Thesis
Reference
Chromatographie en phase supercritique : nouvelles perspectives dans le domaine de l'analyse pharmaceutique
GRAND-GUILLAUME-PERRENOUD, Alexandre
Abstract
L'attention prêtée aux préceptes de la chimie verte est en nette augmentation. Elle se traduit par de nombreux efforts consentis dans toutes les disciplines de la chimie afin minimiser leur impact environnemental. La chimie analytique n'y fait pas exception. Dans ce domaine, la contrainte relative à la hausse des coûts d'approvisionnement et de recyclage des solvants organiques, utilisés par la technique chromatographique de référence en phase liquide (LC), plaide également en faveur du recours à des options plus écologiques. La chromatographie en phase supercritique (SFC) constitue une alternative élégante puisqu'elle remplace la majeur partie des solvants par du CO2 pressurisé. La présente contribution se concentre sur l'évaluation des performances analytiques de la SFC portée par une instrumentation ultra-moderne. L'applicabilité de la SFC pour l'analyse d'un vaste spectre de composés pharmaceutiques ainsi que les modalités de couplage à la spectrométrie de masse (MS) y sont également explorées. Elles mettent en évidence à la fois la complémentarité, l'orthogonalité et la compétitivité de [...]
GRAND-GUILLAUME-PERRENOUD, Alexandre. Chromatographie en phase supercritique : nouvelles perspectives dans le domaine de l'analyse pharmaceutique. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2014, no. Sc. 4717
URN : urn:nbn:ch:unige-415586
DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:41558
Available at:
http://archive-ouverte.unige.ch/unige:41558
Disclaimer: layout of this document may differ from the published version.
1 / 1
UNIVERSITÉ DE GENÈVE FACULTÉ DES SCIENCES
Section des Sciences Pharmaceutiques Professeur Jean-Luc Veuthey Chimie Analytique Pharmaceutique Docteur Davy Guillarme
Chromatographie en phase supercritique :
Nouvelles perspectives dans le domaine de l’analyse pharmaceutique
THÈSE
Présentée à la Faculté des Sciences de l’Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention sciences pharmaceutiques
par
Alexandre Grand-Guillaume-Perrenoud
de
Sainte-Croix (VD)
Thèse N° 4717
GENÈVE Atelier ReproMail
2014
DE GENEVE '
FACULTÉ DES SCIENCES
Doctorat ès sciences
Mention sciences pharmaceutiques
Thèse de
Monsieur Alexandre GRAND-GUILLAUME-PERRENOUD
intitulée:
"Chromatographie en phase supercritique: Nouvelles perspectives dans le domaine de l'analyse pharmaceutique"
La Faculté des sciences, sur le préavis de Monsieur J.-L. VEUTHEY, professeur ordinaire et directeur de thèse (Section des sciences pharmaceutiques), Monsieur D. GUILLARME, docteur et codirecteur de thèse (Section des sciences pharmaceutiques),nsieur
E. ALLEMANN, professeur ordinaire (Section des sciences pharmaceutiques),
Monsieur P. EDDER, docteur (Service de la Consommation et des Affaires Vétérinaires, Etat de Genève, Suisse), Monsieur P. SANDRA professeur (Research lnstitute for Chromatography, Kortrijk, Belgium) et Monsieur E. FRANCOTTE, docteur (Novartis Institutes for BioMedical Research, Global Discovery Chemistry, Base!, Switzerland), autorise l'impression de la présente thèse, sans exprimer d'opinion sur les propositions qui y sont énoncées.
Genève, le 26 septembre 2014
Thèse - 4717 -
Le Décanat
N.B.- La thèse doit porter la déclaration précédente et remplir les conditions énumérées dans les "Informations relatives aux thèses de doctorat à l'Université de Genève".
Do not pray for an easy life, pray for the strength to endure a difficult one
Bruce Lee
I
Remerciements
Le présent travail de thèse n’aurait pu être effectué sans l’encadrement, la collaboration et le soutien de nombreuses personnes que je souhaite remercier en préambule.
Mes sincères remerciements vont tout d’abord à mon directeur de thèse, le Professeur Jean- Luc Veuthey. Jean-Luc, le football est un sujet qui te tient à cœur et ma gratitude envers toi est analogue à celle que peut sans doute ressentir un jeune joueur pour son sélectionneur.
En effet, bien avant le début de ma thèse, tu as su m’intéresser et m’orienter dans la direction de la chimie analytique. Tu m’as suivi depuis mon travail de master effectué au sein du Laboratoire Suisse d’Analyse du Dopage et, malgré le délai inhérent à la fin de ma formation et à mon travail en officine, tu m’as gardé une place potentielle dans ton équipe.
En dépit de ta fonction hors du terrain, tu as toujours gardé un œil attentif sur la progression de ma thèse. Tes conseils avisés, ta perspicacité et ton encadrement, ainsi que la mise à disposition des ressources et des compétences de ton laboratoire m’ont permis d’intégrer les règles de ton art de jeu tout en me laissant une certaine part de liberté. Merci pour la confiance que tu as, et dont tu continues de faire preuve, à mon égard.
Ma très profonde gratitude va à mon co-directeur de thèse, le Docteur Davy Guillarme.
Davy, il y aurait de quoi écrire un chapitre entier pour te remercier de tout ce que tu as fait pour moi durant les quatre années passées sous ta supervision. Du point de vue scientifique, dès ton arrivée dans le projet, tu as joué le rôle de locomotive et générateur intarissable de voies à explorer. Ta disponibilité, ta réactivité, ton efficience et ta façon de présenter les concepts scientifiques ont grandement contribué à mettre mon travail sur de bons rails.
Merci de ton encadrement parfait et de m’avoir permis de gagner l’autonomie et, je l’espère, l’esprit critique nécessaire à la suite de ma carrière. Merci également pour ton soutien et tes encouragements dans certains moments de doute. Je te remercie également grandement de la confiance que tu me témoignes et pour l’opportunité que tu m’offres de poursuivre une collaboration à distance avec toi. Sur un plan moins scientifique, mais toujours aussi efficace, je ne peux qu’encenser et te remercier pour tes performances de bricoleur express’ et ton enthousiasme à toutes épreuves… Même lorsqu’il s’agit de louer une voiture ou de prendre l’avion.
Je tiens à vivement remercier le Professeur Pat Sandra, le Professeur Éric Allémann, le Docteur Éric Francotte et le Docteur Patrick Edder d’avoir accepté de juger mon travail de thèse et de siéger en tant que membres du jury.
Je tiens également à remercier le Professeur Serge Rudaz pour m’avoir accueilli au sein du laboratoire et de son soutien. Serge, merci d’avoir donné une réponse à la question récurrente des bonnes résolutions de début d’année. Depuis cette année, mes bonnes résolutions commencent toujours par me rappeler de celle-ci (Éq. 0).
Éq. 0
II Merci également d’avoir contribuer à ma meilleure connaissance de la République et canton de Genève qui, outre le fait qu’elle possède, elle aussi, un John Knox célèbre, comporte certains quartiers aux traditions sympathiques comme celui des Grottes les jeudis d’été.
J’aimerais encore remercier le Docteur Julie Schappler pour son soutien direct et indirect au bon déroulement de mon travail de thèse et pour les découvertes cinématographiques qu’elle m’a fait partager.
Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance à l’équipe de la société Waters, plus particulièrement à Hélène Boiteux, Joël Fricker, Marleen van Wingerden, Stéphane Brunner ainsi qu’au Docteur Isabelle François pour leur collaboration, leur support, leurs conseils et la mise à disposition d’appareils performants. Ma gratitude va également au Professeur Lucie Novakova, au Docteur William P. Farrell, au Docteur Christine M. Aurigemma, au Docteur Caroline West, au Docteur Éric Lesellier, au Docteur Raul Nicoli, au Docteur Bertrand Duléry, au Dr Joëlle Verne, au Docteur Pilar Franco ainsi qu’à Christopher Hamman pour m’avoir permis de collaborer activement dans différents projets scientifiques.
Merci également à tous mes collègues des pavillons des Isotopes et Ansermet pour leur accueil ainsi que pour tous les excellents moments partagés. Merci pour la très bonne ambiance de travail qu’ils font régner dans le laboratoire. Cette atmosphère positive contribue clairement à faciliter la longue et parfois difficile épreuve du travail de thèse et je ne peux que souhaiter que tous les futurs doctorants soient aussi bien entourés. Un merci particulier à Cédric, Christophe et Emilie pour leur disponibilité et leur réactivité en toutes situations. Merci les braves pour toutes les occasions où vous avez sauvé mon temps, mes résultats et mon estomac! Merci également à Véronique et Pascal pour leurs bons mots et leur esprit affûté qui ont contribué à ma bonne humeur chaque matin dès mon arrivée.
Un grand merci à mes collègues doctorants et post-doctorants passés et présents. Aline l’efficiente, Bénédicte la maman, Flavia l’exemplaire, Grég l’insoumis, Juan le papa, John (El Ron) le dépositaire de la classe, Benjamin le ouagon-ouallon et Marta la battante, et Balázs az igazi kromatográfia király, merci d’avoir si bien ouvert la voie et j’espère être digne d’être des vôtres. Merci également aux intraitables traiteurs de données Florence et Julien, pour leur aide mais aussi et surtout pour leurs références cathodiques. Un grand merci à Aurélie, Vincent, Nicolas, Stéphanie et Yoric à qui je souhaite de passer une thèse aussi riche et agréable que la mienne et d’ores et déjà bonne chance dans leurs travaux respectifs.
Je tiens à remercier plus particulièrement mes collègues de bureau pour m’avoir accompagné durant toutes mes années de thèse. Dany, Direttore, grazie per il tuo sostegno, la tua amicizia e la tua classe ticinese. Molto più di un compagno di squadra sei come un fratello. Filet mignon, patatine fritte e insalata frat’. Szabolcs, köszönöm nagy főnök az összes nagy idő együtt töltött. Nagyon köszönöm a segítséget, és minden tudományos, sport-és a sör orientált vitákat abebooks web volt. Örömömre szolgál, hogy a részét a maffia, és kívánok minden jót. Egészségére! Főnök !
Merci également à mes camarades de travaux pratiques, en particulier Caroline, Marco et Sébastien ainsi que Monsieur Fluka avec qui nous avons formé une équipe de choc durant les longues et difficiles sessions de chimie organique.
III J’aimerais également remercier mes diplômantes Laura, Cecilia et Sirine ainsi que mes collègues en stage Charlotte et Cristina pour avoir significativement contribué à l’avancée des différents projets qui composent cette thèse et pour m’avoir aidé à explorer de nouvelles voies.
Merci du fond du cœur à ma famille, en particulier mes parents et mon frère Luca pour leur soutien sans faille depuis le début de mes pérégrinations universitaires (et ça date). Merci d’avoir toujours épaulé l’étudiant perpétuel que je suis, et ce, quelles que soient les directions et les décisions que j’ai pu prendre. Un grand merci également à mes amis, Nico, Max, Yann, Steve, Raph, Fabrice, Fabien, Caroline, Marina, Yasmine, Aude, Eva et Line pour m’avoir permis de recharger mes batteries aux bons moments à grands coups de soirées folles, de fêtes, de sport et de réunions stratégiques. Manu, mon frère lost up north, merci pour ta bienveillance, ton exemple lointain, tes recharges en produits suédois et de me permettre d’écrire le paragraphe suivant.
Mes plus vifs remerciements vont à Isabelle. À mon aide et à mon soutien apporté il y a peu, alors que tu passais par l’épreuve difficile de la rédaction, tu as répondu en m’en offrant cent fois plus. Malgré la distance, merci d’avoir toujours été présente et d’avoir su trouver les mots pour me relancer lorsque cela s’est avéré nécessaire. Merci d’être à mes côtés en toutes situations et si je t’ai, à une certaine époque, ouvert les yeux, sache que depuis lors tu suscites l’admiration dans les miens.
IV
Avant-propos
L’analyse, par essence étymologique, est une opération visant à décomposer méthodiquement un ensemble plus ou moins complexe afin d’en déceler les constituants fondamentaux. Considérée comme la pierre angulaire de la chimie moderne depuis les travaux précurseurs de Lavoisier et de Klaproth, la chimie analytique s’emploie à caractériser, identifier et quantifier les constituants de la matière et des corps. Au centre du processus analytique, les techniques permettant la séparation des éléments contenus dans des matrices simples ou plus complexes connaissent une évolution constante orientée vers la performance et la productivité. Le domaine d’application des sciences séparatives dépasse aujourd’hui celui la chimie seule et s’étend également aux problématiques liées à la biochimie, la biologie, la pharmacologie et à la toxicologie. La compréhension des besoins analytiques liés à ces problématiques est une des préoccupations centrales du groupe de chimie analytique pharmaceutique (CAP) de l’Ecole de Pharmacie Genève-Lausanne de l'Université de Genève. Par l’exploration des possibilités et du potentiel analytique des différentes techniques séparatives, le groupe cherche à offrir des solutions applicables pour appréhender la complexité de ces problématiques et anticiper les besoins futurs. Parmi les techniques séparatives, la chromatographie en phase liquide (LC) fait partie des pôles d’investigations principaux du groupe de recherche. Dans le domaine pharmaceutique, la LC s’est imposée comme un outil incontournable de par ses hautes performances en termes de vitesse d’analyse, de sélectivité, de robustesse, de versatilité, ainsi que de sensibilité lorsqu’elle est couplée en ligne à la détection par spectrométrie de masse (MS). Le travail de thèse du Dr Didier Ortelli intitulé « Utilisation de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse pour l’analyse de médicaments dans les fluides biologiques » (Université de Genève, Thèse n° 3296), réalisé au sein du groupe illustre cet état de fait. Ce travail, ainsi que celui du Dr Sandrine Souverain intitulé « Extraction en ligne sur support solide pour l’analyse de composés pharmaceutiques contenus dans des matrices biologiques par chromatographie liquide – spectrométrie de masse » (Université de Genève, Thèse n°
3520) ont également mis en évidence la possibilité d’intégrer en ligne des procédures d’extraction sur support solide en amont des plateformes LC-MS. Ceci afin de permettre l’automatisation et l’accélération des étapes préparatoires souvent considérées comme chronophages et sources d’erreurs dans le processus analytique global. La réduction des temps d’analyse et le gain inhérent en productivité a été le sujet central du travail de thèse du Dr Dao T. T. Nguyen intitulé « Analyses rapides et ultra-rapides en chromatographie liquide : Application aux composés pharmaceutiques » (Université de Genève, Thèse n°
3862). Ce travail a notamment mis en évidence l’intérêt cumulé de l’utilisation de colonnes
V chromatographiques courtes remplies de particules de très faible granulométrie (sub-2 µm) et de système de pompage à très haute pression (UHPLC) pour atteindre des performances analytiques considérées comme « ultra-hautes ». Le travail du Dr Nguyen peut, dans ce sens, être considéré comme un des points de départ du présent manuscrit.
Alternativement à la LC, l’expertise du CAP s’étend également à des techniques séparatives orthogonales comme l’électrophorèse capillaire (CE) couplée à la MS. Cette technique est une option de choix pour l’analyse de produits pharmaceutiques polaires et facilement ionisables et son applicabilité dans les domaines de la toxicologie a récemment fait l’objet du travail de thèse du Dr Isabelle Kohler intitulé « Sensitivity Improvements in Capillary Electrophoresis - Mass Spectrometry for Clinical and Forensic Toxicology » (Université de Genève, Thèse n° 4611). Le couplage CE-MS se révèle être une approche puissante pour bon nombre applications telles que l’analyse des protéines intactes comme démontré par le travail de thèse du Dr Aline Staub intitulé « Analyse de protéines intactes par électrophorèse capillaire couplée à un spectromètre de masse à temps de vol » (Université de Genève, Thèse n° 4288). Ces travaux de thèse démontrent également que l’orthogonalité et la complémentarité des techniques sont des aspects importants qui permettent d’étoffer l’arsenal analytique afin de pouvoir proposer des solutions rationnelles aux questions analytiques actuelles et faire face aux problématiques nouvelles.
Le présent travail de thèse part également de ce constat et se propose d’explorer les possibilités offertes par la chromatographie en phase supercritique (SFC). Cette approche n’est pas nouvelle au sein du groupe de recherche de l’Université de Genève puisque le recours aux fluides supercritiques a déjà fait l’objet du travail de thèse du Dr Patrick Edder intitulé « Utilisation des fluides supercritiques pour l'extraction de stupéfiants dans des matrices biologiques liquides (urine) et solides (cheveux) » (Université de Genève, Thèse n°
2675). Ce travail a mis en avant les avantages du dioxyde de carbone à l’état supercritique non seulement comme agent d’extraction mais également comme phase mobile chromatographique pour l’analyse de stupéfiants sur colonnes capillaires. Ces travaux ont été suivis par ceux du Dr Marcel Kohler dans la thèse intitulée « Extraction et analyse de principes actifs d'origine végétale. Application à l'artémisinine extraite de Artemisia annua L. » (Université de Genève, Thèse n° 3129) qui ont souligné l’intérêt et l’aspect prometteur de l’utilisation des colonnes remplies en SFC tout en affirmant que la technique et l’appareillage devaient encore gagner en maturité afin de constituer une alternative viable à la LC.
La récente mise sur le marché d’une nouvelle génération d’instruments dédiée à la SFC, au design repensé et à la fiabilité correspondant aux standards actuels, ouvre un nouveau volet
VI dans l’histoire de cette technique au sein du groupe de recherche et donne également un nouvel élan à la SFC en tant qu’approche analytique de premier plan.
La présente thèse a pour mission d’évaluer le potentiel analytique de la SFC moderne en confrontant notamment ses possibilités, ses limitations et ses performances à celles des approches chromatographiques actuelles de référence. Le cadre choisi pour l’appréciation des possibilités de cette technique est celui de l’analyse de composés achiraux de bas poids moléculaires qui incluent notamment les substances d’intérêt pharmaceutique. Le choix de ce domaine est relevant car il constitue le champ d’application pour lequel la SFC doit véritablement prouver sa force face à la concurrence directe de techniques analytiques très performantes comme l’UHPLC. Le but final de ce travail est de donner les informations nécessaires pour pouvoir juger de la viabilité de la SFC à l’échelle analytique et d’offrir un support décisionnel concernant l’implémentation potentielle de cette technique au sein de laboratoires d’analyses.
Le présent travail s’articule en deux axes principaux. Le premier axe s’oriente sur la détermination des performances chromatographiques atteignables grâce aux évolutions technologiques apportées à l’instrumentation et aux colonnes de dernières générations, incluant les particules sub-2 µm totalement poreuses et les particules sub-3 µm superficiellement poreuses. Le second axe de l’étude est consacré aux applications potentielles de la SFC dans l’analyse de substances d’intérêt pharmaceutique et toxicologique. La compatibilité des conditions analytiques ainsi que les paramètres de couplage à la MS constituent un point central de ce volet.
Structure de la thèse
Le travail présenté est subdivisé en quatre chapitres. Le chapitre 1 donne un aperçu détaillé de l’historique de la SFC et introduit les bases théoriques des éléments qui seront abordés au fil de la thèse. Le second chapitre constitue le véritable corps du manuscrit et reprend les articles en anglais publiés, en cours de publication ou soumis et dans leur format définitif ou le plus avancé au moment de l’impression du présent travail de thèse. Chaque article est précédé d’un court résumé en français et d’une illustration qui permettent de définir le contexte de l’article dans la structure générale de la thèse. Ces résumés soulignent également les conclusions principales extraites de chaque article. Le chapitre 3 présente les conclusions et les perspectives consécutives à la présente étude. Finalement, le quatrième chapitre contient des études annexes publiées dans le cadre de la supervision de stagiaires.
VII Les articles illustrant les principaux sujets abordés dans ce travail sont reportés ci-dessous :
La SFC à ultra-haute performance en tant que technique analytique de premier plan.
Le cœur de ce travail de thèse vise à déterminer le potentiel de la SFC moderne en tant que technique analytique de premier choix pour diverses applications. Une revue bibliographique et un tutoriel ayant fait l’objet de publications s’y consacrent principalement. Ces deux premières publications reprennent les aspects généraux détaillés dans le chapitre 1. La revue souligne la grande souplesse de la SFC et place cette technique comme une alternative à la fois évolutive, complémentaire et orthogonale à la LC (article I).
Elle commente également certains aspects liés au net regain d’intérêt que connait actuellement la SFC à l’échelle analytique et introduit les dernières évolutions technologiques apportées à cette technique. En complément de cette partie bibliographique, le tutoriel (article II) donne les principales clés pour une prise en main rapide et facilitée des plateformes SFC modernes afin de permettre un développement efficace de méthodes analytiques. Finalement, une première étude illustre qualitativement le potentiel analytique de la SFC et son applicabilité pour l’analyse de molécules pharmaceutiques en comparaison directe avec une approche de type UHPLC en phase inverse (article III).
Détermination des limites de performances atteignables en SFC.
L’article III donne également un premier aperçu des performances chromatographiques qu’il est possible d’obtenir en SFC. L’optimisation des performances cinétiques passe par une caractérisation complète des possibilités offertes par l’instrumentation et par la prise en compte de ses limitations (article IV). Outre ces aspects, ce dernier article met en évidence de manière théorique et pratique les performances relatives à l’utilisation de colonnes remplies de particules sub-2 µm totalement poreuses. Une étude complémentaire révèle le potentiel prometteur des colonnes remplies de particules sub-3 µm superficiellement poreuses pour atteindre de très hautes performances sur les plateformes SFC modernes (article V).
Applications analytiques et couplage SFC-MS.
L’applicabilité de la SFC pour l’analyse de substances à caractère basique qui représentent un grand intérêt pour le domaine pharmaceutique a été évaluée dans une étude spécifique (article VI). Au cours de celle-ci, des conditions analytiques compatibles à la MS ont été développées. Une étude supplémentaire a souligné l’intérêt de la SFC en tant qu’approche
VIII compétitive, au même titre que la chromatographie d’interaction hydrophile (HILIC), à la LC en phase inverse (RPLC) pour l’analyse de composés polaires (article VII). Cette étude a également permis d’établir le couplage SFC-MS via une interface au design revisité et une source d’ionisation par électrospray (ESI). Une étude individuelle (article VIII) décrit en détail le mode de fonctionnement de cette interface. Cette étude intègre, de plus, l’optimisation des paramètres de couplage et d’ionisation ESI permettant de maximiser la sensibilité de détection. Pour une série de composés pharmaceutiques, cet article met également en évidence les meilleures performances de détection atteintes avec une plateforme SFC-ESI- MS/MS comparativement à celles obtenues avec une chaine UHPLC-ESI-MS/MS optimisée.
La fiabilité et les performances de la plateforme SFC-ESI-MS/MS ont permis de démontrer l’applicabilité et les avantages de cette approche analytique dans le domaine toxicologique, plus précisément dans le cadre d’un criblage d’agents dopants dans une matrice urinaire (articles IX.a et IX.b). Finalement un dernier article de revue (article X) permet de formuler les premières conclusions quant à la viabilité et l’applicabilité future de la SFC en tant que technique analytique de premier plan.
IX
Table des matières
REMERCIEMENTS ... I AVANT-PROPOS ... IV TABLE DES MATIERES ... IX PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS SCIENTIFIQUES ... XI ABREVIATIONS ... XVII CHAPITRE 1 ...
1 INTRODUCTION... 1
1.1 Évolutions récentes en LC ... 1
1.1.1 Les supports chromatographiques modernes ... 2
1.1.1.1 Les colonnes monolithiques ... 2
1.1.1.2 Les particules sub-2 µm totalement poreuses ... 3
1.1.1.3 Les particules superficiellement poreuses ... 5
1.1.2 L’appareillage LC moderne ... 7
1.1.3 Détermination des performances cinétiques ... 9
1.1.4 Sélectivité et modes chromatographiques complémentaires à la RPLC ... 12
1.2 L’alternative SFC ... 14
1.2.1 Nature et propriétés des fluides supercritiques ... 14
1.2.2 La SFC et son évolution ... 17
1.2.2.1 La SFC sur colonnes capillaires ... 17
1.2.2.2 La SFC sur colonnes remplies ... 18
1.2.2.3 La SFC moderne ... 19
1.2.3 Développement de méthodes en SFC ... 21
1.2.3.1 Aspects relatifs à la sélectivité ... 21
1.2.3.2 Aspects relatifs à l’évaluation des performances cinétiques ... 23
1.3 Spectrométrie de masse ... 25
1.3.1 Couplage des techniques chromatographiques à la MS ... 26
1.3.1.1 Les sources d’ionisation à pression atmosphérique (API) ... 26
1.3.1.2 Interfaçage SFC-API-MS ... 29
1.3.2 Analyseurs de masse... 32
1.3.2.1 Analyseurs de masse à basse résolution, le triple quadripôle ... 32
1.3.2.2 Analyseurs de masse à haute résolution ... 35
1.4 Références ... 37
CHAPITRE 2 ... 2 VIABILITÉ DE LA SFC EN TANT QUE TECHNIQUE ANALYTIQUE ... 49
X
2.1 Évolution et tendances actuelles en LC et SFC ... 51
2.1.1 Article I ... 53
2.2 Utilisation de colonnes remplies de particules sub-2 µm en SFC ... 80
2.2.1 Article II ... 82
2.3 Possibilités, performances et limitations de la SFC moderne ... 101
2.3.1 Article III ... 103
2.4 Limitations des performances cinétiques de la SFC moderne ... 114
2.4.1 Article IV ... 116
2.5 Intérêt des particules superficiellement poreuses en SFC ... 127
2.5.1 Article V ... 129
2.6 Analyse de composés pharmaceutiques basiques en SFC ... 146
2.6.1 Article VI ... 148
2.7 Composés polaires : comparaison des modes HILIC, RPLC et SFC ... 158
2.7.1 Article VII ... 160
2.8 Optimisation du couplage SFC-MS ... 172
2.8.1 Article VIII ... 175
2.9 Analyse d’agents dopants par SFC-MS/MS ... 187
2.9.1 Article IX.a ... 191
2.9.2 Article IX.b ... 203
2.10 Tendances actuelles en SFC associée aux particules sub-2 µm ... 217
2.10.1 Article X (Revue) ... 219
CHAPITRE 3 ... 3 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ... 233
CHAPITRE 4 ... 4 ANNEXES... 239
4.1 Travaux publiés ... 239
4.1.1 Article XI... 239
XI
Publications et communications scientifiques
Le présent travail de thèse a été l’objet de plusieurs publications dans des revues scientifiques à comité de lecture (« peer-reviewed »). Les projets de recherche ont également été présentés dans divers congrès nationaux et internationaux sous la forme de communications orales et/ou d’affiches.
Articles scientifiques à comité de lecture
I. Evolution and current trends in liquid and supercritical fluid chromatography.
(Review)
S. Fekete, A. Grand-Guillaume Perrenoud, D. Guillarme, Curr. Chromatogr. 1 (2014) 15-40.
II. Modern analytical supercritical fluid chromatography using columns packed with sub-2 µm particles: a tutorial. (Review)
L. Novakova, A. Grand-Guillaume Perrenoud, I. François, C. West, E. Lesellier, D.
Guillarme, Anal. Chim. Acta 824 (2014) 18-35.
III. Comparison of ultra-high performance supercritical fluid chromatography and ultra-high performance liquid chromatography for the analysis of pharmaceutical compounds.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, J.L. Veuthey, D. Guillarme, J. Chromatogr. A 1266 (2012) 158-167.
IV. Maximizing kinetic performance in supercritical fluid chromatography using state-of-the-art instruments.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, C. Hamman, M. Goel, J.L. Veuthey, D. Guillarme, S. Fekete, J. Chromatogr. A 1314 (2013) 288-297.
V. Evaluation of stationary phases packed with superficially porous particles for the analysis of pharmaceutical compounds using supercritical fluid chromatography.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, W.P. Farrell, C.M. Aurigemma, N.C. Aurigemma, S. Fekete, D. Guillarme, J. Chromatogr. A (2014) accepted.
VI. Analysis of basic compounds by supercritical fluid chromatography: Attempts to improve peak shape and maintain mass spectrometry compatibility.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, J. Boccard, J.L. Veuthey, D. Guillarme, J.
Chromatogr. A 1262 (2012) 205-213.
XII VII. Evaluation of various chromatographic approaches for the retention of
hydrophilic compounds and MS compatibility.
A. Periat, A. Grand-Guillaume Perrenoud, D. Guillarme, J. Sep. Sci. 36 (2013) 3141- 3151.
VIII. Coupling state-of-the-art supercritical fluid chromatography and mass spectrometry: from hyphenation interface optimization to high-sensitivity analysis of pharmaceutical compounds.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, J.L. Veuthey, D. Guillarme, J. Chromatogr. A 1339 (2014) 174-184.
IX.a. UHPSFC-MS/MS for screening of doping agents. I : investigation of mobile phase and MS conditions.
L. Novakova, A. Grand-Guillaume Perrenoud, R. Nicoli, M. Saugy, J.L. Veuthey, D.
Guillarme, Anal. Chim. Acta (2014) submitted.
IX.b. UHPSFC-MS/MS for screening of doping agents. II : analysis of biological samples.
L. Novakova, M. Rentsch, A. Grand-Guillaume Perrenoud, R. Nicoli, M. Saugy, J.L.
Veuthey, D. Guillarme, Anal. Chim. Acta (2014) submitted.
X. The use of columns packed with sub-2 µm particles in supercritical fluid chromatography. (Review)
A. Grand-Guillaume Perrenoud, J.L. Veuthey, D. Guillarme, Trends Anal. Chem.
(2014) accepted.
XI. Evaluation and comparison of various separation techniques for the analysis of closely-related compounds of pharmaceutical interest. (Short communication en annexe du present travail de thèse)
C. Gourmel, A. Grand-Guillaume Perrenoud, L. Waller, E. Reginato, J. Verne, B.
Dulery, J.L. Veuthey, S. Rudaz, J. Schappler, D. Guillarme, J. Chromatogr. A 1282 (2013) 172-177.
Communications orales
• Supercritical fluid chromatography for analysis of pharmaceutical compounds.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, 26ème séminaire en Sciences Pharmaceutiques, Septembre 2011, Zermatt (Suisse).
• Analyse de composés acides et basiques par chromatographie en phase supercritique.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, 3ème journée scientifique du Club AfSep Val de Seine, Octobre 2011, Rouen (France).
XIII
• Analyse des composés d’intérêt pharmaceutique par chromatographie en phase supercritique.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, 3ème journée scientifique du Club Jeunes de l’AfSep, Novembre 2011, Lyon (France).
• Critical evaluation of new generation of SFC instrument (Waters Acquity UPC2) and dedicated stationary phases and first application development for drugs analysis.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, J.L. Veuthey, D. Guillarme, 29th International Symposium on Chromatography 2012 (ISC 2012), Septembre 2012, Torun (Pologne).
• Supercritical fluid chromatography and sub-2μm particles: towards new frontiers in pharmaceutical analysis.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, 16èmes journées scientifiques du ccCTA, Septembre 2012, Les Diablerets (Suisse).
• Evaluation of ultra-high performance SFC and dedicated sub-2µm particles for drugs analysis.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, J.L. Veuthey, D. Guillarme, 6th International Conference on Packed Column Supercritical Fluid Chromatography 2012 (SFC 2012), Octobre 2012, Bruxelles (Belgique).
• Evaluation of ultra-high performance SFC and dedicated sub-2µm particles for drugs analysis.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, journée de la Société Suisse de Chimie: Applica 2012, Octobre 2012, Bâle (Suisse).
• Sub-2μm particles and SFC: towards greener frontiers in pharmaceutical analysis.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, 3ème journée scientifique du Club AfSep Sud-ouest, Novembre 2012, Toulouse (France).
• Avantages et limitations de la SFC à ultra haute performance et optimisation de son couplage à la MS pour l’analyse de composés pharmaceutiques.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, S. Fekete, J.L. Veuthey, D. Guillarme, 10ème congrès bisannuel de l’AfSep sur les sciences séparatives et techniques couplées 2013 (SEP’13), Juin 2013, Paris (France).
• UHPSFC-MS/MS: from hyphenation optimisation to highly sensitive analysis.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, J.L. Veuthey, D. Guillarme, 7th International Conference on Packed Column Supercritical Fluid Chromatography 2013 (SFC 2013), Juillet 2013, Boston (États-Unis).
XIV
• Evaluation of SFC as an alternative to HILIC and RPLC for the analysis of hydrophilic and ionizable compounds.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, A. Periat, J.L. Veuthey, D. Guillarme, 7th International Conference on Packed Column Supercritical Fluid Chromatography 2013 (SFC 2013), Juillet 2013, Boston (États-Unis).
• UHPSFC-MS/MS: from hyphenation optimisation to high sensitivity doping agents analysis in urine.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, L. Novakova, R. Nicoli, M. Saugy, J.L. Veuthey, D.
Guillarme, 13th International Symposium on Hyphenated Techniques in Chromatography and Separation Technology (HTC-13), Janvier 2014, Bruges (Belgique).
• New developments in SFC: the green awakening of the sleeping beauty of separation sciences.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, Geneva-Lausanne School of Pharmacy PhD-Day 2014, Juin 2014, Genève (Suisse). Best oral communication award.
• SFC and SFC-MS workshop.
Jean-Luc Veuthey, Davy Guillarme, Alexandre Grand-Guillaume Perrenoud, 10th International Symposium on Drug Analysis (DA-2014), Juin 2014, Liège (Belgique).
Communications orales associées
• High-speed and high-resolution separation in pharmaceutical analysis.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, S. Fekete, J.L. Veuthey, D. Guillarme, Pittcon congress 2013, March 2013, Philadelphie (États-Unis).
• Les récentes évolutions en chromatographie liquide pour l'analyse de petites molécules et biomolécules.
D. Guillarme, A. Periat, A. Grand-Guillaume Perrenoud, S. Fekete, S. Rudaz, J.L.
Veuthey, 10ème congrès bisannuel de l’afSep sur les sciences séparatives et techniques couplées 2013 (SEP’13), Juin 2013, Paris (France).
• Possibilities and limitations of SFC and SFC-MS/MS using state-of-the-art instrument and innovative stationary phases.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, S. Fekete, J.L. Veuthey, D. Guillarme, 39th International Symposium on High-Performance Liquid Phase Separation and Related Techniques 2013 (HPLC 2013), Juin 2013, Amsterdam (Pays-Bas).
• SFC and SFC-MS in Pharmaceutical Analysis.
J.L. Veuthey, A. Grand-Guillaume Perrenoud, S. Fekete, D. Guillarme, 9th Balaton Symposium on High-Performance Separation Methods, Septembre 2013, Siofok (Hongrie).
XV
• Coupling of supercritical fluid chromatography with mass spectrometry detection: principles and applications.
L. Novakova, A. Grand-Guillaume Perrenoud, D. Guillarme, School of mass spectrometry 2013, Septembre 2013, Jesenik (République Tchèque).
• High-speed and high-resolution separation in pharmaceutical analysis.
D. Guillarme, S. Fekete, A. Periat, A. Grand-Guillaume Perrenoud, S. Rudaz, J.L.
Veuthey, Scientific exchange conference 2013 (SCIX 2013), Octobre 2013, Milwaukee City (États-Unis).
• Is Modern SFC a Viable Alternative to RPLC in Pharmaceutical Analysis?
D. Guillarme, A. Grand-Guillaume Perrenoud, J.L. Veuthey, 10th International Symposium on Drug Analysis (DA-2014), Juin 2014, Liège (Belgique).
Affiches
• Evaluation of supercritical fluid chromatography for the analysis of pharmaceutical compounds.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, B. Chauve, J. Verne, B. Dulery, H. Boiteux, J.L.
Veuthey, D. Guillarme, Congrès de la Société Allemande de chimie analytique Anakon 2011, Mars 2011, Zurich (Suisse).
• Evaluation de la chromatographie en phase supercritique pour l’analyse des composés pharmaceutiques.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, B. Chauve, J. Verne, B. Dulery, H. Boiteux, J.L.
Veuthey, D. Guillarme, 9ème congrès bisannuel de l’AfSep sur les sciences séparatives et techniques couplées 2011 (SEP’11), Mars 2011, Toulouse (France).
• Supercritical fluid chromatography for the analysis of basic drugs.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, J. Verne, B. Dulery, H. Boiteux, J.L. Veuthey, D.
Guillarme, 36th International Symposium on High-Performance Liquid Phase Separation and Related Techniques 2011 (HPLC 2011), Juin 2011, Budapest (Hongrie).
• Supercritical fluid chromatography for fast and high resolution analysis of drugs.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, C. Gourmel, J. Verne, B. Dulery, H. Boiteux, J.L.
Veuthey, D. Guillarme, 14th International Meeting on Recent Developments in Pharmaceutical Analysis 2011 (RDPA 2011), Septembre 2011, Pavia (Italie).
• Generic approach development for basic drugs analysis on new Waters Acquity UPC2.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, J.L. Veuthey, D. Guillarme, 29th International Symposium on Chromatography 2012 (ISC 2012), Septembre 2012, Torun (Pologne).
XVI
• UHPSFC-MS/MS: from hyphenation optimisation to high sensitivity analysis.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, J.L. Veuthey, D. Guillarme, 39th International Symposium on High-Performance Liquid Phase Separation and Related Techniques 2013 (HPLC 2013), Juin 2013, Amsterdam (Pays-Bas).
• Optimal column geometry for high kinetic performance supercritical fluid chromatography using state-of-the-art instruments.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, J.L. Veuthey, D. Guillarme, S. Fekete, 39th International Symposium on High-Performance Liquid Phase Separation and Related Techniques 2013 (HPLC 2013), Juin 2013, Amsterdam (Pays-Bas).
• Optimal column geometry for high kinetic performance supercritical fluid chromatography using state-of-the-art instruments.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, J.L. Veuthey, D. Guillarme, S. Fekete, 7th International Conference on Packed Column Supercritical Fluid Chromatography 2013 (SFC 2013), Juillet 2013, Boston (Etats-Unis). Best poster award.
• Effects of analytical conditions on chromatographic behavior and performance in UHPSFC using polar stationary phase.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, D. Guillarme, C. West, E. Lesellier, 7th International Conference on Packed Column Supercritical Fluid Chromatography 2013 (SFC 2013), Juillet 2013, Boston (États-Unis).
• UHPSFC-ESI/MS/MS: a powerful platform for high sensitivity doping agents analysis in urine.
A. Grand-Guillaume Perrenoud, L. Novakova, R. Nicoli, M. Saugy, J.L. Veuthey, D.
Guillarme, 10th International Symposium on Drug Analysis (DA-2014), Juin 2014, Liège (Belgique).
XVII
Abréviations
Les abréviations utilisées dans ce travail sont répertoriées ci-dessous. Elles sont, pour la plupart, exprimées avec les acronymes anglais et traduites en français lorsque la traduction existe et est utilisée.
A Coefficient d’anisotropie d’écoulement (courbe de van Deemter) ACN Acétonitrile
APCI Ionisation chimique à pression atmosphérique API Ionisation à pression atmosphérique
APPI Photo-ionisation à pression atmosphérique
B Coefficient de diffusion longitudinale (courbe de van Deemter) BPR Régulateur de contre-pression
C Coefficient de résistance au transfert de masse (courbe de van Deemter) CE Electrophorèse capillaire
CID Dissociation induite par collision CO2 Dioxyde de carbone
C18 Colonne remplie de particules de portant des greffons octadecyl DM Coefficient de diffusion
dp Diamètre des particules E Impédance de séparation
ELSD Détecteur évaporatif à diffusion de la lumière
EP Éthylpyridine
Er Efficacité résiduelle apparente ESI Ionisation par électrospray
EtOH Ethanol
FID Détecteur à ionisation de flamme FPP Particule totalement poreuse
FT-ICR Analyseur à résonance cyclotronique d’ion à transformée de Fourier FWHM Largeur du pic mesurée à mi-hauteur (MS)
GC Chromatographie en phase gazeuse
H HEPT = Hauteur équivalente à un plateau théorique h Hauteur réduite équivalente à un plateau théorique HILIC Chromatographie d’interaction hydrophile
Hmin Hauteur minimale équivalente à un plateau théorique
hmin Hauteur minimale réduite équivalente à un plateau théorique HPLC Chromatographie en phase liquide à haute performance HRMS Spectrométrie de masse à haute résolution
IEX Chromatographie d’échange d’ions I.D. Diamètre interne
IpOH Isopropanol
IT Trappe ionique
k Facteur de rétention Kv Perméabilité de la colonne LC Chromatographie en phase liquide
m Masse
mA Masse expérimentale
mE Masse exacte monoisotopique calculée m/z Rapport masse sur charge
MeOH Méthanol
MS Spectrométrie de masse N Nombre de plateaux théoriques
XVIII
Ncol Efficacité propre à la colonne chromatographique nc Capacité de pic
NPLC Chromatographie en phase liquide à polarité des phases normales Pc Pression critique
PFP Colonne remplie de particules de portant des greffons pentafluorophenyl Pmax Pression maximale de pompage
RPLC Chromatographie en phase liquide à polarité des phases inversées SIM Single ion monitoring
SFC Chromatographie en phase supercritique
cSFC Chromatographie en phase supercritique sur colonne capillaire pSFC Chromatographie en phase supercritique sur colonne remplie SPP Particule superficiellement poreuse (core-shell)
SRM Single reaction monitoring S/N Rapport signal sur bruit de fond TOF Analyseur de masse à temps de vol Tc Température critique
Téb Température d’ébullition td Temps de délai
tinj Temps de cycle d’injection tr Temps de rétention
t0 Temps mort
Q Quadripôle
QqTOF Hybride quadripôle-TOF QqQ Triple quadripôle
u Vitesse linéaire de la phase mobile
uopt Vitesse linéaire optimale de la phase mobile
UHPLC Chromatographie en phase liquide à ultra haute performance/pression UHPSFC Chromatographie en phase supercritique à ultra haute performance
UV Ultraviolet
V0 Volume mort de la colonne chromatographique Vd Volume de délai
vopt Vitesse linéaire optimale réduite de la phase mobile Y Tension de surface
w50% Largeur du pic à mi-hauteur
z Charge
2-EP Colonne remplie de particules de portant des greffons 2-éthylpyridine 4-EP Colonne remplie de particules de portant des greffons 4-éthylpyridine
Lettres grecques
ΔP Perte de charge
η Viscosité de la phase mobile
σ2col Variance due à la colonne chromatographique σ2ec Variance due aux effets extra-colonne σ2tot Variance totale
ɸ Facteur de résistance à l’écoulement (loi de Darcy) νacq Fréquence d’acquisition du détecteur UV
ρ Masse volumique
Chapitre 1
Chapitre 1 |Introduction
1
1 Introduction
Depuis l’apparition des techniques chromatographiques, la recherche des meilleures performances séparatives suscite un intérêt croissant, impliquant un effort constant dans l’amélioration de l’équipement. À l’échelle analytique, l’histoire récente de la chromatographie en phase liquide (LC) en est la parfaite illustration et sert aujourd’hui de source d’inspiration au développement de la chromatographie en phase supercritique (SFC).
1.1 Évolutions récentes en LC
Telle qu’elle était pratiquée à la fin du siècle dernier, avec des colonnes de larges dimensions (4.6 mm de diamètre interne (I.D.) et 150 – 250 mm de long) remplies de particules totalement poreuses (FPP) de 5 ou 3.5 µm de diamètre (dp) et des temps d’analyse de l’ordre de 10 à 60 min, la LC à haute performance (HPLC) a rapidement montré ses limites suite à l’apparition de nouvelles contraintes analytiques. Parmi celles-ci, l’augmentation constante du nombre d’échantillons à traiter et leur complexité croissante ont orienté la recherche vers le développement d’équipements LC capables de réduire les temps d’analyse et d’augmenter la résolution chromatographique. Ces deux grandes tendances sont à l’origine de la révolution vécue par la LC dès le début des années 2000 avec l’apparition de supports chromatographiques novateurs et de systèmes à ultra-hautes performances (Figure 1.1).
Figure 1.1 : Évolutions technologiques récentes de la LC.
2 1.1.1 Les supports chromatographiques modernes
La présente section se concentre sur les caractéristiques des phases stationnaires commercialisées depuis les années 2000 qui ont pour but d’augmenter les performances chromatographiques en LC. Les aspects inhérents à la nature des greffons chimiques ne sont pas abordés en détails dans cette section. Toutefois, il convient de mentionner que les supports décrits peuvent être greffés avec des entités de natures diverses leurs permettant d’être utilisés avec succès dans différents modes chromatographiques incluant la polarité des phases inversées (RPLC) et la chromatographie d’interaction hydrophile (HILIC). Dans l’ordre chronologique de leur commercialisation, les phases stationnaires monolithiques [1], les colonnes courtes FPP de faible granulométrie [2,3] et les particules superficiellement poreuses (SPP ou core-shell) [4] sont à mettre en évidence. De plus, bien que l’implémentation de ces nouveaux types de phases stationnaires se soit d’abord faite dans le cadre de la LC, ils peuvent également être utilisés en SFC [5-7].
1.1.1.1 Les colonnes monolithiques
Une des premières voies explorées pour augmenter la vitesse de séparation est la réduction de la résistance intrinsèque de la colonne chromatographique à l’écoulement de la phase mobile. Dans cette optique, une augmentation de la porosité de la phase stationnaire permet l’utilisation de vitesses plus élevées de phase mobile, réduisant ainsi le temps d’analyse. Cette stratégie, basée sur les travaux préliminaires de Svec, Tennikova, Hjerten et Tanaka [8-11], a donné lieu au développement des colonnes monolithiques commercialisées en 2000 par Merck (Darmstadt, Allemagne). Ces supports sont constitués d’une phase stationnaire monobloc poreuse encapsulée dans un cylindre résistant en polyétheréthercétone qui tient lieu de paroi de la colonne. Les monolithes se divisent en deux catégories, à savoir les monolithes à base de polymère organique et les monolithes à base de silice. Plus adaptés à l’analyse des composés de bas poids moléculaire, les monolithes de silice possèdent une structure bimodale qui s’articule autour de macropores (1 – 3 µm) responsables de la perméabilité du monobloc et de mésopores (10 – 25 nm) offrant une large surface d’interaction pour ces composés. Par rapport aux colonnes de mêmes dimensions remplies de particules FPP de 5 µm, les monolithes de silice permettent l’utilisation de débits de phase mobile 3 à 5 fois plus élevés sans génération excessive de perte de charge [1,12]. Ils possèdent également l’avantage d’avoir une faible résistance au transfert de masse, ce qui leur permet d’atteindre des performances cinétiques comparables à celles de colonnes de longueur équivalente remplies de particules FPP de 3 – 4 µm [13].
Dans le cas d’analyses à haute résolution, de très hautes efficacités de l’ordre de 100'000 plateaux peuvent être atteintes en couplant des colonnes monolithiques en série [14].
3 Cependant, la longueur de colonne (de l’ordre du mètre) nécessaire pour atteindre ces performances n’est pas représentative de la pratique routinière de la LC. De plus, avec la première génération de monolithes de silice, l’intérêt pour ces phases stationnaires a rapidement diminué en raison des contraintes liées à leur faible résistance mécanique, thermique et chimique d’une part, et à cause d’inhomogénéité du réseau de silice provoquant des pertes de performances chromatographiques, d’autre part. Enfin, leur utilisation en tant que supports chromatographiques en amont d’une détection par spectrométrie de masse (MS) peut compromettre cette dernière à cause du relargage des constituants de leur matrice de silice dans la source (« bleeding »). Une seconde génération de monolithes de silice apparue en 2011 pourrait toutefois relancer l’intérêt pour ce type de phase [15].
1.1.1.2 Les particules sub-2 µm totalement poreuses
Parallèlement au développement de nouveaux designs de phases stationnaires, les colonnes remplies de particules de silice ont également poursuivi leur évolution [16], axée sur la diminution du dp dans le but d’obtenir les meilleures performances chromatographiques, comme décrit par Knox dès 1969 [17].
L’année 2004 marque le passage d’un nouveau cap avec la commercialisation des premières colonnes remplies de particules FPP de diamètre compris entre 1.7 et 1.9 µm, appelées particules sub-2 µm. Par rapport aux colonnes conventionnelles FPP de 5 µm jusqu’alors couramment utilisées en HPLC, la diminution de dp permet un gain significatif d’efficacité (N) via la réduction de la hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT = H) (Éq. 1). De plus, les particules de faible granulométrie réduisent l’inhomogénéité de remplissage de la colonne qui est une source indésirable d’élargissement des pics chromatographiques.
Éq. 1
Dans le cas d’une réduction de dp de 5 à 1.7 µm, il devient ainsi théoriquement possible d’obtenir une efficacité augmentée d’un facteur 3 pour une longueur de colonne maintenue constante, ou de diminuer la longueur de la colonne d’un facteur équivalent afin de gagner un facteur 3 en temps d’analyse pour une efficacité analogue. De plus, la diminution de dp
permet une réduction supplémentaire des temps d’analyse via l’augmentation de la vitesse linéaire optimale de la phase mobile (uopt) (Éq. 2).
Éq. 2
4 Les particules de taille réduite permettent également de maintenir une bonne efficacité à très haute vitesse (u > uopt) puisque la résistance au transfert de masse (C), principal facteur influençant l’efficacité dans ces conditions, diminue proportionnellement au carré de dp (Éq.
3).
Éq. 3
Malgré ces avantages, la vitesse linéaire optimale de phase mobile ne peut pas être atteinte avec les instruments HPLC conventionnels, en raison de la capacité de pompage trop limitée de ces appareils (400 bar) par rapport à la perte de charge (ΔP) générée par les particules de faible granulométrie contenues dans la colonne. La perte de charge répond à la loi de Darcy [18] (Éq. 4).
Éq. 4
Ainsi, en combinant les Éq. 2 et 4, pour une vitesse linéaire optimale de phase mobile (u = uopt), la perte de charge est inversement proportionnelle au paramètre dp élevé au cube. Par conséquent, une colonne de 1.7 µm génère une pression 27 fois (33) plus élevée à uopt
qu’une colonne de même longueur remplie avec des particules 5 µm. L’introduction des colonnes FPP sub-2 µm s’est donc faite conjointement à celle d’une nouvelle génération d’instruments LC permettant le pompage de la phase mobile à des pressions allant jusqu’à 1’000 bara. L’association de ces deux technologies est connue sous la terminologie chromatographie liquide à ultra-haute pression ou ultra-haute performance (UHPLC) [19,20].
Afin de pouvoir supporter de telles pressions, la résistance chimique et mécanique des particules de silice sub-2 µm est renforcée lors de leur fabrication par l’ajout de ponts éthyles entre deux atomes de silice adjacents. Ce type de particule est référencé sous le nom d’hybride ou sous l’acronyme BEH pour « bridged ethyl hybrid » [19,21]. La résistance des particules est particulièrement importante lors de l’étape de remplissage des colonnes. En effet, cette étape nécessite l’application de très hautes pressions, supérieures aux pressions de fonctionnement des colonnes, afin d’assurer l’homogénéité de remplissage et de limiter la formation de chemins préférentiels pouvant conduire à une perte d’efficacité. Une particule insuffisamment résistante présente de grands risques de fractures qui peuvent se répercuter sur l’efficacité de la colonne ou sur une augmentation de la perte de charge due au blocage des frittés d’entrée et de sortie de colonne.
a Au moment de la rédaction du présent manuscrit, la pression maximale délivrée par un instrument UHPLC commercial est de 1'300 bar (Nexera X2, Shimadzu Corp., Kyoto, Japon).
5 Un autre phénomène délétère pour l’efficacité chromatographique peut survenir lorsque la pression de travail dépasse 400 bar [22]. Celui-ci est lié à l’échauffement causé par la friction du fluide durant la percolation de la phase mobile visqueuse au travers d’une colonne remplie de particules de faible granulométrie [23]. Lorsqu’il ne peut être complètement dissipé par les parois de la colonne, cet échauffement conduit à la formation de gradients de température longitudinaux et radiaux à l’intérieur du support chromatographique [24]. Si les gradients longitudinaux provoquent un changement de rétention des analytes via la modification de la viscosité de la phase mobile, les gradients radiaux sont également problématiques. En effet, ils provoquent une déformation de la bande chromatographique dans laquelle les molécules d’analytes qui se déplacent au centre de la colonne sont plus rapides que celles évoluant près des parois [25]. Une perte significative d’efficacité peut ainsi en résulter [25,26]. Cependant, la réduction du diamètre interne de la colonne de 4.6 à 2.1 mm et l’utilisation de four à colonne à air non pulsé semblent limiter l’impact de ce phénomène [27].
Malgré ces possibles complications inhérentes à l’application d’ultra-hautes pressions, les bénéfices en termes d’efficacité et de temps d’analyse (généralement < 5 min) font de l’utilisation des particules FFP sub-2 µm sur des appareils UHPLC modernes, l’approche LC la plus répandue pour de nombreuses applications [2].
1.1.1.3 Les particules superficiellement poreuses
Déjà investiguées par Horvath [28] et Kirkland [29] dans les années 1960, les particules SPP ou core-shell sont réapparues sous l’impulsion de ce dernier au début des années 2000 pour l’analyse de macromolécules principalement [30], puis pour celle des composés de bas poids moléculaire. Ces particules se composent d’un noyau solide et non-poreux de silice fondue entouré par une enveloppe de silice poreuse similaire à celle qui compose les particules totalement poreuses (Figure 2.2).
Figure 1.2 : Morphologie des particules de silice FPP et SPP contenant un noyau solide de silice fondue
6 L’intérêt principal des particules SPP repose sur l’augmentation de l’efficacité par rapport aux FPP. Bien que la raison exacte de cette augmentation est encore sujette à de nombreuses discussions [4,31], il semble être admis qu’elle soit liée à l’amélioration des termes A et B de van Deemter (cf. section 1.1.3). Introduites en 2007, des particules core- shell de taille réduite composées d’un noyau solide de 1.7 µm de diamètre et d’une enveloppe de 0.5 µm d’épaisseur pour un dp total de 2.7 µm (sub-3 µm) ont rapidement suscité un grand intérêt en tant qu’alternative aux particules FPP sub-2 µm [32]. En effet, les particules core-shell sub-3 µm permettent d’obtenir une efficacité comparable (environ 80
%) à celle des particules FPP sub-2 µm pour une perte de charge réduite d’un facteur compris entre 2 et 3 [33,34] (cf. Éq. 4). Cette faible perte de charge rend de ce fait possible l’utilisation de colonnes core-shell sub-3 µm avec des appareils HPLC conventionnels à condition que ces derniers possèdent un volume extra-colonne raisonnable [31]. Sur des appareils UHPLC de dernières générations, la pression supplémentaire à disposition peut être mise à contribution pour des séparations ultra-rapides via l’application de vitesses de phase mobile très élevées, ou pour des analyses à haute efficacité sur des colonnes SPP longues [32,35].
Aujourd’hui, les particules core-shell existent avec des morphologies variables qui diffèrent par le rapport entre le diamètre du noyau solide et le dp total incluant l’enveloppe poreuse.
De manière générale, plus l’enveloppe poreuse est fine, plus les performances cinétiques seront importantes [36,37]. En contrepartie, la rétention des analytes est réduite puisque le volume poreux responsable des interactions est diminué [36]. De plus, la capacité de charge de la colonne est également diminuée lorsque l’épaisseur de l’enveloppe devient faible [38].
Ce paramètre est particulièrement critique dans l’analyse de composés ionisables qui ont tendance à surcharger la colonne et à subir de ce fait une déformation de pic et une diminution de l’efficacité [37]. Un bon compromis entre efficacité, rétention et capacité de charge est donc nécessaire.
Malgré cette limitation, l’utilisation des particules core-shell tend actuellement à prendre le pas sur les particules FFP [4]. Elles ont déjà été utilisées avec succès pour des séparations rapides et à haute résolution dans différents domaines d’investigation incluant les sciences pharmaceutiques [39,40], la toxicologie [41,42], l’analyse environnementale [43] ou l’analyse agro-alimentaire [44,45]. Finalement, associées aux appareils UHPLC de dernières générations, les colonnes SPP sub-2 µm (jusqu’à 1.3 µm de dp total) récemment mises sur le marché devraient contribuer à repousser encore plus loin les limites de performances chromatographiques [46].