@ DEMANDE DE BREVET D'INVENTION A1

® ^{REPUBLIQUE FRANQAISE}

INSTITUT NATIONAL

DE LA PROPRIETE INDUSTRIELLE PARIS

©N° ^de

publication

:

(kn'utiliserquepourles

commandesdereproduction)

N°

d'enregistrement_national

:

2 813 789 00 11546

(§)^IntCI7:

A

61

K

7/48,

A

61 K31/375,

A

61 P17/00// (A 61 K

31/375, 31:07, 31:70)

@ ^{DEMANDE DE BREVET} D'INVENTION A1

(22)Datede depot:11.09.00.

©Priorite:

@

^IDemandeur(s): INDUSTRIA

E COMERCIO DE

COS-

METICOS NATURA

LTDA

—

BR.

(43)Datede mise hladispositiondupublicdela

demande

: 15.03.02Bulletin02/11.

@

Inventeur(s):

ROBERT

LADISLAS,

ROBERT ALEXANDRE

MICHEL,

ROBERT CATHERINE

SYLVIE etGESZTESI

JEAN

LUC.

(56) Listedesdocumentscitesdanslerapportde recherchepreliminaire: Sereporteralafindu presentfascicule

©

^{Referencesh d'autresdocumentsnationaux}

apparentes

:

©

Titulaire(s)

:

®

Mandataire(s): REGIMBEAU.

@ NOUVELLE COMPOSITION COSMETIQUE OU PHARMACEUTIQUE COMPRENANT UNE

ASSOCIATION

DE

VITAMINE

C

ET/OU

AVEC UN COMPOSANT FUCOSE, ET

UTILISATION

DE CETTE

ASSOCIATION

EN COSMETIQUE OU

PHARMACIE.

(5p Lapresenteinventionconcerneunenouvellecompo- smon cosm6tique ou pharmaceutique caracteris6 en ce

u'elle comprend au moins un composantvitaminechoisi anslegroupeconstitu6parlavitamine

C

etsesd6riv6s,la vitamine

A

(ou r&inol) etsesderives, et les melanges de cesceux-ci,enassociationavec au moins uncomposantfu-

cosechoisidanslegroupeconstitueparlefucose,lespoly- saccharidesetoligosaccharidescontenantdu^fucose,et les

melangesde cesceux-ci, ainsiqu'aumoins unexcipient ac- ceptable.

CettecompositionpermetderSduiresignificativement, parunveritable effetdesynergie,I'effettoxiqueducompo- sant vitamineetdoned'utiiiserdans lacompositiondeste-

neurs en composant vitamine sup6rieures ou Ggales k cellesdes produits dejci existantdans lecommerce, sans risquepourI'utilisateur.

iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii

2813789

i

Titre _: Nouvelle composition cosmetique

ou

pharmaceutique

comprenant

_une association de vitamine

C

et/ou

A

avec

un composant

fucose, et utilisation de cette association en cosmetique

ou

pharmacie.

La

presente invention concerne une nouvelle composition cosmetique

ou

pharmaceutique

comprenant une

association

de

vitamine

C

et/ou

A

avec

un composant

fucose, et l'utilisation de cette association

notamment

dans des produits a application topique,

pour

lesquels uneactivite surletissuepithelial

ou

conjonctifest recherchee, en particulier desproduits anti-age,tels que des produitspharmaceutiques

ou

veterinaires, etplus particulierement,dans desproduitscosmetiques.

Le

collagene, constituant majeur

du derme

subit, selondes travaux anterieurs

(BRANCHET

^et al„ Arch. Gerontol Geriatr., 1991, 13: 1-14),

une

diminution quantitative avec Page.

La

regulation de sa biosynthese est

done une

etape tres

importanteaconsidererpourluttercontrele vieillissement cutan£.

S'il est bien

connu que

l'acide ascorbique (ou «vitamine

C»)

et ses sels

(notamment

de sodium) possedent un effets stimulant sur labiosynthese

du

collagene,

on

a

pu en

revanche mettre en evidence son effet cytotoxique a partir d'une concentration d'environ 0,01

%

^enpoids.

L'effet deactivation de la biosynthese

du

collagene, tres favorable, est

observable sur des cliches

de

microscopie £lectronique, par

une

forte dilatation des v£sicules

du

reticulum endoplasmiquerugueux,rempliesdeproteines neosynthetisees.

L'effet cytotoxique, defavorable, observable & desconcentrations millimolaires d'ascorbate (environ _2,5

mM),

se manifeste par le decollement des cellules

de

leur substrat, le ralentissement de leur proliferationet de laviabilite cellulaire, puis par une

mort

cellulaire.

Par ailleurs, le retinol (ou « vitamine

A

») ainsi

que

d'autres retinoi'des tel le retinyl palmitate sont des

composes

apprecies en particulier dans le

domaine

des produits cosmetiques pour leurs activites biologiques favorables

notamment

_pour la lutte contre le vieillissement cutane.

Ces

activites revelees par

une

utilisation par voie topique

de

la vitamine

A

etde sesderivessont presentees par

exemple

dans Particlede

Wade Cheng, PhD

et Shirley

De

^Petris, «Vitamin

A Complex

», Skin Inc, mars/avril 1998.

2813789

2

Toutefois, Putilisation de la vitamine

A

pure

ou

d'un

de

ses derives presente Pinconvenient d'une toxicite telle que

Ton

doit limiter le dosage

ou

ajouter des

composants notamment

pour minimiserPinconfortdePirritation

de

lapeau

en

resultant.

En

particulier, il a ete signale

que

le retinol induit

une

inhibition de la proliferation cellulaire sur des fibroblastes

en

culture conventionnelle (Lacroix A.,

Anderson

G.D.L.,

Lippman

M.E., « Retinoids

and

cultured

human

fibroblasts»,

Exp

Cell Res, 1980, 130: 339-344; Harper

R.A, Burgoon

T., «Differential effects

of

retinoic acid

on

the

growth

of normal fibroblast-like cells in vitro

from human, swine and

rabbitskin», Cell Biol IntRep, 1982, 6: 163-170;

ou

encore

Stumpenhausen

G.,

Hein

R., Kulozik M.,

Mauch C,

Bryce G.F.,

Oono

T., Krieg Th.,

«The

influence

of

retinoids

on

fibroblastfunctions», in Saurat

JH

ed., Retinoids : 10 years

On,

_{1991, pp.}

139-150 Karger, Basel). II s'agit d'un veritable effet toxique

du

retinol sur les fibroblastes.

Les vitamines

C

et

A

etles selsetderives deces dernieres etant des

composants

vitaminetres souvent presents

notamment

dans les produits cosmetiques, en particulier les produits cosmetiques anti-age, il etait

done hautement

souhaitable de pouvoir surmonter les inconvenients precites afin de pouvoir accroTtre les teneurs et

done

les effets favorablesde cescomposants,toutenreduisantleurs effetstoxiques.

On

^a maintenant constate de maniere tout a fait surprenante et inattendue

que P

association de fucose

ou

d'un polysaccharide

ou

oligosaccharide contenant

du

fucose avec la vitamine

C

et/ou la vitamine

A

permet

de

reduire significativement, par

un

veritable effetdesynergie, leseffetstoxiquesdeces vitamines.

La

presente invention a ainsi pour objet

une

composition cosmetique

ou

pharmaceutique caracterise en ce ^qu'elle

comprend au moins un composant

vitamine choisi dans le groupe constitue par la vitamine

C

et ses derives, la vitamine

A

(ou retinol) et ses derives, et les melanges de ceux-ci, en association avec au

moins un composant

^fucose choisi dans le groupe constitue par le fucose, les polysaccharides et oligosaccharidescontenant du fucose, etles

melanges

de ceux-ci, ainsi qu'au

moins un

excipient

cosmetiquement ou

pharmaceutiquement acceptable.

Par « derives

de

la vitamine

C

»,

on

entend en particulier selon Pinvention les sels, telquele

sodium

ascorbate,et lesesterstels

que

Pascorbyl phosphate

ou

_Pascorbyl

palmitate.

2813789

Le

terme «retinol» (ou vitamine

A)

doit etre compris

comme

^incluant les

isomereshydrogeneset

non hydrog6n&,

^tels

que

les9-cis-retinol etdidehydroretinol.

Par «derivesde la vitamines

A

»,

on

entend en particulier selon Pinvention les retinoidesautres

que

leretinol,enparticulierles esters obtenus avec ler&inol et Pacide

5 acetique, l'acide propionique, Pacide palmitique

ou

Pacide stearique, et plus particulierementPacider&inoi'que,leretinaldehyde (ouretinal) etleretinylpalmitate.

Le

terme «retinaldehyde» doit etre compris

comme

incluant les 4 formes stereoisomerstrans, 13-cis, 11-cis et 9-cis.

Le

monosaccharide fucose est

un deoxyhexose

proche

du

galactose dont il

10 possede la conformation sterique. Toutefois, la structure

du

fucose differe de maniere essentielle de celle

du

galactose en ce

que Patome de

carbone-6

comporte un

groupe methyle(-CH3)et

non un

groupealcoolprimaire

(-CH2OH). Ce

groupe meihyle confere eneffeta la molecule

du

fucose

un

caractere

hydrophobe

partiel intSressant,

compense

parles autresgroupes hydroxylesurlesquatreautres

atomes de

carbonepresents.

15

Le

monosaccharide fucoseutilisable dans la composition selon Pinvention peut etre le L-fucose, le D-fucose

ou Pun

de leurs melanges.

Le

L-fucose et le D-fucose peuvent se presenter chacun sous la

forme

alpha, beta

ou

d'un

melange

de ces formes alphaet beta.

Ces

produits sont

notamment

commercialises parlasociete

SIGMA.

Le

fucose apparait tot au cours

de

la phylogenese, les polysaccharides

de

20 certaines algueset de

champignons

en contiennent

en

quantite relativement importante, seul

ou en combinaison

avec d'autres

composes

chimiques.

Le

fucose est par ailleurs repandu dans le regne vegetal et certaines bacteries en synthetisent aussi.

Le

fucose peutegalementapparaitresous forme sulfatee

comme

dans lesfucanes.

Ainsi, par Pexpression « polysaccharides ^et oligosaccharides contenant

du

25 fucose »

on

entend tout polysaccharide

ou

oligosaccharide

comprenant

au

moins une

unite fucose,

y

^comprisles polysaccharidesetoligosaccharides sulfates« fucanes».

Les fucanes sont des polysaccharides sulfates, entrant dans la constitution des parois cellulaires desthallesd'algues brunes (Pheophycees).lissontegalementpresents chezcertains

animaux

marins, telsque Poursin et le

concombre de

mer.

Le

fucane brut, 30 egalement

denomme

fucoidanes, obtenu par extraction acide a partir des parois cellulaires des thalles d'algues brunes, est constitu£ d'une population heterogene

de

molecules, qui

comprend

principalement des polymeres

de

L-fucose ^sulfate,

de masse

2813789

4

molaire

moyenne

elevee (100 000 a 800

000

g/mol).

Des

preparations de fucanes de

masse

molaire

moyenne moins

elevees (inferieure a

20 000

a 10

000

g/mol, ont etd obtenues, par

exemple

par hydrolyse

menagee de

fucane

de masse

molaire elevee

comme

decrit dans

EP-0 403

377

ou

par depolymerisation radicalaire

comme

decrit dans

WO

97/08206.

On

peut citer en particulier le produit

denomme

«Fucoidane»,

commercialiseparlasociete

SIGMA.

Parmi

les polysaccharides et oligosaccharides contenant

du

fucose utilisables danslacompositionselonI'invention,autres

que

lesfucanes,

on

peutciterenparticulier

ceux

commercialises parla soctete Solabia,tel

que

le polysaccharide « Fucogel 1000».

La demande WO

96/23057 decrit le precede de preparation d'un tel polysaccharide,

comprenant

lemotif de repetition fiicose-galactose-acidegalacturonique.

Nous

avons par ailleurs decouvert

un nouveau melange

d'oligosaccharides contenant

du

fucose, ci-apres

denomm6

«

Melange

d'oligofucoses » particulierement appropriepourlapresenteinvention.

II s'agit d'un

melange

d'oligosaccharides

non

sulfates a base de fucose, caracterise en ce qu'il

comprend

des oligosaccharides de

moins

de 13 unites saccharidiques comprenant

au

moins

une

unite fucose en position terminale

non

reductrice, et en ce qu'il est susceptible d'etre obtenu par

un

procede

comprenant

au

moins une

etape dedegradationd'unpolysaccharideissu d'un microorganisme

du

genre Klebsiella

pneumoniae

subsp.pneumoniae.

Par "oligosaccharide

non

sulfate a base

de

fucose"

on

entend selon Invention, en accord avec les connaissances generales

de l'homme du

metier,

un

oligosaccharide contenant au

moins une

unite saccharidique fucose et ne comportant pas de groupe sulfate

-0(S0

₃^)'.Lesfucanes sontenparticulierexclus

de

cette definition.

Par "oligosaccharide comprenant au

moins

une unite fucose en position terminale

non

reductrice"

on

entend selon 1'invention, en accord avec les connaissances generales de

l'homme du

metier, un oligosaccharide contenant au

moins

une unite saccharidique fucoseen position terminale de lachaine de l'oligosaccharide, cette unite fucose etant relivea Tunite saccharidique suivante

du

reste de roligosaccharide parune liaisonde typeacetal.

2813789

Les

nombres

d'unites saccharidiques peuvent etre

mesurees

a I'aide de techniques bien connues de

l'homme du

metier, en particulier

en

utilisant la technique

de

chromatographic

HPLC

^telleque celledecritedansles

exemples

ci-apres.

De

preference, le

Melange

d'oligofucoses

comprend,

_par rapport au poidstotal 5

du

melange,

au moins

15

%

^{enpoids, et}plus particulierement

de

preferencede

20

a

50

%

^{en poids,} ^oligosaccharides de

moins

de 13 unites saccharidiques

comprenant

au

moins

uneunitefucoseenpositionterminale

non

reductrice.

Plus particulierement, le

Melange

d'oligofucoses est caracterise en ce qu'il

comprend

en outre, par rapport au poids total

du

melange,

de 25

a

45 %

en poids

10 ^oligosaccharides ayant de 13 a

24

unites saccharidiques

comprenant

au

moins une

unitefucoseenpositionterminale

non

reductrice.

Plus particulierement encore, le

Melange

d'oligofucoses est caracterise en ce

qu'il

comprend en

outre, par rapport aupoids total

du

melange,

de

15 a 35

% ^en

poids

^oligosaccharides de plus de 54 unites saccharidiques

comprenant

au

moins une

unite

15 fucoseenposition terminale

non

reductrice.

Le Melange

d'oligofucoses etant susceptible d'etre obtenu par

un

procede comprenant

au moins une

etape de degradation d'un polysaccharide issu d'un microorganisme

du

genre Klebsiella

pneumoniae

subsp.

pneumoniae,

les oligosaccharides

comprennent

de preference, au

moins

en partie, le motifde repetition 20 fucose-galactose-acide galacturonique.

En

particulier, le

Melange

d'oligofucoses est susceptible d'etre obtenu par le

procede

comprenant

lesetapesconsistanta:

a) fairecroitre lemicroorganisme

du

genreKlebsiella

pneumoniae

subsp.

pneumoniae

dans

un

milieu nutritif

aqueux

par fermentation aerobie d'une 25 source deglucideassimilable;

b)recupererlepolysaccharideforme apartir

du mout de

fermentation;

c) soumettrelepolysaccharidea

une

hydrolysemoderee;

d) soumettre le produit d'hydrolyse de Tetape c) a

une

hydrolyse enzymatique; et

30 e) desactiver l'enzyme puis recuperer le

Melange

d'oligofucoses ainsi forme.

2813789

6

Plus particulierement, ces etapes a) a e) peuvent etre decrites de la

manteresuivante.

Etapea)

On

utilisedepreferencelemicroorganismeKlebsiella

pneumoniae

subsp.

5

pneumoniae

est lemicroorganisme depose alaCollection Nationalede Cultures de Microorganismes sous le

numero

1-1507,

ou un

mutant de ce dernier.

Ce

microorganismeestparailleursdecritendetailsdansla

demande WO

96/23057.

Le

milieu nutritif aqueux peut etre tout milieu

aqueux connu

de

l'homme du

metier, contenant des sources de carbone, d'azote et des sels

mineraux

tels

que ceux

10 decrits dansla

demande WO

^96/23057.

On

peutconduirelafermentationa destemperaturesde Tordrede

25

a 35 °C,a

un

pH

d'environ 6,0 a 7,5,dansdes conditionsd'aeration et d'agitation,pendant des durees del'ordre

de

2 a

4

jours.

La

fermentation peutetre effectu£edans

un

fermenteur classique

en

inoculant

du

15 milieunutritifpr^alablementsterilise, par

exemple

par chauffage a une temperature

de

l'ordrede 120

°C ou

parfiltration sterilisante.

Etapeb)

A

lafin

de

laperiodede fermentation,

on

recupere le

mout de

fermentationduquel

on

isole

un

polysaccharide richeenfucosede lamanieresuivante.

20

On soumet

le

mout

de fermentation a

un

traitement thermique a une temperature

notamment comprise

entreenviron 100 et environ 130 °C, de preference entre environ

115 etenviron 125

°C

pendant

un

temps

notamment

d'environ

30

minutes

a

environ 2 heures etde preference d'environ 40 minutes a environ ¹ heure et a

un pH notamment

comprisentreenviron 2etenviron5,5 etdepreference entreenviron 3 etenviron5,5.

25

Le

produit

du

traitement thermique est filtre selon des

moyens

classiques tels qu'une filtrepresseavecplaques.

On

obtientainsi

un

polysaccharide limpide,visqueuxet

exempt

detoute cellule.

On

realise ensuite une precipitation dans

un

solvant alcool, de preference

un

solvant alcool choisi parmi l'ethanol, I'isopropanol et les

melanges

de ces derniers.

On

30 utilise en particulier environ 1 a environ 3,0

volume de

solvant pour ¹

volume

de polysaccharide et

de

preference environ 1,3 a environ 2,0

volume

de solvant pour 1

volume

depolysaccharide.

2813789

On

effectue ensuite

un

sechage sous vide a

une

temperature

notamment

compriseentre environ

20

et environ

60 °C

et

de

preference entreenviron

30

etenviron

50

°C, jusqu'a obtention d'une poudre.

5 Etapes c)etd): hvdrolvse dupolysaccharide

II s'agit

d

^!unecombinaisond'etapes essentielle.

On

a

en

effetconstate demaniere surprenante et inattendue

que

la combinaison d'une etape d'hydrolyse moderee, de preference par irradiation

aux

rayons

gamma

et/ou par protolyse, avec une

&ape

d'hydrolyse enzymatique, permet d^!obtenir avantageusement

un rendement

global 10 d'hydrolyse suffisant, proche de celui d^fune hydrolyse classique telle qu'une hydrolyse acide,

mais

avec l'avantage

de

coupures specifiques d'une hydrolyse enzymatique.

En

particulier,

une

^hydrolyse classique acide

ne

permet pas d'obtenir le

Melange

d'oligofucoses specifiques dans la

mesure

oil elle conduit a l'obtention de coupures

statistiques, redhibitoires quant

a

leur caractere aleatoire. Les

composes

resultant d'une 15 hydrolyseacide classiquesesontd'ailleurs rdvetesbiologiquementinactifs.

Etapec):hvdrolvse

moderee du

polysaccharide

L'hydrolyse

moderee

est realisee par

un

traitement au rayons

gamma, ^un

traitementdeprotolyse

ou

par cesdeuxtraitementssuccessifs.

De

preference,

on

realise successivement

un

traitementau rayons

gamma

puis

un

traitement deprotolyse.

20

Le

traitementpar les rayons

gamma

^s'avereprovoquer

une

baisse sensible de la viscosite

de

parune degradation limitee, attribuable aTaction

de

radicaux libres. II peut etrerealiseavecdes

moyens

d'irradiationbienconnusde

Thomme du

metier.

Ce

traitement par des rayons

gamma,

rayons tres penetrants, presente en outre Tavantage

de

steriliser le polysaccharide en tuant les

germes

presents qui pourraient 25 induire

une

inflammation

ou meme

provoquer

un

granulome.

On

previent ainsi toute attaque bacterienne sans devoir ajouter au milieu des produits antiseptiques qui eux pourraient interferer de maniere indesirable avec les activites biologiques

du

produit final.

La

poudre de polysaccharide obtenue a Tetape b), eventuellement irradiee aux 30 rayons

gamma,

peut

done

egalementetresoumise a

un

traitement de protolyse. Elle est pour cela

mise

en solution aqueuse & raison

notamment

de 1 a

20 % ^en

^{poids et} de preference

de

2a 10

%

enpoids, par rapportaupoids totalde lasolution aqueuse.

2813789

8

La

solution aqueuse est soumise a

un

traitement thermique, c'est a dire a

un

chauffageaune temperature

notamment

comprise entreenviron

75

etenviron 120

°C

et

de

preferenceentreenviron

90

etenviron 100°C, pendant

un temps notamment

compris entre 1 et

6

heures,

en

presence d^!une r£sine generatrice

de

protons telles

que

celles 5

commercialism

et bien connues de

l'homme du

metier, c'est a dire

une

resine generant des protons qui entrainent une coupure des liaisons glycosidiques avec fixation d'une moleculed'eau.

Etaped)^:hvdrolvse enzymatique

On

introduit

un tampon

acide tel

que

le

tampon

acide citrique (4,15 g/kg)-

10 hydrogenophosphate disodique (environ 10,75 g/kg) dans Thydrolysat obtenu a l'etape b).

On

regie latemperature

de

lasolutionaune temperature

notamment

compriseentre environ 25etenviron

45 °C

etdepreference entreenviron

30

etenviron

40

°C.

On

introduit

une

preparation enzymatique

comprenant

au

moins

une endo- fucosidase, de preference la

Fermizyme HCP

^telle

que

commercialisee par la societe 15 Gist Brocades, selon

une

teneur

notamment

compriseentre environ 2 et environ

20 %

enpoids,etdepreferenceentre environ5 etenviron 15

% en

poids,parrapportau poids initialde poudre

de

polysaccharideutilisee.

Le melange

ainsi obtenu est

maintenu

sous agitation pendant

un temps notamment

compris entre environ8et environ

24

heureset de preference entreenviron 20 10 et environ

20

heures, a

une

temperature

notamment

comprise entre environ 25 et

environ

45 °C

et

de

preference comprise entre environ

30

et environ

40

°C, le

pH

etant regiek6parlapresence

du

melange tampon.

Etapee)

Le

produitd'hydrolyse obtenu a Tissue

de

l'etape d) est filtre selon des

moyens

25 classiques telsqu'unefiltrepresseavec plaques.

La

solution recueillie est ensuite traitee

thermiquement

a

une

temperature

notamment

comprise entreenviron 75 et environ 120

°C

et de preferenceentre environ

90

etenviron 105 °C,pendant un temps

notamment

comprisentre environ 10et environ

45

minutes etde preference entreenviron

20

et environ 35 minutes, afin

de

desactiver 30 l'enzymeetplus particulierementPactivitefucosidase

de

cette

enzyme

specifique.

On

laisse refroidir a une temperature

notamment

comprise entre environ

20

et

environ

40 °C

.

2813789

9

Lors

du

refroidissement,des conservateurspeuventetreajoutesklasolution.

On

filtre ensuite l'ensemble dans des conditions steriles puis

on

realise le

conditionnement.

Le Melange

d'oltgofucoses ainsi obtenu peut etre caracterise a l'aide

de

techniques bien connues de

rhomme du

metier

notamment

par

HPLC,

chromatographic sur

couche mince

etautresmethodesetdosageschimiques.

On

peutainsi constaterqueles oligosaccharides

du Melange

d'oligofucoses sont tels que tels

que

le fiicose se retrouve majoritairement

en

bout

de

chaine, en position terminale

non

reductrice.

Les

effets favorables de la composition selon Finvention se

manifested

a des concentrations faiblesde

composant

fucose,de preferencea

une

concentrationcomprise entre environ 0,001 ^et environ

20 %

^en poids, et plus particulierement de preference entre environ 0,01 et environ 10

% ^en

poids, la concentration

en composant

vitamine

&ant de

preference comprise entre environ 0,001 et environ

90 %

^{en poids,} et plus particulierementdepreferenceentre environ 0,1 et environ 10

%

en poids,parrapport aupoidstotal

de

lacomposition.

En

choisissant d'une fafon adequate les concentrations respectives

du composant

vitamine et

du composant

fucose, il est ainsi possible de reduire significativement, voire de supprimer I'effet toxique

du composant

vitamine et

done

d'utiliser

dans

la composition selon 1'invention des teneurs en

composant

vitamine sup&ieures

ou

egales a celles des produits deja existant dans le

commerce,

sans risque pourl'utilisateur.

De

preference, le rapport ponderal

composant

vitamine :

composant

fucose est

compris entre environ 800 ^: 1 et environ 1 : 2 et plus particulierement de preference entreenviron

600

^: 1 etenviron

1:1.

L'excipient cosmetiquement

ou pharmaceutiquement

acceptable peut etre tout excipient

parmi

ceux connus de

l'homme du

metier en

vue

d'obtenir

une

composition selon Tinvention sous forme d'une creme, d'une lotion, d'un gel, d'une

pommade,

etc,

eventuellement sous la forme d'une emulsion avec en outredes

composants connus

de

Thomme du

metier, pourameliorer,modifier

ou

stabiliser lacomposition _{d'un point} de vue cosmetique

ou

cosmetique.

2813789

10

L'expression «excipient pharmaceutiquement _acceptable» englobe _les excipients adaptesa

un

usageveterinairedelacompositionselon 1'invention.

La

composition selon Tinvention peuten particuliercontenir d'autres additifs et aides a la formulation, tels que des agents antioxydants pour combattre les radicaux

libres.

On

peut citer

notamment

la vitamine

E

pure

ou

le di-alpha- tocopherol et ses derives,etle2,6-di-ter-buthyl-p-cresol(BHT).

Selon

un mode

derealisation particulierde lapresente invention, lacomposition

comprend en

outre

un

vecteur, tel que des microspheres renfermant

en

particulier le

composant

vitamine,

comme

parexemple les «Talaspheres » decrites dans

US-5

395

620 ou dans

notre

demande

de brevetPI9706994-7.

La

composition selon l'invention peut ainsi par

exemple comprendre

une pluralite

de

microspheres, dispersees,

comprenant un

premier

composant

vitamine

C

dans

un

premier groupe

de

microsphereset

un deuxieme composant

_vitamine

A

dans

un deuxieme

groupe

de

microspheres, le

composant

fucose etant a Pexterieur des microspheres, danslerestedelacomposition.

Bien

entendu, une variante

de

ce

mode

de realisationpeutconsister

en

cequele

composant

vitamine

C

et/

ou A

soitcompris dans

un

seul groupe demicrospheres.

Avantageusement,

la composition selon l'invention peut

en

particulier

comprendre

en outre

au moins

un additif

cosmetiquement ou pharmaceutiquement

acceptable, choisi dans le groupe constitue par les agents structurants

de

la

peau

(tels

que le squalane et les sphigolipides), les agents humectants (tels

que

la glycerine et

I'hydroxy prosilan C), les emollients (tels

que

le buthylene glycol et le lactate de cethyle), les silicones (telles

que

la cyclomethicone), les agents de protection solaires (tels

que

les Parsol

1789

et Eusolex 6300), les emulsifiants

(notamment

le Carbopol 1342associea latriethanolamineet lalecithinedesoja), lesepaississants

(notamment

la

gomme

de xanthane), les agents sequestrants

(notamment 1'EDTA),

les antioxydants (tels que le

BHT

^decritci-dessus) les fragrances, les conservateurs, et les

melanges

de ceux-ci.

Bien

entendu, les conditions operatoires

pour

preparer la composition selon l'invention fontpartiesdesconnaissances generales

de l'homme du

metier.

La

presente invention a encore pour objet Putilisation, dans

une

composition cosmetique

ou

pharmaceutique, d'au

moins un composant

vitamine tel

que

defini _ci-

2813789 n

dessusenassociation avec au

moins un composant

fucosetel

que

defini ci-dessus,pour reduireleseffetstoxiques

du composant

vitamine.

De

preference,

on

utilise un rapport ponderal

composant

vitamine :

composant

fucose est compris entre environ

800

: 1 et environ 1 : 2 et plus particulierement de preferenceentreenviron

600

: 1 etenviron

1:1.

Enfin, la presente invention a encore pour objet

une methode

pour le traitement cosmetique

ou

pharmaceutique de lapeau, caractSriseeen ce

qu

^f

on

applique sur la

peau

une composition cosmetique ou pharmaceutiquetelle quedefinie ci-dessus.

En

particulier, la presente invention a pour objet une

methode

de traitement cosmetique

de

la peau, caracterisee en ce qu'on applique sur la

peau une

composition cosmetiquetelle

que

definieci-dessus.

Les

exemples

ci-apres illustrent

une

veritable synergie entre le fucose, les oligosaccharides a fucose avec le retinol et l'ascorbate et justifient leur association

notamment

dans

une

preparation" anti-vieillissement"cosmetologique.

Les exemples suivants ne sont toutefois destines qu'a illustrer la presente invention et

ne

doivent en aucun cas etre interprets

comme pouvant

en limiter la portee.

La

Figure 1 est

un

histogramme reportant les resultats presentes a l'exemple 4.b.l, en termes de pourcentage d'efficacite

du

fucose et

du Melange

d'oligofucoses-1 pourlastimulation delasynthesedecollagene parlesfibroblastes.

La

Figure 2 est

un

histogramme reportant les resultats presentes a l'exemple 4.b.2, en termes de pourcentage d'efficacite

du

fucose et

du Melange

d'oligofucoses-1 pour la stimulation de la biosynthese de collagene par les fibroblastes en presence d'ascorbatede sodium.

La

Figure 3 est

un

histogramme reportant les resultats presentes a I'exemple 4.b.3, en termes de pourcentage d'efficacite

du

fucose et

du Melange

d'oligofucoses-1 pourlastimulationdelasyntheseducollageneen presence deretinol.

2813789

12

Exemple

1 : preparation

d'un Melange

d'oligofucoses

a)

Fermentation

On

utilise le microorganisme Klebsiella

pneumoniae

subsp.

pneumoniae

est le

microorganisme

_{depose klaCollection}Nationale deCultures de

Microorganismes

_sous

le

numero

1-1507.

Le

milieu nutritif et autres conditions

de

la fermentation sont les suivants.

Preparationdes inoculums

Milieudeculture

:

N^osorb®70-07(teneurensorbitol:70

%

M.S.;

Vendupar

ROQUETTE

FRERES,Lille/France): 17,90_{g/1(soit 12,5g/1}desorbitol) Peptone Biokar 104003(hydrolysatdeproteines,

vendu par

SOLABIA-BIOKAR,

Pantin, France) :4,50g/1 Extraitdelevure

KH

2

P0

₄

K

2

HP0

4

MGS0

4,

7H

20

Pluronic®

PE

61000(agent anti-mousse,

VenduparBASF,D-6700Ludwigshafen, Allemagne)

Miseensolutiondans deI'eau.

j

Conditiondeculture

:

Stdrilisationa I21°Cpendant 30 minutes Temperature deculture:30°C

Tauxd'inoculation: 5 £ 10

%

Aeration : I

VVM

PH

nonregute(pHd'environ 7,00) Duree deculture: 24heures

:0,05g/I

: 1,50g/1

:4,50g/1

:0,20g/1

:0,50g/1

Milieude production Milieudeculture:

Neosorb®70-07

Peptone Biokar

®b

104003 Extraitdelevure

KH

2

PO<

54,00g/1(soit38g/Idesorbitol) 4,50g/1

0,05g/1 1,50g/1

2813789

13

MgS0

_4,

7H

₂

0

Pluronic®PE61000

:0,20g/1

:0,50g/1

Miseensolutiondans deI'eau.

Conditionsdeculture(FermenteurChemapayantunvolumeutilede350litres)

:

Sterilisationk120°C pendant45minutes Temperaturedeculture:30°C

Tauxd'inoculation:environ 5

%

Agitation:300rpm(agitateurdetype Rushton) Aeration : 1

VVM

PHrtgutea7,0parNaOH7N

Pression: 100a200mbars Dureedeculture:60a65 heures

Valeursmoyennesobtenues enproduction^:

Viscositeenfindecycle_: :40000 Mpa.s(Viscosimfcres Brookfield DV-II+

b)

Recuperation du

polysacharide

forme

On

soumetle

mout

defermentationa

un

traitementthermique aune temperature de 120

°C

pendant 45 minutes et a un

pH

de 5,5.

Le

produit

du

traitement thermique est filtre a l'aide d'une filtre presse avec plaques type Seitz.

On

obtient ainsi

un

polysaccharide limpide, visqueux et

exempt

de toute cellule.

On

realise ensuite

une

precipitation dans

un

1,5

volume

d'ethanol

pour

1

volume de

polysaccharide.

On

effectue ensuite un sechage sous vide a une temperature

de

25

°C

jusqu'a obtention d'une poudre.

Compte

tenu

du

microorganisme utilise, ce polysaccharide est

compose,

d'unites repetitives trisaccharidiques fucose -galactose- acide galacturonique, et presenteainsilastructuresuivante

:

modeleLV, mobileSP31,chambre SC4-34/13R, 30°C) Concentrationdupolysaccharide produit

danslemilieu, calcuteeenL-flicose Sorbitolconsomme

NaOH

&

20%

enpoidsconsomm^e D£but deregulationdu

pH

Extraitsecfinaldumilieude fermen-

:2g/1(mdthode de DischeetShettles)

:>35_g/1(ensorbitol)

: 151itres/m³

: 16a 17heures apr^sinoculationdufermenteur

tation :-20g/1

14

2813789

9"!°" COOH

c)

Hydrolyse moderee du

polysaccharide

La poudre de

polysaccharideestmise ensolution aqueuse araisonde 5

%

enpoids, par rapport

au

poids total

de

la solution aqueuse.

La

solution aqueuse est

soumise

a

un

traitement thermique, c'est a dire a

un

chauffage a 100 °C, pendant 3 heures, en presence d'uneresinegenfratricedeprotons.

d)

Hydrolyse enzymatique

On

introduit le

melange tampon

acide citrique (4,15 g/kg)-hydrogenophosphate disodique (environ 10,75 g/kg) dans I'hydrolysat.

On

regie la temperature

de

lasolution a 37

°C On

introduit la preparation enzymatique

Fermizyme HCP

telle

que

commercialisee par la societe Gist Brocades, selon

une

teneur

de

10

%

en poids, par rapport

au

poidsinitialde poudre depolysaccharide utilisee, c'est kdire

0,05%

en poids par rapport a la

masse

totale de la solution aqueuse aprfes remise en eau

de

lapoudre

comme

^d6critci-dessus

pour

l'hydrolyse

mod£r£e

par protolyse.

Le melange

ainsi obtenu est maintenu sous agitation pendant 15 heures a

une

temperature

de 37

°C,le

pH

etant regiea6parlapresence

du melange

tampon.

e)

Deactivation de

l'enzymeetrecuperation

du melange

d'oligosaccharides

Le

produit d'hydrolyse est filtre avec

une

filtre presse avec plaques type Seitz.

La

solution recueillie est ensuite traitee thermiquement a 100

°C

pendant

30

minutes, pour desactiver Tenzyme.

On

laisse refroidir a une temperature de 25°C. Lors

du

refroidissement, lesconservateurs

pWnoxy

ethanol

(1%

enpoids) et

phenonip

_(0,3

%

^en

poids) sont ajoutes a la solution.

On

filtre ensuite l'ensemble dans des conditions

steriles.

Le melange

d'oligosaccharides ainsi obtenu est

denomme "Melange

d'oligofucoses-l".

2813789

. 15

Exemple

2 : caracterisation

HPLC du Melange

d'oligofucoses-1

Le

fractionnement

du Melange

d'oligofucoses-1 obtenu a l'exemple 1 a ete realise dans le dessin

de

determiner la proportion d'oligo- et polysaccharides dans sa 5 composition.

a)

Fractionnement par chromatographic

d'exclusion preparative sur la

colonne

"

Xk

50/60

Superdex 75 prepgrade

⁹⁹

Nous

avons passe

50ml du Melange

d'oligofucoses-1 concentrea

50mg/ml,

sur

une

colonne preparative

"XK

50/60 Superdex 75

prepgrade"

(chromatographic

10 d'exclusion)et

nous avons

collecte95fractions,passees ensuiteen

HPLC

.

Tableau

1 ;

Informations

techniques

concernant

lacolonne preparative

XK

50/60

Superdex

75

prepgrade

Remplissage

1

Superdex

75

prepgrade (34^\xm)

Taille

de

lacolonne Hauteur ^:

50 cm

Diametre^:

60 mm

Type de

colonne

XK

50/60

Intervalle utilisable

de fractionnement

5xl0

²

Da-3xl0

⁴

Da

Echantilloninjecte

:

50

ml du Melange

d'oligofucoses-1 a la concentration de 50 mg/ml. (au total ^:

=

2,50 _g)

Vitessed'elution 1 ml/ minute

Nombre de

fractions collectees

95 fractionsde 12,5

ml chacune

Phase mobile PBS

2813789

16

Apres

fractionnement

du Melange

d'oligofiicoses-l sur la colonne ^"

XK

50/60 Superdex 75 ^prepgrade,

on

^{recueille95 fractionsdont}

45

contiennentdesosides.

b) Caracterisation des ^fractions

obtenues par HPLC (chromatographic

5 d'exclusion)colonnes ultrahydrogel

120

etultrahydrogel

250

L'objectifde cette

deuxieme

partie

de

notre etude^etait de passer sur

une

colonne d'exclusion

HPLC

^(colonnes Utrahydrogel 120 et 250) toutes les 95 ^fractions

du Melange

d'oligofucoses-1 pour analyser les poids moleculaires et la concentration des composants decesfractions.

i0

Nous

^{avonstravaillepourcette etude avec}

^un

^systeme

HPLC de Waters

dont la description^suit.

Tableau

^{2 :} caracteristiaues techniques

du systeme de chromatographic HPLC

utilise

Appareil

HPLC

Waters

600

Colonnes

Ultrahydrogel 120(tailledepores : 120

A)

etUltrahydrogel

250

(taille de pores^:

250 A)

de Waters. Taille: 7,8

mm x 300 mm,

contenantlegel

de

polymetacrylatehydroxyle

Echantillonsinjectes 20 nlparinjecteurautomatique

Elution

Temps de F

^elution

0,10MNaNO

3

50minutes/ echantillons

Vitesse

de

Pelution 0,5ml/^minute.

Detection ^Parmesure dePindicede^refractionavec

un

refractometre Waters410.

15

20

2813789

17

Tableau 3

:standards

de

poids moleculaires

de

polyethyleneglycol (Fluka)

utilises

pour

la

chromatographic

d'exclusion

par HPLC

Poids moleculaire

Temps d 'elution (minutes)

400

37,892

600

^36,026

1000

33,940

2000

31,154

4000

28,896

6000

27,868

8000

26,946

12000

26,192

20000

25,308

35000

24,216

c) Resultats

Les

poids moleculaires des

composants

desfractions etudiees ontet£calculesen

utilisant

F

equation suivante, obtenue avec les standards de poids moleculaire de Fluka decrits

au

tableau 3 :

Poidsmoleculaire descomposants :

= _55290000

^* 10

A

(-03

13942*

x)

R

^2=0,982

x

= _temps

_d'elution(minutes)

2813789

18

La

premiere fractioncontenantdes

composants du Melange

d'oligofucoses-l est la fraction n°44 et la derniere est la fraction n°89, ce qui veut dire

que meme

le

composant du

poids moleculaire le

moins

eleve est sorti apres

89

fractions recueillies (apres

une

elution de

89

x 12,5

ml =

_1112,5 ml).

Les

fractions recueillies contiennent 5 des

mono-,

oligo- etpolysaccharides de

184Da (melange

de monosaccharides) jusqu'a environ

21kDa.

Cette derniere fraction contient

done

des polysaccharides

composes

en

moyenne

de 117unitesmonosaccharidiques

ou de 39

unitestrisaccharidiques.

La

majoritedes^{fractions,exceptees lesfractions}n°77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85

et 86, contiennent

un

seul pic saccharidique (separation ^limitee par la sensibilite

de

la

lo

methode de

separationutilis^e).

La

concentration approximative des

composants

des differentes fractions a

pu

etre determinee

en

utilisant une

gamme

d'etalon de fiicose

aux

concentrations croissantes. Cette sorte de

gamme

etalon "mono-compositionnelle" a

pu

etre utilisee grace au systeme dedetection(mesure de l'indice de refraction avec

un

refractometre).

15 Selon ces resultats,

une

solution de l^g/ml de fucose

donne

en

moyenne un

pic de surface

29409

(unites arbitrages

du

systeme).

En

connaissant les surfaces des pics analyses,nous avons

done pu

^calculer

lews

concentrations apparentes,

Les

resultats obtenus montrent

que

le

Melange

d'oligofucoses-l contient environ

26%

de petits osides

Gusqu'a

2Kda, environ

4

unites trisaccharidiques), environ 20

36%

d'oligosaccharides (jusqu'£ 4Kda, 8 unites trisaccharidiques) et environ

23%

de

polysaccharidesde poidsmoleculaire superieura

lOkDa

(18unites trisaccharidiques).

Compte

tenu

du

microorganisme et de

Tenzyme

specifique (endo-fiicosidase) utilises pour la preparation du

Melange

d'oligofucoses-1, il apparait

que

les oligosaccharides

du Melange

d'oligofucose-l comportent une unite fucose

en

position 25 terminate

non

reductrice.

Exemnle

3: action

de

^association

du Melange

d'oligofucoses-1

avec

l^ascorbate

de sodium

et/ou ^le retinoidsurles fibroblastes

de neau humaine

30

Le Melange

d'oligofucoses-l tel

que

prepare a

Texemple

¹ est teste aux concentrations de ¹

ng/ml

et 10 fig/ml, seul ainsi qu'en presence simultanee de 375jig/ml d'ascorbate

de sodium

et/oude

20ng/ml de

^retinol.

19

2813789

a)

Methodologie

a.l)

Etude de

la proliferationcellulaire

Les

fibroblastes de peau

humaine

utilises dans cette etude proviennent d'un

5 prelevement cutane d'une

femme

de

20

ans (28^4mc passage). Les cellules ont ete cultiveesdans desplaquesde 12 puits,dans

un

milieu

de

culture

DMEM

^{avec 10}

%

de

serum

de

veau

^foetal(SVF), 1

%

d'antibiotiques etd'antifongiques (PSF), et 1

nCi/ml

de

[

3H]-thymidine

(ICN)

pendant

72

heures

en

presence des produits a tester dans les concentrationsfinalesde 1 jig/mlet10 jig/ml.

10

Apres 72

heures de culture en etuve

(5%

^(v/v)

C0

2,

95%

^{(v/v) air)} a

37°C

en presence des produits testes, lescellulesont ete lavees quatrefois avec

du PBS,

puis le tapis cellulaire detache ^par

0,05%

de trypsine. Trois

ml

de liquide de scintillation sont ensuite ajoutes parechantillon, puis la radioactivity incorporee dans les cellules est lue dans

un compteur

ascintillation.

15

a.2)Synergie

avec

leretinol

Nous avons

incube les cellules avec 20[ig/ml de retinol (69,72|iM).

Le

retinol induit,

en

absence des oligosaccharides,

une

baisse de la proliferation cellulaire d'environ

45%

(tableau 2 ci-apres).

Deux

concentrations ontete testees ^: 1 |ig/ml et 10 20 ^ig/ml.

a.3)

Etude de

la synergie avecl'ascorbate

de Na

Nous avons

incube les cellules avec

375^g/ml

d'ascorbate de

Na (l,875mM). La

vitamine

C

induit, en absence de fucose

ou du Melange

d'oligofucoses-l, une 25 diminution de la proliferation cellulaire d'environ

60%

^{(tableau 3 ci-apres).}

^Deux

concentrationsontete testees ^{: 1} fig/mlet 10 ng/ml.

a.4) Synergie

avec

Tascorbate

de Na

etleretinol

Les cellules ont ete incubeessimultanement avec

375 ng/ml

d'ascorbate

de Na

et 30 20 ng/ml

de

retinol. Cette combinaison produit une forte inhibition de la proliferation,

partiellement lev6e parlesproduitstestes.

2813789

20

b) Resultats

b.l)Action surlaproliferation cellulaire

L'incubation

de

72 heures des fibroblastes avec le

Melange

d'oligofucoses-l a stimulelaproliferation cellulaireparcomparaison avec lescellules

non

trait6es(tableau 5 1 ci-apr£s).

b.2)SynergieaveclerStinoI

L'incubation

de 72

heures des fibroblastes avec

20

jig/ml

de

retinol a

provoque une

diminutionde

42,5%

delaproliferation cellulaire(tableau

2

ci-apr£s)parrapportau

10 temoinsansretinol.

En

presence de

20

^ig/ml de retinol et de differentes concentrations

du

produit testes, ajoutes simultanement aux milieux

de

culture des fibroblastes, la proliferation cellulaire est significativement plus elevee qu'enpresence de 20jig/ml de r&inol seul. II

s'agit d'un effet protecteur temoignant d'une synergie entre le retinol et le

Melange

15 d'oligofucoses-l.

1 ng/ml ^{et 10 |ig/ml}

du Melange

d'oligofucoses-l ont

augmente

d'une fa9on significative la proliferation cellulaire (+ 24

%

^et

^{+ 27} %,

respectivement) par rapport

au

temoin(20|ig/ml

de

retinolseul,tableau

2

ci-apres).

20 b,3)Synergie avec

Tascorbate

de

Na

72

heuresd'incubation des fibroblastes avec

375

jig/ml (1,875

mM)

d'ascorbate

de Na

ontdiminue Tincorporation de la

[

3H]-thymidine,

done

laproliferation cellulaire,

d'environ

36 %

par rapportaucontrole(tableau3 ci-apres).

En

presence simultanee de

375

ng/ml

d

^fascorbate

de Na

et

de

differentes 25 concentrations

du

produit teste, laproliferation cellulaire des fibroblastes a

augmente

d'unefa?on significative parrapporta Pascorbate seul (tableau 3 ci-apres).

Le Melange

d'oligofucoses-l estefficaceaussi bien a 1 et 10ng/ml.

b«4)Synergie avec

Tascorbate de Na

etleretinol

30

En

presence simultanee de

375

|ig/ml d'ascorbate de

Na

et

de 20

(ig/ml de

retinol, la proliferation cellulaire des fibroblastes

diminue

d'environ

88%

par rapport a Pascorbate^seul (tableau4ci-apres).

2813789

21

TABLEAU

4:

EFFET PES DIFFERENTES CONCENTRATIONS DU MELANGE D'OLIGOFUCOSES-l SUR LA PROLIFERATION CELLULAIRE PES FIBROBLASTES DE PEAU HUMAINE (PROLIFERATION PAR RAPPORT AU CONTROLE1

Produit Concentration

Efficacite par rapport au contrdle

Sign, statistique (p par rapport

au

contrdle)

Contrdle

Melanged'oligofucoses-l 1 ug/ml +4,4 N.S.

Melanged'oligofiicoses-l 10jig/ml +20,6 0,019

TABLEAU

5: Effetdes differentes concentrations

du

Mflanged'oligofucoses-l sur la cvtotoxicite

de 20 ug/ml de

^retinol (proliferation

par rapport au

controle et

par rapport au 20 ug/ml de

retinol)

Traitement

Concentration

%

^vs.

20 jig/mide retinol

%

vs.

Contrdle Sign.

statistique (pvs. retinol)

Sign.

statistique (Pvscontdlc)

Retinol 20ug/ml -42,5 0,019

Melange d'oligofucoses-

1

+

ascorbate375[ig/ml

1jig/ml

+

24,2 -293

*

0,047 58

Melange d'oligofucoses-l

+ascorbate375ug/ml

10jig/ml +_26,9 -27,1

*

0,046 54

10

TABLEAU

6 : Effet des differentes concentrations

du Melange

d'oligofucoses-l sur la cvtotoxicite

de 375 ug/ml

d'ascorbate

de Na

(proliferation

par

rapport

au

controleet

par

rapport

au 375

ug/ml d'ascorbate)

Traitement

Concentration

%

^vs.

375 ug/ml

d'ascorbat e

%

^vs.

contrdle Sign.

statistique (pvs.

ascorbate)

Sign, statistique

(pvs.

contrdle)

Ascorbate

de Na ³⁷⁵

^{ug/ml -64,4 05}

Melange

d'oligofucoses-l

+

ascorbate

375

ug/ml

1

ug/ml +

96,9 -30,0

**

0,003 51

Melange

d'oligofucoses-l

+

ascorbate

375

ug/ml

10

ug/ml +

80,8 -35,7

*

0,015 33

22

2813789

TABLEAU ⁷

^{: Effet} des differentes concentrations

du Melange

d'oligofucoses-1 sur la cytotoxicity

de 375

ug/ml d'ascorbate

de Na

^et

de 20 ug/ml de r&inol

5 (proliferation

par rapport au

^{controle et}

par rapport au 375 ug/ml

d'ascorbate

+ 20

ttg/ml

de

rjtinol)

Traitement

Concentration

%

^vs.

ascorbate

+

retinol

%

^vs.

controle Sign.

statistique (P^vs.

+retinol +ascorbate)

Sign.

|

statistique

(pvs.

contrdle)

Ascorbatede

Na

375 ug/ml ^-64,4

05

Retinol

20

ug/ml ^-42,5 19

Ascorbatede

Na +

r&inol

375 ug/ml

+ 20

ug/ml ^-87,54 03

Melange

d'oligofucoses-1

+

ascorbate375

ug/ml

1

ug/ml +95,2

-75,7

*

0,010

04

Melange

d'oligofucoses-1

+

ascorbate375

ug/ml

10

ug/ml +102,8

-74,7

**

0,007

04

Exemple

4 ^: effet

du

fucose et

du Melange

d'oligofucoses-1

en presence

10 d'ascorbate

de sodium

et/ou

de

retinol

Nous

avonsetudie ^influence

du

fucose et

du Melange

d'oligofucoses-1, tel

que

prepare a

rexemple

1, sur Peffet cytoxique de Pascorbate

de sodium

^ainsi que Tinfluencedeces

deux

composantsfucose surl'effet

du

retinol.

15

a)

Methodologie

Les fibroblastesde plastie

mammaire

d'une

femme

de

45

ans, au passage 14 ont

&e ensemences

dans les plaques de 12 puits a raison de 0,5. 10⁵ cellules parpuits. Les cellules sont mises en culture pendant

48

heures en presence

du

milieu

de

culture 20

DMEM

^a

10%

de

serum

de veau ^foetal (SVF), a

V

etuve ₍₅

%

(v/v)

C0

2,

95%

^{(v/v) air)}

a37°C.