéines morphogénétiques osseuses (BMP) et les inhibent (De Robertis et al., 2000).
I.3 Mouvements de gastrulation chez les vertébrés
Chez les vertébrés la paroi du blastocœle est constituée de plusieurs couches de cellules. Chez le xénope, il est constitué d’un mince épithélium couvrant une couche de cellules internes multistratifiées. Il forme le mince plafond du blastocœle (BCR) au pôle animal, une zone marginale équatoriale d’épaisseur intermédiaire et la masse cellulaire végétative. Ces régions correspondent approximativement à l’ectoderme, mésoderme et endoderme présomptif (voir Figures 7 et 8)(Shook and Keller, 2008). Au cours de la gastrulation les cellules qui tapissent la paroi du blastocoele subissent un ensemble de mouvements de telle sorte que la masse cellulaire végétative et la zone marginale sont internalisés pour donner respectivement naissance à l’endoderme et au mésoderme définitif avant le début de l'organogénèse (Farge,
A
B
a
39
2017; Huang and Winklbauer, 2018b; Keller, 2005; Leptin, 2005; Solnica-Krezel and Sepich, 2012; Tada et al., 2002). Chez le xénope, il existe 4 types de mouvements de gastrulation : - L'épibolie dans l'ectoderme : ce type de mouvement permet l'amincissement et l'étalement du feuillet du pôle animal vers le pôle végétatif dans le but de recouvrir tout l'embryon.
- L'internalisation ou embolie dans le mésoderme : l'internalisation génère trois feuillets embryonnaires en favorisant le positionnement des progéniteurs du mésoderme et de l'endoderme en dessous du futur ectoderme via un blastopore, structure essentielle à la gastrulation.
- La convergence et l’extension dans le mésoderme involutif permet l'intercalation médio latérale des cellules, suivie de leur élongation le long de l'axe antéro-postérieur.
- La rotation végétative
I.3.1 Les mouvements d'épibolie
40
41 Figure 7:Les bases cellulaires du mouvement d'épibolie
Au début de la gastrulation, les cellules du pôle anime sont constitués de deux couches : la couche unistratifiée externe (rouge) et la couche multistratifiée interne (vert). Au fur et à mesure que la gastrulation progresse, la couche couche interne s’amincit et s’expand grâce à l’intercalation radiale des cellules entre elles. Cette intercalation entraine un mouvement des cellules du pôle animal vers le pôle végétatif en vue de couvrir l’embryon entier. Plusieurs molécules chimiques notamment l’élément C3a complement, produites par les cellules de la couche externe de l’ectoderme régulent les mouvements d’intercalation radiale par chimiotactisme. Les molécules C3a se fixent sur leur recepteurs localisés sur les cellules de la couche interne et favorisent les migrations cellulules (Szabo, Cobo et al. 2016).
I.3.2 Mouvements d'involution ou d'embolie
L'internalisation du précurseur mésendoderme est l'événement clé définissant la gastrulation (Solnica-Krezel, 2005b), mouvement conservé chez les invertébrés et les vertébrés (Leptin, 2005). Chez les diploblastiques comme les cnidaires, les premières cellules à pénétrer dans le blastocœle sont les cellules du mésenchyme primaire, qui se détachent du pole végétatif de l’épithélium du blastoderme. L’épithélium forme alors un placode épaissi, qui finit par s’invaginer, probablement par constriction apicale, pour former l’archenteron, qui s’allonge dans le blastocœle par le mouvement de convergente-extension (Leptin, 2005). Chez les triploblastiques, notamment les amphibiens, l'involution est un processus au cours duquel les précurseurs du mésoderme et de l'endoderme migrent à l'intérieur de l'embryon via la fente blastoporale (Fig. 8) (Solnica-Krezel and Sepich, 2012). L’Involution chez le xénope consiste en une migration groupée des cellules (en un feuillet simple) de la zone marginale le long du plafond du blastocœle via la lèvre du blastopore (Hardin and Keller, 1988). En revanche, durant le mouvement d'ingression dans les gastrulas du poussin et de la souris, les cellules individuelles migrent de la couche superficielle vers l'intérieur à proximité du blastopore (Kane and Adams, 2002).
42
l’endoderme et du mésoderme présomptifs antérieurs contre le plafond du blastocœle de l’ectoderme et le déplacement du mésoderme postérieur vers le pôle végétatif (Fig. 8) (Huang and Winklbauer, 2018b; Winklbauer and Damm, 2012; Winklbauer and Schurfeld, 1999).
Chez le xénope, le mésoderme dorsal est subdivisé en plusieurs partie :
-Le chordamésoderme (CM) ou mésoderme axial qui exprime le gène Xbra (qui code pour le facteur de transcription brachury (Xbra)) et est à l’origine de la notochorde
-Le mésoderme préchordal (PCM) qui exprime le gène qui code pour le facteur de transcription Goosecoid (Gsc) et mésendoderme du bord d’attaque (LED) localisé au niveau du coté dorsal du planché du blastocœle qui exprime le Xhex (Huang and Winklbauer, 2018b) .
Figure 8:Réarrangement des tissus dans l'embryon de xénope au cours de la gastrulation à différents stades
Dessins schématiques d’embryons de xénope au début de la gastrulation (stade 10), au début (Stade 10.5) et de la gastrulation moyenne (stade 11). Flèches noires, mouvement cellulaire actif ; flèches blanches, mouvements de cellules passifs ; jaune, cellules en bouteille. BCR (ectoderme), plafond du blastocœle ; CM, chordamésoderme ; LEM, mésendoderme du bord d’attaque ; PCM, mésoderme préchordal (Huang and Winklbauer, 2018b).
43
lamellipodes est induite par la fibronectine présente sur la face interne des cellules du plafond du blastocœle (Winklbauer et al., 1996). Cette migration des cellules le long du plafond du blastocœle (BCR) est contrôlée par plusieurs facteurs notamment les platelet-derived growth factor, PDGF-A (Ataliotis et al., 1995). Ce dernier est exprimé dans le BCR selon un gradient animal-végétatif, et ses différents isoformes sont capables de se lier aux récepteurs PDGF-α localisés dans le mésoderme préchordal (PCM) et le mésendoderme du bord d’attaque (LEM)(Ho et al., 1994).
Que ce soit chez les amphibiens, les poissons ou les amniotes, le processus d'internalisation est associé à une altération de l'architecture des tissus. En effet, les cellules épithéliales adhérentes et moins mobiles se transforment en tissus ou cellules mésenchymateuses moins adhérentes et mobiles par le processus de transition épithéliale mésenchymateuse (Shook and Keller, 2003). La répression de molécules d'adhésion cellulaire telles que l'E-cadhérine est une fois de plus l'un des événements majeurs impliqués dans la TEM durant l'internalisation. La répression des molécules d'adhésion dans les cellules mésenchymateuses mésodermiques se fait via l'activation des répresseurs transcriptionels d’ E-cadhérine tels que snail1/2, Zeb, twist (Kalluri and Weinberg, 2009).
I.3.3 Mouvement de convergence-extension (CE)
44
Plusieurs modèles sont proposés pour expliquer le mécanisme qui sous-tend les mouvements de CE (Fig. 9b) : le modèle rampant et le modèle de contraction. Dans le modèle rampant, les cellules utilisent les protrusions aux extrémités des cellules allongées pour ramper dans les espaces entre les cellules voisines et provoquer ainsi une intercalation (Keller et al., 1992; Shih and Keller, 1992). Dans ce modèle, les cellules sont capables de migrer bidirectionnellement le long de l'axe médio-latéral à la suite de la formation des protrusions bipolaires riches en filaments d'actine (Keller, 2002). Ces protrusions favorisent les migrations dirigées des cellules au cours de l’intercalation à l’aide des lamellipodes que développent les cellules du bord d’attaque (Fig. 9a).
Dans le modèle de contraction, il y a formation de ponts acto-myosines le long des jonctions intercellulaires qui favorisent la contraction des membranes cellulaires, et le raccourcissement qui en résulte produit la force nécessaire pour déplacer les cellules (Sun and Amourda, 2017).
La perte des molécules d’adhésion intercellulaire est indispensable à des mouvements cellulaires. Les cadhérines C et P sont internalisées par endocytose durant l’initiation de la gastrulation chez Xenopus laevis (Marsden and DeSimone, 2003). Par ailleurs, l’interaction intégrine-fibronectine est indispensable dans la CE des cellules du plafond qui constituent le plafond du blastocœle (Marsden and DeSimone, 2003).
A la fin de la gastrulation, tous ces mouvements contribuent au positionnement des différents feuillets embryonnaires dans leurs zones de prédestination avant le début de l’organogénèse. A partir de la fin de gastrulation, les différents territoires de l’embryon sont déjà cartographiés et leurs destinées connues.
45 Figure 9 : Le mouvement de convergence-extension comprend deux types de mouvements cellulaires
a) Dans la migration collective, les cellules migrent sous forme d’un tapis. Les cellules du bord
d’attaque sont fortement polarisées et produisent différents types de protubérances telles que les lamellipodes et bulles (rouge) par rapport aux cellules situées derrière le bord d’attaque (orange). La flèche rouge indique la direction du mouvement collectif des cellules. b) Dans l’intercalation cellulaire médio-latérale, les cellules grâce à leurs lamellipodes sur leurs extrémités médiales et latérales, s’intercalent, ce qui entraine un allongement antéro-postérieur du tissu. Les flèches rouges indiquent les directions du mouvement des cellules. A, antérieur ; P, Postérieur ; M, médian ; L, latéral. (Tada and Heisenberg, 2012).
I.4 Mécanisme de la transition épithélio-mésenchymateuse au cours de
l'embryologie
Au cours de la morphogénèse, notamment la gastrulation et la formation des crêtes neurales, les cellules acquièrent des propriétés migratrices importantes dans leur positionnement. Ces mouvements cellulaires sont gouvernés par la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) (Nakaya and Sheng, 2008). La TEM, en plus d'être un processus crucial pour l'embryogenèse, joue aussi un rôle très important dans la genèse des métastases dans les souches cancéreuses et des fibroses.
I.4.1 Définition de la transition épithélio-mésenchymateuse
La transition épithélio-mésenchymateuse est un processus biologique au cours duquel les cellules épithéliales non motiles et polarisées subissent une série de transformations biochimiques pour devenir des cellules mésenchymateuses non-polarisées douées de capacités migratoires (Radisky, 2005; Serrano-Gomez et al., 2016).
Les cellules épithéliales sont des cellules adhérentes étroitement attachées entre elles par des complexes d'adhésion intercellulaires (jonctions serrées, jonctions adhérentes, desmosomes etc.) dans leurs membranes latérales (Kalluri, 2009; Radisky, 2005). Les cellules épithéliales présentent aussi une polarité apico-basale avec une membrane basale qui sépare les cellules des autres tissus (Acloque et al., 2009 ; Ferrer-Vaquer et al., 2010). En revanche, les cellules mésenchymateuses ne forment pas un feuillet organisé et ne présentent pas de polarité apico-basale. Elles sont lâchement attachées les uns aux autres par des contacts focaux permettant une capacité migratoire accrue (Kalluri, 2009; Lee et al., 2006b).
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et al., 2012). La dissolution des complexes d'adhésion cellulaire entraîne une réduction ou dégradation des molécules telles que les claudines, Zona occludens1 (ZO-1), les cadhérines (notamment E-cadhérine) (Fig. 10) (Dongre and Weinberg, 2018; Lamouille et al., 2014).
La perte de l'E-cadhérine est une caractéristique du phénotype épithélial, marquant le point d'initiation de la TEM (Baum et al., 2008; Cano et al., 2000; Thiery and Sleeman, 2006). La membrane basale est perturbée et les marqueurs mésenchymateux tels que la vimentine, la N-cadhérine et fibronectine sont surexprimés (Lee et al., 2006b). Enfin, les cellules remodèlent leur cytosquelette, changent de forme et étendent leurs protubérances pour enfin migrer (Campbell, 2018). En fonction de l'environnement cellulaire et de la voie de signalisation impliquée, les cellules épithéliales peuvent perdre uniquement certaines propriétés ou présenter certaines caractéristiques épithéliales et mésenchymateuses.
Figure 10:Transition épithélio-mésenchymateuse et ses marqueurs clés
47 I.4.2 Mécanisme cellulaire des mouvements de la gastrulation et la formation des crêtes neurales
I.4.2.1 La transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) dans l'embryogenèse
Au cours de l'embryogénèse, de nombreux signaux convertissent les cellules épithéliales en cellules mésenchymateuses à la suite de la TEM. La TEM est un processus conservé au cours du développement embryonnaire, plus précisément dans le remodelage tissulaire où elle intervient (Thiery and Sleeman, 2006). La TEM primaire (qui se déroule dans les tissus embryonnaires qui n'ont jamais subi de la TEM) a lieu essentiellement lors de la gastrulation et contribue à la formation et au positionnement du troisième feuillet embryonnaire, le mésoderme, entre l'ectoderme et l'endoderme chez les triploblastiques (Campbell, 2018; Hay, 2005). C'est un mécanisme conservé chez les vertébrés, notamment le xénope et les amniotes. Par ailleurs, la TEM se poursuit au stade neurula où elle contribue à la formation des crêtes neurales et des somites (Kalcheim, 2015).
Par ailleurs, la TEM joue un rôle très important dans la progression de certaines tumeurs et en particulier dans l’acquisition d’un potentiel métastasique au cours de laquelle les cellules néoplasiques développent des propriétés mésenchymateuses, perdent leurs propriétés adhésives et gagnent des propriétés migratrices et protéolytiques nécessaires à la formation de métastases (Bhangu et al., 2012; Cao et al., 2015).
La répression transcriptionnelle de E-cadhérine est une étape cruciale qui marque le point d'initiation de la TEM (Campbell and Casanova, 2015; Huber et al., 2005). L'E-cadhérine est l'une des molécules clés impliquées dans le contact cellule-cellule et sa répression pousse les cellules épithéliales vers une destinée mésenchymateuse (Batlle et al., 2000; Gheldof and Berx, 2013). Chez le poisson-zèbre, l'E-cadhérine joue un rôle dans le mouvement d'épibolie (Babb and Marrs, 2004; Shimizu et al., 2005). La répression de l’expression de l’E-cadhérine et d'autres marqueurs épithéliaux tels que la cytokératine, les mucines, claudines et occludines s'accompagne d'une activation des marqueurs mésenchymateux, notamment les gènes vimentine, vitronectine, fibronectine, etc. (Lamouille et al., 2014; Thiery and Sleeman, 2006).
I.4.2.2 Régulation transcriptionnelle de la TEM
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L’expression des gènes qui codent pour ces facteurs de transcriptions est activée par plusieurs voies de signalisation, notamment les voies TGF-β, sonic Hedgehog, Wnt, Notch, FGF, BMP etc (Fig. 11) (Barrallo-Gimeno and Nieto, 2005). La GSK-3β peut inhiber l'activation de LEF-1 induite par la β-caténine ainsi que la stabilité et la translocation nucléaire de Snail1/2. La famille 200 des microARN peut inhiber l’expression de Zeb1 et Zeb2. GSK-3β et miR-200 peuvent être bloqués par la kinase Akt, qui est activée par la plupart des voies de signalisation de la TEM (Gonzalez and Medici, 2014).
Figure 11:Facteurs de transcription induisant la TEM
La TEM est déclenchée par des facteurs de transcription qui lient et inhibent l'expression de gènes codant marqueurs épithéliaux (rouge) telles que la E-cadhérine, ZO-1, les claudines et l'occludine ; et l’activation de l’expression des gènes codant pour les marqueurs mésenchymateux (Vert). Ces facteurs de transcription incluent Snail1/2, Zeb1/2, Twist et LEF-1 et leur expression est induite par diverses voies de signalisation dont les voies TGF-β/BMP, Wnt, Notch, Shh etc... (Modifié à partir de Barrallo-Gimeno and Nieto 2005).
Les gènes de la famille Snails codent pour des facteurs de transcription à doigts de zinc et activent le programme de la TEM durant le développement, la fibrose et le cancer (Barrallo-Gimeno and Nieto, 2005). Les snails se lient aux séquences E-boxes du promoteur des gènes épithéliaux via son domaine Zinc finger et induisent leur répression (Nieto, 2002; Xu et al.,
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2009). Il existe plusieurs membres de la famille Snail chez les vertébrés : Snail1, Snail2 encore connu sous le nom slug et snail3 (Xu et al., 2009). L'expression ectopique de snail1 et snail2 induit la TEM via la répression d'E-cadhérine et la plaskoglobine et une activation de la vimentine et la fibronectine. Par contre, la suppression de snail inverse le phénotype de la TEM (Batlle et al., 2000; Bolos et al., 2003; Cano et al., 2000; Olmeda et al., 2007). Chez la souris, la déficience en Snail1 dans les embryons inhibe la TEM et entraîne par conséquent une anomalie au cours de la formation du mésoderme du fait de l'expression de l'E-cadhérine qui reste maintenue (Carver et al., 2001). La répression de Snail2 dans l'embryon de poussin entraîne une malformation mésodermique et une inhibition des migrations des crêtes neurales (Nieto et al., 1994). En plus de leur fonction dans la TEM, les gènes snails sont impliqués dans la survie des cellules et sont capables d'induire indirectement d'autres répresseurs de l’E-cadhérine tels que Zeb1, Zeb2 et Twist etc (Goossens et al., 2017).
Les facteurs de transcription de la famille des hélice-loupe-hélice sont des facteurs de transcription formés de deux hélices liées entre elles par une loupe nécessaire pour sa dimérisation (Bolos et al., 2003; Xu et al., 2009). Cette famille est divisée en sept groupes dont les plus connus sont les protéines E12 ,E47, TWIST1 et TWIST2 (Fang et al., 2011; Yang et al., 2004). Ces facteurs de transcription hélice-loupe-hélice jouent un rôle très important dans le développement embryonnaire et dans la progression du cancer via une activation et/ou répression des gènes impliqués dans la TEM notamment l’E-cadhérine (Ansieau et al., 2008; Yang et al., 2004).
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I.5 Les protéines de la famille des ZICs
I.5.1 Généralité sur les ZICs
Les gènes Zic chez les vertébrés sont des homologues du gène Odd-pair (opa) de la drosophile (Aruga et al., 1994). Le gène Opa chez la drosophile est impliqué dans la segmentation pendant le modelage embryonnaire (Benedyk et al., 1994). Par ailleurs, il a été montré chez les drosophiles que les mutations du gène Opa affectaient l'expression des gènes impliqués dans le développement du mésoderme viscéral et de la morphogénèse du tractus digestif (Benedyk et al., 1994).
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Dandy-Walker et des cancers (Grinberg and Millen, 2005). Cependant les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les fonctions des gènes Zic ne sont pas encore complètement connus.
I.5.1.1 Organisation génomique des gènes de la famille des ZICs
Le séquençage, l'assemblage et l'annotation de plusieurs génomes de vertébrés montrent que les gènes de la famille Zic ont une organisation particulière (Houtmeyers et al., 2013). L'arrangement des gènes Zic chez plusieurs espèces de vertébrés tels que l'homme, la souris, le xénope et le poisson zèbre montre que les différents membres de la famille de Zic sont organisés en paires de gènes en tandem. Par conséquent, chez l'homme et le xénope, les 5 membres de la famille Zic (Zic1-5) sont localisés sur trois chromosomes différents à l'exception de Zic3 qui est localisé sur le chromosome X seul ; les Zic1 et Zic4 sont situés ensemble sur le chromosome 3 et Zic2 et Zic5 ont une configuration similaire sur le chromosome 13 mais sont transcrits dans des directions opposées (Grinberg and Millen, 2005; Houtmeyers et al., 2013).
Tous les membres de la famille de Zic proviendraient d'un ancêtre commun constitué d'une seule copie de gène Zic et d’un intron (Aruga et al., 2006). Cet ancêtre de Zic aurait subi une série de duplications en tandem et différentes mutations dans la séquence du gène qui ont donné lieu à deux sous-groupes de Zic : un sous-groupe de Zic avec addition d'un intron et l'autre caractérisé par des modifications associées à la délétion de certains domaines. La duplication du gène Zic ancestral a donné naissance à 8 membres de la famille Zic connus jusqu'à présent. Chez l’humain et le xénope, les Zic ont été regroupés en deux sous-groupes : le sous-groupe A, constitué de Zic1, Zic2, Zic3 ; le sous-groupe B qui comprend Zic4, Zic5. Chez le poisson-zèbre, on compte sept Zic (Zic1, Zic2a, Zic3, Zic4, Zic5 et Zic6) organisés en paires de gènes en tandem sur 4 chromosomes, excepté Zic2b qui est seul (Grinblat et al., 1998; Houtmeyers et al., 2013; Toyama et al., 2004).
I.5.1.2 Structure de la famille des protéines ZICs
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Zinc Opa Conserved Domain (ZOC) dans la partie N-terminale. La sous-classe B, comprenant Zic4 et Zic5, ne possède pas de domaine ZOC dans la partie N-terminale. Le domaine ZOC est impliqué dans l'activation transcriptionnelle des gènes cibles in vitro et est capable de se lier à la protéine myogénique I-mfa (Ishiguro et al., 2004; Mizugishi et al., 2001).
Les protéines Zic possèdent une région Zinc finger N-flanking conserved (ZF-NC) située à côté du premier domaine à doigt de Zinc, mais sa fonction reste jusqu'ici inconnue (Ali et al., 2012; Aruga et al., 2006). Aucun Zic ne présente de signal /β-caténine de localisation nucléaire (NLS). Cependant il existe un signal de localisation nucléaire entrecoupé dans le domaine à doigt à zinc de Zic3 qui interagit avec les importines (Bedard et al., 2007). Tous les Zic contiennent également une région de faible complexité située en dehors de la zone délimitée par les ZFD et ZF-NC. Contrairement aux autres membres de la famille Zic, Zic2 comporte une extension riche en alanine dans la partie C-terminale. Cette extension riche en alanine influe sur la force de la liaison de l'ADN, modifie l'activité transcriptionnelle de manière spécifique au promoteur et peut aussi induire l'Holoprosencéphalie (Brown et al., 2005; Brown et al., 2001).
