Thérapie génique
pour le traitement des anémies
Emmanuelle Fabre
Les anémies
Symptôme biologique
Taux d’hémoglobine abaissé
↓ nombre d’hématies, ↓ hématocrite
<12-13g/dl
Pâleur des téguments, des muqueuses Polypnée d’effort, tachycardie
L’hémoglobine
Fe Fe
Fe Fe
Hème
Tétramère
Hb F: α2γ2 Fœtus 6 mois Hb A1: α2β2 97% à l’âge adulte Hb A2: α2δ2 3% à l’âge adulte Hb embryonnaires
Gènes en clusters
Synthétisée dans les précurseurs des hématies
Locus Control Region
Gène α-globine dupliqué
L’érythropoïèse
BFU-E
CFU-E
Pro-érythroblaste
Hématie Erythroblaste
Réticulocytes
Réticulocytes Sang
M.O. Synthèse de l’Hb
Durée de vie 120 jours
5-8 jours
Fe
Erythropoïétine
Régulation Hypoxie, polyglobulie
Rein
Les causes d’anémie
BFU-E
CFU-E
Pro-érythroblaste
Hématie Erythroblaste
Réticulocytes
Réticulocytes Sang
M.O.
Erythropoïétine
Synthèse de l’Hb Régulation
sont multiples…
Insuffisance rénale
Les causes d’anémie
BFU-E
CFU-E
Pro-érythroblaste
Hématie Erythroblaste
Réticulocytes
Réticulocytes Sang
M.O.
Erythropoïétine
Synthèse de l’Hb Régulation
sont multiples…
Thalassémies
Les causes d’anémie
BFU-E
CFU-E
Pro-érythroblaste
Hématie Erythroblaste
Réticulocytes
Réticulocytes Sang
M.O.
Erythropoïétine
Synthèse de l’Hb Régulation
sont multiples…
Anémies hémolytiques Drépanocytose
Les causes d’anémie
BFU-E
CFU-E
Pro-érythroblaste
Hématie Erythroblaste
Réticulocytes
Réticulocytes Sang
M.O.
Erythropoïétine
Synthèse de l’Hb Régulation
sont multiples…
Hémoglobinopathies
↑ Epo Insuffisance rénale
↓ Epo Insuffisance rénale
↓ Epo
Hémoglobinopathies
↑ Epo
Gènes
La thérapie génique
Physiopathologie Immunisation Effet
thérapeutique
Apoptose cellulaire Transgène
Protéine ARNm
oligonucléotides ARNi ARN antisens Acides Nucléiques
Perte de fonction
Gènes
La thérapie génique
Physiopathologie Immunisation Effet
thérapeutique
Apoptose cellulaire Transgène
Protéine ARNm
Cassette d’expression
Cassette d’expression
Transgène Promoteur
Transgène et séquences associées
Gène ou ADNc
± Intron Poly A
5’ 3’
ADNc Intron + ADNc Niveau Gène
d’expression
Promoteur
5’ Enh TATA exon exon 3’
+1 -30 -100
Séquences régulatrices d’amont Séquences
stimulatrices
Promoteur basal
Complexe de pré-initiation de la transcription Facteurs de transcription
± tissu-spécifiques
Site d’initiation de la transcription
Gène
Cassette d’expression
Transgène Promoteur
Efficacité Fort niveau d’expression du transgène Sécurité Contrôle de l’expression du transgène
Objectifs
Transgène et séquences associées
Gène ou ADNc
± Intron Poly A
5’ 3’
ADNc Intron + ADNc Niveau Gène
d’expression
Promoteur
• Promoteurs viraux (ex: pCMV), eucaryotesContrôle spatial de l’expression
Contrôle temporel de l’expression Principe du Lego®
Gènes
La thérapie génique
Physiopathologie Immunisation Effet
thérapeutique
Apoptose cellulaire Transgène
Protéine ARNm
Vecteurs
virus
plasmide Cassette d’expression
Exemple des lentivirus
Famille des Retroviridae: Virus enveloppés à ARN simple brin
LTR
LTRΨ gag pol env
•LTR: long terminal repeats
•Ψ: signal d’encapsidation
•gag: capside, assemblage
•pol: transcriptase inverse, intégrase, protéase
•env: enveloppe
Génome Cycle viral
Infection des cellules en division et quiescentes
Vecteurs viraux
http://vvanuxem.free.fr
Vecteurs lentiviraux
LTRΨ LTR
« LTR driven » 1- Défectif pour la réplication
LTRΨ LTR 2- Porteur de la cassette d’expression du transgène
Cellules d’empaquetage gag pol env 3- Production de particules virales
LTRΨ LTR
Avantages Inconvénients
Expression à long terme Mutagénèse insertionnelle Faible immunogénicité Production, conservation
Stratégies de thérapie génique
Cellules prélevées
Cellules transduites Greffe
Transduction
Thérapie génique Thérapie génique ex vivo
Thérapie cellulaire
La thérapie génique: développement
AMM
Vitraven® : rétinite à CMV des patients VIH (1998)
Macugen® : forme néovasculaire de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (2004)
Facteurs limitants
Efficacité, biosécurité, tolérance 60-100 lancements par an depuis 1995 225 en 2017 et 2018 (↑)
~95% en phases I et II Indications
Essais cliniques
Traitement de l’anémie associée à
l’IRC par transfert du gène de l’Epo
L’insuffisance rénale chronique
> 2 millions de personnes en France Traitement:
1 à 4 injections / semaines Ø qualité de vie du patient coût ++
Transfert du gène de l’Epo Atteinte rénale ↓ Epo ↓ érythropoïèse Anémie
Epo recombinante (rhEpo)
Traitement de l’anémie associée à l’IRC par transfert du gène de l’Epo
Objectifs
Bénéfice par rapport à l’rhEpo : longévité des effets
Concentration sanguine
Temps
Seuil thérapeutique Seuil toxique Protéine recombinante Traitement
Protéine transgénique Traitement
Efficacité Sécurité
• Niveau d’expression efficace
•Expression à long terme
• Promoteur
•Vecteur
oDurée de vie des hématies
• Niveau d’expression non toxique
•Non immunogène
Essai clinique de phase I
13 patients présentant une IRC modérée ou sévère Anémie: 8.9 à 13g/dl
Lippin Y., Blood, 2005
Cellules dermiques
Adénovirus
Cellules transduites Prélèvement
Implantation Dosage Epo
Transduction
pCMV hEpo +
SV40 polyA
Essai clinique de phase I
Lippin Y., Blood, 2005
16-18 UI/j/kg 55-65 UI/j/kg
En théorie, 40 à 200 mU/ml de hEpo permettent d’obtenir une érythropoïèse efficace 2 cohortes:
Essai clinique de phase I
Lippin Y., Blood, 2005
Effet Epo: ↑ réticulocytes (<0.5% 1.25%), Ht??
Expression Epo pendant 14 jours
Pas d’Ac anti-Epo, ni anti-Ad
Réaction inflammatoire locale: immunité cellulaire
Effets secondaires chez 3 patients: HTA, œdème, AVC sévère Effets du traitement
Réponses immunitaire et inflammatoire
Essai clinique de phase I: conclusion
nécessité de contrôler
≠ polyglobulie
• la quantité d’Epo transgénique produite
• la durée de production de l’Epo Utilisation
• des systèmes de régulation transcriptionnelle
• d’administration répétées de faibles doses de vecteur
Switch-on
Transfert du gène de l’Epo Systèmes de régulation transcriptionnelle
Contrôle temporel de l’expression du transgène
Expression +++
I
I
Vecteur Transgène
Pas d’expression
Switch-on
TA
Transgène
pCMV TA P basal
+
RE
I
I
I + TA
Transgène
pCMV TA P basal
+
RE
Transfert du gène de l’Epo Systèmes de régulation transcriptionnelle
Contrôle temporel de l’expression du transgène
Switch-on
Réponse rapide, intense et brève à l’inducteur Absence d’expression sans inducteur
Tolérance Système idéal :
Systèmes de régulation transcriptionnelle
Favre D., J Virol, 2002
Macaques sains (n=6)
Injection intramusculaire AAV codant l’Epo (5.10
8– 1.10
9particules)
Système Tet-on:
Systèmes de régulation transcriptionnelle
Dérivé de E. coli et virus de l’Herpes
La doxycycline induit l’expression de l’Epo
Favre D., J Virol, 2002
Dox: I.V. 10mg/kg pendant 5 jours
Systèmes de régulation transcriptionnelle
Traitement de l’anémie associée aux
hémoglobinopathies
Les hémoglobinopathies:
thalassémie et drépanocytose
Héréditaires autosomiques récessives 7% de la population mondiale
β-thalassémie
> 200 anomalies génétiques connues sur le gène de la β-globine Localisation: Bassin méditerranéen, Asie du sud-est
↓↓ ou Ø expression β-Gb
Excès α-gb Tétramères α4: précipitation
érythroblastes Érythropoïèse inefficace Anémie (4-7g/dl)
↑↑ Epo Hyperplasie érythroblastique Physiopathologie:
Les hémoglobinopathies
β-thalassémie
Hétérozygotes:
•Apparition avant 1 an Aspects cliniques et biologiques:
• asymptomatiques
•Anémie microcytaire (HbA2: 3.5-8%; HbF: 1-2%) Homozygotes: β-thalassémie majeure – maladie de Cooley
•Hépato-splénomégalie, faciès mongoloïde, infections, retard staturo- pondéral et pubertaire
•Anémie majeure (<7g/dl): HbA1: 0-45%; HbA2: 3-7%; HbF: 50-95%
•Hypersidérémie
Les hémoglobinopathies
Evolution, pronostic, traitement de la maladie de Cooley:
•Evolution naturelle: ↑ hépato-splénomégalie, IC, hémosidérose, accidents thrombotiques espérance de vie < 10 ans
β-thalassémie
•Traitements: transfusions + chélateurs du fer espérance de vie > 30 ans, allogrèphe, réactivation de la synthèse d’HbF (hydroxyurée), supplémentation vitaminique…
Les hémoglobinopathies:
thalassémie et drépanocytose
Drépanocytose ou anémie falciforme
Localisation:
Mutation β6 Glu Val sur le gène de la β-Gb
HbS Polymérisation en milieu désoxygéné
Déformation des GR (faucille ): drépanocytes
↓ demi-vie + hyperviscosité sanguine Physiopathologie:
Prévalence 15-25% en Afrique centrale et de l’ouest
+ crises hémolytiques aigües
Les hémoglobinopathies:
thalassémie et drépanocytose
Drépanocytose
•Complications aigües:
Hétérozygotes:
•Apparition avant 1 an
Aspects cliniques et biologiques:
• asymptomatiques
•Anémie normocytaire Homozygotes:
•Splénomégalie, infections, douleurs+++
•Complications chroniques:
Accidents ischémiques vaso-occlusifs cardio-pulmonaires, hépatobiliaires, rénales, endocriniennes, neurologiques, ostéo-articulaires
•Anémie (7-9g/dl): HbS: 80-95%; HbA1: 0%; HbA2: 2-4%; HbF: 1-10%
Les hémoglobinopathies:
thalassémie et drépanocytose
Drépanocytose
Evolution, pronostic, traitement :
•Evolution naturelle: espérance de vie ~15 ans sans prévention ni traitement
•Traitements: Prévention (hyperhydratation, antibiothérapie…) Transfusion si urgence vitale
Réactivation de la synthèse d’HbF (hydroxyurée) Allogreffe
Espérance de vie ~45-50 ans
Thérapie génique des hémoglobinopathies:
Principe
Thérapie cellulaire / ex-vivo Cellules souches hématopoïétiques
HSC
Gène β-globine
Cellules transduites Prélèvement M.O.
Implantation après irradiation létale Transduction
Objectifs
•Expression de la β-Gb:
A long terme, à un fort niveau
Spécifiquement dans la lignée érythroïde Spécifiquement au stade érythroblastique
•Vecteur viral sûr:
Rétrovirus: intégration / risque d’oncogénèse
Modèles animaux
↓β-Gb majeure
Souris thalassémiques (1983-1995):
Th1
HbbTh1/Th1: thalassémie modérée Øβ-Gb majeure
Th2
HbbTh2/Th2: thalassémie létale HbbTh2/+: thalassémie très modérée Øβ-Gb majeure, Øβ-Gb mineure
Th3
HbbTh3/Th3: thalassémie létale (gestation) HbbTh3/+: thalassémie modérée
Expression des Gb murines + Gb humainesαetβSuper S Souris drépanocytaires (1991-1997):
SAD
Drépanocytose modérée
Ø Gb murines + Gb humainesαetβS BERK
Drépanocytose sévère
Expression de la β-Gb érythro-spécifique à un niveau thérapeutique
Onco-rétrovirus lentivirus (taille de l’insert, stabilité génomique)
Vecteur TNS9 – May C., Nature, 2000
Expression érythro-spécifique à un niveau thérapeutique β-Gb LCR
Expression de la β-Gb érythro-spécifique à un niveau thérapeutique
Sadelain M., Hum Gene Ther, 2007
Correction β-thalassémie modérée
May C., Nature, 2000
Correction β-thalassémie létale Hbb
Th3/Th3Rivella S., Blood, 2003
Transduction de FSC embryonnaire HbbTh3/Th3
Correction de la drépanocytose Pawliuk R., Science, 2001
Transduction de HSC SAD ou BERK
Gène de laβ-GbβA-T87Q(↑résistance à la polymérisation)
Transgène
LTR P LTR
+ + +
Oncogène
Les essais cliniques
•FR-029:
β-thalassémie, drépanocytose Phase I/II France, 2006 β-GbβA-T87QLentivirus, dérivé TNS9: Insulators cHS4
2 patients adultes recrutés avecβ-thalassémie majeure
•US-852:
β-thalassémie Phase I USA, 2007 β-GbLentivirus, TNS3
Ins Ins
Correction de la β -thalassémie humaine Cavazzana-Calvo M., Nature Letters 2010
P2: Homme, 18 ans Transfusions à partir de 3 ans (6.7g/dl)
Splénectomie à 6 ans (4g/dl; hydroxyurée inefficace) Chélateurs du fer à partir de 8 ans
1 an après la greffe: Hb stable entre 8 et 10 g/dl sans transfusion (presque 2 ans de recul)
Transfusions
Saignées Dernière transfusion
Correction de la β -thalassémie humaine Cavazzana-Calvo M., Nature Letters 2010
HbA: transfusion; HbE:β-thal
HbAT87Q: 1/3 Hb totales
Présence du vecteur lentiviral:
~3% érythroblastes sg
~10% érythroblastes mo
HPLC
PatientβE/β0 HbE Mutation ponctuelle
26èmecodon β-gb Glu Lys: HbE
création d’un site alternatif d’épissage:↓ β-gb
Correction de la β -thalassémie humaine Cavazzana-Calvo M., Nature Letters 2010
Sites d’intégration du vecteur
Expansion clonale des cellules ayant intégré le vecteur de le 3èmeintron d’HMG2A (High Mobility Group AT-hook 2)
Site HMG2A: ~1.5% des érythroblastes modifiés Stabilisation de l’expansion 15 mois après la greffe
Correction de la β -thalassémie humaine Cavazzana-Calvo M., Nature Letters 2010
Niveau d’expression HMG2A×10000 Causes: LCR (perte d’un insulator)
HMG2A tronqué stabilisation
Expression de HMG2A tronqué: lipome
hémoglobinurie paroxystique nocture HMG2A: Protéine de liaison à l’ADN
Rôle dans l’assemblage des complexes nucléoprotéiques
Correction de la β -thalassémie et de la drépanocytose Negre O. et al, Hum Gene Ther, 2016
En France:
Essai 1: Patient1: β+/β0
greffe de secours Patient 2: βE/β0
Intégration HMGA2 Après 5 ans: clone <1%
8 ans de recul: indépendant des transfusions 1 an après la greffe (7 ans) Patient 3:βE/β0
Resté dépendant des transfusions
Correction de la β -thalassémie et de la drépanocytose Negre O. et al, Hum Gene Ther, 2016
En France:
Essai 2: Vecteur BB305:
• sans insulator (efficacité dépendante du site d’intégration, diminue infectiosité, diminue facilité de production)
• promoteur U3 modifié en 5’LTR: hybride CMV (augmentation facilité production dans cellules d’encapsidation dédiées)
Correction de la β -thalassémie et de la drépanocytose Negre O. et al, Hum Gene Ther, 2016
En France:
Essai 2: Vecteur BB305
4 patientsβ-TM: tous devenu indépendants des transfusions 1 patient drépanocytaire: traitement bénéfique
Aux USA: 5 essais cliniques dont 2 avec le même vecteur (10β-TM et 3 drépanocytaires)
Italie
Correction de la β -thalassémie et de la drépanocytose Ribeil J.-A. et al, New England J of Med, 2017
Homme, 16 ans βS/βS+ délétion d’un seul allèle codantα-globine Diagnostic à la naissance
Transfusions à partir de 9 ans + chélateurs du fer 13 ans – 2014: inclusion dans l’essai vecteur BB305
Correction de la β -thalassémie et de la drépanocytose Ribeil J.-A. et al, New England J of Med, 2017
Contrôle 1: mère du patient, hétérozygote A1/S Contrôles 3 à 5: homozygotes S/S
Correction de la β -thalassémie et de la drépanocytose Ribeil J.-A. et al, New England J of Med, 2017
Patient P2 du 1eressai: ~20% du clone HMG2A à 13 mois
Exemple de la drépanocytose
Hoban et al, Blood, 2016, 127(7)