Contraintes de germination et Diagnostic Moléculaire des Champignons associés aux Maladies chez Ricinodendron heudelotii au Cameroun

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Djeugap Fovo J. et al. / Revue Scientifique et Technique Forêt et Environnement du Bassin du Congo. Volume 6. P. 76-78, Avril 2016

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Revue Scientifique et Technique Forêt et Environnement du Bassin du Congo Volume 6. P. 76-78, Avril (2016)

Contraintes de germination et Diagnostic Moléculaire des Champignons associés aux Maladies chez Ricinodendron heudelotii au Cameroun

Djeugap Fovo J.¹, Bernier L.², Dostaler D.³, Khasa D.⁴, Rioux D.⁵

(1) Etablissement : Faculté d’Agronomie et des Sciences Agricoles (FASA), Université de Dschang, République du Cameroun. Laboratoire de Pathologie Forestière, Département des Sciences du Bois et de la Forêt, Faculté de Foresterie, de Géographie et de Géomatique, Université Laval, Québec, Canada. / e-mail :joseph.djeugap@univ-dschang.org

(2) Directeur de thèse : Professeur Titulaire des Universités, Chef Laboratoire de Pathologie Forestière, Département des Sciences du Bois et de la Forêt, Faculté de Foresterie, de Géographie et de Géomatique, Université Laval, Québec (Québec), Canada.

(3) Co directeur de thèse : Professeur Titulaire des Universités, Département de Phytologie, Faculté d’Agriculture et des Sciences de l’Alimentation, Université Laval, Québec (Québec), Canada

(4) Membre du Comité de Thèse : Professeur Titulaire des Universités, Directeur du Programme de Maîtrise en Agroforesterie, Département des Sciences du Bois et de la Forêt, Faculté de Foresterie, de Géographie et de Géomatique, Université Laval, Québec (Québec), Canada.

(5) Membre du Comité de Thèse : Maître de Recherche, Pathologie forestière, Centre de foresterie des Laurentides, Sainte-Foy, Québec (Québec) Canada, Ressources Naturelles Canada.

1. Objectif général

Contribuer à la réussite des programmes de domestication de Ricinodendron heudelotii au Cameroun à travers l’identification moléculaire des champignons pathogènes et la lutte contre les maladies des semences et des plantules qu’ils occasionnent.

2. Objectifs spécifiques (OS)

OS1 : Dresser un état des lieux des opportunités et des contraintes agroforestières de R. heudelotii au Cameroun ;

OS2 : Déterminer les contraintes de germination chez cette essence à produits forestiers non ligneux ; OS3 : Isoler et identifier les champignons phytopathogènes associés à tous les organes malades chez R. heudelotii au Cameroun;

OS4 : Caractériser phénotypiquement les champignons présumés phytopathogènes fréquemment isolés chez R. heudelotii et constituer une banque de souches de champignons isolés chez R. heudelotii;

OS5 : Réussir l’infection artificielle des plantules saines et vérifier les Postulats de Koch ;

OS6 : Etudier la pathogénie de quelques espèces présumées pathogènes ayant été identifiées ;

OS7 : Lutter contre les maladies des semences et des plantules chez R. heudelotii.

3. Hypothèses (H)

H1 : L’absence des informations sur l’identité biologique des champignons pathogènes chez

Ricinodendron heudelotii constitue une entrave majeure à la réussite de la domestication chez cette espèce.

H2 : Les fongicides oxyde de cuivre et mancozèbe constituent de bons candidats pour la lutte contre les maladies foliaires chez R. heudelotii.

4. Méthodologie 4.1 Zone d’étude

Trois zones agroécologiques (ZAE) (zone forestière à pluviométrie monomodale, zone forestière à pluviométrie bimodale et les Hauts Plateaux) ont été considérées. Deux localités ont été considérées par ZAE. Un total de 350 échantillons a été collecté à partir de tous les organes de la plante.

4.2 Détermination des contraintes de germination L’effet de la scarification des semences sur leur germination ainsi que l’effet des pesticides sur la germination, l’infection des graines et le taux de plantules infectées ont été évalués. Il était également question de déterminer le délai entre le semis et la première levée, la durée moyenne de germination et l’effet de la durée de conservation sur la germination des graines chez R. heudelotii.

4.3 Extraction d’ADN, amplification, séquençage et identification

Les ADN ont été extraits en utilisant le protocole décrit dans le DNeasy Plant Mini Kit de la compagnie QIAGEN. Les séquences ITS des gènes des ADNr des champignons ont été amplifiés par

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77 les amorces universelles ITS4 (R) et ITS5 (F) dont la composition nucléotidique est la suivante:

ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC et ITS5:

GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG. Le séquençage a été réalisé par la méthode Sanger à la Plate- forme d’Analyses Génomiques (PAG) de l’Institut de Biologie Intégrative et des Systèmes (IBIS) de l’Université Laval, sur des séquenceurs à 16 capillaires de type 3130 XL de la compagnie Life Technologies.

Les séquences d’ADN ont été enfin comparées à celles de la banque Nucléotide collection (Nr/nt) du NCBI à l’aide de l’algorithme WU-BLAST (Washington University-Basic Local Alignment Search Tool) en vue de leur identification.

4.4 Postulats de Koch

Chaque champignon isolé a été inoculé individuellement sur les feuilles des plantules saines.

Chacun des champignons devra être capable de reproduire les symptômes observés en milieu naturel et d’être de nouveau isolé des lésions occasionnées; il devra par ailleurs être constamment associé à tous les individus présentant les mêmes symptômes afin d’être considéré comme microorganisme responsable de la pathologie en cause.

5. Résultats

R1.1 : R. heudelotii est une essence modèle d’avenir pour l’agroforesterie dans le bassin du Congo et diverses pistes de recherche ont été explorées en vue de contribuer au succès des programmes de domestication en cours pour cette espèce; tout ceci ayant pour corollaire la lutte contre la pauvreté. Un article a été publié en 2013 à ce sujet (International Journal of Biological and Chemical Science 7(1): 344- 355). http://www.ajol.info/index.php/ijbcs/article/

view/90485

R2.1 : La dormance tégumentaire, la durée de conservation des graines et les maladies constituent les principales contraintes de germination chez R.

heudelotii.

R2.2 : La scarification mécanique au marteau améliore significativement (P<0,05) le taux de germination des graines (88%) comparée aux autres traitements. La durée moyenne de germination des graines est de 13 jours lorsque celles-ci subissent un prétraitement au marteau. La durée de conservation des graines pour une germination optimale est d’environ 6 mois chez R. heudelotii.

R2.3 : Les pesticides Imidaclopride, Thirame et Chlorpyrifos-éthyle n’ont pas d’effet significatif sur la germination des graines mais influencent positivement le taux d’infection des graines et des plantules après la

levée. Les résultats R2.1, R2.2 et R.3 ont été publiés en 2014 (Seed Technology 36 (1): 25-36). http://www.

seedtechnology.net/seed_technology_journal

R3.1 : Les principaux champignons fréquemment associés aux organes infectés chez R. heudelotii sont Fusarium oxysporum (37%), Lasiodiplodia theobromae (21%), Pestalotiopsis microspora (13%), Colletotrichum gloeosporioides (11%), Diaporthe phaseolorum (11%), Trichoderma sp (4%) et Fusarium solani (3%).

R3.2 : L’étude des caractéristiques morpho culturales et microscopiques des espèces F. oxysporum, L.

theobromae et P. microspora sur les milieux de culture PDA, MEA et V8 (10%) à différentes températures montre que les trois milieux de culture sont appropriés pour la croissance de F. oxysporum et de L. theobromae.

Le milieu V8 a été le plus approprié pour la croissance de P. microspora.

R3.3 : La vitesse de croissance et la concentration des spores des champignons augmentent avec la température d’incubation et atteignent leur optimum à 23°C chez P. microspora et L. theobromae et à 28°C chez F. oxysporum. Les espèces P. microspora et L.

theobromae ne se développent pas à la température de 33°C alors que F. oxysporum y croit et sporule. C’est la première fois que ces champignons sont isolés chez R. heudelotii.

R3.4 : La morphologie et la pigmentation du mycélium, la taille et la concentration des spores des champignons étudiés varient en fonction du milieu de culture et de la température d’incubation. Un manuscrit est en préparation pour les résultats R3.

R4.1 : L’étude sur la pathogénie montre que l’espèce F. oxysporum est responsable du flétrissement des plantules et est plus agressive aussi bien sur les feuilles détachées que sur les plantules comparés aux agents responsables des nécroses foliaires (P. microspora et L. theobromae).

R4.2 : Les fongicides Plantomil 72WP® et le Nordox 75WG® ont une efficacité comparable et protègent mieux les plantules contre les nécroses foliaires dues à P. microspora et L. theobromae comparativement aux autres fongicides (P<0,05).

R4.3 : L’intensité et l’incidence de la maladie ont été plus élevées dans le site expérimental de Dschang (zone des Hauts Plateaux) qu’à Yaoundé (zone forestière);

soit respectivement 65 et 85% à Dschang contre 46 et 59% à Yaoundé à l’absence des traitements fongicides.

Les résultats R4 ont fait l’objet de deux publications scientifiques : la première en 2015 (International

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78 Journal of Current Research in Biosciences and Plant Biology 2(10): 82-87). http://ijcrbp.com/vol-2-10/

Fovo%20Joseph%20Djeugap,%20et%20al.pdf et la deuxième en 2016 (International Journal of Agriculture and Agricultural Research (8)1: 59-63). http://

www.innspub.net/ijaar/first-report-of-lasiodiplodia- theobromae-causing-shoot-blight-of-ricinodendron- heudelotii-seedlings-in-cameroon

6. Discussion

L’état sanitaire de la semence et son potentiel génétique constituent des données importantes qui conditionnent la croissance, le développement et la survie ou non de la future plantule aux maladies. Contrairement aux graines de Graminées et autres plantes cultivées qui germent assez rapidement, les graines d’arbres prennent le plus souvent plus de temps à germer en raison de divers facteurs intrinsèques tels que la dormance tégumentaire ou physiologique. Diverses techniques de prétraitement des semences forestières existent et ont été appliquées avec des taux de succès variables d’une essence forestière à l’autre et d’une technique à l’autre. Dans les pépinières et autres niches écologiques de R. heudelotii au Cameroun, tous les organes des plantules ainsi que ceux des individus adultes présentent divers symptômes de maladies d’origine fongique. Bien que tous ces champignons identifiés aient été longtemps isolés chez les plantes cultivées, la littérature phytopathologique signale de plus en plus leur présence chez diverses essences ligneuses forestières autant dans les zones tropicales que subtropicales. Ce sont donc pour la plupart des espèces fongiques cosmopolites et polyphages. La taille et la concentration des spores varient d’un milieu de culture à un autre ou d’une température d’incubation à une autre, reste tout de même dans l’intervalle de dimension signalée dans la littérature au sein de chaque taxon. Les fusarioses observées chez les plantules de R. heudelotii sont des maladies à propagation rapide via les racines et dont la répression n’est pas toujours aisée. A titre indicatif, Fusarium oxysporum f.sp. albedinis a été responsable de la mort de 12 millions de palmiers dattier au Maroc depuis son apparition en 1870 et s’est répandu de nos jours dans les palmeraies algériennes et tunisiennes. Les espèces des genres Pestalotiopsis et Lasiodiplodia signalées chez une gamme variée de conifères, arbres fruitiers et forestiers provoquent des symptômes variables selon les espèces végétales hôtes. Ceux- ci sont généralement des pourritures des fruits, des taches et lésions foliaires (grises, brune ou brun noir), des gommoses, des brunissements des vaisseaux et

des dépérissements. La lutte contre les maladies des plantes constitue la finalité de la phytopathologie.

Dans les pays en développement, malgré l’utilisation des moyens de lutte actuels, les pertes s’élèvent encore à plus de 40%. En dépit de certaines risques et problèmes qu’elle présente, la lutte chimique reste encore l’un des moyens de lutte le plus efficace à court terme. L’efficacité d’un fongicide dans la lutte contre une pathologie dépend de plusieurs facteurs tels que les conditions de manutention, sa mobilité dans les tissus du végétal, son mode d’action, la méthode d’application, le moment de son application, la phénologie de l’hôte, la biologie de l’agent pathogène mis en cause et les facteurs climatiques.

7. Recommandations et perspectives

- R. heudelotii est une espèce à exploiter pour son potentiel agroforestier et ses multiples vertus;

- La scarification mécanique au marteau dans les conditions de l’étude est indiquée pour rompre la dormance tégumentaire des graines; le traitement chimique des semences à base de l’Imidaclopride, Thirame et Chlorpyrifos-éthyle sont recommandés pour réduire le taux d’infection des graines et des plantules après la levée;

- Pour une croissance rapide et une sporulation abondante des espèces fongiques isolées chez R.

heudelotii, considérer les températures d’incubation respectives de 28°C pour les Fusarium et 23°C pour P. microspora et L. theobromae;

- L’oxyde de cuivre et le mancozèbe constituent de fongicides à utiliser contre les maladies foliaires des plantules chez R. heudelotii en pépinières.

Mots clés : Identification moléculaire, champignons phytopathogènes, contraintes de germination, pathogénicité, postulats de Koch, maladies des plantules, lutte chimique, agroforesterie, Ricinodendron heudelotii, Cameroun.

Thèse de Doctorat PhD (Philosophiae Doctor) de l’Université Laval en Sciences forestières dans la spécialité «Pathologie forestière». Soutenance de Thèse délocalisée à l’Université de Dschang le 16 juin 2013 devant un Jury constitué des Professeurs André Desrochers (Président, Canada), Louis Bernier (Rapporteur, Canada), Damase Khasa (Membre interne, Canada), Richard Ghogomu Tamouh (Membre externe, Cameroun) et Bella Manga (Membre externe, Cameroun).