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Texte intégral

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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Charles, C. (1979). Etude de quelques métabolites de l'éponge Dysidea herbacea Keller(Porifera) (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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(2)

X> ^(o ^ U O T H È Q U E DE CHIMJE ^ UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

F a c u l t é d e s S c i e n c e s C o l l e c t i f d e B i o é c o l o g i e

U n i t é d e C h i m i e B i o - o r g a n i q u e

ETUDE DE QUELQUES METABOLITES

DE L'EPONGE DYSIDEA HERBACEA KELLER

( P o r i f e r a )

' T h è s e p r é s e n t é e p o u r l ' o b t e n t i o n

d u g r a d e d e

D o c t e u r e n S c i e n c e s

CHARLES Claude

1 9 7 9

(3)

le mode de biosynthèse des terpénoïdes r''arrangés de la famille du pinguisaiTe.

(4)

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES

F a c u l t é d e s S c i e n c e s C o l l e c t i f d e B i o é c o l o g i e U n i t é d e C h i m i e B i o - o r g a n i q u e

ETUDE DE QUELQUES METABOLITES DE L'EPONGE DYSIDEA HERBACEA KELLER

(Porifera)

T h è s e p r é s e n t é e p o u r l ' o b t e n t i o n d u g r a d e d e

D o c t e u r e n S c i e n c e s [ c ^ ' * ^ p ^ ^

CHARLES Claude

1 9 7 9

(5)

FACULTE DES SCIENCES

L'épreuve publique pour l'obtention du grade légal de Docteur en Sciences, de Monsieur CHARLES, Claude, Licencié en Sciences, pour le groupe des sciences chimiqueB, aura lieu le :

MARDI 12 JUIN 1979 A l6.30 HEURES

en la saile de séminaires 10T, Bâtiment préfabriqué III, 1er étage, avenue P. Héger, Grille IV - 1050 Bruxelles

Monsievir CHARLES présentera et défendra publi- quement une dissertation originale intitulée :

"Etude de quelques métabolites de l'éponge Dysidea herbacea Keller (Porifera)";

et une thèse annexe intitulée :

"L'utilisation de précurseurs marqués permettrait de préciser le mode de biosynthise des terpénoïdes réarrangés de la famille du pingiiisane".

(6)

diverses difficultés, le professeur B. TURSCH a voulu m'aider à les surmonter et m'a accueilli dans son service. Tout au long de ce travail, il ne cessa de prodiguer ses encouragements et suscita un enthousiasme qui s'avéra précieux dans les moments (ils ne furent pas rares) où l'on est tenté de céder au découragement. Qu'il trouve ici l'expression de ma profonde gratitude.

Je tiens à adresser mes plus vifs remerciements à Messieurs

D. DALOZE, Chef de Travaux et J.C. BRAEKMAN, Chercheur Qualifié du F.N.R.S.

pour leur compétence et l'attention avec laquelles ils ont suivi le dérou- lement de cette thèse.

J'adresse aussi mes remerciements au Dr R. KARLSSON pour l'analyse par diffraction des rayons X de l'isodysidénine, ainsi qu'à Messieurs

VAN MEERSSCHE, G. GERMAIN et J.P. DECLERCQ du laboratoire de Chimie

Physique et de Cristallographie de l'JJCL, qui ont déterminé la structure et la configuration relative des sesquiterpénoîdes 87 et 91.

Je remercie le professeur R.H. MARTIN, dans le service duquel la plupart des spectres de masse et certains spectres de RMN'^H ont été relevés,

13 ainsi que Messieurs R. OTTINGER et D. ZIMMERMANN pour les spectres de RMN C.

Que tous ceux qui furent mes compagnons de travail au laboratoire soient assurés que l'excellent souvenir que je garderai de ces années est dû également à l'indispensable climat serein et détendu qu'ils surent créer.

J'exprime ma reconnaissance au Fonds National de la Recherche

Scientifique pour la confiance témoignée en m'accordant son appui financier.

Enfin, je veux ici rendre hommage à celle qui a su sacrifier certains avantages matériels et renoncer à une existence sans surprises pour me

permettre de réaliser un désir profond. En dépit de sa modestie et de son désir de discrétion, je tiens à la remercier infiniment pour la patience dont elle fit preuve et pour cet appui discret mais si efficace qu'elle m'accorda quotidiennement.

(7)

CHAPITRE I.

I N T R O D U C T I O

1.Généralités.

Les océans et les mers couvrent plus de 71 % de la surface du globe, 6 2 [ 1 ]

soit environ 360,10 Km . Parmi les divers écosystèmes marins,les récifs coralliens attirent d'emblée l'attention par la complexité de leur organisation et par leur richesse faunistique. A titre d'exemple, la faune récifaie de 1'Indo-Pacifique comprend environ 500 espèces de coraux, 5.000 espèces de mollusques (gastéropodes et lamellibranches), 2.200 espèces de poissons auxquels il faut encore adjoindre les échino- dermes, les crustacés, les bryozoaires, les vers, . . .''^^^

Les madréporaires sont les principaux bâtisseurs du récif. Ce sont des organismes sessiles, coloniaux, munis de cellules urticantes (les

cnidoblastes3 et qui sécrètent un squelette externe constitué oe calcaire.

Ils exigent pour prospérer, uns aau clairs, asrse, dont la tsmpsratura n'est pas inférieure à 20°C. Ces exigences limitent leur distribution à une zone délimitée grosso modo par les tropiques du Cancer et du

3 2 (2b}

Capricorne, où ils occupent une surface approximative de 150.10 Km

La production primaire des récifs est une des plus élevées de l'ensemble des écosystèmes marins et est même supérieure à la moyenne observée pour

(3 ]

les zones cultivées . Ce fait est a priori surprenant car leur situation exclusivement tropicale et leurs exigences quant à la transparence de l'eau sont généralement associées à un milieu peu productif. Quoique le phytoplancton et les macrophytes ne soient pas absents du récif, l'essentiel de la production primaire est assuré par des algues unicellulaires

(4)

symbiotiques, les zooxanthelles . Celles-ci semblent Jouer un rôle essentiel dans l'alimentation des coraux, en leur fournissant certaines substances organiques élaborées lors de leur activité photosynthétique Ce transfert direct de matière est particulièrement efficace puisqu'il

(8)

2

(2c)

évite la dispersion des nutrients essentiels . La comparaison du récif corallien avec un écosystème tempéré fait ressortir l'extraordi- naire diversité des espèces du premier, par rapport à la relative uniformité du second, où quelques espèces seulement constituent

fréquemment l'essentiel de la biomasse. Précisément, une loi de l'écologie affirme que les ressources d'un milieu sont mieux exploitées par un

écosystème complexe. La productivité paradoxale du récif corallien s'ex- plique donc par 1'exceptionne]le efficacité des transferts de matière et d'énergie assurée par la diversité spécifique élevée et la symbiose entre producteurs primaires et consommateurs. Le foisonnement des espèces a pour corollaire une compétition inter- et intraspécifique intense dans tous les actes essentiels de la vie des habitants du récif. L'âpreté de cette compétition a entraîné notamment la sélection d'une gamme très

C 6 ]

étendue de comportements et de signaux visuels , l'importance de ceux-ci étant illustrée par l'abondance des formes et la richesse des coloris. En outre, des études comportementales ont mis en évidence le rôle joué par les médiateurs chimiques lors d'interactions inter- ou

. . . . (7,8,9,10,11,12] , ^ ^ ^ ^ • _,, ^

intraspecifiques . La structure de certains d entre eux (7 8 13]

a pu être établie ' ' . A la fin de 1973, 385 métabolites secondaires

(14]

originaux avaient été isolés et identifiés à partir de sources marines Depuis, ce nombre n'a cessé de croître et, bien que le rôle écologique de la plupart d'entre eux soit encore inconnu, cette diversité est probablement le reflet de l'importance des messages chimiques dans les processus de compétition.

Le phylum des Spongiaires ou Porifères comprend environ 5.000 espèces, essentiellement marines. Les Eponges sont des métazoaires qui, dans leur structure morphologique la plus simple, se présentent sous forme d'une petite urne fixée par sa base et ouverte à son sommet par un orifice, l'oscule. La paroi est formée d'un ectoderme et d'un endoderme séparés par un gel, la mésoglée. La plupart des espèces sont coloniales et peuvent affecter des formes diverses, encroûtantes, arborescentes, digitées,

(15]

lobulées ou en éventail . Ce sont des organismes sessiles qui filtrent

(9)

l'eau de mer mise en circulation forcée par le battement de cellules ciliées tapissant l'endoderme. Ces cellules ciliées ou choanocytes présentent une colerette cytoplasmique qui entoure le flagelle. Cette structure est similaire à celle des Choanoflagellés, unicellulaires

eucaryotes qui sont peut-être à l'origine des métazoaires. L'alimentation des Eponges est constituée de bactéries et de microplancton. Il semble cependant que cette matière particulaire soit insuffisante pour permettre aux espèces volumineuses de prospérer. Le déficit alimentaire serait comblé par une symbiose entre l'Eponge et une population bactérienne

(16]

qui représente parfois le tiers du volume de tissus de l'animal

L'Eponge fournirait aux bactéries leur substrat sous forme de matière organique dissoute apportée par la circulation d'eau, mais prélèverait

(17]

en échange l'éxcédent de population par phagocytose . Beaucoup de

substances présentant une activité antibiotique ont été isolées d'Epongés (17]

pourvues ou non d'une population bactérienne symbiotique

L'antibiotique pourrait donc ne pas être d'origine bactérienne; chez les espèces non symbiotiques, il inactiverait les bactéries préalablement à leur ingestion, tandis que chez les espèces symbiotiques, il assurerait en outre la spécificité de l'association avec des souches bactériennes

(18]

résistantes . Les Démosponges marines hébergent parfois aussi des zooxanthelles et plus fréquemment des Cyanophycées de l'ordre des

Chlorococcales. De par leur organisation et leur mode de vie, les Eponges seraient particulièrement exposées à la prédation, notamment par des poissons, si elles n'étaient fréquemment douées de propriétés ichthyo- toxiques. Il a été observé que le nombre d'espèces ichthyotoxiques d'un écosystème marin augmente lorsque la latitude diminue, c'est-à-dire

(19]

lorsque la compétition interspécifique devient plus sévère . Comme

les éponges d'un récif présentent souvent une biomasse comparable à celle des Octocoralliaires (généralement dominants], 'elles constituent, de par leur accessibilité aisée, un matériau de choix pour la prospection de

nouveaux métabolites, que le but poursuivi soit écologique, pharmacologique ou purement chimique.

(10)

Z.Les métabolites de Spongiaires.

De nombreux métabolites secondaires ont été isolés d'épongés et plusieurs , , (20,21.22] ^

revues leur ont ete consacrées . Dans ce qui suit, nous nous

contenterons donc d'en dégager les lignes générales et nous illustrerons notre propos par quelques exemples choisis en fonction de leur intérêt structural, écologique ou biosynthétique.

Les métabolites de Spongiaires sont habituellement répartis en cinq classes: les dérivés bromés, les terpènes, les méroterpènes, les stérols et une classe de composés divers.

2.1. L§s_Çomgosés_bromés.

Beaucoup de composés bromés isolés d'épongés peuvent être considérés comme dérivant de la 3,5-dibromotyrosine 1.

COOH

Spongia offioindlis [23]

Aeroplysinine-2

Iccnthella sp. et Aplysina aerophoba (24)

OMe OMe

NH^ ^NH 0 0

4 j Aerothionine [25,27]

4 n = 5 ; Homoaerothionine Aplysina aerophoba et

Verongia thiona

[26,27]

Quelques dérivés bromés de la tyrosine

(11)

Parmi les composés de cette classe, dont l'origine biosynthétique n'implique pas la 3,5-dibromatyrosine, on remarquera dans les exemples qui suivent, les composés 8 a 13 extraits de spécimens de l'éponge Dys-idea hevbaoea collectés à Koror, Palau (îles Carolines],

•roîdine

Agelas oroides (28,29]

Axinella damiaormïs et A. verruGosa

6 R 7 R = Br

Phakellia flabellata H ; 4-bromophakelline

4,5-dibromophakelline (31,32]

Dysidea herbaaea (33,34]

R, z R. R-

ID

8 Br H Br Br Br 9 Br Br Br Br H 10 Br H Br H Br

11 H Br H Br H

12 H H H H Br

13 H Br H H H

Quelques composés bromes divers

2.2. Les_terpènes.

A ce jour, aucune publication ne fait état de l'isolement d'un mono- ou d'un triterpene à partir d'une éponge, à la seule exception du squalène

• • . [35 ]

identifié chez Jre^n^a spznosuta et I. musacamm (36]

(12)

6

Les autres terpènes constituent la classe la plus fournie de métabolites issus d'épongés. En dépit de leur nombre élevé, certaines caractéristiques structurales peuvent être mises en évidence.

a/ La fréquence élevée de structures comportant au moins un noyau furanne.

14

Pallescensine-A

Dysidea pallesaens [37,38]

15

Pleraplysilline-1

Plerccptys-ùlla spinifera (39)

AcO-

16

Spongïa sp. [40]

H O

17 Ircinine-1

Iraïnia oros (41 ]

18

Ircinine-2 (41) Irainia oros

Quelques furanoterpènes d'épongés

(13)

Certains de ces composés possèdent un squelette à 21 atomes de carbone, tels par exemple la furospongine-1 19, l'ircinine-3 20 et l'ircinine-4 21.

Ô H

19 Furospongine-1

(42 ) Spongza off^a^nal^s et H%ppos-pong%a aommums

21 Ircinine-4 r • - C43) Ira^n^a OTOS

Le problème de l'origine biosynthétique de ces C^^-difuranoterpènes n'a pas encore été résolu, quoique la présence dans le même organisme {Iraznia oros] des composés 20, 21 et des sesterterpènes voisins 17, 18 suggère

une filiation à partir de ces derniers.

b/ L'abondance relative de composés comportant des fonctions par ailleurs très rares dans la nature, telles que les isonitriles, les thiocyanates e t les dichlorocarbonimides.

(14)

22 R 23 R 24 R

N = C N=C=S NH-CHO

AxinelZa aannabina

Axisonitrile-2 Axisothiocyanate-2 Axamide-2

(44.45)

25 R =-N=C 26 R = - N = C=S 27 R =-NH-CHO

Axinella aannabina

Axisonitrile-3 Axisothiocyanate-3 Axamide-3

[46]

28

9-isocyanopupuKeanane Hymeniaoidon sp. ^^'^'^

OH 29

N=CCI.

Fseudaxvnyssa pïtys (48)

diisocyanoadociane i4acc^a sp.

Le diisocyanoadociane 30 est le premier composé naturel comportant un noyau perhydropyrène. Comme l'origine de ce squelette est inconnue, son apparte-

. . . , ^ , (49,22)

nance au groupe des terpenes est contreversee

Le rôle écologique de 1'isocyanopupuKeanane 28 est connu et constitue un bon exemple de relation interspécifique en milieu marin. Ce métabolite a d'abord été isolé d'un mollusque nudibranche, Phyllidïa varïaosa. Dépourvu de coquille et de plus brillamment coloré, ce dernier serait une proie aisée pour les prédateurs, s'il ne bénéficiait de la protection que lui procure

(15)

1'isocyanopupukeanane dont la toxicité à l'égard des poissons et des crustacés a été reconnue. L'isocyanopupukeanane est donc une allomone puisque sa présence dans les tissus du nudibranche lui confère un avantage évident. Ce métabolite est cependant d'origine exogène puisqu'il a été également trouvé chez l'éponge Hymeni-acidon sp. , aux dépens de laquelle le nudibranche se nourrit. Dans l'éponge, 1'isocyanopupukeanane est donc une allomone à l'égard de tous les organismes pour lesquels la dissuasion est effective et une kairomone vis-à-vis du nudibranche.

c/ L'importance du groupe des sesterterpènes d'épongés, proportionnellement plus abondants qu'en milieu terrestre. Aux furanosesterterpenes déjà évoqués, on doit adjoindre les sesterterpènes tétracycliques dont la scalarine 31

constitue un exemple.

O H

ÀCÇ ^ 10

31 Scalarine

Caoospongia saalar-ùs (50)

Une dizaine de sesterterpènes ayant ce squelette ont été isolés de (60)

Caaospongia moll-Cor ^ Heteronema eveota '•^''''^^^^ Spong-ia nitens et S. offiainalis

2.3. Les_mérotergènes.

Les méroterpènes sont des composés d'origine mixte; leur biosynthèse fait appel au mévalonate et à un précurseur benzénoïde. Parmi ces composés, les

"bioquinones" (ubiquinones, plastoquinones,...) sont uniformément répandues dans le monde végétal puisqu'elles sont indispensables au déroulement de l'activité photosynthétique. D'autres ont un rôle écologique; en particulier, dans le domaine marin, les composés 32 et 33 isolés de l'algue Sargasswn

(61)

tortiZe agissent comme inducteur de fixation pour la larve de 1'hydrozoaire Coryne uahidai.

(16)

32 33

L'étuae chimique des Spongiaires a également fourni des méroterpènes originaux qui peuvent être répartis en 2-polyprénylbenzoquino(ls]nes, mérosesqui-, mérodi- et mérosesterterpènes.

Dysidea avara [63,64)

34 n = 6 35 n = 7 36 n = 8

Irainia spinosula C62]

Dysidea pallesaens (65)

R^OOC

39 R. H, R^= CHg 40 R^= H

Strongylophorine-I 41 Strongylopharine-3

Strongylophora durissima

Quelques méroterpènes d'épongés

Strongylophorine-2 (66) •

(17)

2.4. Les_stérols.

On sait maintenant que le rôle biologique des stéroîdes est très diversifié.

Selon leur nature et l'organisme concerné, ils participent par exemple au métabolisme du calcium (vitamine •], à la digestion (acides biliaires],

au mécanisme de la mue chez les Arthropodes (ecdysones], aux relations interspécifiques (saponines et poisons d'insectes], à la reproduction chez certains champignons, à la régulation ionique et à la reproduction (hormones minéralocortico'ides, sexuelles,..,] chez les Mammifères. Les stérols

remplissent également une fonction primordiale chez tous les organismes

eucaryotes, où ils jouent un rôle dans la stabilité de la membrane cellulaire.

L'étude de la structure et des fonctions des membranes cellulaires est en plein développement, grâce surtout à l'emploi de membranes synthétiques.

La composition en phospholipides de ces membranes synthétiques est presque toujours calquée sur la composition des membranes naturelles d'animaux

supérieurs. Dans les limites imposées par de tels modèles, il a été possible de déterminer les caractéristiques structurales qui permettent à un stérol de réaliser de façon optimale la stabilisation de la membrane. Ce sont:

a/ la jonction trans des cycles A/B, B/C et C/D, ce qui confère au noyau stéroïdique une structure plane.

b/ les configurations 20R et 17B.

c/ la présence d'une fonction hydroxyle 36.

d/ la perte des trois groupements méthyle initialement présents dans les positions 4 et 14 du précurseur triterpénique.

e/ la présence des groupements méthyle angulaires en C-10 et C-13.

f/ une chaîne latérale dont le nombre d'atomes de carbone est compris entre 5 et 10.

Or, depuis l'essor de la chimie des substances naturelles d'origine marine, le nombre de stérols originaux, qui font exception à l'une ou l'autre de ces conoitions, s'est considérablement accru. En particulier, les composés 42 à 45 (cfr. page 12] illustrent la contribution des Porifères à cet

enrichissement. Certains des stérols, qui ne répondent pas aux critères ci-dessus, participent indubitablement à la physiologie de la membrane.

Cette apparente contradiction traduit probablement une différence de composition qualitative et/ou quantitative de la membrane. Des recherches ultérieures, visant à mieux comprendre les interactions entre ces stérols particuliers et les constituants lipidiques de la membrane, feraient

(18)

12

certainement progresser notre compréhension des phénomènes complexes qui se déroulent à l'interface du cytoplasme et du monde extérieur.

Enfin, on peut espérer, grâce aux investigations futures dans le domaine

des stérols marins, établir des relations phylogéniques entre certaines classes de protozoaires et les métazoaires

Aplys-ina aerophoba (67}

44

Vérongulastérol

Veronguta aautiformïs (69)

HOH^C

Axïnelta verruoosa (68)

45

Strongylostérol

Strongylophora durissima (70,71 ) Quelques stérols d'épongés

2.5. Composés divers.

Cette classe regroupe nombre de composés relativement simples et déjà

rencontrés dans d'autres phyla (histamine et dérivés, taurine, carnitine,...) Parmi les substances originales isolées d'épongés, nous citons à titre

exemplatif celles reprises à la page 13.

(19)

MeO

COOMe

(CHg).

15 CH.

C H 3 —C - C O O H

^ Il

N — O H

46

Chondrilline Chondvilla sp. [73]

47

Hymeniaaidon sanguinea (74)

48 Aplysinopsine Thoveata sp. ''''^^

Quelques composés divers d'épongés

3. Aspects pharmacologiques.

De tout temps, l'homme a fait appel à la nature pour tenter de soulager ou guérir les maux qui l'accablaient. Si actuellement un grand nombre de médicaments sont issus de la chimie de synthèse, les substances naturelles conservent un intérêt évident pour orienter la recherche dans de nouvelles voies. Jusqu'à ce que le milieu marin ait été rendu plus aisément accessible par la mise au point du scaphandre autonome, la rechercne de nouvelles

substances naturelles s'était, pour l'essentiel, adressée au monde végétal terrestre. L'océan offre cependant un champ d'inve3tigations beaucoup plu:: vrjirte, à la fois par la superficie qu'il occupe et aussi parce que, si on excepte les Insectes, environ 65 % de toutes les espèces anirralss

[76]

sont marines . Actuellement, la prospection au milieu marin ds^n un

^. , , . ^ n ^ (77,78,79.80,81 ,82,83]

but pharmacologique est en plein développement

Différentes activités biodynamiques ont déjà été reconnues pour certains

(20)

3.1. Actiyité_anti\/irale.

L'éponge des Caraïbes Cryptothetia arypta recèlE les rucléosides 49 à 51

HOH2C ^ 0 HOH^C ^ 0

50 Spongouridine

N ^ ^ ^ ^ l N

HOH^C ^ 0

HO HO 51 Spongosine

Nucléosides de Cryptothetia crypta [84,35,86]

Ceux-ci sont libres dans le tissu de l'éponge et ne sont donc pas des constituants de ses acides nucléiques. Ces métabolites ont servi de modèle pour la synthèse de la 1-g-D-arabinofuranosyl cytosine 52 ou

(81 ) Ara C qui présente une activité antitumorale

HOH^C

52 Ara C

(21)

3.2. Acti\/ité_ai2tibiotigue

Nous avons déjà fait allusion à l'activité antibiotique de nombreuses éponges (cfr. p.3]. Les substances responsables de cette activité appar- tiennent le plus souvent à la classe des composés bromés et un bon exemple nous est fourni par les métabolites 8 à 13 (cfr. p.5) extraits de Dysidea herbaoea, à la fois actifs contre les bactéries gram-positives et gram- négatives.

3.3. Activité_antifongigue.

L'acide L-azétidinB-2-carboxylique 53, isolé des éponges EaLvolona sp. et Chalïnops'Llla sp. est actif à faible concentration contre différentes espèces de dermatophytes [Triahophyton mentagrophyteSj Epidermophyton

( 88 ] floacostarij Miarcsporum audouini]

H

53 3.4. Activité cardioyasculaire.

WEINHEIMER et al. ont constaté l'activité cardiovasculaire de plusieurs extraits bruts d'épongés '•^'^^^ mais les substances en cause ne sont pas encore connues. • • . -

(22)

B U T D U T R A V A I L

Dysïdea herbaoea est une éponge encroûtante commune sur le récif entourant la station biologique de l'île de Laing en Nouvelle-Guinée. Elle présente

la particularité remarquable de "tuer" les autres espèces (éponges, coraux,...}

avec lesquelles elle est en compétition territoriale. Cette observation

nous a conduit à penser que ce comportement pouvait être dû à une ou plusieurs substances chimiques, toxiques ou répulsives, qui conféreraient a l'éponge un avantage adaptatif pour l'occupation du substrat. La recherche et l'étude de tels produits se situe précisément dans le cadre des activités de ce laboratoire. Nous nous sommes donc assigné comme but l'étude des métabolites secondaires de cette éponge.

N O T E P R E L I M I N A I R E

Dysidea herbaoea abrite des populations très importantes de microorganismes symbiotiques (algues et bactéries]. Comme on le verra dans la suite, l'origine précise des métabolites secondaires des éponges est encore très discutée.

Dans le texte, nous employons Dysidea herbaoea pour désigner l'ensemble des symbiotes.

(23)

CHAPITRE II

L A D Y S I D E N I N E E T L' I S O D Y S I D E N I N E

M E T A B O L I T E S H E X A C H L O R E S D E

D Y S I D E A HERBACEA

1. Isolement.

L'extrait au dichlorométhane de l'éponge Dysidea herbaaea KELLER, préala- blement séchée et broyée, fournit, après plusieurs chromatographies, une fraction qui réagit positivement au réactif de DRAGENDORFF et représente 2 % en poids sec. Celle-ci est en réalité constituée de deux substances très voisines, l'une prépondérante que nous appellerons isodysidénine et l'autre, mineure, la dysidénine. Ces deux métabolites n'ont pu être séparés que par chromatographie sur plaque à l'échelle préparative, à l'issue d'une élution continue au chloroforme pendant une semaine.

2. L'isodysidénine.

2.1. Etablissement_de_la_formule_br^

Le spectre de résonance magnétique C révèle la présence de dix sept atomes de carbone dans la molécule.

Le dernier ion du spectre de masse se situe à m/z 543 mais est trop peu intense pour permettre une mesure précise de la masse moléculaire. Par le nombre et l'intensité de ses pics isotopiques, l'ion à m/z 508 est carac- téristique de la présence de cinq atomes de chlore. Une mesure de la masse précise de cet ion établit la formule brute 7'^23'"'''5'^3'^2^ (mes. 507,9952;

cale. 507,9954]. D'autre part, on observe dans le spectre des signaux caractéristiques de la présence de six atomes de chlore et comme l'écart entre les ions à m/z 543 et m/z 508 est justement de 35 uma, la formule brute de 1 ' isodysidénine est donc finalement C.-,H_„C1„N„0_S.

1 / 23 b 3 2

Nous faisons évidemment abstraction des pics isotopiques.

(24)

2.2. Çaractéristigues_sgectrales.

Spectrométrie de masse masse

mesurée

masse calculée

formule brute de 1' ion

filiation des ions

507.9952 415,9315 387,9364 379,9545 201 ,9958

507,9954 415,9311 387,9363 379,9546 201,9957

^17^23^^5^°22 S 2 ^ 6 " 6 ^ ° 2

^ 1 1 ^ 6 " 6 ^ ° S 2 ^ 5 ^ ^ 5 ^ ° 2

^ 6 ^ 1 " 3 ^

dt -35(C1]

n! -127(C^H^N^S) 416 -28(CD]

508 -128(C^H N^S]

b 0 2 388 -186(C^H^Cl^O)

Principaux ions du spectre de masse de 1'isodysidenine.

[116]

Les filiations sont démontrées par la méthode MIKE CMass analyzed Ion Kinetic Energy"]

X 238 nm, log e 3,52 max ^ _

3.320, 1688, 1630, 1530, 790 et 763 cm + 47° (C=0,a8; CHClg)

CDCl^/TMS, ôCppm], J(Hz)]

1,36 (d. J=6, 3H]; 1.39 (d, J=6,5, 3H); 1,49 (m, 1H};

1,65 (d, J=7, 3H]; 2,51 (dd, J=16 et 9,5, 1H]j 2,68 (m, 1H];

2,94 (m, 1H]; 2,98 (s, 3H]; 3,08 (dd. J=16 et 2. 1H];

3,30 (m, 1H]; 5,34 (dd, J=9 et 4,5, IH); 5,43 (dq, J=a et 7.

1H]; 6,97 (d élargi, J=8, 1H]j 7,31 (d, J=3,5, 1H];

7,70 (d, J = 3,5, 1 H K UV (CH^DH]

IR (film]

r i22

RMN H [270 m z .

Les spectres de 1'isodysidénine sont reproduits à la suite de la partie expérimentale.

(25)

RMN c [l5.0a MHz. CDCl^/TriS, Ô(ppm)]

6 [BBD3 Multiplicité (CWORD]

Attribution

171.9 s 2 ^ C = 0

171.7 s +

2 ^ C = 0 +

168,6 s 1 ^C = X

142.3 d H-C =

118,9 d 1

H-C=

105,5 s C

105,2 s C

54,3 d CH

51, 6 d CH

51,6* d CH

47,1 d CH

37,4 t CH^

31,3 4-t CH^

31 .3 q CH3

21,6 q

17,3 q

16,5 q CH3

2.3. P£g[Disrs_élé[Ti9nts_structLraux.

L'isodysidênine comporte une fonction amide secondaire et une fonction amide tertiaire N^éthylée.

La présence de deux fonctions amide est suggérée par les bandes carbonyle -1 -1

à 1688 et 1630 cm (bandes I d'amide] ainsi que par la bande à 1530 cm (bande II d'amide].

13

Du spectre de RMN C on peut déduire que vingt-deux protons sont lies a des atomes de carbone. Un atome d'hydrogène est donc nécessairement lié à un hétéroatome, en l'occurence l'azote puisque le spectre IR exhibe une bande à 3320 cm et que les deux atomes d'oxygène de la molécule sont impliques dans -1

1

des fonctions carbonyle. Cet atome d'hydrogène, qui en RMN H apparaît à 6,97 ppm sous forme d'un doublet élargi par le moment quadrupolaire de l'azote, ne s'échange avec le deutérium ( D O ) qu'en présence d'acide trifluoracétique

et La superposition de deux signaux est démontrée en relevant un spectre dans le benzène.

(26)

deutérié. L'existence d'une fonction amide secondaire dans 1'isodysidénine est ainsi clairement établie.

La présence d'une fonction amide tertiaire N-méthylée est suggérée par le singulet d'aire 3H à 2,98 ppm et confirmée par le déplacement de ce signal à 2,32 ppm lorsque 1'isodysidénine est traitée par le diborane oans le tétrahydrofuranne. Le produit 54 de cette réaction présente une masse de

-1 529 uma et son spectre IR révèle une seule bande carbonyle à 168Q cm Dans nos conditions expérimentales, l'amide tertiaire a donc été réduit sélectivement. Les résultats expérimentaux publiés montrent que la séquence des cinétiques de réduction par le diborane est bien amide tert.> amide

. (89,90) s e c . » amide prim.

L'isodysidénine possède deux groupements triahloromêthyle.

Le spectre HIKE ae 1'isodysidénine révèle la filiation entre l'ion moléculaire et l'ion à 426 (rit-117). Dans le spectre de masse, le signal à 426 uma est caractéristique de la présence de trois atomes de chlore et correspond donc nécessairement è la perte d'un groupement trichlorométhyle, dont la présence dans 1'isodysidénine est ainsi démontrée.

13

Le spectre de RMN C nous apprend d'autre part que 1'isodysidénine ne

possède que deux carbones quaternaires apparaissant respectivement à 105,2 et 105,5 ppm. A l'un d'entre eux correspond donc obligatoirement le groupe- ment trichlorométhyle mis en évidence ci-dessus. La grande ressemblance de ces deux signaux, tant par leur déplacement chimique que par leur faible intensité, nous amène à postuler l'existence d'un deuxième groupement trichlorométhyle dans 1'isodysidénine.

2.4. Informations_structurales_déduites_de 55.

Le traitement de 1'isodysidénine par une solution à 50 % d'acide chlorhydrique concentré dans le méthanol, pendant vingt-quatre heures à reflux, fournit un produit 55 dont le dernier ion se situe à m/z 447. Une mesure de masse précise sur l'ion beaucoup plus intense à 412 uma permet finalement d'attribuer à 55 la formule brute t^^s'^-ig'^lg^Os ^^^^s. 411,9782; cale. 411 ,9806]. La

comparaison des spectres IR de 1'isodysidénine st de 55 révèle la disparition -1

des bandes à 3320 et 1530 cm ainsi que d'une bande carbonyle d'amide, celle -1

qui subsiste étant déplacée à 1658 cm . Il apparaît également une bande -1

carbonyle à 1745 cm . Ces observations suggèrent que l'amide secondaire a été rompue et remplacée par une fonction ester méthylique. Ceci se trouve confirmé par le spectre de RMN H où on observe, outre la disparition du doublet élargi à 6,97 ppm (-CO-NH-], un signal singulet d'aire 3H à 3,73 ppm

(27)

(-COOCHg). En conséquence, la rupture de l'amide secondaire s'accompagne de la perte d'un fragment C^H^N^S.

Le fragment CENS perdu lors de la rupture de l'amide secondaire comporte une double liaison disubstituee cis et le système

-NH-CH-CH^

1 3 56

•ans le spectre de RMN H de 55 on constate également la disparition des signaux à 1,65 (d, J=7, 3H]j 7,31 [d, J=3,5. 1H]j 7,70 (d. J=3,5, 1H) et le remplacement des signaux à 5,34 (dd, J=9 et 4,5, 1H]j 5,43 Cdq, J=8 et 7,

13 1H] par un signal à 5,27 (dd, J=6,5 et 4, IH], Le spectre de RMN C de 55 est en plein accord avec ce qui précède puisqu'on observe la disparition

I I

des signaux à 142,36 (H-C=} et 118,96 (H-C=] et qu'au bilan il manque un groupement CH et un groupement CH^, compte tenu de la fonction ester

méthylique. Des découplages par double irradiation réalisés sur 1'isodysidénine montrent que le signal élargi à 6,97 ppm est couplé avec le signal à 5,43 ppm,

lequel est également couplé au signal à 1,65 ppm. Le système 56 est ainsi démontré. De même, le signal à 7,31 ppm est apparemment couplé au seul signal à 7,70 ppm et vice-versa, ce qui caractérise une double liaison disubstituée, probablement isolée d'autres protons.

Irradiation à 6 (ppm] Modification à 6 (ppm)

6,97 5,43 (dq—^q]

5,43 6,97 (d é l a r g i — S él.};1,65 (d-»-s}

7,31 7,70 (d-^s)

7.70 7,31 (d—»-s)

Expériences de découplage démontrant la présence de l'enchaînement 56 et d'une double liaison disubstituée dans 1'isodysidénine.

•ans le spectre de RMN C de 55, on n'observe pas de signaux au-delà de 105 ppm, autres que ceux associés aux deux fonctions carbonyle présentes.

Le groupement _^C=X (où X = N ou S) de 1'isodysidénine est donc nécessairement localisé dans le fragment C^H^N^S. Le bilan des non-saturations montre que celui-ci possède également un système cyclique , lequel, compte tenu des informations dont nous disposons déjà, est obligatoirement de petite taille.

La double liaison disubstituée incluse dans un tel cycle est donc nécessaire- ment cis. La proposition est ainsi démontrée.

(28)

22

Le fragment CENS perdu lors de la rupture de l'amide secondaire comporte un cycle thi-azole.

Parmi les possibilités structurales qui subsistent lorsqu'on combine les informations précédentes, l'enchaînement 57, caractérisé par la présence d'un cycle thiazole, présente des caractéristiques spectrales en accord complet avec nos valeurs expérimentales.

- N H - C H - C H g

N

As

W

57 •

Isodysidénine Thiazole

1 (92 ] a - C - H

a

^b

X 238 nm, log z 3,52 max ^ 7,70 ppm 7,31 ppm 142,3 ppm 118,9 ppm

A 240 nm, log e 3,60 max

7,98 ppm 7,41 ppm 143,2 ppm 118,6 ppm Caractéristiques spectrales publiées pour le cycle thiazole et valeurs expérimentales correspondantes pour 1'isodysidénine Nous sommes ainsi amenés à considérer comme établie la structure partielle 57 pour le fragment C H N S.

Le plus répandu des produits naturels comportant un cycle thiazole est sans conteste la thiamine (vitamine B ) dont l'ester phosphorique 58 participe

(94]

notamment à la décarboxylation de l'acide pyruvique

CH2-CH2- 0 — P — P

58

A notre connaissance, les autres métabolites possédant un cycle thiazole ont tous été isolés de bactéries ou de champignons. Ce sont le plus souvent des peptides comme par exemple la micrococcine-P issue de Bactllus pumilus la bottromycine isolée de Strepto?nyaes bottropensïs^^^\ le thiostrepton

(95]

(29)

e x t r a i t de Streptomyaes azureus (97) l'acide aminé 59 isolé par JADOT et al

auxquels il y a lieu d'ajouter '•^^^de Xevocomus subtomentosus,

HOOC-

C H g - C H r - C —COOH H

59 2.5, Les_informations_structurales_dédu

La réduction de l'ester 55 par le tétrahydruroborate de sodium dans le tétrahydrofuranne humide fournit l'alcool 60, lequel est acétylé par l'anhydride acétique dans la pyridine. Le produit 61, de masse 461

(C..H C1„IM0 ], ne présente plus de bande hydroxyle en IR, mais exhibe deux 14 ^ I b o ^ bandes carbonyle à 1755 et 1660 cm , respectivement attribuables à un

1

acétate et un amide. En RMN H, des découplages par double irradiation M:

révèlent l'existence de deux ensembles de protons.

1 CH,

2

H

H,

8 H-

H,

C-

H

N T Hh H 12

CHgOCOCHg

62 63

La numérotation est celle qui sera adoptée ultérieurement pour l'isodysi- dénine. La structure partielle encadrée provient des réactions décrites et ne se retrouve donc pas dans 1'isodysidénine.

(30)

Irradiation à 6 (ppm) Modifications à 6 (ppm)

3,31 1,36 (d—.-s); 2,43 (dd-n^d); 3,0 ( d d ^ d ) 2,43 (H, C-3 ]

D

3,0 ( d d ^ s él.)j 3,31 (m—*-m']

1 ,36 (H^C-IJ et 1,38 [H^C-SJ 2,58 (m-r^d élargi); 3.31 (m-»-dd) 5,01 (HC-5] 1,5 (m — d d ) ; 2,28 ( m ^ d él.)

4,18 ( d — s)

1,50 (H C-6) a 2,28 (m_*m'); 2.58 (m-».q élargi);

5,01 (m-H-m') 2,28 (H, C-6]

1 , !dU l m —^ m J; /,DO Lm — ^ uq j ; D , U 1 L m — m J 2,58 (HC-7) 1.38 (d-*s)j 1.5 ( m ^ d d ) j 2.28 (.m-*-d.d)

4,18 (H2C-I2) 5.01 (m-»-dd)

Expériences de découplage démontrant la présence des enchaînements 62 et 63 dans le composé 61

proton multiplicité 6(ppm) J (Hz)

H3C-I d 1 ,36

HC-2 m 3.31 ^1.2 = 6; ^2.3a= 2 H C-3 a

HuC-3 D

dd dd

3,0

2,43 "^2.3b' = 9j ^3a.3b=

HC-5 m 5,01

H C—S a m 1.5 ~^5,12' = 6; 5. 6a

H^C-6 m 2,28

•^5.6b' = 8; ba, bb

HC-7 m 2. 58 •^5.6b' = 8; ba, bb H3C-8 d 1 ,38 '^6a.7' = 9; ^6b,7= 2

^7.8 = 6

^7.8 = 6

H2C-I2 d 4.18 ^7.8 =

Spectre de RMN H de 61

Attributions déduites des expériences de découplage

2.6. Informations_structurales_dédu

La fonction amide tertiaire N-méthylée de 55 est réduite en N-méthylamine par le diborane dans le tétrahydrofuranne.

• ans le spectre de RMN''H du produit 64 obtenu (fit 433, C^ „ H _ n i^ N O ^ ). le

(31)

double doublet déblindé, qui dans 55 se situait à 5,27 ppm, se retrouve avec les constantes de couplage inchangées à 3,35 ppm. On est donc amené à conclure que le proton HC-5 ne se trouve pas en a du carbonyle de l'amide, auquel cas la réduction aurait certainement modifié l'allure du signal, mais très probablement en a de l'azote.

2.7. Çonclusions_gartielles.

A ce stade, nous avons donc démontré que 1'isodysidénine comporte une fonction amide tertiaire N-méthylée, deux groupements trichlorométhyle et les séquences

C H ,

C H - C H p - C H ' ^

C O - N H - C H - C H 3

w

CH3

^ C H - CHg-

65 66

Nous pouvons également considérer comme très probable (cfr.2.6.] le système

CH3

^ C H - C H - C H C H' C O - N H - C H - C H ,

67

W

ce qui limite à 68 et 69 les structures encore compatibles avec ce que nous savons de 1'isodysidénine.

CCI.

CH, CH3

CH3 O ^ N H

H3C

68 69

(32)

2.8. Structure_et_configuration_absolu .

Les diverses tentatives de cristallisation de 1'isodysidénine ont toujours échoué. Nous avons déjà fait allusion à la réduction de l'amide tertiaire de 1'isodysidénine par le diborane dans le tétrahydrofuranne (cfr.2.3.).

Le traitement de 1'aminé tertiaire résultante par l'iodure de méthyle dans 1'acétonitrile fournit un dérivé cristallin dont la structure et la confi- guration absolue, obtenues par diffraction des rayons X, sont représentées par 7 0 .

70

La structure et la configuration absolue de 1'isodysidénine sont donc 10

où les atomes de carbone asymétriques C-2. C-5, C-7 et C-13 sont respecti- vement R, S, R et R.

3. La dysidénine 3.1. Généralités.

Par ses caractéristiques spectrales, la dysidénine apparaît d'emblée comme très proche de 1'isodysidénine.

En spectrométrie de masse, l'ion moléculaire se situe également à 543 uma.

Les principaux ions de 1'isodysidénine se retrouvent dans le spectre de la dysidénine, en particulier ceux signalés page 18.

(33)

En comparant les caractéristiques spectrales de 1'isodysidénine Ccfr.

page 18 ) et de la dysidénine (cfr. ci-dessous], on constate quelques différences. Ainsi, en RMN H les signaux à 1,49 ppm (m, 1H] et 2.94 ppm

(m, 1H3 ne se retrouvent pas dans le spectre de la dysidénine, où l'on observe par contre des signaux à 1,94 ppm Cm, 1H) et 2,26 ppm Cm, 1H}.

UV CCH^OH] X 240 nm, log e 3,56 3 max ' S

IR Cfilm] 3320, 1680, 1640, 1540, 785 et 765 cm [a]^^ -99° CC= 0,78j CHCl^}

R M N ' ' H [270 MHz, CDCl^AMS, SCppm), J CHz)]

1,37 Cd, J=5,5, 3H)j 1,40 Cd, J=6,5, 3H]; 1,60 Cd, 3=7.

3H]; 1,94 Cm. 1H]j 2,26 Cm. 1H]; 2,51 Cdd, J=16 et 8, 1H]

2,64 Cdd élargi, J=15 et 11, 1H]; 3,07 Cs, 3 H h 3.15 Cdd.

J=16 et 3. 1H)j 3.38 Cm, 1H]; 5,35 Cm. IHjj 5.40 Cdd, J=11 et 4, 1 H h 6,82 Cd élargi, J=8, IH]; 7,27 Cd, J=3,5, 1H)} 7,70 Cd, J=3,5, 1H)

Eu égard à leur grande similitude, la dysidénine et 1'isodysidénine sont donc probablement des diastéréoisomères.

Vers la fin de 1977, un groupe de chercheurs australiens du ROCHE RESEARCH INSTITUTE of MARINE PHARMACOLQGY publie la structure suivante pour un métabolite isolé d'un échantillon de Dysidea herbaaea récolté sur la

C99 ]

Grande Barrière . Par ses caractéristiques spectrales et son pouvoir rotatoire, ce métabolite est sans conteste identique à la dysidénine.

ÇH3

72

Sur la base de découplages par double irradiation à 10Q MHz, ils attribuent à un signal complexe situé vers 2,5 ppm. les deux protons portés par C-3 et aux signaux à 1,94 et 3,10 ppm, les deux protons portés par C-6. Les spectres

(34)

de la dysidénine et de 1'isodysidénine relevés à 270 MHz nous suggèrent une attribution différente pour ces signaux. Des découplages par double irradiation confirment cette impression et permettent d'attribuer sans

ambiguité chaque signal des spectres de la dysidénine et de 1'isodysidénins.

Irradiation à 6(ppm) Modifications à ôCppm]

1.49 5,34 Ldd—*-djj 2,94 Lm—»-m jj 2,bo Lm—^m j

2 , 6 8 1,39 (d—•s}; 2,94 Cm-*.m')j 1,49 Cm-*-m']

2 , 9 4 5,34 Cdd-*d]; 2,68 (m-»-m'); 1,49 Cm-*m']

5. 3 4 z,y'r t m » m jj i,'Tb 1,111—^m j

2,51 J,OU 1.m » m il o . u o i • • > uj 3 . 0 8 o , J u i m — ^ m J ; z, 3 J l u G — • G j

3 . 3 0 O , U O l UU ^ GJ, ^,31 LUG — G J . l,OU l,G ^ a J

Isodysidénine - Expériences de découplage

Irradiation à ôCppm) Modifications à 6(ppm]

1,94 5,40 Cdd-^d); 2,64* j 2,26 Cm-»-m')

2 . 2 6 2,64 Cdd él.-^dd]; 1,94 (m-^m']; 1,37 Cd-^s}

2 . 6 4 5,40 C d d ^ d h 2,26 Cm-*m']j 1,94 C m ^ m ' ]

5, 4 0 2,64* J 1,94 (m — m ' )

2.51 3,38 Cm-*m'}; 3,15 (dd-*-d}

3.15 3,38 C m ^ m ' î j 2,51 Cdd-:?.d}

3,38 3,15 Cdd-^d]j 2,51 Cdd-a-d]

Dysidénine - Expériences de découplage

Contrairement à ce qu'on observerait si les attributions de KAZLAUSKAS (99 ]

et al. étaient correctes, l'irradiation du signal à 5,40 ppm (HC-5] du 1

spectre de RMIM H de la dysidénine n'entraîne aucune modification du signal à 3,13 ppm et vice-versa.

Modification non interprétable

(35)

Le tableau suivant révèle les attributions déduites de l'ensemble des expériences de découplage.

Déplacement chimique (ppm]

Dysidénine Isodysidénine H_C-1

3 1,40 1,36

HC-2 3 , 3 8 3,30

H C-3

a 3,15 3,08

H.C-3

b 2,51 2.51

HC-5 5, 4 0 5,34

H C-6

a 1, 9 4 1,49

H^C-6

b 2 ,6 4 2,94

HC-7 2,26 2,68

H3C-8 1,37 1,39

H3C-IO 3,07 2, 9 8

HC-13 5,35 5,43

H 3 C - I 4 1,60 1,65

HC-16 7,70 7,70

HC-17 7,27 7,31

N-H 6,82 6.97

Attributions des signaux des spectres de RMN H de la dysidénine et de 1'isodysidénine

Du tableau ci-dessus, il ressort que les protons correspondants dans les deux composés ont pratiquement le même déplacement chimique, à l'exception des protons portés par C-6 et C-7. Ceci suggère d'ores et déjà que la dysidénine et 1'isodysidénine diffèrent seulement par la configuration de l'un ou des deux atomes de carbone asymétriques C-5 et C-7.

3.2, Configurâtioi2_absolue_gar_corrélati . 3.2.1. Principe.

L'étape obligée de la corrélation est l'hydrolyse des fonctions amide de la dysidénine et de 1'isodysidénine. Si les conditions expérimentales d'hydrolyse n'entraînent pas la racémisation de l'un ou l'autre des centres

(36)

d'asymétrie, les produits finals devraient être

à partir de 1'isodysidénine à partir de la dysidénine

H,C H

73.

COOH

H 3 C H 73

H,C H H tOOH

5 .NH CH,

>l H COOH

74. 74.

H p N \ i 3 ^ H

H,C'

75,

H g N ^ I S ^ H

i '"d 75

La configuration absolue de l'atome de carbone asymétrique C-2 de la dysidénine peut alors être déterminée aisément par comparaison du pouvoir rotatoire des composés homologues 73^ et 73^. On peut ce même connaître directement la configuration absolue de C-13 en mesurant les pouvoirs rotatoires de 75. et 75 ,. Par contre, la configuration absolue de C-5 et 1 d C-7 n'est accessible immédiatement que si les composés 74^ et 74^ sont identiques ou antipodes. Si au contraire, ils s'avèrent être diastéréo- isomères, il y aura lieu de réduire le groupement trichlorométhyle en méthyle et de comparer ensuite les pouvoirs rotatoires de 76^ et 76^.

(CH3)2CH^

g ^ N H — C H , H COOH

(CH3)2CH'''''^'^' 5 ^ N H - — C H . H COOH

76. 76

(37)

3.2.2. L'hydrolyse. Isolement des produits issus de cette réaction, La nécessité d'éviter, si passible, la racémisation de l'un ou l'autre centre asymétrique favorise évidemment l'hydrolyse acide vis-à-vis de

l'hydrolyse basique. Après quelques essais préliminaires, le procédé choisi consiste à traiter le métabolite hexachloré par l'acide chlorhydrique dans l'acide acétique à ref lux^'"^'^^.

A l'issue de la réaction, l'extraction du mélange réactionnel brut permet d'isoler l'acide 4,4,4-trichloro-3-méthylbutanoîque 73. En principe, il est aisé de séparer la 1-C2-thiazolo]-éthylamine de la N-méthyltrichloro- leucine par extraction de la phase aqueuse après alcalinisation. Des considérations de nature expérimentale nous ont pourtant dissuadés de procéder ainsi. En effet, des essais antérieurs avaient démontré que la purification par chromatographie de la 1-C2-thiazolo]-éthylamine pouvait être facilitée par formation préalable d'un dérivé moins polaire. Ceci paraissait également devoir être le cas de la N-méthyl-trichloroleucine, d'une part afin d'éviter l'emploi d'éluants très polaires et d'autre part, pour faciliter la détection de l'acide aminé, la ninhydrine étant inopérante ici puisque la fonction aminé est méthylée. Ces différents points nous ont amené à choisir un réactif commun à 74 et 75, le fluoro-2,4-dinitrobenzène

CFDNB, réactif de SANGERK Après lyophylisation de le phase aqueuse, le résidu, repris dans une solution de bicarbonate, est traité par le réactif

(1013

adopte . L'extraction du milieu réactionnel (basique] fournit une fraction contenant principalement 77.

77

Après acidification, une nouvelle extraction permet de récupérer une fraction constituée pour l'essentiel par 78

(38)

C C I ,

CH, COOH

N0„

N0„

78

Maintenant aisément détectable grâce à son chromophore aromatique, le composé 78 est encore trop polaire pour que sa purification soit aisée.

En conséquence, le composé 78 est transformé en 79 par l'action du diazo- méthane.

•3 COOCH3 NO2

79

3.2.3. Configuration absolue de l'atome de carbone C-2 de la dysidénine.

L'acide 4,4,4-trichloro-3-méthylbutanoIque 76, isolé par extraction de 1'hydrolysat brut, est malaisé à purifier tel quel par chromatographie, car il donne lieu à un "tailing" important. De plus, comme il s'avère difficile à détecter, nous avons été amenés à le transformer en un dérivé avantageux sous tous ces rapports, le 4,4,4-trichloro-3-méthylbutanoate de p-bromo- phénacyle 80^'^°^^

C C I .

C O O — C H ^ C O

O

Br

CH,

80

Les propriétés spectroscopiques des composés 80^ et 80^ sont identiques et s'accordent avec la structure ci-dessus.

SM L'ion moléculaire se situe à 400 uma (C^^H^^BrCl^O^].

On observe également des ions à 365 (M.-Cl), 330 Cnt-ZCl], 321 Cnt-Br], 283 Cut-CClg) et des signaux importants à 241, 197, 183 et 155 uma qui s'interprètent par les fragmentations suivantes

(39)

CCI

UV CCH^QH]

-1

\ 257 nm, log e 4,26 max ^ IR CKBr, cm ]

RflN^'n [iaO nHz, C D C I , 6 CppmK J CHz]]

1755 Cv C=Q ester), 1705 (v C=0], 1590 (v C=C], 795 et 765 (v C-Cl]

2,57(dd,J=i6 et 10)

CCI3 I H

^ C — C — C O O —CH2—CO

C H 3 I I 5,33(S)

^ H H

( d , J = 6 , 5 ) . ; .

--3,2(01)

La mesure du pouvoir rotatoire de 80^ et 80^ établit l'identité de confi- guration absolue de ces deux composés .

H 22

r i22

-7.8° ± 0,3° CC=2,35; CHCl^} pour 80.

-8,7° ± 0,8° CC=1,155 CHCl^) pour 80^

L'atome de cerbone asymétrique C-2 de la dysidénine est donc R.

L'erreur sur le pouvoir rotatoire est calculée grâce à

= 100 C | A a | + a | A C |

ou ù |AC| lAmI V -3 - 4

Les erreurs absolues sont estimées à 5.10 sur la mesure de a et 5.10 g sur la pesée.

(40)

3.2.4. Configuration absolue de l'atome de carbone C-13 de la dysidénine.

Les caractéristiques spectrales de 77^ et 77^ sont identiques et confirment la structure attendue.

SM 294 Cnt, C^^H^^N^O^S], 279 (nt-CH^]. 248 Cnt-NO^], + CH-CH3

Ô ^

112 > ^ . 8 4 M ^ ^ e

UV CCH^OH] X 232 nm, log e 4,19 ; épaulement à 265 nm 3 max » e. »

X 340 nm, log e 4,29 ; épaulement à 402 nm . max

IR (KBr, cm" ] 3340 (v N-H), 1628, 1594, 1586, 1522, 1505, 1420, 1338, 1300

R U N ^ ' H [100 MHz, CDCl , 6 Cppm], J (Hz)]

8,27(dCl,J=9et3)7,0(d,J=9)

H ^ 9,04(d é l . , J = 6 , 5 )

^ 5,25(quint.,J=6,5)

0 2 N - - ( Q ) N H C H C H 3 i , 8 4 ( d , J = 6 , 5 )

H NO, N^^^^^S

9,16(d,J-3)

H H / \

7,80(d,J=3) 7,36(d,J=3)

La mesure du pouvoir rotatoire de 77^ et 77^ établit l'identité de configuration absolue de ces deux composés.

[a]^^g 0,65°+ 0,06° [C=8,35; CHCl^} pour 77^

[a]^4g 0,77° ± 0,09° (C=5,97j CHCl^] pour 77^

Ces valeurs, quoiques faibles, sont cependant significatives. La présence

dans 80 de deux systèmes aromatiques exclut de mesurer le pouvoir rotatoire

à une longueur d' o n d e plus faible.

L'atome de carbone asymétrique C-13 de la dysidénine est donc R.

(41)

3.2.5. Configuration absolue des atomes de carbone C-5 et C-7 de la dysidénine.

Comme les atomes de carbone C-2 et C-13 de la dysidénine et de l'isodysidé- nine ont la mime configuration, nous nous attendions à ce que les composés 79. et 79_, soient diastéréoisomères ou antipodes. En réalité, l'hydrolyse

1 d

des métabolites hexachlorés entraîne, dans chaque cas, la formation de

deux produits. En chromatographie sur couche mince, la résolution du mélange s'avère particulièrement délicate et n'a pu être réalisée que dans les

conditions d'élution mentionnées ci-dessous.

éluant hexane/acétate d'éthyle 8/2 (4 élutions}

Le mélange obtenu à partir de dysidénine est dans le rapport

_ 7 V 79^B d

= 1,2

Le mélange obtenu à partir d'isodysidénine est dans le rapport

79.A 79^B

= 2.5

On constate également que les constituants correspondants de chaque couple ont le même Rf. De même, aucune différence n'est mise en évidence par les méthodes spectroscopiques. Finalement une mesure du pouvoir rotatoire établit

l'identité des constituants correspondants de chaque couple : -163° ± 10° CC=0,22j CHCl.,] pour 79.A

H H

22

• 22

D -161' 10' (C=0,24; CHCl.,] pour 79_,A 3 d

MB

22

22

240° ± 10° (C=0,32; CHCl^} pour 79^B 258° ± 10° CC=0,35; CHCl^) pour 79^B

Les spectres de masse des composés 79A et 79B présentent des similitudes

frappantes. On y retrouve notamment l'ion moléculaire à 427 uma ^'--j4*^^5^^3'^3'^5^

ainsi que des signaux importants à 392 (nt-Cl], 368 [nt-CODCH^Î, 322 [368-NO2], 268 (Mt-CCl2CCH2}CH-CH2}.

En spectrométrie IR, les différences sont mineures et n'affectent pas lés

(42)

bandes les plus intenses, lesquelles se situent à 1755 CvC=0 ester], 1610 CvC=Ch 1525 Cv NO^], 1340 (v NO^}, 790 et 770 cm~''[vC-ClK ^ as 2 s 2

La RMN H met en évidence quelques écarts de déplacement chimique [cfr.

ci-dessous], mais globalement les différences observées entre 79A et 79b sont très faibles et peuvent raisonnablement être attribuées à une diastéréo isomérie.

C C I 3 \ J

H 6 1 5 /

.C — C — C ^

8 / 1 I I

C H 3 H H H

C O O C H ,

79a 79b

HC-5 H C-6

4,5 1,90

Cdd, J^= 7,5) Cdd, J=15 et 7,5}

4,42 2,06

(dd, J=13,5 Cm)

et 4,5)

H. C-6

^ * HC-7

J-

2,78 Cm) 2.77 Cm)

H^C-8 1,43 (d, J=6,5} 1 ,25 Cd, J=6,5)

H3C-IO 2,92 (s) 2,92 (s)

H3C-a 3,83 (s) 3,84 Cs)

HC-b 7,20 Cd, J=9} 7,17 Cd, J=9)

HC-c 8,33 (dd, J=9 et 3) 8,33 Cdd, J=9 et 3) HC-d 8,72 (d, J=3) 8,75 Cd. J=3)

RnN''H [100 MHz, CDCl^AMS, 6 Cppm), J CHz)]

En l'absence de données de découplage, ces attributions sont vraisemblables mais pas démontrées.

(43)

L'une des étapes de la séquence des réactions décrite au paragraphe

3.3.2. s'accompagne donc de la racémisation de l'un des centres asymétriques.

L'étape incriminée est très probablement l'hydrolyse acide. En effet, en nous reportant au paragraphe 2.4., le produit 55, obtenu à partir de

1'isodysidénine par l'action d'une solution d'acide chlorhydrique dans le méthanol, est également un mélange de deux diasteréoisomères. Ce fait est attesté par le spectre de RMN H de 55, où certains signaux dus au produit principal sont accompagnés par un signal homologue, d'intégration fraction- naire. La chromatographie sur couche mince permet finalement de mettre en évidence, dans 55, la présence de deux constituants partiellement résolus.

L'acide chlorhydrique, qui participe aux deux réactions concernées, semble donc être la cause du phénomène d'épimérisation,

Nous démontrerons plus loin que le centre asymétrique en question est l'atome de carbone C-5. A priori, nous n'avons aucune explication de ce phénomène.

En nous référant aux peptides, qui présentent le plus d'analogies avec 1'isodysidénine, la littérature ne mentionne pas, à notre connaissance,

une éventuelle épimérisation lors de l'hydrolyse acide. Certains acides aminés se racémisent en milieu acide, mais dans des conditions habituellement plus sévères que les nôtresj ainsi, la racémisation de l'arginine exige un

f 103 ]

traitement par l'acide sulfurique 50 % à 1B0-180°C pendant 37 heures

Trois possibilités de configuration subsistent pour la dysidénine, à savoir . a/ C-2 CR), C-5 CR], C-7 CR), C-13 (R)

b / C-2 CR}, C-5 CS], C-7 CS}, C-13 CR) c/ C-2 CR}, C-5 CR}, C-7 CS}, C-13 CR} •

Dans chacune des hypothèses, nous devons envisager que le processus d'hydrolyse conduit à un couple de produits 79A et 79B, l'un ayant la configuration initiale et l'autre résultant de 1'épimérisation d'un des centres asymétriques concernés. En considérant successivement, pour chaque hypothèse structurale de la dysidénine, 1'épimérisation de C-5 et 1*épimé- risation de C-7, nous obtenons au total six possibilités de couple pour

C79A et 79B]. En comparant chacune d'entre elles avec le couple correspondant provenant de 1'isodysidénine, on constate que seules sont compatibles avec les pouvoirs rotatoires mesurés Ccfr. page 35}, les hypothèses encadrées dans le tableau de la page suivante.

(44)

atomes de carbone C-5 et C-7

C-5 CS], C-7 CR) C-5 (Rh C-7 (R) C-5 CS3, C-7 (S] C-5 (R), C-7 (S) C-5 CS], C-7 CR)

couple résultant de 1'épimérlsation en C-5

5 (S), 7 (R]

5 (R], 7 (R]

5 (R), 7 (S) 5 (S], 7 (S)

5 (R), 7 (S]

5 (S], 7 (S]

5 (S), 7 (R) 5 fR), 7 (R)

couple résultant de 1'épimérisatlon en C-7

5 (R), 7 (S) 5 (R], 7 (R)

5 es), 7 (R) 5 (S). 7 CS]

5 (R). 7 (S]

5 (R). 7 (R)

5 CS), 7 (R) 5 (S), 7 (S)

(45)

Les configurations de la dysidénine, compatibles avec toutes les données expérimentales disponibles, se limitent donc aux deux ci-dessous.

Configurations possibles de la dysidénine

Epimérisation lors de 1'hydrolyse

C-2 CR}, C-5 (R], C-7 [R], C-13 [R}

C-2 (R], C-5 (S), C-7 [S], C-13 (R]

C-5 C-7

Afin de déterminer la configuration correcte, la dysidénine et l'isodysi- dénins sont soumises à l'action du couple zinc/cuivre dans le tétrahydro- furanne humide, ce qui entraîne la réduction des groupements trichlorométhyle

[1041 et la formation des composés 81. et 81 . 1 d

( C H 3 ) 2 C H

81

Les spectres de masse des composés 81^ et 81^ présentent les mêmes signaux caractéristiques à 339 '^-^y^23^3°2^^ ' CM^-CH^J, 283 W%iCH^] ^CHCh^)

et 184 112

(CK2]2CH-CH2-CH=N-CD-CH2-CH[CH2)2

j J ^ y - C H - C H ,

CH,

100 C C H 2 ] 2 C H - C H 2- C H = N- C H 2

U V C C H ^ O H )

-1

X 355 nm, log e 4,10 max *

IR (CHClg, cm ] Identiques dans les deux composés, les bandes principales se situent à 3400 (vNH], 1685 et 1635 (vC=a amide) et 1520 (bande II d'amide]

1

Le fait saillant en RMN H (100 MHz, CDCl^) est la présence vers 0,94 ppm d'un signal d'aire 12 H résultant de la superposition de quatre doublets d'aire 3H; comme l'illustre le tableau repris à la page 40. les déplacements

(46)

chimiques des quelques signaux nettement individualisés présentent parfois certaines différences.

6(ppm), J(Hz) 81 .

1 81 d

H3C 14 H3C-IO HC-5 HC-13 HC-17 HC-16 N-H

1,62 Cd, J=7) 2,93 (s) J- 5,2 (m]

7,27 (d, J=3]

7,73 (d, J=3]

7.00 (d élargi, J=a]

1,52 (d, J=7) 2,91 (s]

5,2 Cm] •

7,24 (d, J=3]

7,71 (d, J=3}

6,91 (d élargi, J=8)

Les composés 81^ et 81^ ont des Rf légèrement différents en chromatographie sur couche mince, et la mesure de leur pouvoir rotatoire confirme qu'ils sont diastéréoisomères.

[a]^^ = 1 3 3 ° ± 3° CC=1,2j CDCI3) pour 8 K [a]^^ = -122° ± 4° CC=0,89; CDCl^) pour 81^

Comme nous savons que l'atome de carbone asymétrique C-13 a la même confi- guration dans les deux produits Ccfr. 3.2.4.], ceux-ci diffèrent nécessai- rement par la configuration de l'atome de carbone C-5.

Les atomes de carbone asymétriques C-5 et C-7 de la dysidénlne sont donc R.

3.2.6. Conclusion.

La dysidénlne et 1'isodysidénine diffèrent seulement par la configuration de l'atome de carbone asymétrique C-5. Il est intéressant de remarquer que c'est précisément cet atome de carbone qui est épimérisé lors de la réaction d'hydrolyse acide.

La dysidénlne présente donc la configuration suivante où les atomes de carbone asymétriques C-2, C-5, C-7 et C-13 sont tous R.

Figure

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Références

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