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Thérapie génique pour le traitement des anémies

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Academic year: 2022

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(1)

Thérapie génique

pour le traitement des anémies

Emmanuelle Fabre

Les anémies

Symptôme biologique

Taux d’hémoglobine abaissé

↓ nombre d’hématies, ↓ hématocrite

<12-13g/dl

Pâleur des téguments, des muqueuses Polypnée d’effort, tachycardie

(2)

L’hémoglobine

Fe Fe

Fe Fe

Hème

Tétramère

Hb F: α2γ2 Fœtus 6 mois Hb A1: α2β2 97% à l’âge adulte Hb A2: α2δ2 3% à l’âge adulte Hb embryonnaires

Gènes en clusters

Synthétisée dans les précurseurs des hématies

Locus Control Region

Gène α-globine dupliqué

L’érythropoïèse

BFU-E

CFU-E

Pro-érythroblaste

Hématie Erythroblaste

Réticulocytes

Réticulocytes Sang

M.O. Synthèse de l’Hb

Durée de vie 120 jours

5-8 jours

Fe

Erythropoïétine

Régulation Hypoxie, polyglobulie

Rein

(3)

Les causes d’anémie

BFU-E

CFU-E

Pro-érythroblaste

Hématie Erythroblaste

Réticulocytes

Réticulocytes Sang

M.O.

Erythropoïétine

Synthèse de l’Hb Régulation

sont multiples…

Insuffisance rénale

Les causes d’anémie

BFU-E

CFU-E

Pro-érythroblaste

Hématie Erythroblaste

Réticulocytes

Réticulocytes Sang

M.O.

Erythropoïétine

Synthèse de l’Hb Régulation

sont multiples…

Thalassémies

(4)

Les causes d’anémie

BFU-E

CFU-E

Pro-érythroblaste

Hématie Erythroblaste

Réticulocytes

Réticulocytes Sang

M.O.

Erythropoïétine

Synthèse de l’Hb Régulation

sont multiples…

Anémies hémolytiques Drépanocytose

Les causes d’anémie

BFU-E

CFU-E

Pro-érythroblaste

Hématie Erythroblaste

Réticulocytes

Réticulocytes Sang

M.O.

Erythropoïétine

Synthèse de l’Hb Régulation

sont multiples…

Hémoglobinopathies

↑ Epo Insuffisance rénale

↓ Epo Insuffisance rénale

↓ Epo

Hémoglobinopathies

↑ Epo

(5)

Gènes

La thérapie génique

Physiopathologie Immunisation Effet

thérapeutique

Apoptose cellulaire Transgène

Protéine ARNm

oligonucléotides ARNi ARN antisens Acides Nucléiques

Perte de fonction

Gènes

La thérapie génique

Physiopathologie Immunisation Effet

thérapeutique

Apoptose cellulaire Transgène

Protéine ARNm

Cassette d’expression

(6)

Cassette d’expression

Transgène Promoteur

Transgène et séquences associées

Gène ou ADNc

± Intron Poly A

5’ 3’

ADNc Intron + ADNc Niveau Gène

d’expression

Promoteur

5’ Enh TATA exon exon 3’

+1 -30 -100

Séquences régulatrices d’amont Séquences

stimulatrices

Promoteur basal

Complexe de pré-initiation de la transcription Facteurs de transcription

± tissu-spécifiques

Site d’initiation de la transcription

Gène

Cassette d’expression

Transgène Promoteur

Efficacité Fort niveau d’expression du transgène Sécurité Contrôle de l’expression du transgène

Objectifs

Transgène et séquences associées

Gène ou ADNc

± Intron Poly A

5’ 3’

ADNc Intron + ADNc Niveau Gène

d’expression

Promoteur

• Promoteurs viraux (ex: pCMV), eucaryotes

Contrôle spatial de l’expression

Contrôle temporel de l’expression Principe du Lego®

(7)

Gènes

La thérapie génique

Physiopathologie Immunisation Effet

thérapeutique

Apoptose cellulaire Transgène

Protéine ARNm

Vecteurs

virus

plasmide Cassette d’expression

Exemple des lentivirus

Famille des Retroviridae: Virus enveloppés à ARN simple brin

LTR

LTRΨ gag pol env

•LTR: long terminal repeats

Ψ: signal d’encapsidation

•gag: capside, assemblage

•pol: transcriptase inverse, intégrase, protéase

•env: enveloppe

Génome Cycle viral

Infection des cellules en division et quiescentes

Vecteurs viraux

http://vvanuxem.free.fr

(8)

Vecteurs lentiviraux

LTRΨ LTR

« LTR driven » 1- Défectif pour la réplication

LTRΨ LTR 2- Porteur de la cassette d’expression du transgène

Cellules d’empaquetage gag pol env 3- Production de particules virales

LTRΨ LTR

Avantages Inconvénients

Expression à long terme Mutagénèse insertionnelle Faible immunogénicité Production, conservation

Stratégies de thérapie génique

Cellules prélevées

Cellules transduites Greffe

Transduction

Thérapie génique Thérapie génique ex vivo

Thérapie cellulaire

(9)

La thérapie génique: développement

AMM

Vitraven® : rétinite à CMV des patients VIH (1998)

Macugen® : forme néovasculaire de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (2004)

Facteurs limitants

Efficacité, biosécurité, tolérance 60-100 lancements par an depuis 1995 225 en 2017 et 2018 (↑)

~95% en phases I et II Indications

Essais cliniques

Traitement de l’anémie associée à

l’IRC par transfert du gène de l’Epo

(10)

L’insuffisance rénale chronique

> 2 millions de personnes en France Traitement:

1 à 4 injections / semaines Ø qualité de vie du patient coût ++

Transfert du gène de l’Epo Atteinte rénale ↓ Epo ↓ érythropoïèse Anémie

Epo recombinante (rhEpo)

Traitement de l’anémie associée à l’IRC par transfert du gène de l’Epo

Objectifs

Bénéfice par rapport à l’rhEpo : longévité des effets

Conce

ntration sanguine

Temps

Seuil thérapeutique Seuil toxique Protéine recombinante Traitement

Protéine transgénique Traitement

Efficacité Sécurité

• Niveau d’expression efficace

•Expression à long terme

• Promoteur

•Vecteur

oDurée de vie des hématies

• Niveau d’expression non toxique

•Non immunogène

(11)

Essai clinique de phase I

13 patients présentant une IRC modérée ou sévère Anémie: 8.9 à 13g/dl

Lippin Y., Blood, 2005

Cellules dermiques

Adénovirus

Cellules transduites Prélèvement

Implantation Dosage Epo

Transduction

pCMV hEpo +

SV40 polyA

Essai clinique de phase I

Lippin Y., Blood, 2005

16-18 UI/j/kg 55-65 UI/j/kg

En théorie, 40 à 200 mU/ml de hEpo permettent d’obtenir une érythropoïèse efficace 2 cohortes:

(12)

Essai clinique de phase I

Lippin Y., Blood, 2005

Effet Epo: ↑ réticulocytes (<0.5% 1.25%), Ht??

Expression Epo pendant 14 jours

Pas d’Ac anti-Epo, ni anti-Ad

Réaction inflammatoire locale: immunité cellulaire

Effets secondaires chez 3 patients: HTA, œdème, AVC sévère Effets du traitement

Réponses immunitaire et inflammatoire

Essai clinique de phase I: conclusion

nécessité de contrôler

≠ polyglobulie

• la quantité d’Epo transgénique produite

• la durée de production de l’Epo Utilisation

• des systèmes de régulation transcriptionnelle

• d’administration répétées de faibles doses de vecteur

(13)

Switch-on

Transfert du gène de l’Epo Systèmes de régulation transcriptionnelle

Contrôle temporel de l’expression du transgène

Expression +++

I

I

Vecteur Transgène

Pas d’expression

Switch-on

TA

Transgène

pCMV TA P basal

+

RE

I

I

I + TA

Transgène

pCMV TA P basal

+

RE

Transfert du gène de l’Epo Systèmes de régulation transcriptionnelle

Contrôle temporel de l’expression du transgène

(14)

Switch-on

Réponse rapide, intense et brève à l’inducteur Absence d’expression sans inducteur

Tolérance Système idéal :

Systèmes de régulation transcriptionnelle

Favre D., J Virol, 2002

Macaques sains (n=6)

Injection intramusculaire AAV codant l’Epo (5.10

8

– 1.10

9

particules)

Système Tet-on:

Systèmes de régulation transcriptionnelle

Dérivé de E. coli et virus de l’Herpes

La doxycycline induit l’expression de l’Epo

(15)

Favre D., J Virol, 2002

Dox: I.V. 10mg/kg pendant 5 jours

Systèmes de régulation transcriptionnelle

Traitement de l’anémie associée aux

hémoglobinopathies

(16)

Les hémoglobinopathies:

thalassémie et drépanocytose

Héréditaires autosomiques récessives 7% de la population mondiale

β-thalassémie

> 200 anomalies génétiques connues sur le gène de la β-globine Localisation: Bassin méditerranéen, Asie du sud-est

↓↓ ou Ø expression β-Gb

Excès α-gb Tétramères α4: précipitation

érythroblastes Érythropoïèse inefficace Anémie (4-7g/dl)

↑↑ Epo Hyperplasie érythroblastique Physiopathologie:

Les hémoglobinopathies

β-thalassémie

Hétérozygotes:

•Apparition avant 1 an Aspects cliniques et biologiques:

• asymptomatiques

•Anémie microcytaire (HbA2: 3.5-8%; HbF: 1-2%) Homozygotes: β-thalassémie majeure – maladie de Cooley

•Hépato-splénomégalie, faciès mongoloïde, infections, retard staturo- pondéral et pubertaire

•Anémie majeure (<7g/dl): HbA1: 0-45%; HbA2: 3-7%; HbF: 50-95%

•Hypersidérémie

(17)

Les hémoglobinopathies

Evolution, pronostic, traitement de la maladie de Cooley:

•Evolution naturelle: ↑ hépato-splénomégalie, IC, hémosidérose, accidents thrombotiques espérance de vie < 10 ans

β-thalassémie

•Traitements: transfusions + chélateurs du fer espérance de vie > 30 ans, allogrèphe, réactivation de la synthèse d’HbF (hydroxyurée), supplémentation vitaminique…

Les hémoglobinopathies:

thalassémie et drépanocytose

Drépanocytose ou anémie falciforme

Localisation:

Mutation β6 Glu Val sur le gène de la β-Gb

HbS Polymérisation en milieu désoxygéné

Déformation des GR (faucille ): drépanocytes

↓ demi-vie + hyperviscosité sanguine Physiopathologie:

Prévalence 15-25% en Afrique centrale et de l’ouest

+ crises hémolytiques aigües

(18)

Les hémoglobinopathies:

thalassémie et drépanocytose

Drépanocytose

•Complications aigües:

Hétérozygotes:

•Apparition avant 1 an

Aspects cliniques et biologiques:

• asymptomatiques

•Anémie normocytaire Homozygotes:

•Splénomégalie, infections, douleurs+++

•Complications chroniques:

Accidents ischémiques vaso-occlusifs cardio-pulmonaires, hépatobiliaires, rénales, endocriniennes, neurologiques, ostéo-articulaires

•Anémie (7-9g/dl): HbS: 80-95%; HbA1: 0%; HbA2: 2-4%; HbF: 1-10%

Les hémoglobinopathies:

thalassémie et drépanocytose

Drépanocytose

Evolution, pronostic, traitement :

•Evolution naturelle: espérance de vie ~15 ans sans prévention ni traitement

•Traitements: Prévention (hyperhydratation, antibiothérapie…) Transfusion si urgence vitale

Réactivation de la synthèse d’HbF (hydroxyurée) Allogreffe

Espérance de vie ~45-50 ans

(19)

Thérapie génique des hémoglobinopathies:

Principe

Thérapie cellulaire / ex-vivo Cellules souches hématopoïétiques

HSC

Gène β-globine

Cellules transduites Prélèvement M.O.

Implantation après irradiation létale Transduction

Objectifs

•Expression de la β-Gb:

A long terme, à un fort niveau

Spécifiquement dans la lignée érythroïde Spécifiquement au stade érythroblastique

•Vecteur viral sûr:

Rétrovirus: intégration / risque d’oncogénèse

(20)

Modèles animaux

↓β-Gb majeure

Souris thalassémiques (1983-1995):

Th1

HbbTh1/Th1: thalassémie modérée Øβ-Gb majeure

Th2

HbbTh2/Th2: thalassémie létale HbbTh2/+: thalassémie très modérée Øβ-Gb majeure, Øβ-Gb mineure

Th3

HbbTh3/Th3: thalassémie létale (gestation) HbbTh3/+: thalassémie modérée

Expression des Gb murines + Gb humainesαetβSuper S Souris drépanocytaires (1991-1997):

SAD

Drépanocytose modérée

Ø Gb murines + Gb humainesαetβS BERK

Drépanocytose sévère

Expression de la β-Gb érythro-spécifique à un niveau thérapeutique

Onco-rétrovirus lentivirus (taille de l’insert, stabilité génomique)

Vecteur TNS9 – May C., Nature, 2000

Expression érythro-spécifique à un niveau thérapeutique β-Gb LCR

(21)

Expression de la β-Gb érythro-spécifique à un niveau thérapeutique

Sadelain M., Hum Gene Ther, 2007

Correction β-thalassémie modérée

May C., Nature, 2000

(22)

Correction β-thalassémie létale Hbb

Th3/Th3

Rivella S., Blood, 2003

Transduction de FSC embryonnaire HbbTh3/Th3

Correction de la drépanocytose Pawliuk R., Science, 2001

Transduction de HSC SAD ou BERK

Gène de laβ-GbβA-T87Q(↑résistance à la polymérisation)

(23)

Transgène

LTR P LTR

+ + +

Oncogène

Les essais cliniques

•FR-029:

β-thalassémie, drépanocytose Phase I/II France, 2006 β-GbβA-T87Q

Lentivirus, dérivé TNS9: Insulators cHS4

2 patients adultes recrutés avecβ-thalassémie majeure

•US-852:

β-thalassémie Phase I USA, 2007 β-Gb

Lentivirus, TNS3

Ins Ins

Correction de la β -thalassémie humaine Cavazzana-Calvo M., Nature Letters 2010

P2: Homme, 18 ans Transfusions à partir de 3 ans (6.7g/dl)

Splénectomie à 6 ans (4g/dl; hydroxyurée inefficace) Chélateurs du fer à partir de 8 ans

1 an après la greffe: Hb stable entre 8 et 10 g/dl sans transfusion (presque 2 ans de recul)

Transfusions

Saignées Dernière transfusion

(24)

Correction de la β -thalassémie humaine Cavazzana-Calvo M., Nature Letters 2010

HbA: transfusion; HbE:β-thal

HbAT87Q: 1/3 Hb totales

Présence du vecteur lentiviral:

~3% érythroblastes sg

~10% érythroblastes mo

HPLC

PatientβE/β0 HbE Mutation ponctuelle

26èmecodon β-gb Glu Lys: HbE

création d’un site alternatif d’épissage:↓ β-gb

Correction de la β -thalassémie humaine Cavazzana-Calvo M., Nature Letters 2010

Sites d’intégration du vecteur

Expansion clonale des cellules ayant intégré le vecteur de le 3èmeintron d’HMG2A (High Mobility Group AT-hook 2)

Site HMG2A: ~1.5% des érythroblastes modifiés Stabilisation de l’expansion 15 mois après la greffe

(25)

Correction de la β -thalassémie humaine Cavazzana-Calvo M., Nature Letters 2010

Niveau d’expression HMG2A×10000 Causes: LCR (perte d’un insulator)

HMG2A tronqué stabilisation

Expression de HMG2A tronqué: lipome

hémoglobinurie paroxystique nocture HMG2A: Protéine de liaison à l’ADN

Rôle dans l’assemblage des complexes nucléoprotéiques

Correction de la β -thalassémie et de la drépanocytose Negre O. et al, Hum Gene Ther, 2016

En France:

Essai 1: Patient1: β+0

greffe de secours Patient 2: βE0

Intégration HMGA2 Après 5 ans: clone <1%

8 ans de recul: indépendant des transfusions 1 an après la greffe (7 ans) Patient 3:βE0

Resté dépendant des transfusions

(26)

Correction de la β -thalassémie et de la drépanocytose Negre O. et al, Hum Gene Ther, 2016

En France:

Essai 2: Vecteur BB305:

• sans insulator (efficacité dépendante du site d’intégration, diminue infectiosité, diminue facilité de production)

• promoteur U3 modifié en 5’LTR: hybride CMV (augmentation facilité production dans cellules d’encapsidation dédiées)

Correction de la β -thalassémie et de la drépanocytose Negre O. et al, Hum Gene Ther, 2016

En France:

Essai 2: Vecteur BB305

4 patientsβ-TM: tous devenu indépendants des transfusions 1 patient drépanocytaire: traitement bénéfique

Aux USA: 5 essais cliniques dont 2 avec le même vecteur (10β-TM et 3 drépanocytaires)

Italie

(27)

Correction de la β -thalassémie et de la drépanocytose Ribeil J.-A. et al, New England J of Med, 2017

Homme, 16 ans βSS+ délétion d’un seul allèle codantα-globine Diagnostic à la naissance

Transfusions à partir de 9 ans + chélateurs du fer 13 ans – 2014: inclusion dans l’essai vecteur BB305

Correction de la β -thalassémie et de la drépanocytose Ribeil J.-A. et al, New England J of Med, 2017

Contrôle 1: mère du patient, hétérozygote A1/S Contrôles 3 à 5: homozygotes S/S

(28)

Correction de la β -thalassémie et de la drépanocytose Ribeil J.-A. et al, New England J of Med, 2017

Patient P2 du 1eressai: ~20% du clone HMG2A à 13 mois

Exemple de la drépanocytose

Hoban et al, Blood, 2016, 127(7)

Les autres stratégies en cours de d’études...

Références

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