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Etude de biocapteurs, à algues immobilisées pour le
contrôle des milieux hydriques
Pascal Pandard
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Pascal Pandard. Etude de biocapteurs, à algues immobilisées pour le contrôle des milieux hydriques. Toxicologie végétale et mycotoxicologie. Université Paul Verlaine - Metz, 1992. Français. �NNT : 1992METZ013S�. �tel-01775972�
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v6 +s hïo
I]NTTIERSITE DE NTETZ
CENIRE
DES
SCIENCES
DE L'ENVII?ONNEMENT
TIIESE DE DOCTORAT DE L'T]NTTIERSITE
DE METZ
S'pnCHf.ftn : TO)ilCOLOGIE DE L'EI{VIBONNEMENT
ETUDE DE BIOCAPTEURS
A ALGUES IMMOBILISEES
pou& LE coNTnoLE DES MILIEUX TIYD&IQUES
Soutenue le 25 MARS 1992
par
Pascal PANDARD
Mernbtps du, ju,ry :
P. UASSEUR, h1êsid,srùt
D. BURNEL, RapWtteur
F. COLIN, Rapfm'tar
J.F. FERANN
J.F. OONNNT
S. MULT,ER
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éhtdp ; quiette trouae icô lP tênwigrage de mn ptofondn re@ra61iisscmæ'
Je suis porticutiÈremznt sensibte à, ln yrêsettæ dÆnts lP iurv de Mansi,eur D-BURNEL, ie Irui eryrimc, dnns æs qu,elwtes lignns, tou,te ma rewnnaisscttt'æ psur auoù,r acæptê de fit'ger æ trauo,iL
Jerryri:me mn grratihtdz à, Monsiour J.F. FERARD pou'r lns yrécieu,t conseùIs quil r,:o a:minnlpment yrod,i,gtuÉs et pou,r UintÉrêt quit o mnnifestÉ pou'r cette êtud,e'
Mes remerciemsnts lod,resssnt a:ussi à, Monsîeur F. COLIN qu'i me fait le plnisir dêtre rryWrtsur dp ætte thàse et à. Messi,eurs S. MULLER et J.F. GONNET ry'i ont oæ,eptÉ dn siÉger dan's moniwU.
Je rqmercie ln Rêgitn lfrrT@ine, lÆ sociÉtÉ Aspct Seruiæ Emtironnem,ent, ln Ministère de liflrwironnement et ta Fondatitn Ernofiennn pou,r ln Scimr;e pour leur soutien fr,nancior ou co,Lrs d,e ce
ttailail-Je np saurais oubtisr Monsieur D.M. RAWSON et son êWûpe qu,i tniont rêseruê un ornteit chnlsureu,r dans leu,r Labqratnire et nlqnt lait bênÉfrÆiÊ? de l,eurs wnnaissanæs opyrofottd'ins irf,rrs lP donwi:np des bi'oæpteurs'
1 . L E S B I O C A P T E U R S 1 . 1 D é f i n i t i o n 1 . 2 R é a c t i f b i o ' l o q i q u e L . 2 . L T e c h n i q u e s d ' i m m o b i I i s a t i o n L . 2 . 2 C h o i x d u r é a c t i f b ' i o l o g i q u e 1 . 3 A p p l i c a t i o n s d e s b i o d é t e c t e u r s 1 . 3 . 1 D o m a i n e m é d i c a l L . 3 . 2 D o m a i n e a l i m e n t a i r e e t d e 1 . 3 . 3 C o n t r ô l e d e s f e r m e n t a t i o n s 1 . 3 . 4 C o n t r ô ' l e d e ' l a q u a l i t é d e a p p l i q u é s a u x c o n t r ô l e s d e 2 . R E A C T I F B I O L O G I Q U E : L E S A L G U E S 2 . 1 A c t i v i t é o h o t o s v n t h é t i q u e I a n u t r i t i o n e t d e s b i o r é a c t e u r s i n d u s t r i e l s I ' E n v i r o n n e m e n t e t b i o c a p t e u r s t o x i c i t é
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3 . 1 . 3 I m m o b i I i s a t i o n d u b i o c a t a ' l y s e u r 3 . 1 . 3 . 1 A d s o r P t i o n s u r m e m b r a n e 3 . 1 . 3 . 2 I n c ' l u s i o n d a n s u n g e 1 d ' a 1 9 i n a t e 3 . 2 E l e c t r o d e à o x v q è n e 3 . 2 . I P r i n c i p e d e l a m e s u r e 3 . 2 . 2 A p p a r e i l l a g e 3 . 2 . 3 M e m b r a n e p r o t e c t r i c e , é l e c t r o l y t e 3 . 2 . 4 R é a c t i f b i o l o g i q u e , I m m o b i l i s a t i o n 3 . 3 E x o r e s s i o n d e s r é s u ' l t a t s 3 . 4 T e s t s a l q u e s 4 . R E S U L T A T S : S Y S T E M E A M E D I A T E U R 4 . 1 0 o t i m i s a t i o n d u s v s t è m e 4 . 1 . 1 C h o i x d u m é d i a t e u r 4 . L . 2 P r o p r i é t é s d e I a p - b e n z o q u i n o n e 4 . L . 2 . I P r o p r i é t é s c h i m i q u e s 4 . L . 2 . 2 T o x i c i t é 4 . 1 . 3 D u r é e d e v i e d u b i o c a P t e u r 4 . 2 S e n s i b î ' l i t é d u s v s t è m e 4 . 2 . L T o x i c i t é d e s h e r b i c i d e s 4 . 2 . L . 1 B i o c a p t e u r im m o b i l i s é p a r 4 . 2 . I . 2 B i o c a t a l y s e u r in c l u s d a n s 4 . 2 . 2 T o x i c i t é d e s m é t a u x 4 5 4 5 4 5
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7 9 8 4 8 4 a d s o r p t ' i o n s u r m e m b r a n e u n g e 1 d ' a 1 g i n a t e 4 . 3 C o n c l u s ' i o n s c o n c e r n a n t l e s e s s a i s a v e c m é d ' i a t e u r s 5 . R E S U L T A T S : B I O C A P T E U R A O X Y G E N E 5 . 1 O p t i m i s a t i o n d u s v s t è m e 5 . 1 . 1 P a r a m è t r e s p h y s i q u e s d u s y s t è m e 5 . 1 . 1 . 1 P o t e n t i e l ' i m p o s é 5 . 1 . 1 . 2 C h o i x d e I ' é 1 e c t r o l y t e 5 . 1 . 1 . 3 I n f l u e n c e d e l a m e m b r a n e p r o t e c t r i c e 5 . L . 2 A m é ' l i o r a t i o n s a p p o r t é e s a u s y s t è m e 5 . I . 2 . 1 C h o i x d u s u p p o r t d e f i x a t i o n d e s m i c r o - o r g a n i s m e s 5 . L . 2 . 2 I n f ' l u e n c e d e ' l ' â g e de la culture sur la sensibilitéé l e c t r o d e s 5 . L . 2 . 3 I n f ' l u e n c e d e I a c o n c e n t r a t i o n a ' l g a 1 e s u r I a s e n s i b i ' l i t é v i s - à - v i s d e s t o x i q u e s 5 . 1 . 3 D u r é e d e v i e d u c a p t e u r 5 . 1 . 4 C o n c l u s i o n s s u r ' l e s e s s a i s d ' o p t i m i s a t i o n d u s y s t è m e 6 7 6 8
5 . 2 . L T o x i c i t é d e s s u b s t a n c e s c h i m i q u e s 5 . 2 . 1 . 1 T o x i c i t é d e s h e r b i c i d e s 5 . 2 . 1 . 2 T o x i c i t é d e s m é t a u x 5 . 2 . I . 3 A u t r e s s u b s t a n c e s c h i m i q u e s 5 . 2 . 2 A p p l i c a t i o n d e s b i o é ' l e c t r o d e s à d e s e f f l u e n t s i n d u s t r i e l s 5 . 2 . 2 . I R é a c t i f b i o l o g i q u e S c e n e d e s n u s s u b s p f c a t u s 5 . 2 . 2 . 2 R é a c t i f b i o l o g i q u e C h l o r e l l a v u l g a r f s 5 . 3 A o o l i c a t i o n s à u n e n v i r o n n e m e n t m a r i n 6 . C O N S E R V A T I O N D E S A L G U E S A L O N G T E R M E 6 . 1 E l e c t r o d e s o r ê t e s à I ' e m p l o i 6 . 2 C u ' l t u r e s li q u i d e s 6 . 2 . L E t u d e s d e s e n s i b i ' l i t é 6 . 2 . 2 S t a b i l i t é d e l a r é p o n s e 6 . 2 . 3 E t u d e s m i c r o s c o p i q u e s 7 . D I S C U S S I O N 7 . 1 S o e c t r e d ' a p p ' l ' i c a b i l i t é d e s b i o é l e c t r o d e s a l q a l e s 7 . 2 C o m p a r a i s o n e t i n t é r ê t d e s s v s t è m e s d é v e l o p p é s 7 . 3 A o o l i c a t i o n f n s i t u d u b i o c a o t e u r à o x v q è n e 7 . 3 . 1 I n f l u e n c e d e l a c o n f i g u r a t i o n d u c a p t e u r 7 . 3 . 2 C o n t r a j n t e s li é e s à l ' u t i l i s a t i o n d ' u n r é a c t i f b i o l o g i q u e 8 . C o N C L U S T o i l 9 . R E F E R E N C E S B I E L I O G R A P H I Q U E S A N N E X E S A n n e x e 1 A n n e x e 2 A n n e x e 3 A n n e x e 4 A n n e x e 5 Annexe 6 8 7 8 7 9 2 9 6 9 8 9 8 1 0 3 1 0 8 1 0 9 1 1 3 1 1 5 1 1 5 1 2 0 T2T 123 L24 r26 1 3 3 1 3 3 1 3 4 1 3 6 1 3 9 1 5 3 i 5 4 1 5 6 L57
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3 N o t r e t r a v a i ' l c o n c e r n e l e d é v e l o p p e m e n t d ' u n b i o c a p t e u r à a l g u e s i m m o b . i l ' i s é e s s u r u n e m e m b r a n e p o u r l e c o n t r ô l e d e t o x i c i t é d e s e a u x . N o u s a v o n s é t u d i é d a n s u n p r e m i e r t e m p s l ; f a i s a b i l i t é e t ' l a s e n s i b i l i t é d ' u n s y s t è m e d e c o n f i g u r a t i o n t r è s s i m p l e , a p p l i c a b l e a u ' l a b o r a t o i r e e t p e r m e t t a n t d e m e s u r e r ' l ' a c t i v i t é p h o t o s y n t h é t i q u e d ' a l g u e s u n i c e l l u l a i r e s u t i I i s é e s c o m m e i n d i c a t e u r d e f i m p a c t d e s p o 1 1 u a n t s h y d r i q u e s . D e u x p h é n o m è n e s t r a d u i s a n t I ' a c t i v'i té photosynthéti q u e c o n s é c u t i v e à u n e e x c i ta t i o n I u m i n e u s e , o n t é t é é t u d i é s e t a p p l i q u é s à ' l a r é a ' l i s a t i o n d e b i o c a p t e u r s : é m i s s i o n d ' u n f l u x d ' é l e c t r o n s e t p r o d u c t i o n d ' o x y g è n e . C e s e s s a i s o n t p e r m i s d e d é f i n ' i r l e t y p e d e b i o é l e c t r o d e s l e m i e u x a d a p t é a u c o n t r ô l e d e t o x i c i t é d e s e a u x . N o u s n o u s s o m m e s a t t a c h é s d a n s u n e d e u x i è m e é t a p e à é p r o u v e r l a f i a b i l i t é e t l ' i n t é r ê t d e c e s y s t è m e e t à c o m p a r e r s e s p e r f o r m a n c e s à c e l l e d e s m é t h o d e s d ' e s s a i s c o n v e n t i o n n e l ' l e s d é v e l o p p é e s a u ' l a b o r a t o ' i r e .
IÆS BIOCAPIEURS
- Défïnition
- Réactif biologique
1 . 1 D ê f i n i t l o n U n b i o c a p t e u r p e u t s e d é f i n i r c o m m e u n a p p a r e i l a n a l y t i q u e c o m p r e n a n t u n e c o m p o s a n t e b i o ' l o g i q u e s e n s ' i b l e é t r o i t e m e n t a s s o c ' i é e o u i n t é g r é e à u n d é t e c t e u r p h y s i q u e o u é l e c t r o c h i m i q u e a p p e l é T R A N S D U C T E U R . C e t a p p a r e ' i ' l v a r é p o n d r e à l a p r é s e n c e d ' u n c o m p o s é c h i m i q u e o u d ' u n e s é r i e d e c o m p o s é s e t t r a d u i r e r a p i d e m e n t s a c o n c e n t r a t i o n e n u n s i g n a l é l e c t r i q u e o u d ' i g i t a 1 ( 0 W E N e t T U R N E R , 1 9 8 7 ) . L a c o m p o s a n t e b i o l o g i q u e o u B I 0 C A T A L Y S E U R v a r e c o n n a l t r e l e c o m p o s é à d é t e c t e r a v e c u n e s p é c i f i c i t é e t u n e s e n s i b i l i t é q u i c a r a c t é r j s e r o n t l e s p e r f o r m a n c e s d u b i o c a p t e u r ( L O b J E , 1 9 8 5 ) . L e b i o c a t a l y s e u r e t l e t r a n s d u c t e u r d o i v e n t ê t r e e n c o n t a c t é t r o i t p o u r p r o d u i re , u n e r é p o n s e r a p i d e e t p l u s s e n s i b 1 e . U n e i m m o b i ' l i s a t i o n d u b i o c a t a l y s e u r s u r l e t r a n s d u c t e u r c o n s t i tu e I e m o y e n I e p 1 u s e f f i c a c e p o u r a s s o c i e r c e s d e u x é l é m e n t s . L a r é a c t i o n e n t r e ' l ' é l é m e n t b i o l o g i q u e e t 1 e c o m p o s é à d é t e c t e r p e u t ê t r e m e s u r é e e n s u i v a n t l a p r o d u c t i o n o u l a c o n s o m m a t i o n d ' u n d e s é l é m e n t s d e l a r é a c t i o n c h i m i q u e r é s u l t a n t e t e l q u e , 0 2 , N H + , H Z } Z . E l l e p e u t é g a l e m e n t e n t r a l n e r u n c h a n g e m e n t d e c o u l e u r , I ' u t i l i s a t ' i o n d ' u n c o f a c t e u r ( N A D , A T P . . . ) , ' l a p r o d u c t i o n o u l a c o n s o m m a t i o n d e c h a l e u r o u ' l e t r a n s f e r t d ' é ' l e c t r o n s d ' u n e r é a c t i o n d ' o x y d o - r é d u c t i o n ( M c C A N N , 1 9 8 7 ) . C e t é v é n e m e n t v a ê t r e t r a n s c r i t e n u n s i g n a l p a r l e t r a n s d u c t e u r . C e t t e t r a n s f o r m a t i o n p e r m e t d ' e n r e g i s t r e r e t d e q u a n t i f i e r a i s é m e n t l a r é p o n s e o b t e n u e ( C f f i g u r e 1 ) . L ' o r i g i n e d e s b i o d é t e c t e u r s r e m o n t e à 1 9 6 2 l o r s q u e C L A R K e t L Y O N S o n t p r o p o s é I ' i m m o b i I i s a t i o n d ' e n z y m e s à 1 ' e x t r é m i t é d ' u n e é l e c t r o d e à o x y g è n e . C e p r e m i e r s y s t è m e a é t é m i s a u p o i n t p o u r l e s u i v i d u c h a n g e m e n t d e l a p r e s s ' i o n p a r t ' i e 1 l e d ' o x y g è n e d a n s ' l e s a n g r é s u ' l t a n t d e I ' o x y d a t i o n c a t a ' l y t ' i q u e d u g l u c o s e p a r l a g l u c o s e o x y d a s e .
P R O D U I T
R é a c t i o n s p é c i f i q u e
R e c o n n a i s s a n c e
b i o l o g i q u e
L i a i s o n é t r o i t e
g é n é r a ' l d ' u n b i o c a p t e u r ( d ' a p r è s H I G G I N S e t L 0 W E , L 9 8 7 i 1 9 8 8 ) .A D E T E C T E R
1
I
F i q u r e 1 : S c h é m a S C H M I D e t K A R U B E . .7 D e p u i s c e p r e m i e r d é t e c t e u r d e n o m b r e u x t r a v a u x o n t é t é p u b l i é s p r o p o s a n t d e s a s s o c i a t i o n s v a r i é e s e n t r e b i o c a t a ' l y s e u r s e t t r a n s d u c t e u r s . L e t a b ' l e a u I r é s u m e l e s p r i n c i p a l e s c o m p o s a n t e s p o u v a n t ê t r e u t i l i s é e s p o u r c o n s t r u i re u n b ' i o c a p t e u r . T a b l e a u I : P r i n c i p a u x é l é m e n t s p o u v a n t ê t r e u t i I i s é s p o u r I a f a b r i c a t i o n d ' u n b i o c a p t e u r ( d ' a p r è s T U R N T R e t a l . , 1 9 8 7 e t C O U G H L A N e t a l . , 1 9 8 8 ) . E ' l é m e n t s b i o ' l o g i q u e s T ra n s d u c t e u r s m i c r o - o r g a n i s m e s ( b a c t é r i e s , a l g u e s ) t i s s u c e ] l u l a i r e ( a n i m a l . v é g é t a l ) c e l l u l e o r g a n i t e s c e l l u l a i r e s m e m b r a n e s e n z y m e s a n t i c o r p s r é c e p t e u r s a n t i g è n e s a c i d e s n u c l é i q u e s E l e c t r o c h i m i q u e s : . p o t e n t i o m é t r i q u e s ( é l e c t r o d e s s p é c i f i q u e s N H 1 , C 0 t , p H , F -F . E . T . I . S . -F . E : T ) -. a m o é r o m é t r i q u e s ( é l e c t r o d e s à 0 2 , m é t a l l i q u e s , s y s t è m e s à m E d i a t e u r s ) O p t i q u e s : ( f i b r e s o p t i q u e s , p h o t o d i o d e s ) C a 1 o r i m é t r i q u e s : ( t h e r m i s t ô n c e , c a l o r i m è t r e ) l ' l é c a n i q u e s : ( m e s u r e d e c h a n g e m e n t d e m a s s e , c r i s t a l p i é z o -é 1 e c t r i q u e ) A u r e g a r d d e s t r a v a u x p u b f i é s , I ' u t ' i l i s a t i o n d ' u n e d é t e c t ' i o n é l e c t r o c h ' i m i q u e ( p o t e n t i o m é t r i q u e o u a m p é r o m é t r i q u e ) r e s t e a c t u e l l e m e n t p r é d o m i n a n t e p o u r l a r é a l i s a t i o n d e b i o c a p t e u r s . M a i s l e s c a p t e u r s o p t i q u e s s e d é v e l o p p e n t ra p i d e m e n t d u f a i t d e s p r o g r è s r é c e n t s d a n s l a t e c h n o l o g ' i e d e s f i b r e s o p t i q u e s ; l e d o m a i n e d ' a p p l ic a t i o n d e t e l s t r a n s d u c t e u r s o u o p t r o d e s e s t v a s t e p u i s q u e c e s é 1 é m e n t s p e r m e t t e n t d e q u a n t i f i e r d e s r é a c t i o n s b i o ' l u m i n e s c e n t e s . c h i m i l u m i n e s c e n t e s o u m e s u r e r u n e é m i s s i o n f ' l u o r e s c e n t e . A i n s i T R E T T N A K e t W 0 L F B E I S ( 1 9 8 9 ) o n t p r o p o s é u n c a p t e u r p e r m e t t a n t l a m e s u r e d u l a c t a t e e n i m m o b i l i s a n t u n e e n z y m e . 1 a l a c t a t e m o n o o x y g é n a s e , à l ' e x t r é m ' i t é d e f i b r e s o p t i q u e s . L a r é a c t i o n e n z y m e -s u b -s t r a t e n t r a i n e u n e c o n -s o m m a t i o n d ' o x y g è n e q u i e s t q u a n t i f i é e p a r u n e m o d i f i c a t i o n d e ' l a f l u o r e s c e n c e d ' u n e s u b s t a n c e c o l o r é e , m ô i n t e n u e a u c o n t a c t d u b i o c a t a ' l y s e u r e t s e n s i b l e a u x v a r i a t i o n s d e l a p r e s s i o n p a rt ' i e l I e e n o x y g è n e .
1 . 2 . 1 T e c h n i q u e s d ' i m m o b i l i s a t i o n P o u r q u ' u n b i o d é t e c t e u r s e r é v è l e s e n s i b ' l e e t r é p o n d e t r è s r a p i d e m e n t , i l f a u t m a i n t e n i r ' l a c o m p o s a n t e b i o ' l o g i q u e a u c o n t a c t d u t r a n s d u c t e u r . C e t t e a s s o c i a t i o n d o i t ê t r e r é a l i s é e d e m a n i è r e à n e p a s e n t r a v e r l ' i n t e r a c t i o n b i o c a t a l y s e u r - p r o d u i t à d é t e c t e r ( C O U G H L A N e t a l . , 1 9 8 8 ) . P l u s i e u r s m é t h o d e s d ' i m m o b i I i s a t i o n , c o n f o r m e s à c e s e x i g e n c e s , o n t é t é d é v e l o p p é e s . L e c h o i x d e l a m é t h o d e d é p e n d s u r t o u t d e l a n a t u r e d u m a t é r i e l b i o l o g i q u e à i m m o b i ' l i s e r . I l c o n v i e n t n é a n m o i n s d e p r e n d r e e n c o m p t e 1 e t y p e d e t r a n s d u c t e u r e t I ' e n v i r o n n e m e n t d a n s l e q u e l l e b i o c a p t e u r v a ê t r e a p p e l é à f o n c t i o n n e r . I ' l e x i s t e q u a t r e t e c h n i q u e s p r i n c i p a ' l e s d ' i m m o b i l i s a t i o n ( K E N N E D Y e t C A B R A L , 1 9 8 3 ) : ' l 'a b s o r p t i o n , t e c h n i q u e l a p l u s s i m p l e q u ' i m e t e n i e u u n i q u e m e n t d e s i n t e r a c t i o n s d e f a i b l e é n e r g i e e n t r e l e s u p p o r t e t l e b i o c a t a l y s e u r : i l s ' a g i t d ' u n s ' i m p 1 e p h é n o m è n e d ' a t t r a c t i o n p h y s i q u e , l e c o u p l a g e c o v a ' l e n t ( o u c o v a l e n t - b i n d i n g ) q u i I i e d e m a n i è r e q u a s i m e n t ' i rr é v e r s i b l e I e m a t é r i e l b i o 1 o g i q u e s u r u n s u p p o r t p r é a 1 a b ' l e m e n t a c t i v é ( c r é a t i o n d e l i a i s o n d i r e c t e d e n a t u r e c h i m i q u e ) . 0 n d i s t i n g u e 2 p r i n c i p a u x t y p e s d e s u p p o r t s s e l o n l e u r n a t u r e , i n o r g a n i q u e s ( v e r r e , q u a r t z , c é r a m i q u e , a l u m i n e . . . ) e t o r g a n i q u e s ( n y 1 o n , c o l l a g è n e , . . . ) . l a r é t i c u l a t i o n ( o u c r o s s l i n k i n g ) q u i m e t e n j e u d e s r é a c t i f s b i f o n c t i o n n e l s t y p e g 1 u t a r a ' l d é h y d e , ' l 'i n c l u s i o n d a n s u n g e 1 o u e n t r a p m e n t ( a ' l g ' i n a t e , p o ' l y a c r y l a m i d e ) C e s t e c h n i q u e s , r n i s e s a u p o i n t i n i t i a ' l e m e n t p o u r l ' i m m o b ' i l i s a t i o n d e s e n z y m e s , o n t é t é a p p l i q u é e s p a r l a s u i t e à l a f i x a t i o n d e s c e l l u l e s .
9 L ' a d s o r p t i o n e t I ' i n c l u s i o n s o n t l e s p r o c é d é s 1 e s p l u s u t i l i s é s p o u r I ' i m m o b i ' l i s a t i o n d e s c e l l u l e s c a r c e s t e c h n ' i q u e s s o n t m o i n s a g r e s s i v e s q u e ' l e c o u p l a g e c o v a ' l e n t o u I a r é t i c u l a t i o n q u ' i m e t t e n t e n j e u d e s a g e n t s t r è s r é a c t i f s c a p a b l e s d e m o d i f i e r l ' i n t é g r i t é d e l a c e 1 l u l e e t d o n c d e c o m p r o m e t t r e I a v i a b i I i t é c e l ' l u l a i r e . C o m p t e t e n u d e 1 ' a p p 1 i c a t i o n p a r t i c u l i è r e d e c e s b i o é l e c t r o d e s a ' l g a l e s à ' l a m e s u r e g l o b a l e d e ' l a t o x i c i t é d e s e a u x . l a t e c h n i q u e d ' i n c ' l u s i o n d u b i o c a t a ' l y s e u r d a n s d e s g e 1 s n e s e m b l e p a s a p p r o p r i é e . E n e f f e t , ' l e g e l v a c r é e r u n e b a r r i è r e s u p p l é m e n t a i r e a u t r a n s f e r t d e m a s s e e n t r e l a c e l l u l e e t I ' e n v i r o n n e m e n t f i q u i d e e x t e r n e . A i n s i , H A R P E R ( 1 9 8 6 ) a m o n t r é q u e l ' i m m o b i ' l i s a t i o n d e C h l o r e l l a d a n s 1 ' a l g i n a t e ( p o l y m a n n u r o n a t e ) p r o t è g e a i t l e s c e l l u ' l e s d e l a t o x i c i t é d e s m i c r o p o l l u a n t s m é t a l l i q u e s . L e g e ' l , r i c h e e n g r o u p e m e n t p o l a i r e s ( h y d r o x y l e s e t c a r b o x y ' l e s ) , v a f i x e r l e s c a t i o n s m é t a l l i q u e s , f a i r e o b s t a c l e à l e u r p é n é t r a t i o n e t à l e u r d i f f u s i o n j u s q u ' a u x o r g a n i s m e s b i o l o g i q u e s . D e s t r a v a u x r é a l i s é s p a r T H A R R E A U ( 1 9 9 0 ) s u r l a b i o s o r p t i o n d u c a d m i u m p a r d e s a l g u e s d a n s 1 ' a l g i n a t e i n d i q u e n t q u e l a f i x a t i o n d u c a d m i u m p a r c e s b ' i l le s d ' a l g i n a t e e s t t r è s é l e v é e ; c e s e s s a ' i s n ' o n t p a s m o n t r é d e m o d i f i c a t ' i o n d e c a p a c i t é d ' a d s o r p t ' i o n e n t r e ' l e s b i l l e s t é m o i n s e t l e s b i l l e s e n s e m e n c é e s p a r d e s c e ' l l u l e s a 1 g a 1 e s . C e c ' i c o n f i r m e q u e l e g e l , d e p a r s a n a t u r e , ' l i m i t e ' l a d i f f u s i o n d u c a d m i u m à ' l '' i n t é r i e u r d e s b i l l e s e t I e c o n t a c t , d u m é t a ' l a v e c I e s a I g u e s . C e t t e m é t h o d e d ' i m m o b i ' l i s a t i o n d e s a l g u e s d a n s d e s g e l s e s t p i u s p a r t i c u l ' i è r e m e n t u t i ' l i s é e p o u r l a p r o d u c t i o n d e d i f f é r e n t s m é t a b o l i t e s . A i n s i , M U S G R A V E e t a 7 . ( 1 9 8 2 ) o n t i m m o b i l j s é A n a b a e n a ( c y a n o b a c t é r i e ) p o u r p r o d u i r e d e I ' a m m o n i a q u e . D e m ê m e G R I Z E A U e t N A V A R R 0 ( 1 9 8 6 ) o n t o b t e n u u n e p r o d u c t i o n d e g l y c é r o 1 à p a r t i r d e D u n a l f e l I a t e r t i o l e c t a i m m o b i I i s é e d a n s ' l 'a 1 g ' i n a t e . S e u l e ' l a t e c h n i q u e d ' i m m o b i ' l i s a t i o n d e s a l g u e s u n i c e l l u ' l a i r e s p a r a d s o r p t ' i o n s e m b l e a p p ' l i c a b ' l e à l a r é a l i s a t ' i o n d e b i o c a p t e u r s u t i l i s a n t d e s c e ' l l u l e s e n t i è r e s . L e s t r a v a u x c o n c e r n a n t l e s b i o d é t e c t e u r s a p p l i q u é s à l a m e s u r e d e s t o x i q u e s r e p r e n n e n t c e p r o c é d é d ' i m m o b i l i s a t i o n . A i n s i , K A R U B E e t a l . ( 1 9 8 1 ) o n t r é a l i s é u n e é l e c t r o d e d o n t ' l e b i o c a t a l y s e u r E a c f l l u s s u b s t i I i s e s t i m m o b i I i s é p a r f i I t r a t i o n s u r u n e m e m b r a n e d ' a c é t a t e d e
c e l I u l o s e p o r e u s e p o u r I ' é v a 1 u a t i o n c h i m i q u e s . L ' é l e c t r o d e m i s e a u p o i n t P a r m e s u r e d e s m i c r o p o l I u a n t s m é t a ' l ' l i q u e s E s c h e r f c h f a c o l i m a i n t e n u a u c o n t a c t m e m b r a n e n u c l é o p o r e ( p o r o s i t é 0 , 4 5 p m ) . d e l a m u t a g é n ' i c i t éd e s c o m p o s é s D e m ê m e R A W S O N e t c o l l a b o r a t e u r s ( 1 9 8 7 ) o n t a p p l i q u é u n e t e c h n i q u e i d e n t i q u e d e f i x a t i o n d e s c y a n o p h y c é e s p o u r l e u r s y s t è m e d e d é t e c t ' i o n d e s h e r b i c i d e s d a n s l e s e a u x d e s t i n é e s à 1 a p o t a b i l i s a t i o n . L . 2 . 2 C h o i x d u r é a c t i f b i o l o q i q u e D a n s l e c a d r e d u c o n t r ô l e t o x i c o l o g i q u e , l e c h o i x d u r é a c t i f b i o ' l o g i q u e v a ê t r e f o n c t i o n d u r ô l e q u e ' l 'o n v a a t t r i b u e r a u c a p t e u r : d é t e c t i o n s p é c i f i q u e o u g ' l o b a l e d e s m i c r o p o l l u a n t s . D e s m a c r o m o l é c u l e s , c o m m e d e s e n z y m e s o u d e s a n t i c o r p s , s e r o n t d e s b i o c a t a l y s e u r s s ' a p p l i q u a n t p a r t ' i c u l i è r e m e n t à ' l a r e c h e r c h e d ' u n e c l a s s e d é f i n i e d e p o 1 ' l u a n t s : m i s e e n é v i d e n c e , p a r e x e m p l e , d e s c o m p o s é s o r g a n o p h o s p h o r é s o u d e s c a r b a m a t e s p a r i n h i b i t i o n d e l a c h o l i n e s t é r a s e ( W O L F B E I S e t K O L L E R , 1 9 8 9 ) . L e s b i o d é t e c t e u r s c e l I u l a i r e s s o n t m o i n s s p é c i f i q u e s q u e I e s é l e c t r o d e s à e n z y m e s m a i s p r é s e n t e n t u n s p e c t r e d e s e n s i b i ' l i t é b e a u c o u p p l u s ' l a r g e : p r o p r i é t é i n d i s p e n s a b l e p o u r é v a l u e r l a t o x i c i t é d ' u n e f f l u e n t m u I t i c o m p o s i t e . C e s b ' i o c a p t e u r s c e l I u ' l a i r e s c o n s t i tu e n t . e n e f f e t , d e s s y s t è m e s i n t é g r a n t u n e n s e m b l e d e r é a c t i o n s m é t a b o l i q u e s c o n t r a i r e m e n t a u x é l e c t r o d e s à e n z y m e s s p é c i f i q u e s d ' u n s c h é m a r é a c t i o n n e ' 1 . I ' l s p r é s e n t e n t u n d e g r é i m p o r t a n t d e s t a b ' i I i t é e t s o n t d e s u n i té s a u t o n o m e s c o n f i n a n t l e u r s y s t è m e m é t a b o l i q u e d a n s u n e n v i r o n n e m e n t p r o t é g é ( RAI'JSON, 1988 ) . L a p r é p a r a t i o n d e s r é a c t i f s c e ' l l u l a i r e s e s t p e u o n é r e u s e c o m p a r é e à c e l l e d e s e n z y m e s d o n t l e c o 0 t d ' e x t r a c t i o n e t d e p u r i f i c a t i o n e s t é l e v é ( F R E W e t H I L L , 1 9 8 7 ) . E n r e v a n c h e , le u r t e m p s d e r é p o n s e e s t e n g é n é r a 1 p l u s ' l o n g ; l a p a r o i e t l e s m e m b r a n e s c e l ' l u l a i r e s c o n s t i t u e n t d e s b a r r i è r e s s u p p l é m e n t a i r e s e n t r e l e c o m p o s é à a n a l y s e r e t l e s s y s t è m e s r é a c t i f s i n t r a c e l l u ' l a i r e s . M a i s e n r é d u j s a n t l e b i o c a t a l y s e u r à u n e c o u c h e m o n o c e l ' l u ' l a i r e , i l e s t p o s s i b l e d e m i n i m i s e r c e t i n c o n v é n i e n t ( R A W S O N , 1 9 8 8 ) . D O R W A R D e t B A R I S A S ( 1 9 8 4 ) p o u r l a u t i I i s e c o m m e m a t é r i e l b i o ' l o g i q u e d u t r a n s d u c t e u r p a r f i I t r a t i o n s u r
1 1 1 .3 A o p ' l i c a t i o n s d e s b i o d é t e c t e u r s C e t t e t e c h n i q u e d e s b i o c a p t e u r s a c o n n u d u r a n t ' l e s a n n é e s 8 0 . C O U G H L A N e t c o l l a b o r a t e u r s d e 7 5 0 p u b l i c a t i o n s e n t r e 1 9 8 0 e t 1 9 8 6 d é c r i v a n t s o u v e n t u n e a s s o c i a t i o n b i o c a t a ' l y s e u r - t r a n s d u c t e u r n o n d é t e c t é p a r c e t t e t e c h n i q u e p r é c é d e m m e n t . 1 . 3 . I D o m a i n e m é d i c a l D a n s le d o m a ' i n e m é d ' i c a l . le b e s o i n d é v e l o p p e r d e s b i o c a p t e u r s e n c o r e p l u s s e n s i b i l i t é e t s t a b i l i t é . L e s r e c h e r c h e s m i s e a u p o i n t d e c a p t e u r s m e s u r a n t i n p r é s e n t s n o t a m m e n t l a q u a n t i t é d e g l u c o s e R E A C H , 1 9 8 8 ) . u n e s s o r t r è s ' i m p o r t a n t ( 1 9 8 8 ) o n t d é n o m b r é p l u s d e s b ' i o c a p t e u r s e t t r è s s p é c i f i q u e d ' u n p r o d u i t s e f a ' i t d e p l u s e n p ' l u s g r a n d d e p e r f o r m a n t a u p 1 a n s p é c i f i c i t é , à c o u r t t e r m e s o n t a x é e s v e r s 1 a v i v o ' l a q u a n t i t é d e m é t a b o l i t e s c h e z l e s d i a b é t i q u e s ( T H E V E N O T e t L e s r e c h e r c h e s c o n c e r n a n t ' l e s b i o c a p t e u r s s e s o n t o r i e n t é e s p r i n c i p a l e m e n t v e r s l e d o m a i n e p h a r m a c e u t i q u e e t m é d i c a l . D e n o m b r e u x d é t e c t e u r s s o n t c a p a b l e s d ' e f f e c t u e r l a m e s u r e d u g ' l u c o s e s a n g u i n , d e s c a r b o h y d r a t e s a i n s i q u e l a c o n c e n t r a t ' i o n e n m é t a b o l i t e s , h o r m o n e s , d r o g u e s d a n s l e s a n g o u d a n s l e s u r i n e s . D e s c a p t e u r s à g l u c o s e , s u c r o s e , ' l a c t o s e , m a ' l t o s e , g a I a c t o s e , u r é e , c r é a t i n i n e , a c i d e u r i q u e , a s c o r b a t e , a l c o o l o u a s p a r t a t e s o n t c o m m e r c i a ' l e m e n t d i s p o n i b ' l e s ( Y e l l o w S p r i n g I n s t r u m e n t C o , F u j i E l e c t r o n i c , P r o v e s t a e t F i a t r o n , T a c u s s e l . . . ) . D e s e n z y m e s a s s o c i é e s à d e s d é t e c t e u r s d e t y p e é l e c t r o c h i m i q u e : s o n d e s à 0 Z , H Z Q Z , N H 3 o u C 0 Z . c o n s t i t u e n t l a s t r u c t u r e d e c e s a n a l y s e u r s ( G U I L B A U L T e t L U O N G , 1 9 8 9 ) . I l n ' e x i s t e p a s a c t u e l le m e n t , a u s t a d e c o m m e r c i a l , d e c a p t e u r s i n t é g r a n t d e s t r a n s d u c t e u r s d e t e c h n o l o g i e p 1 u s r é c e n t e c o m m e d e s d é t e c t e u r s à f i b r e s o p t i q u e s o u à c r i s t a u x p i é z o -é ' l e c t r i q u e s . C A M P A N E L L A e t T O M A S S E T T I ( 1 9 8 9 ) o n t r e c e n s é d e s b i o é l e c t r o d e s p e r m e t t a n t l a d é t e r m i n a t i o n d e l a p é n i c i l l i n e . d u c h o l e s t é r o l , d e I ' a c i d e a c é t i q u e e t d e l a l y s i n e . C e s m ê m e s a u t e u r s o n t m i s a u p o i n t d e s s y s t è m e s d é t e c t a n t I ' a c i d e o x a l i q u e d a n s l e s u r i n e s a i n s i q u e 1 e p l o m b d a n s l a b i l e .
1 . 3 . 2 D o m a i n e a l i m e n t a i r e e t d e l a n u t r i t i o n L e s t e c h n i q u e s d e d é t e c t i o n d u g l u c o s e o n t é t é a d a p t é e s e t u t i l i s é e s p o u r m e s u r e r ' l a t e n e u r d e c e c o m p o s é d a n s I e s p r o d u ' i t s a l i m e n t a i r e s : b o i s s o n s , m i e l s , k e t c h u p s o u c o n f i t u r e s ( L E M A R R E C E T L E S G A R D S , 1 9 9 0 ) . D ' a u t r e s a x e s d e d é v e ' l o p p e m e n t o n t f a i t l ' o b j e t d e r e c h e r c h e s e n a g r o - a l i m e n t a i r e e t e n n u t r i t i o n : m e s u r e d e ' l a t e n e u r e n v i t a m i n e s , a c i d e s a m i n é s , a g e n t s m i c r o b i e n s . L ' é v a l u a t i o n d e I a t e n e u r e n é t h a n o l d e b o i s s o n s à f a i b ' l e d e g r é d ' a l c o o l o u s a n s a ' l c o o l e s t u n e x e m p l e d ' a p p l i c a t i o n s p é c i f iq u e d e ' l a t e c h n i q u e d e s b i o c a p t e u r s ( C O U G H L A N e t a l . . 1 9 8 8 ) . I ' l e x i s t e é g a l e m e n t d e s a p p l i c a t i o n s p o t e n t i e ' l l e s p o u r l a m e s u r e d e s a g e n t s c o l o r a n t s , é m u l s i f i a n t s , a g e n t s d e s a v e u r o u a g e n t s p r é s e r v a t i f s ( c o n s e r v a t e u r s , a n t i o x y d a n t s , a n t i m i c r o b i e n s ) d a n s l e s a l i m e n t s . L a t e n e u r e n t r i m é t h y l a m i n e , h y p o x a n t h i n e e t i n o s i n e s o n t d e s i n d i c a t e u r s d e l a f r a l c h e u r d u p o ' i s s o n q u i o n t é t é m i s à p r o f i t p o u r l a r é a ' f i s a t i o n d e b i o c a p t e u r s ( W A T A N A B E e t a l . , 1 9 8 4 ) . P l u s r é c e m m e n t ' l a f i r m e 0 r i e n t a ' l E l e c t r i c a c o m m e r c i a ' l ' i s é u n c a p t e u r p o u r é v a l u e r l a f r a l c h e u r d u p o i s s o n e n s u i v a n t I ' é v o ' l u t i o n d u m é t a b o l i s m e d e ' l a p u r i n e p a r ' l ' i n t e r m é d i a i r e d ' u n e é l e c t r o d e à o x y g è n e . 1 . 3 . 3 C o n t r ô l e d e s f e r m e n t a t i o n s e t d e s b i o r é a c t e u r s i n d u s t r i e l s L e s b i o c a p t e u r s t r o u v e n t é g a l e m e n t d e s a p p l i c a t i o n s a u n i v e a u d e s b i o r é a c t e u r s p o u r l e c o n t r ô l e d e s f e r m e n t a t i o n s . L e s p o s s i b i l i t é s d e m e s u r e e n c o n t j n u d e p a r a m è t r e s te l s q u e : é v a l u a t i o n d e l a m a s s e c e l l u l a i r e , c o n s o m m a t i o n d e l a m a t i è r e c a r b o n é e o u a z o t é e e t m e s u r e d e s p r o d u i t s d e f e r m e n t a t i o n p e r m e t t e n t d e c o n t r ô l e r d e m a n i è r e p 1 u s s a t i s f a i s a n t e e t d ' o p t i m i s e r I ' é v o l uti on des réacti ons dans I es fermenteurs . A ' i n s i E s c h e r i c h i a c o l i i m m o b i I i s é e a u c o n t a c t d ' u n e é l e c t r o d e p o t e n t i o m é t r i q u e e s t u t i ' l i s é e p o u r s u i v r e ' l 'é v o l u t i o n d e ' l a f e r m e n t a t i o n e n c o n t r ô l a n t I a t e n e u r e n a c i d e g l u t a m i q u e (R I E D E L e t a l . 1 9 8 9 ) .
t_3 1 . 3 . 4 C o n t r ô ' l e d e l a q u a l i t é d e l ' E n v i r o n n e m e n t e t b i o c a o t e u r s a p p ' l i q u é s a u x c o n t r ô ' l e s d e t o x i c i t é S C H M I D e t K A R U B E ( 1 9 8 8 ) o n t r é p e r t o r i é 3 a x e s p r i n c i p a u x d e d é v e l o p p e m e n t d e s b i o c a p t e u r s d a n s l e d o m a i n e d e I ' e n v i r o n n e m e n t : - d é t e c t i o n d e p o l l u a n t s c o u r a m m e n t r e t r o u v é s d a n s l ' e n v i r o n n e m e n t t e l q u e n i t r a t e s , p h o s p h a t e s . . . , l e s u i v i d e p a r a m è t r e s g l o b a u x c o m m e l a d e m a n d e b i o c h i m i q u e e n o x y g è n e p o u r m e s u r e r ' l a c h a r g e e n m a t i è r e o r g a n i q u e , l ' é v a ' l u a t i o n d u c a r a c t è r e t o x i q u e o u m u t a g è n e d e c o m p o s é s c h i m i q u e s . M A T S U N A G A e t c o l I a b o r a t e u r s ( 1 9 8 4 ) o n t p r o p o s é I ' i m m o b i I i s a t i o n d e C h l o r e l l a v u l g a r i s à l ' e x t r é m i t é d ' u n e é l e c t r o d e à o x y g è n e a f i n d e m e s u r e r ' l a c o n c e n t r a t i o n d e s p h o s p h a t e s d a n s ' l e s e a u x . M a i s I a I i m i te d e d é t e c t i o n d ' u n t e l d i s p o s i t i f n e d e s c e n d p a s a u d e s s o u s d e I m M ( s o i t 6 4 0 m g / 1 ) . D e p l u s 1 ' a p p a r e i l l a g e n ' e s t p a s a d a p t é à u n e u t i l i s a t i o n i n s i t u . R I E D E L e t c o ' l ' l a b o r a t e u r s ( 1 9 8 9 ) r a p p o r t e n t q u e d e s c a p t e u r s à m j c r o -o r g a n i s m e s o n t é t é p r o p o s é s p o u r l e d o s a g e d e s n i t r a t e s e t d e s n i t r i t e s . A i n s i , K A R U B E e t a l . ( 1 9 8 3 ) o n t r é a l i s é u n e s o n d e p o u r 1 a d é t e r m i n a t i o n d e s n i t r i t e s d a n s 1 ' a t m o s p h è r e e n e m p l o y a n t N i t r o b a c t e r s p i m m o b i I i s é a u c o n t a c t d ' u n e é l e c t r o d e à o x y g è n e . K A R U B E e t T A M I Y A ( 1 9 8 7 ) ' i n d i q u e n t ' l 'e x i s t e n c e d ' u n c a p t e u r à m i c r o s o m e s d e f o i e d e r a t p o u r 1 a d é t e r m ' i n a t i o n d e s s u l f i t e s . L e s y s t è m e d e d é t e c t i o n e s t b a s é s u r l a r é a c t i o n d ' o x y d a t i o n d e s s u l f i t e s e n s u l f a t e s r é a c t i o n q u i v a c o n s o m m e r d e 1 ' o x y g è n e . L a m i s e a u p o i n t d e c a p t e u r s m e s u r a n t l a d e m a n d e b i o c h i m i q u e e n o x y g è n e ( D 8 0 ) a f a i t I ' o b j e t d e n o m b r e u x t r a v a u x . C e p a r a m è t r e r e s t e , m a l g r é s o n c a r a c t è r e a s p é c i f i q u e , 1 e p l u s c o u r a m m e n t u t i l i s é p o u r l a m e s u r e d e l a p o l l u t i o n o r g a n i q u e . L e p r e m ' i e r b i o d é t e c t e u r d a n s c e d o m a i n e a é t é d é c r i t e n I 9 7 7 p a r K A R U B E e t c o l l a b o r a t e u r s . C l o s t r f d f u m e s t i m m o b i l i s é a u c o n t a c t d ' u n e é l e c t r o d e à o x y g è n e : c e s y s t è m e p e r m e t d e s u i v r e l a c o n s o m m a t i o n d ' Q Z d e s m i c r o - o r g a n i s m e s c o r r e s p o n d a n t à ' l a m e s u r e d e l a b i o d é g r a d a t i o n ( g l u c o s e e t g 1 u t a n a t e ) . P l u s r é c e m m e n t u n e m e i I I e u r e
r e p r o d u c t i b i ' l i t é e t u n e d i m i n u t i o n d u t e m p s d e r é p o n s e o n t é t é o b t e n u e s e n r e m p l a ç a n t C l o s t r i d i u m p a r T r i c h o s p o r o n c u t a n e u m ( H I K U M A e t a l . , I 9 7 9 ) . D ' a u t r e s o r g a n i s m e s o n t é t é t e s t é s t e l q u e S a c c h a r o m y c e s e t E a c f l l u s . L e c a p t e u r d é v e l o p p é a v e c T r i c h o s p o r o n a é t é c o m m e r c i a l i s é e t e s t e n c o u r s d e s t a n d a r d i s a t ' i o n a u J a p o n . L a r e c h e r c h e d e b i o c a p t e u r s p o u r ' l e s c o n t r ô l e s d e t o x i c i t é r e s t e e n c o r e li m i t é e , s i ' l 'o n s e r é f è r e à l ' e n s e m b l e d e s t r a v a u x p u b ' l i é s d a n s c e d o m a i n e . L e s p r i n c i p a l e s d o n n é e s b i b l i o g r a p h i q u e s , c o n c e r n a n t la d é t e c t i o n d e s t o x i q u e s , s o n t r é s u m é e s d a n s l e t a b l e a u I I c i - d e s s o u s . T a b ' l e a u I I : B i o d é t e c t e u r s a p p f i q u é s à l a m e s u r e d e s t o x i q u e s . B i o c a t a ' l y s e u r s ( r é f é r e n c e s ) T ra n s d u c t e u r s T o x i q u e s C o n c e n t r a t ' i o n c h o l i n e s t é r a s e ( 1 ) c o l o r i m é t r i e p e s t i c i d e s
0 . 1 / 1 0 m s / l
c h o l i n e s t é r a s e ( 2 ) é l . p l a t i n e p e s t i c i d e s 0 , I / 2 0 n g l l c h o l i n e - o x y d a s e , a c é t y l c h o l i n e s -t é r a s e ( 3 ) é l . p l a t i n e ( H 2 0 2 ) p e s t i c i d e s p a r ô o x o n a l d i c a r b e 0 , 0 1 / 0 . 1 m s / ' l c h o l i n e s t é r a s e ( 4 ) f i b r e o p t i q u e p h o t o d i o d e s ( c o l o r i m é t r i e ) p e s t i c i d e s 0 r g a n o -p h o s p h o r é s p a r a o x o n 0 , 0 0 5 m g / 1 B .s.
s u b t i l i s
t y p h i m u r i
u m
( 5 )
é là o z
p r o d u i t s m u t a g è n e s 2 1 2 0 n g / 1 E s c h e r f c h f a c o l f ( 6 )é't
. à c02
m i c r o p o l I u a n t s m é t a l l i q u e s0 , 1 3 /
1 , 5 m g / l
p h é n o l o x y d a s e ( 7 )é 1 . à 0 z
p h é n o l s0 , 6 / 6 n s / 1
S y n e c h o c o c c u s ( 8 ) +é l . c a r b o n em é d i a t e u r h e r b i c ' i d e s m i n 0 , 0 2 n g / l ( 1 ) S M I T H 1 9 8 5 ( 2 ) G 0 0 D S 0 N e t J A C O B S 1 9 7 4 ( 3 ) B E R N A B E I e t a l . 1 9 9 1 ( 4 ) W O L F B E I S e t K O L L E R 1 9 8 9 K A R U B E e t a l . 1 9 8 1 , 1 9 8 2 D0RbJAR0 et BARISAS 1984 HACHOLAN et SCHANEL L977 R A W S 0 N e t a l . 1 9 8 7 ( 5 ) ( 6 ) ( 7 ) ( 8 )1 5 D ' a u t r e s b i o c a p t e u r s a p p l i q u é s à I a m e s u r e d e s t o x i q u e s o n t é t é p r é s e n t é s a u n s e c o n d I n t e r n a t i o n a l t . l o r k s h o p o n B i o s e n s o r s , 1 9 8 9 n m a i s l e s r e c h e r c h e s r e s t e n t p o u r I ' i n s t a n t a u s t a d e d e s p r é l i m i n a i r e s . N O A C K e t c o ' l l a b o r a t e u r s (1 9 8 9 ) o n t m i s a u p o i n t u n c a p t e u r a u t o m a t i s é p e r m e t t a n t la d é t e c t i o n r a p i d e d e s h e r b i c i d e s d a n s I e s e a u x ( r i v i è r e s , I a c s e t e a u x u s é e s ) ; c e b ' i o d é t e c t e u r e s t b a s é s u r u n e m e s u r e d i f f é r e n t i e ' l ' l e d e f l u o r e s c e n c e d e c e l ' l u ' l e s a l g a l e s i n d u i t e p a r l e m o n u r o n e t ' l a f l u o r e s c e n c e d e ' l ' é c h a n t i l l o n . C e s a u t e u r s o n t o b t e n u p o u r u n e c o n c e n t r a t i o n d e 5 m g / l d ' i s o p r o t u r o n u n e m p o i s o n n e m e n t d e 9 9 % . D e m ê m e H I L P E R T e t a l . ( 1 9 8 9 ) o n t t r a v a i ' l l é a u d é v e ' l o p p e m e n t d ' u n c a p t e u r p o u r ' l a d é t e c t i o n d e s m i c r o p o l I u a n t s m é t a l 1 i q u e s . P l u s i e u r s a s s o c i a t i o n s b i o c a t a l y s e u r - t r a n s d u c t e u r s o n t é t é t e s t é e s ô v e c d e s p r o t é i n e s ( p h y t o c h é l a t i n e , m é t a l ' l o t h i o n é i n e s e t g ' l u t a t h i o n ) i m m o b i l i s é e s a u n i v e a u d e t r a n s i s t o r s à e f f e t d e c h a m p s , d e c r i s t a u x p i é z o - é ' l e c t r i q u e s o u d e d é t e c t e u r s o p t i q u e s . C e s p r o t é i n e s p o s s è d e n t I a p r o p r i é t é d e f o r m e r d e s g r o u p e m e n t s t h ' i o l s e n s e ' l i a n t a v e c I e s m é t a u x . D e p a r ' l e u r c o n c e p t i o n , l e s b i o c a p t e u r s s ' a d a p t e n t p a r f a i t e m e n t a u x c o n t r ô l e s d e t o x i c i t é d e s e a u x . L a m e s u r e e n t e m p s r é e l c o n v i e n t t o u t à f a i t à d e s e s s a i s e n d y n a m i q u e e t p e r m e t : d e s c o n t r ô l e s d e t o x i c i t é e n c o n t i n u , d e s c o n t r ô l e s i n s i t u , - u n e a u t o m a t i s a t i o n d e s s y s t è m e s d e d é t e c t i o n a i n s i c o n s t i t u é s , - l a m i s e e n p l a c e d e s y s t è m e s d ' a l e r t e e n c a s d e c h a r g e p o l l u a n t e a n o r m a l e m e n t é l e v é e . L e s s y s t è m e s p r o p o s é s , d a n s I a I i t t é r a t u r e , n e d é p a s s e n t p a s I e s t a d e d e l a b o r a t o i r e ; t r è s p e u s o n t e n u s a g e f n s f t u p o u r ' l e c o n t r ô l e d e s m i c r o p o ' l ' l u a n t s e t d e I e u r t o x i c i t é . L a n a t u r e m ê m e d u r é a c t i f b i o ' l o g i q u e p o u r r a i t e x p f iq u e r c e t t e d i f f i c u 1 t é à p a s s e r d ' u n s t a d e I a b o r a t o i r e à u n p i 1 o t e . E n e f f e t , I a s e n s i b i I i t é d e c e r é a c t i f v a ê t r e f o n c t i o n d e s c o n d i t i o n s d e p H ,
t e m p é r a t u r e , o x y g é n a t i o n e t f o r c e i o n i q u e d u m i ' l i e u n o t a m m e n t : p a r a m è t r e s q u i p e u v e n t v a r i e r r a p i d e m e n t f n s f t u . C e s p a r a m è t r e s , d é f i n i s d a n s I e s t e s t s s t a n d a r d i s é s d e ' l a b o r a t o i r e , d e v r o n t é g a l e m e n t ê t r e m a i n t e n u s à u n n i v e a u d é t e r m i n é d a n s l e s e s s a i s e f f e c t u é s à I ' a i d e d e b i o c a p t e u r s . C e c i i m p l i q u e d e r é g u 1 e r c e s p a r a m è t r e s d a n s l e f 1 u x à a n a l y s e r , a v a n t s o n p a s s a g e a u n i v e a u d e ' l a m e m b r a n e a c t i v e . L e b i o c a p t e u r , à p r o p r e m e n t p a r l e r d e v r a d o n c ê t r e a s s o r t i d e s y s t è m e s d e r é g u l a t i o n q u i v o n t c o m p l i q u e r I ' i n f r a s t r u c t u r e d e ' l ' a n a l y s e u r e t c o n s t i t u e r a u t a n t d e s o u r c e s p o s s i b l e s d e d y s f o n c t i o n n e m e n t .
CTIAPITNE
2
REACTIF BIOLOGIQTIE : I,ES ALGUES
- Activité photosynthétique
- Intérêt des algues unicellulaires pour l'évaluation de
la toxicité des milieux aquatiques
2 . 1 A c t i v i t é o h o t o s v n t h é t l q u e 2 . 1 . 1 R a p o e l s s u r I a p h o t o s v n t h è s e L e s a l g u e s u n i c e l ' l u l a i r e s s o n t r e c o n n u e s c o m m e é t a n t 1 e s p r o d u c t e u r s p r i m a i r e s d u m i ' l i e u a q u a t i q u e ( C O U T U R E e t a l . , 1 9 8 1 : P A R R I S H , 1 9 8 5 ) : e ' l I e s p o s s è d e n t d o n c u n e p l a c e p r i v i I é g ' i é e d a n s ' l e s é c o s y s t è m e s . L ' a c t i v i t é p h o t o s y n t h é t i q u e , c a r a c t é r i s t i q u e d e t o u s l e s v é g é t a u x , l e u r p e r m e t d e c a p t e r ' l 'é n e r g i e s o l a i r e e t d e ' l a t r a n s f o r m e r e n é n e r g i e c h i m i q u e . C e t t e t r a n s f o r m a t i o n s ' e f f e c t u e e n r é d u i s a n t ' l e C } Z p o u r f o r m e r d e s h e x o s e s s e l o n u n e r é a c t i o n g l o b a l e q u i v a l i b é r e r d e l ' o x y g è n e : n H 2 Q + n C 0 2 -) ( C H 2 0 ) n + n 0 2 R a p p e l o n s q u e l a p h o t o s y n t h è s e e s t c a r a c t é r i s é e p a r d e u x t y p e s d e r é a c t i o n s ; l e s r é a c t i o n s d i t e s " l u m i n e u s e s n q u i d é p e n d e n t d e ' l ' a b s o r p t i o n d e p h o t o n s e t I e s r é a c t i o n s d i t e s " s o m b r e s " q u i p e u v e n t s ' e f f e c t u e r e n I ' a b s e n c e d e l u m i è r e . L ' é n e r g i e ' l u m i n e u s e e s t u t i ' l i s é e d u r a n t l a p r e m i è r e p h a s e d e l a p h o t o s y n t h è s e , n o n s e u l e m e n t p o u r r é d u i r e l e N A D P + , m a i s a u s s i p o u r p h o s p h o r y l e r I' A O P . L e s p r o d u i t s f o r m é s A T P e t N A D P H 2 i n t e r v i e n n e n t d a n s l e s r é a c t ' i o n s d e b ' i o s y n t h è s e c e l l u ' l a i r e ( r é a c t i o n s n s o m b n e s n ) c o m m e c e 1 l e d e s g l u c i d e s à p a r t i r d u C 0 2 a u c o u r s d u c y c l e d e C a ' l v i n . 2 . 1 . 2 A o o a r e i I o h o t o s v n t h é t i o u e C h e z ' l e s c e l l u ' l e s e u c a r y o t e s . | ' a p p a r e ' i l p h o t o s y n t h é t i q u e e s t I o c a l j s é d a n s I e s c h 1 o r o p l a s t e s ; o n n e t r o u v e p a s , e n r e v a n c h e , c h e z I e s p r o c a r y o t e s p h o t o s y n t h é t i q u e s d ' o r g a n i te s d i f f é r e n c i é s , I e s c o m p o s a n t e s m o l é c u ' l a i r e s d u s y s t è m e p h o t o s y n t h é t i q u e s e s i t u a n t d a n s I a m e m b r a n e c e l ' l u l a i r e . L ' é n e r g i e ' l u m i n e u s e e s t c a p t é e e s s e n t i e ' l ' l e m e n t p a r I ' i n t e r m é d i a i r e d e l a c h l o r o p h y l l e ; l e s d e u x a u t r e s c a t é g o r i e s d e p i g m e n t s r e t r o u v é s c h e z l e s a l g u e s : p i g m e n t s c a r o t é n o ï d e s e t p h y c o b i I i n e s é t a n t d e m o i n d r e i m p o r t a n c e . h v
1 9 L e s m o l é c u l e s a b s o r b a n t e s s o n t r e g r o u p é e s e n a m a s d e p 1 u s i e u r s c e n t a i n e s d e m o ' l é c u l e s a p p e l é s a n t e n n e s . C h a q u e a n t e n n e v a s e r v ' i r d ' e n t o n n o i r p e r m e t t a n t d e c o ' l I e c t e r 1 ' é n e r g i e ' l u m i n e u s e e t d e I a d i r i g e r v e r s u n s e u l c e n t r e r é a c t i o n n e ' l . L e s p i g m e n t s p h o t o s y n t h é t i q u e s s o n t o r g a n i s é s e n d e u x e n s e m b l e s f o n c t i o n n e l s ( p h o t o s y s t è m e I e t I I ) q u i s o n t c o n n e c t é s à d e s c h a l n e s d e t r a n s p o r t d ' é l e c t r o n s c h e z l e s a l g u e s e u c a r y o t e s e t l e s c y a n o b a c t é r i e s . L e p h o t o s y s t è m e I , e x c i t é p a r u n q u a n t u m l u m i n e u x v a p e r m e t t r e l a r é d u c t i o n d e N A D P + ; 1 e p h o t o s y s t è m e I I ( c f f i g u r e 2 ) , a p r è s e x c i t a t i o n e t é m i s s i o n d ' é l e c t r o n s p o s s è d e u n c a r a c t è r e o x y d a n t s u f f i s a m m e n t im p o r t a n t p o u r d i s s o c i e r l e s m o ' l é c u l e s d ' e a u ( K A T Z , 1 9 8 8 ) .
stRofrtA
TUMEN
R e a c t i o n c o r e : c e n t r e r é a c t i o n n e l c o n s t i t u é d e 2 s o u s u n i t é s p r o t é i q u e s D l e t D 2 : R e g u l a t o r y c a p : e n s e m b l e d e p r o t é i n e s h y d r o p h i l e s d o n t l a f o n c t i o n e s t d e r é g u ' l e r l ' a p p o r t e n i o n s ( C l - , C a 2 + ) d u c y c l e d ' o x y d a t i o n d e l ' e a u ; P r o x i m a l A n t e n n a , D l s t a l A n t e n n a : s o u s u n i té s q u i r e g r o u p e n t ' l e s m o l é c u ' l e s d e p i g m e n t s a b s o r b a n t l e s p h o t o n s l u m i n e u x : M : a t o m e s d e m a n g a n è s e i n t e r v e n a n t d a n s 1 e c y c l e d ' o x y d a t i o n d e l ' e a u . F i q u r e 2 : R e p r é s e n t a t i o n s c h é m a t i q u e d u p h o t o s y s t è m e I I ( a d a p t é d e H A N S O N e t W Y D R Z Y N S K I . 1 9 9 0 ) .L o r s d ' u n e e x c i ta t i o n I u m i n e u s e , I e c e n t r e r é a c t i o n n e l d u p h o t o s y s t è m e I I t r a n s f o r m e u n e p a r t i e d e ' l ' é n e r g i e l u m i n e u s e a b s o r b é e e n é n e r g i e p o t e n t i e l l e a s s o c i é e à u n e s é p a r a t i o n d e c h a r g e s é ' l e c t r i q u e s . L e c e n t r e r é a c t i o n n e l d u p h o t o s y s t è m e I I p a s s e p a r u n é t a t e x c i t é ( P 6 g 0 * ) . I l s e p r o d u i t a l o r s u n t r a n s f e r t d ' é l e c t r o n s ô u s e i n d u p h o t o s y s t è m e I I . C e t r a n s f e r t f a i t i n t e r v e n i r d i f f é r e n t s c o u p l e s o x y d o - r é d u c t e u r s c o m m e la p h é o p h y t i n e e t I e s q u i n o n e s . L ' é l e c t r o n é m i s v j e n t c o m b ' l e r I e d é f i c i t é l e c t r o n i q u e d u p h o t o s y s t è m e I . L a c h a i n e d e t r a n s f e r t é l e c t r o n i q u e a u s e i n d e s c h l o r o p l a s t e s e s t s c h é m a t i s é e f i g u r e 3 . L e c y c l e d e t r a n s f e r t é l e c t r o n i q u e s ' a c h è v e lo r s q u e l a t o t a ' l i t é d e s c o m p o s a n t s d u p h o t o s y s t è m e I I r e d e v i e n t n e u t r e . L a t y r o s i n e Z t r a n s m e t u n é l e c t r o n a u P 6 8 0 * e t c o m b l e s o n d é f i c i t é l e c t r o n l q u e e n c a p t a n t u n é l e c t r o n f o u r n i p a r l e c y c ' l e d ' o x y d a t i o n d e I ' e a u ( G O V I N 0 J E E e t C O L E M A N , 1 9 9 0 ) . 2 . 1 .3 C v c ' l e d ' o x y d a t i o n d e ' l 'e a u C e c y c l e d ' o x y d a t i o n d e I ' e a u , f a i s a n t i n t e r v e n i r d e s a t o m e s d e m a n g a n è s e , e s t u n m é c a n i s m e e n q u a t r e é t a p e s q u i v a f o u r n i r q u a t r e é l e c t r o n s p o u r d e u x m o ' l é c u ' l e s d ' e a u d i s s o c i é e s ( W Y D R Z Y N S K I e t a l . , 1 9 8 9 : H A N S O N e t W Y D R Z Y N S K I , 1 9 9 0 ) . C e c o m p ' l e x e p r o d u c t e u r d ' o x y g è n e p e u t e x i s t e r s o u s 5 é t a t s d ' o x y d a t i o n c r o i s s a n t . S 0 , S 1 , 5 2 , 5 3 , 5 4 ( R U T H t R F O R D , 1 9 8 9 ) . L o r s q u ' i l s e t r o u v e d a n s l ' é t a t 5 4 , i l a f o u r n i 4 é ' l e c t r o n s e t r e t o u r n e à ' l 'é t a t S g e n I i b é r a n t d e l ' o x y g è n e g a z e u x . H + e
-I
. T
S g . T
S 2 .
-e- 2H+ H+e-L ' é l i m i n a t i o n d e s i o n s C l - a u n i v e a u d u P S I I e n t r a l n e u n e i n h i b i t i o n
r é v e r s
i b l e d u m é c a n ' i
s m e
d e I i b é r a t i
o n d ' o x y g è n e
s a n s a f fe c t e r I e t r a n s f
e r t
d ' é ' l e c t r o n a u s e i n d u P S I I a u s s i l o n g t e m p s
q u ' u n d o n n e u r d ' é l e c t r o n
e x o g è n e
e s t p r é s e n t ( B R U D W I G
e t a l . , 1 9 8 9 ) . G O V I N O J E E
e t C O L E M A N
( 1 9 9 0 )
p r o p o s e n t
d i v e r s e s h y p o t h è s e s
q u a n t a u r ô l e d e c e s i o n s c h l o r u r e s d a n s l e
c y c ' l e d ' o x y d a t i o n
d e I ' e a u . C e s io n s p o u r r a j e n t
f a v o r i s e r l a l i b é r a t i o n d e s
p r o t o n s à p a r t i r d e I ' e a u s o i t e n a u g m e n t a n t
d i r e c t e m e n t
I ' e f f i c a c i t é d e s
2 L
r é a c t i o n s d ' o x y d a t ' i o n d e 1 ' e a u soi t en stabi I j sant 'les i ons manganèse I e s p l u s c h a r g é s d e s é t a t s s u p é r i e u r s . L e s i o n s c h l o r u r e s p o u r r a i e n t é g a l e m e n t o r g a n i s e r ' l e s p r o t é i n e s d u P S I I e n u n s y s t è m e s t a b l e .
1 , 0
0 , 9
0 . 8
0 , 7
0 , 6
0 , 5
0 , 4
0 , 3
0 . 2
0 , 1
0 , 0
0 , 1
0 , 2
0 , 3
0 , 4
0 , 5
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1 , 0
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C h l a I P S I 7 0 0 n m P S I I 6 8 0 n m 7 : t y r o z i n e ( d o n n e u r p r i m a i r e d u P S I I ) ; P h : p h é o p h y t i n e ( a c c e p t e u r d ' é l e c t r o n s i n t e r m é d i a i r e ) | Q a , Q s : q u i n o n e s ( r e s p e c t i v e m e n t a c c e p t e u r s p r i m a i r e e t s e c o n d a i r e s t a b l e s " d u P S I I ) ; P Q , P Q H 2 p l a s t o q u i n o n e ; F e S , c y t f , c y t b ç n a : c o m p o s a n t s d u c o m p l e x e c y t o c h r o m e b l f ; P C : p l a s t o c y a n i n e : A n . A r : a c - i e - p t e u r s p r i m a i r e s d u p h o t o s y s t è m e I ; Ï , F ê S 1 r: c o m p o s é s à g r o ù p e m e i t s f e r - s o u f r e ; F d : f e r r é d o x i n e ; F p : f e l Ê é d o x i n e N A D P o x y d o r é d u c t a s e F i q u r e 3 : C h a l n e d e t r a n s f e r t é l e c t r o n i q u e a u s e i n d e s c h l o r o p l a s t e s a p r è s e x c i t a t i o n l u m i n e u s e ( d ' a p r è s 8 0 h , Y E R e t C A M I L L E R I , 1 9 8 7 ) . P o t e n t i e l r é d o x à p H 7 ( V o ' l t s ) " , , " ) \ , QA \ Q B cVt b5632 3 2 . 2 I n t é r ê t d e s a l q u e s u n i c e l l u l a l r e s p o u r l ' é v a l u a t i o n d e l a t o x l c i t é d e s n i l i e u x a q u a t l q u e s L e s a l g u e s u n i c e l I u l a i r e s , c o m p t e t e n u d e ' l e u r a c t i v i t é p h o t o s y n t h é t i q u e , re p r é s e n t e n t la m a j e u r e p a r t i e d e s p r o d u c t e u r s p r i m a i r e s d u m i ' l i e u a q u a t i q u e . A c e t i t r e , c e s o r g a n i s m e s c o n s t i tu e n t I e p r e m i e r m a i l l o n d e s c h a l n e s t r o p h i q u e s e t i l a p p a r a l t d o n c e s s e n t i e l d e c o n n a î t r e e t p r é v e n i r l ' i m p a c t d e s x é n o b i o t i q u e s à c e n i v e a u . L e s a l g u e s u n i c e l lu l a i r e s s o n t , e n e f f e t , c o n s ' i d é r é e s c o m m e l e s p i l i e r s d e l ' o r g a n i s a t i o n d u b i o t a a q u a t i q u e d e t e ' l l e s o r t e q u e s i l e u r c r o i s s a n c e e s t a f f e c t é e , I a b i o m a s s e d e s n i v e a u x s u p é r i e u r s e n s u b i ra d ' a u t a n t l e s r é p e r c u s s i o n s ( C O U T U R E e t a l . . 1 9 8 1 ) . L e s a l g u e s r e p r é s e n t e n t l a s o u r c e a ' l i m e n t a i r e e t é n e r g é t i q u e d e s o r g a n i s m e s s i t u é s a u x n i v e a u x s u p é r i e u r s d e l a c h a l n e t r o p h i q u e , d o n c u n e p r o d u c t i v i t é t r o p f a i b l e o u i n v e r s e m e n t tr o p é ' l e v é e v a s e r é v é ' l e r n é f a s t e p o u r ' l e s o r g a n ' i s m e s d e s n i v e a u x s u p é r i e u r s . C e t t e p l a c e p a r t i c u l i è r e d e s a l g u e s d a n s l e s é c o s y s t è m e s a f a v o r i s é 1 'a g r é m e n t e t 1 ' a u g m e n t a t i o n c o n s t a n t e d e I ' u t i I i sati on des bi oessa i s s u r m i c r o - a l g u e s p o u r p r é d i r e e t d é t e r m i n e r 1 ' ' i m p a c t d e s s u b s t a n c e s to x i q u e s s u r I ' e n v i ronnement a q u a t i q u e . L e s e s s a i s s u r a l g u e s , d é v e l o p p é s in j t i a l e m e n t p o u r é t u d i e r l e s p h é n o m è n e s d ' e u t r o p h i s a t i o n , o n t é t é u t i l i s é s p a r l a s u i t e p o u r l a d é t e r m i n a t i o n d e s e f f e t s t o x i q u e s d e s m i c r o p o l I u a n t s m é t a l 1 i q u e s , d e s p e s t ' i c i d e s o u d e s e f f I u e n t s i n d u s t r i e l s c o m p l e x e s . L e p r o t o c o ' l e d e c e s e s s a i s e s t b i e n d é f i n i ; c e s t e s t s c o n s t i t u e n t u n e m é t h o d e s t a n d a r d i s é e p o u r I ' é t u d e d e I a q u a l i t é d e s e a u x e t d e I a t o x i c i t é d e s s u b s t a n c e s c h i m i q u e s re c o m m a n d é s p a r I ' I S 0 , l ' 0 C D E , ' l 'A F N 0 R e t I ' E P A . C e s e s s a i s s o n t d e m a n d é s p o u r l a c o n s t i t u t i o n d e s d o s s i e r s d e n o t i f i c a t i o n c o n c e r n a n t l a m i s e s u r l e m a r c h é d e p r o d u i t s c h i m ' i q u e s n o u v e a u x . c l a s s é s a u n i v e a u I s e l o n I a 6 è m e d i r e c t i v e d e s C o m m u n a u t é s E u r o p é e n n e s ( C E E , L 9 7 9 ) . I l s s e r o n t r e q u i s a u n i v e a u d u d o s s i e r d e b a s e d è s I ' a p p 1 i c a t i o n d e 1 u 7 è m e d i r e c t i v e . L e s a 1 g u e s p o s s è d e n t I a p r o p r i é t é d e f i x e r e t d e c o n c e n t r e r c e r t a i n e s s u b s t a n c e s c h i m i q u e s p r é s e n t e s d a n s l e m i l i e u a q u a t i q u e . L a b i o s o r p t ' i o n d e s m i c r o p o l I u a n t s m é t a l I ' i q u e s e s t e s s e n t i e l I e m e n t 1 i é e à ' l a c o m p o s i t i o n d e l a p a r o i c e l l u l a i r e : c e ' l l e - c i é t a n t r i c h e e n
