C omparaison des méthodes de la PCR, d’ELISA-CSP et d’observation microscopique directe pour la

C omparaison des méthodes de la PCR, d’ELISA-CSP et d’observation microscopique directe pour la

détection des sporozoïtes de Plasmodium falciparum chez Anopheles gambiae M au Sénégal.

H. Bassene (1), P. Kengne (2), M.O. Ndiath (1), C. Sokhna (1), T. Dupressoir (3), D. Fontenille (2) &

J-F. Trape (1)

(1) Laboratoire de paludologie et zoologie médicale, Institut de recherche pour le développement (IRD), BP 1386, Dakar Sénégal. Tél. : (221) 33 849 36 21, fax : (221) 33 832 43 07, e-mail : hubassene@yahoo.fr

(2) Laboratoire de lutte contre les insectes nuisibles (LIN), Institut de recherche pour le développement (IRD), BP 64501, 34394 Montpellier cedex 5 France.

(3) Laboratoire EPHE de pathologie comparée des invertébrés, UMR 1231BIVI, CC101, 34095 Montpellier cedex 5 Manuscrit n° 3330. “Entomologie médicale”. Reçu le 22 septembre 2008. Accepté le 7 juillet 2009.

E ^{NTOMOLOGIE MÉDICALE}

Summary: Comparison of PCR, ELISA-CSP and direct microscopic observation methods for the detec- tion of Plasmodium falciparum sporozoites in Anopheles gambiae M in Senegal.

A comparative study between the Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA-CSP) for circums- porozoitic antigen detection method, the direct observation after dissection and the polymerase chain reaction (PCR) technique used to identify Plasmodium falciparum genomic DNA markers was carried out. This to evaluate the sensibility and the specificity of the PCR, for the determination of both sporozoitic index (ICSP) and the entomological inoculation rate (EIR).

The study is conducted in laboratory on eighty six specimens of Anopheles gambiae M infected after being fed with the blood of a gametocytes carrier from Dielmo (Senegal). Salivary glands of forty-eight specimens randomly selected (test A) among the infected eighty six are microscopically observed after manual dissection for the sporozoites detection. The content of these salivary glands and the crushed head/thorax of the remaining 38 specimens (test B) are tested in ELISA-CSP and PCR.

The positive and negative results obtained were recorded and summarized for each method.

A pair-comparison of the results obtained with each method generally revealed a good sensibility and an excellent specificity. The kappa coefficient (K) of test A indicated a “moderate” to “excellent”

concordance between the three different methods performed. By using the crushed head/thorax sample, generally used to determine the transmission parameters (ICSP and EIR), the PCR / ELISA-CSP concordance was excellent.

In the light of the values of sensibility and specificity obtained, this PCR is comparable to the other methods for the assessment of sporozoitic index and entomological inoculation rate.

Résumé :

Une étude comparative entre la méthode immuno-enzymatique de détection de l’antigène circum- sporozoïtique (ELISA-CSP), l’observation directe après dissection et la technique d’amplification en chaîne (PCR) d’un marqueur génomique de Plasmodium falciparum a été menée. Ceci pour évaluer la sensibilité et la spécificité de la PCR comme une autre méthode de détermination de l’indice spo- rozoïtique (ICSP) des anophèles et du taux d’inoculation entomologique (EIR).

L’étude est réalisée en laboratoire sur 86 spécimens d’Anopheles gambiae M infectés après alimenta- tion avec le sang d’un porteur de gamétocytes originaire de Dielmo (Sénégal). Les glandes salivaires de 48 spécimens pris au hasard sur les 86 sont observées au microscope pour la recherche de sporo- zoïtes (test A). Leurs contenus ainsi que les broyats de tête/thorax des 38 échantillons restants (test B) sont utilisés pour l’ELISA-CSP et la PCR. Les résultats positifs et négatifs obtenus avec chacune des techniques sont comparés par paires.

Généralement, une bonne sensibilité et une excellente spécificité sont obtenues. Le coefficient kappa (κ) montre une concordance, variant de modérée à excellente, entre les différentes techniques utilisées dans le test A. Avec le broyat tête/thorax, généralement utilisé pour la détermination des indicateurs de la transmission, la concordance entre la PCR et l’ELISA-CSP est excellente.

Au vu des valeurs de sensibilité et de spécificité obtenues, cette PCR est comparable aux autres méthodes pour la détermination de l’indice sporozoïtique et le taux d’inoculation entomologique.

Anopheles gambiae M ELISA PCR Plasmodium falciparum sporozoitic index laboratory Dielmo Senegal Sub-Saharan Africa

Anopheles gambiae M ELISA PCR Plasmodium falciparum indice sporozoïtique laboratoire Dielmo Sénégal Afrique intertropicale

Introduction

C

lassiquement, la détermination de la présence des sporo- zoïtes chez le moustique est réalisée après dissection des glandes salivaires et examen microscopique. Cette méthode, lourde et nécessitant une grande qualification de l’expérimen- tateur, cède progressivement la place à des méthodes biochi- miques plus aisées à standardiser, voire à automatiser. Il s’agit essentiellement des méthodes de détection des protéines de surface du sporozoïte (circum-sporozoites proteins ou CSP) présentes dans l’ensemble tête/thorax des anophèles, telles que l’ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) (2, 4) et de l’utilisation des bandelettes à anticorps immobilisés (15).

La méthode ELISA, qui est la plus utilisée, n’est pas suffisam- ment discriminante de l’espèce plasmodiale, comme c’est le cas pour Plasmodium malariae (5). D’autre part, il a été suggéré par RYAN et al. (15) que l’antigène CSP soluble libéré par des oocystes matures s’accumule au niveau de l’hémolymphe, mais également au niveau des glandes salivaires, entraînant ainsi une surestimation de l’indice sporozoïtique (7, 17).

Enfin, l’antigène CSP pourrait varier en composition selon les zones géographiques, nécessitant alors le développement d’une gamme élargie d’anticorps monoclonaux pour réaliser le test (5). Récemment, une PCR multiplexe est développée pour détecter l’ADN des différents Plasmodium humains, aussi bien dans le sang humain que dans les tissus de mousti- que (13). Cette méthode est rapide et plus sensible puisqu’elle est réputée détecter moins de 10 sporozoïtes dans les glandes salivaires d’un moustique. De plus, elle permet de différencier en une seule amplification les 4 espèces plasmodiales majeures dans le cas d’infections uniques ou mixtes.

L’objectif de cette étude est d’évaluer la sensibilité et la spéci- ficité de détection de l’ADN des sporozoïtes de P. falciparum par la PCR, par comparaison avec les méthodes ELISA-CSP et l’observation microscopique directe (OD) des sporozoïtes après dissection des glandes salivaires.

Matériel et méthodes

Origine et infection des moustiques

Les moustiques étaient tous âgés de 3 jours et issus d’une souche camerounaise d’Anopheles gambiae de forme molé- culaire M, maintenue en élevage à l’insectarium pendant plu- sieurs générations.

Cent cinquante anophèles ont été gorgés sur un volontaire porteur de gamétocytes de P. falciparum (1 081 gamétocytes/

µl de sang, identifiés au microscope optique). Ce volontaire est originaire du village de Dielmo (13°45’N, 16°25’W) au Sénégal. Il a donné son consentement selon les procédures du comité d’éthique en vigueur au Sénégal (ref : N°1971 MSPM/

DS/DER), relative au programme Dielmo et Ndiop.

Par ailleurs, 40 An. gambiae de forme M, gorgés sur sujets sains, constituaient le contrôle négatif dans la suite de l’étude.

Les anophèles ont été maintenus en élevage à l’insectarium à 25 °C, avec un taux d’humidité de 80 % pendant 13 jours, délai nécessaire à l’apparition des sporozoïtes dans les glandes salivaires (9).

Du fait de la mortalité en élevage, 86 spécimens sur les 150 gorgés sur un sujet porteur de gamétocytes et 10 spécimens sur les 40 gorgés sur sujets sains ont été utilisés pour la suite dans nos analyses (mortalité moyenne de 50,5 %).

Traitement des moustiques

Les 86 moustiques gorgés sur le porteur de gamétocytes ont été séparés en 2 lots de 48 et 38 spécimens, respectivement.

Test A

Les glandes salivaires des femelles du lot de 48 spécimens infectés ainsi que celles des 10 témoins non parasités ont été disséquées et observées au microscope. Le contenu de chaque glande salivaire a ensuite été homogénéisé dans 200 µl de PBS et réparti en 2 aliquotes de 100 µl destinées à l’identification de l’ADN des sporozoïtes, d’une part, et la détection des anti- gènes CSP, d’autre part.

Test B

L’ELISA-CSP et la PCR sont comparés à partir des broyats tête/thorax (fraction du moustique traditionnellement utili- sée pour évaluer l’indice CSP par ELISA). Les têtes/thorax des femelles du lot de 38 spécimens gorgés sur le porteur de gamétocytes ont été broyés dans 200 µl de PBS, homogé- néisés et séparés en deux aliquotes de 100 µl. La première a été utilisée pour la détection d’antigènes de sporozoïtes et la deuxième pour la détection de l’ADN des sporozoïtes de Plasmodium.

Dissection/observation microscopique

Les glandes salivaires des femelles d’anophèles sont dissé- quées, puis placées entre lame et lamelle dans une goutte de PBS. Les sporozoïtes sont observés au microscope à l’objectif x10, à l’état frais, sans coloration, après étalement des glandes salivaires.

Identification des antigènes CSP

Les antigènes CSP ont été identifiés par ELISA-CSP selon la procédure décrite par BURKOT, modifiée par COLLINSet al.(4).

Identification par PCR

L’ADN a été extrait selon le protocole CTAB (11) adapté aux petits volumes d’échantillon.

L’ADN des sporozoïtes de Plasmodium a été identifié par PCR, selon le protocole décrit par PADLEYet al.(13) et en utilisant les amorces suivantes :

Plasmodium (AGTGTGTATCCAATCGAGTTTC), P. malariae (GCCCTCCAATTGCCTTCTG), P. falciparum (AGTTCCCCTAGAATAGTTACA), P. ovale (GCATAAGGAATGCAAAGAACAG), P. vivax (AGGACTTCCAAGCCGAAGC).

Les contrôles positifs étaient constitués d’ADN de P. falcipa- rum, P. ovale et P. malariae extrait à partir de sang de patients parasités.

Analyse statistique

Les différentes méthodes expérimentales mises en œuvre dans ce travail ont été comparées en termes de sensibilité et de spécificité en considérant comme méthode de référence, soit la PCR, soit l’observation directe de sporozoïtes au microscope optique, après dissection des glandes salivaires.

Le coefficient statistique κ de Cohen (3, 6) a été utilisé pour évaluer le degré de concordance par paire entre les résultats des trois tests : OD, ELISA-CSP et PCR (κ < 0,20 = mau- vaise ; 0,21 < κ < 0,40 = médiocre; 0,41 < κ < 0,60 = modérée ; 0,61 < κ < 0,80 = bonne ; 0,81 < κ < 1,00 = excellente) (10).

Le coefficient de Youden a été utilisé pour apprécier l’in- tensité de la liaison entre les techniques de détection citées plus haut (Q = 0 = nulle ; 0 < Q < 0,09 = négligea- ble ; 0,1 < Q < 0,29 = légère ; 0,3 < Q < 0,49 = modérée ; 0,5 <Q <0,69 = forte ; 0,7 < Q<1 = très forte) (21).

Résultats

Détection des sporozoïtes de Plasmodium falcipa- rum

Les résultats obtenus dans les deux tests sont résumés dans le tableau I.

Comparaison des méthodes

Le tableau II synthétise les résultats obtenus au cours des tests A et B et rapporte les éléments de comparaison par paire des trois méthodes utilisées.

Dans le test A, si l’observation directe est retenue comme méthode de référence, nous obtenons une sensibilité de 77 % et une spécificité de 94 %. ELISA-CSP et OD ont révélé des résultats discordants pour 5 anophèles. Deux et 3 spécimens étaient positifs respectivement, uniquement en ELISA ou OD (tableau III).

La comparaison de PCR et ELISA-CSP a montré une dis- cordance des résultats pour 9 anophèles. En considérant la PCR comme la méthode de référence, nous avons obtenu une sensibilité de 59 % et une spécificité de 93 % (tableau II).

Dans cette deuxième comparaison, respectivement 2 et 7 spé- cimens étaient positifs, uniquement en ELISA-CSP ou en PCR (tableau III).

Enfin, en comparant l’observation directe et PCR avec la OD pris comme méthode de référence, nous avons trouvé une sensibilité de 85 % et une spécificité de 80 % (tableau II). Les résultats sont discordants pour 8 anophèles avec respective- ment 2 et 6 spécimens positifs uniquement en ELISA-CSP ou en OD (tableau III).

Les valeurs prédictives positives (vpp), c’est-à-dire la probabi- lité pour que le test soit positif si les sporozoïtes ou l’antigène csp sont présents pour les différentes comparaisons varient de 59 à 83 % dans le test A.

Les valeurs prédictives négatives (vpn), c’est-à-dire la proba- bilité que le test soit négatif si les sporozoïtes ou l’antigène CSP sont absents pour les différentes comparaisons, varient de 80 à 93 % dans le test A.

La concordance entre les deux tests, exprimée par le coeffi- cient de Kappa, a varié de « modérée » (0,56) entre PCR et ELISA-CSP à « bonne » pour les comparaisons OD/PCR (0,61) et ELISA/OD (0,74) dans le test A.

Le coefficient de Youden (Q) qui mesure la concordance entre les différentes paires de comparaison atteint la valeur « très fort », variant de 0,91 à 0,99.

Dans le test B (tableau II), qui s’adresse directement à l’ana- lyse du bloc tête/thorax de chaque moustique, la PCR est considérée comme la méthode de référence. La comparaison des résultats obtenus par PCR et ELISA-CSP a montré des valeurs élevées de sensibilité (95 %) et de spécificité (88 %).

Les résultats sont discordants pour 3 moustiques, avec res- pectivement 1 et 2 spécimens positifs uniquement en PCR ou en ELISA-CSP (tableau IV).

La valeur prédictive positive (vpp) est de 91 % pour le test B.

La valeur prédictive négative (vpn) est de 94 % pour le test B (tableau II). La concordance est « excel- lente » (κ = 0,84) entre PCR et ELISA–CSP du test B (tableau II).

Discussion

L

a mise en œuvre de l’amplification en chaîne (PCR), connue pour être très, voire trop sen- sible, nécessite une évaluation par rapport aux méthodes traditionnelles. Cette étude se situe dans la perspective de comparer l’observation microsco- pique des sporozoïtes après dissection, l’ELISA-CSP et l’am- plification par PCR d’ADN. À notre connaissance, aucune étude de ce genre utilisant un même broyat de glandes sali- vaires (test A) ou de tête/thorax de moustique (test B) n’a été rapportée.

La méthode immuno-enzymatique dite ELISA-CSP est la plus utilisée dans les études de transmission de paludisme au Sénégal (8, 12, 20). Ces dernières années, plusieurs travaux ont cependant relevé des limites à cette méthode. Il a été évoqué, par exemple, une possible surestimation de l’indice sporozoï- tique en raison de la présence chez le moustique d’antigènes CSP circulants provenant de la rupture des oocystes (1).

Dans cette étude, les techniques ELISA-CSP et PCR affi- chent de meilleures sensibilités et spécificité que l’observation directe. Pour chaque présence de sporozoïtes de Plasmodium falciparum avérée par observation après dissection, ceux-ci

Tableau I.

Résultats globaux de la répartition des échantillons positifs et négatifs des méthodes ELISA, PCR et Observation Directe, utilisées dans cette étude.

General results of the distribution of positive and negative samples of ELISA, PCR and Direct Observation methods used in this study.

Tableau II.

Comparaison des méthodes ELISA, PCR et observation directe.

Comparison of ELISA, PCR and direct observation methods.

Tableau III.

Tables de contingence pour la comparaison « par paires » des techniques ELISA, PCR et observation directe pour la détection des sporozoïtes

dans les glandes salivaires (test A).

Contingency tables for the comparison by pairs of ELISA techniques, PCR and Direct Observation performed for the detection of sporozoites

in salivary glands (test A).

Tableau IV.

Table de contingence pour la comparaison des techniques PCR et ELISA après un broyage commun des têtes/thorax (test B).

Contingency table for the comparison of PCR and ELISA techniques after common crushed head/thorax (test B).

test A test B

+ – total + – total

OD 13 35 48

ELISA-CSP 12 36 48 22 16 38

PCR 17 31 48 21 17 38

test comparaison nb de nb sensibilité spécificité Vpp^b Vpn^c κ^d moustiques positifs^a

A ELISA/OD* 48 10 77 % 94 % 83 % 92 % 0,74

ELISA/PCR* 48 10 59 % 93 % 83 % 80 % 0,56

OD*/PCR 48 11 85 % 80 % 59 % 93 % 0,61

B PCR*/ELISA 38 20 95 % 88 % 91 % 94 % 0,84

a : nb d’échantillons positifs pour les 2 tests ; ^b : valeur prédictive positive ; ^c : valeur prédictive négative ;

d : cœfficient de kappa ; * : méthode de référence

OD

+ – total

+ 10 2 12

ELISA-CSP – 3 33 36

total 13 35 48

PCR

+ – total

+ 10 2 12

ELISA-CSP – 7 29 36

total 17 31 48

OD

+ – total

+ 11 6 17

PCR – 2 29 31

total 13 35 48

PCR

+ – total

+ 20 2 22

ELISA-CSP – 1 15 16

total 21 17 38

ont été détectés par ELISA aussi bien que par PCR. Dans le test A, la concordance entre ces deux techniques et l’observa- tion directe a été bonne (κ = 0,74 et 0,61). Un travail antérieur de notre laboratoire (18) avait aussi noté une bonne concor- dance entre ELISA-CSP et l’OD des glandes salivaires. Ceci nous amène à conclure que, plutôt qu’une surestimation du nombre de moustiques infestés par ELISA-CSP, nous pour- rions nous trouver en présence d’une nette sous-estimation lors de l’utilisation de la technique d’identification visuelle des sporozoïtes dans les glandes salivaires. En effet, avec la détec- tion des antigènes circulants, mais aussi des fragments d’ADN de parasites, nous avons deux observations concordantes de marqueurs parasitaires (génomes et antigènes), ce qui consti- tue le meilleur compromis pour avancer l’idée qu’un parasite entier a été détecté. Les résultats du test B vont dans le sens de cette hypothèse dans la mesure où l’utilisation d’un échan- tillon de départ plus représentatif de l’intégralité de l’insecte, le bloc tête/thorax, permet la détection de parasite, de façon concordante (coefficient κ de Cohen : 0,84) par ELISA-CSP et PCR, dans un plus grand nombre d’individus. Une inter- prétation de surestimation est là encore possible. Toutefois, il faut noter que l’ELISA-CSP a une limite de détection de 250 sporozoïtes pour 50 µl (5) alors que la limite de détection pour la PCR a été évaluée à 10 sporozoïtes par glande (19).

Une explication possible serait donc que le nombre de spo- rozoïtes présents dans les glandes salivaires du moustique est en quantité trop faible pour être détecté visuellement ou par la méthode immuno-enzymatique.

Les résultats des témoins négatifs confortent cette interpré- tation, car la PCR n’a détecté aucun faux positif à ce niveau, mais, malgré ce faisceau serré d’indications, nous ne pourrions exclure définitivement la possibilité de faux positifs qu’après avoir mené une étude exhaustive des capacités de détection par PCR, de quantités connues de sporozoïtes introduits extem- poranément dans des glandes vierges avant amplification.

Nous avons montré que l’ELISA-CSP détecte la présence de sporozoïtes dans des femelles dont la dissection des glandes salivaires et l’examen microscopique donnent une interpréta- tion négative. Si l’observation directe est considérée comme le test de référence, l’ELISA-CSP surestimerait donc le taux d’infection des moustiques. Ces données corroborent l’obser- vation de SOKHNA et al. (18), dont les travaux ont montré dans le contexte de leur étude que l’ELISA-CSP détecte 1,5 fois plus de sporozoïtes de Plasmodium que l’observation directe après dissection des glandes salivaires, ce qui n’est pas le cas dans cette étude. En utilisant la PCR, nous avons détecté et identifié des sporozoïtes de P. falciparum alors que l’OD aussi bien que l’ELISA-CSP donnaient des résultats négatifs.

La littérature a aussi évoqué une difficulté de détection des antigènes d’autres espèces plasmodiales comme ceux de P. ma- lariae et P. ovale mais aussi le problème de variation antigéni- que de l’antigène CSP entre zones géographiques (5, 7, 17). Le développement de la PCR diagnostique des quatre espèces de Plasmodium humain a alors offert une opportunité de détec- tion directe des sporozoïtes dans les têtes/thorax d’anophèles infectées (13, 14, 16) pour l’estimation du taux d’inoculation entomologique. Cette étude a aussi montré que la PCR mul- tiplexe utilisée permet de détecter et d’identifier P. falciparum.

Cependant, nous ne pouvons affirmer que la technique utilisée détectera P. ovale et P. malariae dans des conditions similaires, puisque l’infection naturelle par ces parasites n’a pas été mise en évidence dans nos expérimentations. Nous ne connaissons pas non plus le seuil de positivité de cette technique. Pour cela, il faudra tester en PCR une gamme de concentrations croissantes d’ADN plasmodial mélangé avec un broyat de tête/thorax de moustiques non infestés et valider la technique en utilisant l’outil de quantification fourni par l’amplification

en chaîne quantitative (qPCR). Au vu des résultats obtenus, la PCR semble être une bonne méthode pour la détection et l’identification des sporozoïtes de Plasmodium falciparum.

Nous préconisons l’utilisation de cette méthode PCR d’am- plification d’ADN de sporozoïtes présents dans la tête/thorax de moustiques en complément des tests sérologiques ELISA- CSP pour mieux évaluer le taux d’infection des moustiques dans les régions de transmission permanente comme Dielmo au Sénégal.

Remerciements

Nous remercions sincèrement le Docteur Youssouf MANÉ pour la pertinence de ses remarques sur le manuscrit et tous les membres du laboratoire de paludologie et de zoologie médicale de l’IRD à Dakar pour leur contribution aux recherches conduites à Dielmo. Nous remercions particulièrement Charles BOUGANALI pour son apport technique et les volontaires qui ont participé à cette étude en tant que malades ou en tant que donneurs.

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