PREVENTION ET PRISE EN CHARGE DES INFECTIONS A HERPES SIMPLEX VIRUS CHEZ LA FEMME ENCEINTE

PREVENTION ET PRISE EN CHARGE DES

INFECTIONS A HERPES SIMPLEX VIRUS CHEZ LA

FEMME ENCEINTE

Présenté par

Présenté par

:

:

Docteur Sanaa LHAJOUI

Encadré par

Encadré par

:

:

Professeur Rachid ABI

Session Septembre 2020

Mémoire de fin d’études

Mémoire de fin d’études

Pour L’obtention du Diplôme National de

Spécialité

en

ANALYSES BIOLOGIQUES MEDICALES

ANALYSES BIOLOGIQUES MEDICALES

A Mon mari

Mes parents,

mes beaux-parents ,Mes

sœurs, Mes frères, Mes amies et toute

ma famille

Vous étiez pour moi l’exemple de la sagesse,

de la bonté, de la tendresse et d’amour.

Vous m’aviez énormément soutenu, durant

mes moments de faiblesse et de désarroi.

Le fait de penser à vous et à vos paroles me

donne le bon souffle pour poursuivre mon

chemin. Je ne cesserai de me rappeler vos

encouragements et vos prières pour moi.

J’ai appris grâce à vous que la persévérance,

la patience et la foi sont les clés de la

réussite.

Je vous dédie ce travail en témoignage de

mon grand amour.

A notre Maître

Le Professeur R. ABI

Professeur Agrégé de Virologie

Laboratoire de virologie

Hôpital Militaire d’Instruction

Mohammed V

C’est pour moi un grand honneur et une

grande

fierté que vous nous faites en acceptant de

diriger ce travail.

Vos compétences professionnelles et vos

qualités

humaines sont connues de tous.

Nous vous exprimons notre gratitude

A tous nos maîtres

Qui nous ont guidés avec bienveillance,

sollicitude et compréhension pour

l’acquisition du savoir nécessaire à

l’exercice de notre profession. Nous

espérons être dignes de leur confiance et à

la hauteur de leurs attentes.

Veuillez recevoir ici, l’expression de notre

dévouement, de notre reconnaissance et de

notre grande admiration.

« Respectueux et reconnaissant envers mes Maîtres, je rendrai à leurs enfants l’instruction que j’ai reçue de leur père ».

[Hippocrate]

TABLE DES MATIERES

Introduction...11

I. Rappels virologiques et épidémiologiques :...13

1. Caractères virologiques:...13

2. Epidémiologie :...17

II. Rappels physiopathologiques et cliniques :...22

1. Cycle évolutif de l’infection herpétique...22

2. Cycle de réplication virale :...23

3. Manifestations cliniques:...25

III. Diagnostic virologique:...30

1. Prélèvements :...31

2. Techniques de recherche directe de l’HSV :...39

3. Sérologie herpétique :...46

4. Recherche de résistance aux antiviraux :...49

5. Démarche diagnostique de l’herpès génital :...50

IV. Prise en charge de l’infection herpétique génitale :...58

1. Conduite à tenir thérapeutique lors d’une infection herpétique génitale chez la femme enceinte:...58

2. Conduite à tenir devant un nouveau-né issu d’une grossesse à HSV positive :...61

V. Mesures de prévention contre l’infection herpétique :...65

1. Dépistage de l’infection herpétique chez les femmes enceintes :...65

2. Mesures de prévention chez la femme enceinte :...66

3. Mesures de prévention néonatale :...67

4. Vaccination:...68

Conclusion...70

Résumé...72

Bibliographie...74

LISTE DES FIGURES :

Figure 2:Organisation du génome du virus de l'herpès simplex...16

Figure 3:la séroprévalence de l'HSV-2 chez les femmes enceintes en fonction des pays...21

Figure 4: Cycle de réplication d’un virus herpès simplex...24

Figure 5: extension des lésions de la gingivo-stomatite ...25

Figure 6: Gingivo-stomatite herpétique ...24

Figure 7:Vulvo-vaginite herpétique aiguë montrant des érosions confluentes de la muqueuse vulvaire ...26

Figure 8:Ulcération génitale due à l'HSV-2 chez l'homme...26

Figure 9:Conservation de l’HSV avec des fibres d’écouvillon : effet sur le décompte viral...33

Figure 10:Ecouvillon en nylon velouteux (effet de brosse)...33 8

Figure 11:écouvillons et son milieu de transport spécifique...34

Figure 12:Prélèvement d’une lésions suspecte d’HSV en vue de la confirmation...36

Figure 13:Les différentes étapes du prélèvement vaginal...37

Figure 14:effet cytopathique de l’HSV en culture cellulaire (culture non orientée )...41

Figure 15:Étapes de la culture virale par centrifugation sur lamelle (culture orientée)...42

Figure 16:Coloration de tzanck mettant en évidence HSV………...45

Figure 17:Infection herpétique frottis conventionnel - coloration de PAPANICOLAOU …...45

Figure 18:Apparition des anticorps après une infection et leur détection...48

Figure 19:Examens virologiques à effectuer chez un nouveau-né asymptomatique de mère ayant des lésions herpétiques au moment de l’accouchement (naissance par voie vaginale ou césarienne)...56

Figure 20:schéma de la prise en charge du nouveau-né issu d’une grossesse HSV positive...64

LISTE DES TABLEAUX :

Tableau II: Risque de transmission d’herpes néonatal selon l’anamnèse maternelle en cas de voie basse ...18

Tableau III: la séroprévalence de l’HSV-2 dans divers groupes de population au Maroc...20

Tableau IV:matériel utilisé et méthodes en fonction du site du prélèvement ...38

Tableau V:Sensibilité de la culture virale en fonction du stade de l’infection/types des lésions...40

Tableau VII:Interprétation des résultats de la sérologie spécifique de type chez une patiente présentant une lésion génitale mais test de détection virale négatif...52

Tableau VIII: Interprétation des résultats de la sérologie spécifique de type chez une personne qui ne présente pas de lésion génitale au moment de la visite médicale et chez qui aucun test de détection virale n’a pu être effectué...53 9

LISTE DES ABREVIATION

HSV: Herpes simplex virus

SRI: Séquences répétées inversées UL : Séquence unique longue US: Séquence unique courte MFIU: Mort foetale in utero

LATs : latency associated transcripts. PCR: Polymerase chain reaction SA: Semaines d'aménorrhée IV: Intraveineux

TAAN: Test d'amplification des acides nucléiques HAS: Haute autorité de santé

Introduction

L’infection herpétique constitue un véritable problème de santé publique en progression continue. Malgré sa bénignité relative, elle représente un fardeau socio-économique pesant sur les sociétés des quatre coins du monde. Il s’agit bel et bien d’une infection interhumaine universelle dont l’image actuelle et l’avenir sont toujours incomplètement connus. L’herpès simplex virus regroupe deux types de virus à savoir l’HSV-1 et l’HSV-2 dont l’ensemble appartient à la grande famille des herpersviridaes. L’histoire actuelle de ce virus connaît plusieurs changements du point de vue épidémiologique. Et malgré certaines variations, on peut dire que les deux types du virus peuvent infecter toutes les régions du corps humains. En effet, l’herpès simplex virus de type 2 constitue un agent principal des infections sexuellement transmissibles.

La femme enceinte peut être en contact avec ce virus ; soit au cours d’une infection acquise lors de sa grossesse actuelle : on parle alors d’une primo-infection ; soit au cours d’une infection contractée au préalable et on assiste alors à une récurrence au cours de la grossesse. Les différents scénarios apportent un éventuel risque, de sévérité variable, pour le bébé. Ce risque relatif justifie des mesures thérapeutiques et préventives très pointues ; d’abords pour la femme avant de concevoir son projet de grossesse, ensuite au cours de la grossesse pour prévenir un éventuel herpès néonatal qui est grave malgré sa rareté.

Le rôle majeur du partenaire dans la transmission de ce virus doit être toujours dans la ligne de mire du praticien vu sa grande implication.

De ce fait, notre travail va englober tous les aspects concernant cette infection herpétique principalement chez la femme enceinte ; et parmi nos objectifs :

 Etaler les différents aspects épidémiologiques de l’infection herpétique tout en soulignant les éventuelles actualités d’une part et d’une autre part rappeler les différents modes de transmission et les facteurs favorisants dans le but de mieux cerner la prévention.

 Présenter les manifestations cliniques accordées à l’infection herpétique notamment l’infection matérno-fœtale avec ses différents aspects.

 Savoir diagnostiquer une infection herpétique

 Etaler les différentes techniques au laboratoire de virologie destinées au diagnostic de cette infection tout en insistant sur les techniques de prélèvements et d’acheminement des échantillons.

 Connaitre les principales molécules antivirales tolérées par la femme enceinte et le nouveau-né

 Savoir traiter une infection herpétique dans les différents cas s’articulant autour de la femme enceinte,

I.

Rappels virologiques et épidémiologiques :

1.

Caractères virologiques:

Historiquement, la classification de la famille Herpesviridae, était basée uniquement sur quatre caractéristiques structurales communes : un cœur d’ADN double brin linéaire, une

capside icosaédrale, une couche de protéines entourant la capside et une enveloppe

bilipidique dans laquelle sont ancrées les glycoprotéines virales [1], [2].

Récemment, l’accumulation des données par séquençage d’ADN a mené à la révision de cette classification par le Comité international de taxonomie des virus (ICTV). Ainsi, un nouvel ordre nommé Herpes virales a été créé et contient dorénavant trois familles :

• Les Alloherpesviridae regroupant les virus des amphibiens et des poissons.

• Les Malacoherpesviridae qui n’inclut qu’un virus infectant les mollusques bivalves. • Les Herpesviridae une grande famille largement disséminée dans la nature regroupant

les virus de reptiles, d’oiseaux et de mammifères [3], [4].

Les virus herpétiques partagent certaines caractéristiques physiologiques telles que la structure, un large génome d’ADN double brin, des traits généraux du cycle de réplication, et notamment, la capacité à établir la latence. Toutefois certaines particularités de leurs propriétés biologiques telles que la durée du cycle de multiplication, le tropisme cellulaire, les manifestations cliniques associées à la primo-infection ou aux récurrences, le pouvoir transformant, ont mené à les subdiviser en trois sous-familles qui sont les Alphaherpesvirinae, les Betaherpesvirinae et les Gammaherpesvirinae , et parmi cette grande variété de virus, 9 d’entre elles (HHV-1 à –8 ; HHV-6A et -6B) ,isolées jusqu’à maintenant, sont strictement associés à des pathologies humaines ainsi :

 Les Alphaherpesvirinae: regroupent Les genres Simplexvirus (HSV-1 et -2), et Varicellovirus (HHV-3 ou varicella-zoster virus (VZV))

 Les Betaherpesvirinaese :Cette sous-famille est divisée en quatre genres principaux notamment les genres Cytomegalovirus (HHV-5 cytomégalovirus (CMV)), Roseolovirus (HHV-6A, HHV-6B, et HHV-7) les Muromegalovirus, et les Proboscivirus.

 Les Gammaherpesvirinae : Les quatre principaux genres de cettes ous-famille, sont les Lymphocryptovirus (HHV-4 ou EBV),les Macavirus, les Percavirus et les Rhadinovirus (5HHV-8 ou virus du sarcome de Kaposi)[1], [2], [5], [6]

DESIGNATION NOMS COMMUNS GENRE SOUS-FAMILLE

Virus herpès humain 1 (VHH-1) Virus herpès simplex 1 (HSV-1) Simplex virus Alpha

Virus herpès humain 2 (VHH-2) Virus herpès simplex 2 (HSV-2) Simplex virus Alpha

Virus herpès humain 3 (VHH-3) Virus Varcella-Zoster (VZV)

Varicellovirus Alpha

Virus herpès humain 4 (VHH-4) Virus Epstein-Barr (EBV)

Lymphocryptovir us

Gamma

Virus herpès humain 5 (VHH-5) Cytomégalovirus (CMV)

Cytomégalovirus Bêta

Virus herpès humain 6A et 6B (VHH-6A et VHH-6B)

VHH-6 Roséolovirus Bêta

Virus herpès humain 7 (VHH-7) VHH-7 Roséolovirus Bêta

Virus herpès humain 8 (VHH-8) Herpès virus associé au sarcome de Kaposi (KSHV)

Rhadinovirus Gamma

La structure des différents membres de la famille des herpesviridae est grossièrement semblable. Il s’agit de gros virus de 150 à 200 nm de diamètre se caractérisant par quatre éléments distincts : de dedans en dehors :

 un noyau d’ADN bicaténaire linéaire renfermé dans

 une capside de symétrie icosaédrique entouré par

 un ensemble amorphe de protéines, le tégument, le tout est limité par

 une enveloppe bilipidique dans laquelle sont ancrées les glycoprotéines virales.

Figure 1 :Représentation schématique d'une particule de l'herpès simplex virus[7]

c. Réorganisation génomique:

Le génome des herpès virus humains est un acide désoxyribonucléique (ADN) à double brin linéaire, enroulé autour de protéines basiques, l’ensemble constitut le nucléoïde ou core. Cet ADN est constitué de deux segments liés de façon covalente, soit une séquence unique longue (UL) et une séquence unique courte (US). Ces segments sont flanqués par de larges séquences répétées inversées (SRI) : séquences terminales et/ou internes … Les SRI situées aux extrémités du segment UL sont désignés ab et b’a’, alors que celles du segment US sont nommées a’c’ et ca. Les deux segments du génome peuvent donc être inversés et combinés de diverses façons de manière à former jusqu’à quatre isomères qui diffèrent uniquement par l’orientation relative de leurs séquences. Ces variations du nombre de réitérations des SRI a comme conséquence une grande variabilité génomique[8]. De ce fait, l’ADN varie de 152 kpb pour HSV-1 et 154 kpb pour HSV-2[3].

Schématiquement le génome viral comprend plusieurs origines de réplication (3pour HSV-1) nommées selon leurs localisations au niveau des séquences uniques, courtes et longues et

aussi des séquences répétées. Ces dernières codent pour des protéines virales différentes (pour HSV-1 et 2 au moins 84 protéines virales différentes : 5 sont exprimées à partir des séquences répétées, 65 à partir du segment long UL et 14 à partir du segment court US).

Les deux types d’HSV partagent 50% d’homologie nucléotidique, leur génome contient une forte proportion de Guanines +Cytosines (68% pour l’HSV1 et 69% pour l’HSV2)plus élevé que celle des autres virus herpétiques humains[1], [2], [9]–[10].

Figure 2 :Organisation du génome du virus de l'herpès simplex[11]

2.

Epidémiologie :

L’espèce humaine est exclusivement le seul réservoir de l’HSV : ces virus fragilisés par leurs enveloppes sont abrités dans les ganglions sensitifs (ganglion de Gasser pour HSV-1 et ganglions sacrés pour HSV-2), dans un état quiescent, chez les humains infectés au niveau oral et/ou génital qui demeurent une source d’infection constante tout au long de leurs vies. [12].

b. Contagiosité :

Le taux du virus excrété est plus élevé dans les premières heures de formation des vésicules, ensuite on assiste à une décroissance : en moyenne 8 jours lors d’une primo-infection mais peut atteindre 20 jours. L’excrétion virale à partir des muqueuses atteintes peut persister de façon intermittente pendant des années, voire même toute la vie [12].

c. Incubation :

De 2 à 12 ou 14 jours.

d. Mode de Transmission:

i. Transmission orale et génitale[13]–[14] :

Le mode de transmission quasi-exclusif de l’HSV se fait par contacts directs et étroits salivaires et/ou sexuels via les sécrétions, les muqueuses infectées, ou les lésions cutanées d’un patient symptomatique ou patient asymptomatique excrétant le virus. Néanmoins, le risque de transmission est maximal en présence de lésions évolutives.

On note que le mode de transmission indirecte demeure rare en raison de la fragilité du virus dans l’environnement extérieur.

ii. Transmission matérno-fœtale[15]–[16] :

Il existe 3 modes de contamination lors de la transmission materno-fœtale :

 In utero par voie transplacentaire lors d’une virémie maternelle (5%)qui peut être responsable de fœtopathies.

 Au moment de l’accouchement lors du passage dans la filière génitale contaminante (85%).

 En période postnatale lors d’un contact direct avec la mère ou un autre membre de l’entourage contaminant (famille, personnel de santé…)(10 %).

 Facteurs favorisants la transmission matérno-fœtale :

 Age gestationnel : au moment du troisième trimestre de grossesse, en particulier dans les

six semaines précédant l’accouchement :

 Lors d’une primo-infection herpétique génitale caractérisée par un niveau d’excrétion d’HSV élevé et persistant alors que le bébé naît avant le développement d’anticorps maternels protecteurs ; le risque de transmission au nouveau-né est évalué entre 30et 50%

 Lors d’une récurrence d’herpès génital au moment du travail, le risque d’herpès néonatal en présence des lésions est faible et il est compris entre 0 et 5 % pour une délivrance par voie vaginale. Alors qu’en absence des lésions le risque est estimé inférieur à 0,05%.Néanmoins, il faut noter que les récurrences au moment de l’accouchement, bien qu’associées à un faible taux de transmission, peuvent vraisemblablement causer des formes localisées d’herpès néonatal. (La terminologie utilisée sera détaillée dans la partie clinique)

 Prise en charge invasive lors de l’accouchement chez une parturiente ayant des récurrences herpétiques génitales : l’utilisation de matériels au niveau du scalp fœtal (électrode, forceps, ventouse, ph au scalp…).

 Rupture prématurée et prolongée des membranes(plus de 4h) augmente les risques de l’infection du fœtus.

 Le sérotype HSV-1 : Dans une étude de cohorte prospective réalisée en 2003. 58 362 femmes, en travail, ont bénéficié de prélèvement par écouvillonnages (au niveau génital et col de l’utérus) dans le but de réaliser la recherche d’HSV par culture. Ces prélèvements étaient associés à une sérologie HSV. Les résultats ont montré que sur les 40 023 femmes ayant eu un prélèvement local, 202 femmes avaient de l’HSV mis en évidence en culture. Et parmi ces 202 femmes, 10 (5 %) ont eu un enfant atteint d’herpès néonatal. Le risque d’herpès néonatal était supérieur en cas de culture positive pour HSV 1 (31,3 %) par rapport à HSV 2 (2,7 %)[17].

En effet, l’exposition du fœtus à des charges virales élevées augmenterait donc les risques de transmission, alors que le transfert passif d’anticorps de la mère au fœtus les diminuerait ce qui nous laisse dire que le statut immunitaire de la mère avant l’accouchement influence à la fois la sévérité de l’infection et les possibilités de transmission du virus au fœtus[18].

Tableau

II

: Risque de transmission d’herpes néonatal selon

l’anamnèse maternelle en cas de voie basse[19]

(PI) pendant la grossesse

Récurrence

pendant la

grossesse

ATCD sans poussée pendant la grossesse ni pendant l’accouchement Aucun antécéden t Risque de transmission d’herpes néonatal Risque = 30 à 50% si PI au 3ème trim

Risque = 1 à 3 % Risque = 0,02 à 0,05% Faible

e. Aspects épidémiologiques :

L’infection herpétique est un fléau mondial, elle est omniprésente aux quatre coins du globe. En effet ,l’épidémiologie de cette infection est influencée par les caractéristiques du virus : mode de transmission, L’âge de la contamination, Les sites lésionnels ,La pathologie causale et la fréquence des récurrences [20].

De façon générale, la prévalence de l’HSV-1 est toujours plus élevée que celle de l’HSV-2 : un fait probablement dû à leur mode de transmission différent.

i. La séroprévalence de l’HSV-1 :

La prévalence de l’infection à l’HSV-1 est très élevée dans pratiquement tous les pays, et augmente avec l’âge pour atteindre plus de 90% après la cinquième décade : 85% de la population mondiale est séropositive pour l’HSV-1. Cette incidence est influencée par plusieurs paramètres comme la localisation géographique, la classe socio-économique, et l’âge des individus [21].

ii. La séroprévalence de l’HSV-2 :

La séroprévalence de l’HSV-2 varie entre 10 et 40 % et peut atteindre 60-95 % chez les sujets infectés par le VIH et les prostituées. On estime cependant que seuls 10-25 % des gens porteurs d’anticorps anti-HSV-2sont conscients d’être infectés[20], [22], [23].

La prévalence du HSV-2 est constamment plus élevée chez les individus à risque séropositifs pour le VIH, les prostitué(e)s et les individus présentant d’autres IST[24].

Bien que la prévalence de l’HSV-2 dans la population générale du Maroc soit plutôt faible comparée à beaucoup d’autres régions du monde, elle est relativement élevée par rapport aux autres pays du Moyen-Orient et d’Afrique du Nord. Certaines régions d’Afrique et d’Amérique comportent les séroprévalences les plus élevées, le chef de fils est la région Sub-Saharienne où plus de 80% des individus testés étaient séropositifs pour l’HSV-2[24]. En Europe de l’Ouest et du Sud, la prévalence de l’HSV-2 est habituellement moins élevée qu’en Europe du Nord et qu’en Amérique du Nord. Finalement, l’Asie et l’Australie sont les régions les moins touchées et deux études menées au Japon ont révélé une prévalence inférieure à 7% dans tous les groupes d’âge observés[25].

Ces données ont probablement varié depuis quelques années (ou varieront dans un avenir proche) en raison des changements économiques majeurs et la généralisation des échanges entre le monde occidental et le monde oriental.

Au sein de la population marocaine, la séroprévalence varie en fonction du sexe, âge, terrain, l’association avec d’autres infections sexuellement transmissibles et en fin le métier comme mis en évidence ci-dessous :

Tableau III : la séroprévalence de l’HSV-2 dans divers groupes de population au Maroc[26]

iii. actualités épidémiologiques:

La notion que l’HSV-1 est exclusivement responsable des infections herpétiques de la partie supérieure du corps et l’HSV-2 de la partie inférieure du corps n'est plus valable : il a été démontré que l’HSV-1 et l’HSV-2 peuvent infecter toute région cutanéo-muqueuse, et la co-infection à l’HSV-1 et l’HSV-2 au même site anatomique possible aussi[27]. De ce fait, on peut dire que l'épidémiologie des infections à HSV-1 en particulier et l’épidémiologie de l’herpès génital comme notion plus large ont évolué dans le temps, et l’avènement de nouvelles pratiques sexuelles notamment oro-génitales, le faible niveau socio-économique, la promiscuité, l’augmentation de la prostitution et le développement du tourisme sexuel ainsi que les taux des infections sexuellement transmissible qui ne cessent d’augmenter sont largement considérés les principaux acteurs de ce chamboulement épidémiologique. Cependant, en population générale, l’HSV-2 reste la première cause d’herpès génital qui est l’une des maladies sexuellement transmissibles les plus connues et la première cause d’ulcérations génitales d’origine infectieuse à travers le monde : 60 à 80 % des herpès génitaux sont imputables à HSV-2. [20], [22], [23]

Population générale :

Homme Femme

Citadines, âge médian de 40ans Patients des services prénatals

Public des centres de planification familiale

10 % 13 % 26 % 12,9 % 18,3 %

Population fréquentant les structures de santé :

Patients des service spécialisés dans les MST

Public masculin des sites de surveillance sentinelle du VIH

6,7 % 9,2 %

Population passerelle potentielle :

iv. Epidémiologie de l’infection matérno-fœtale :

 L’herpès génital de la femme enceinte représente une entité particulière en raison du risque d’infection du nouveau-né et du fœtus.

 Le taux d’infection primaire génitale chez la femme enceinte a été évalué à 0,5 à 10 % par an.

 60 à 80 % des femmes enceintes ont un antécédent d’infection par un virus Herpès simplex, sans préjuger de la localisation génitale ou labiale et de l’histoire clinique, et celui-ci est dans la majorité des cas de type 1.

 En cas de récurrence herpétique génitale pendant la grossesse, en l’absence de traitement, la prévalence des lésions cliniques d’herpès à l’accouchement est de l’ordre de 14,3 % contre 36 % en cas d’infection initiale sans que le type viral soit précisé. En l’absence de récurrence pendant la grossesse la prévalence des lésions lors de l’accouchement n’est pas connue.

 Prévalence de l’excrétion génitale chez les femmes enceintes Chez les patientes séropositives pour l’un ou l’autre type viral, l’excrétion herpétique asymptomatique détectée par PCR est de l’ordre de 4 à 10 %. L’HSV-2 est plus souvent retrouvé que l’HSV-1. Le taux d’excrétion augmente chez les patientes VIH+ (de l’ordre de 20 à 30 %)  Le risque de séroconversion pendant la grossesse est de l’ordre de 1 à 5 %, mais peut

atteindre 20 % en cas de couple séro discordant.

 Le principal facteur de risque de contamination par HSV pendant la grossesse est l’existence d’une autre IST et l’antécédent d’herpès chez le partenaire, mais aussi les partenaires multiples[20], [28].

La séroprévalence de l’HSV-2 varie de 7 à 40% chez les femmes enceintes dans les différentes régions du monde. Le Maroc est parmi les pays les moins touchés en ce qui concerne cette population.

v. Epidémiologie de l’herpès néonatale[15], [30] :

 L’herpès néonatal est une affection rare (incidence 3/100 000 naissances) mais particulièrement grave vu le haut risque de mortalité et des séquelles neuro sensorielles

 Sur les études les plus récentes, on note une augmentation de la prévalence du sérotype HSV-1. Néanmoins, On estime que dans le monde 75 % environ des infections néonatales à HSV sont dues à l’HSV-2 et 25 % à HSV-1

 Les principaux facteurs de risque de transmission mère-enfant sont la primo-infection maternelle et le sérotype HSV-1.

 La mortalité est élevée et dépend de la forme clinique (mortalité avec traitement : forme cutanéomuqueuse 0 %, atteinte système nerveux central 6 %, atteinte disséminée 31 %).

 La morbidité est principalement neurologique (retard mental, cécité, épilepsie, atteinte neuromotrice) et dépend de la forme clinique. Il existe peu de données sur le risque de récurrence pendant l’enfance, notamment depuis la mise en place du traitement suppresseur par aciclovir oral.

II.

Rappels physiopathologiques et cliniques :

1. Cycle évolutif de l’infection herpétique

Ces virus neurotropes présentent la particularité de persister après la primo-infection. Après la lésion cutanéomuqueuse, le virus infecte les fibres cutanées des neurones sensitifs jusqu’au corps du neurone dans les ganglions spinaux. Ils y persistent à l’état quiescent (latence) et sont capables de se réactiver périodiquement [9].

a. Primo-infection

La primo-infection survient généralement dans l’enfance par un premier infectant muqueux ou cutané, symptomatique(20 % des cas) ou asymptomatique(80 % des cas), avec le virus HSV-1 ou HSV-2.

b. Phase de latence

Les herpès virus sont des causes d’infection latente chez les personnes immunocompétentes. Ils ont la capacité de persister à vie chez leur hôte, grâce au phénomène de latence virale [31]. À partir du site épithélial initialement infecté, le virus gagne rapidement les neurones des ganglions sensoriels concernés : ganglions de Gasser, cervical supérieur, plexiforme et thoraciques pour HSV1 , lombosacrés pour HSV2 [10,32].

La latence donne au virus un avantage majeur : il échappe à la réponse immune humorale et cellulaire de l’hôte infecté, mais également à l’action des drogues antivirales qui, à ce jour, agissent uniquement sur la réplication [32]. Durant l’infection latente, il n’y a ni réplication de l’ADN, ni expression de protéines virales, mais transcription d’ARN viraux particuliers, , les

LATs (pour latency associated transcripts). Ce sont des ARN sans queue de 3’ poly-adénines (A) et pourtant étonnamment stables, et accumulés en grand nombre dans le noyau des neurones [33]. La présence de LAT, semble participer au blocage de la maturation des transcrits nécessaires à la réactivation virale [34,35].

c. Réactivation, récurrences

L' infection latente dans le ganglion sensitif donne des réactivations qui font intervenir la protéine α ICP0, par différents mécanismes conduisant à l’activation de la transcription des gènes β et . Le virus ainsi produit regagne alors la périphérie par voie neuronale centrifuge (antérograde) , pour donner au site de la primo-infection une réinfection endogène, soit symptomatique (récurrence), soit asymptomatique (simple excrétion salivaire ou génitale de virus) [36, 37].

2. Cycle de réplication virale :

Le cycle de réplication virale de L’HSV reste identique au cycle classique d’un virus à ADN. L’HSV utilise la cellule hôte afin d’exprimer les protéines virales nécessaires à sa réplication et à sa propagation en empruntant plusieurs étapes clés incluant : l’entrée du virus, l’expression des gènes viraux, la synthèse de l’ADN viral et l’assemblage et le bourgeonnement des virions.

 Attachement :GP enveloppe au récepteur cellulaire. Puis fusion de l’enveloppe virale à la membrane cellulaire.

 Pénétration de la nucléocapside et libération des protéines du tégument dans le cytoplasme de la cellule hôte.

 Migration de la nucléocapside vers le noyau et libération de l’ADN viral.

 Circularisation de l’ADN viral puis : 3 phases transcription et traduction successives régulées en cascades. La réplication de l’ADN viral sépare les phases précoces et tardives.

 α (protéines très précoces) puis

 β (protéines précoces (enzymes virales: thymidine-kinase et ADN polymérase)) puis

 γ (protéines tardives.

 Réplication de l’ADN viral par l’ADN polymérase, selon le mécanisme du cercle roulant (après synthèse enzymes virales).

 Assemblage protéines structurales et encapsidation

 Enveloppement des nucléocapsides par bourgeonnement à partir de la membrane nucléaire

 Libération des virions néo-formés par exocytose .

La réplication virale est approximativement achevée en l’espace de 18 h et ce processus entraîne des dommages cellulaires irréversibles [12].

L’effet cytopathogène accompagnant le cycle aboutit à la destruction de la cellule hôte (lyse passive ou bien apoptose).

Figure 4 : Cycle de réplication d’un virus herpès simplex[11]

3. Manifestations cliniques:

 Formes inapparentes :

Les formes inapparentes sont les plus fréquentes avec un pourcentage de 80% des cas. Ainsi, la plupart des adultes sont porteurs d’anticorps anti-HSV sans aucun souvenir révélant une primo-infection.

 Primo-infection buccale :Gingivo stomatite herpétique aiguë (HSV-1 >>> HSV-2) : C'est vers 6 mois à un an, après la perte des anticorps maternels, que la plupart des individus s'infectent principalement par l’HSV-1 à partir de l’excrétion salivaire d’une personne de l’entourage, enfant ou adulte :

 Gingivo stomatite caractérisée par une muqueuses gingivales et buccales tuméfiées,

érosives, saignantes avec des érosions multiples coalescentes polycycliques, à bords inflammatoires et couvertes d’un enduit blanchâtre, avec des vésicules en bouquet et/ou croûtes, en périphérie de ces lésions, sur le revêtement cutané ou semi-muqueux (lèvres, menton).

 Signes associés : fièvre à 39◦ et myalgies simulant un tableau pseudo-grippal,

dysphagie

 Évolution favorable en 10 à 15 jours.

Figure 5 : extension des lésions de la gingivo-stomatite Figure 6 :Gingivo-stomatite herpétique[37]

herpétique[1]..

 Primo-infection génitale :(HSV-2 >>> HSV-1)

La plupart des primo-infections génitales ne sont pas reconnues parce qu’elles sont soit asymptomatiques soit atypique et non diagnostiquée (80% des cas). Les manifestations cliniques sont situées dans la région du dermatome sacré (habituellement S2,S3) et peuvent se

trouver sur la peau génitale ou les régions adjacentes après une période d’incubation en moyenne de 7 jours (2 à 20 jours).

chez la femme Il s’agit d’une vulvo-vaginite(Cette partie sera plus détailler dans la partie diagnostique) , chez l'homme La symptomatologie est le plus souvent moins bruyante et peut être confondue avec un herpès récurrent : Balanite œdémateuse, érosions polycycliques et ± vésicules sur le versant cutané (fourreau pénien, scrotum).

Figure 7 : Vulvo-vaginite herpétique aiguë montrant des érosions confluentes de la muqueuse

vulvaire[37].

Figure 8 : Ulcération génitale due à l'HSV-2 chez l'homme[38]

Chez la femme et plus rarement chez l’homme, une atteinte rectale et/ou anale peut accompagner la primo-infection génitale. Une primo-infection anale isolée est possible chez la femme et l’homme homosexuel. Pharyngite, hépatite fulminante, méningite, radiculopathies sacrées, encéphalite, myélite et syndrome de Guillain-Barré ont été exceptionnellement rapportés. Une dissémination cutanée ou viscérale est exceptionnelle chez les patients immunocompétents.

 Primo-infection anale et rectale :

Anite ou anorectite érosive aiguë qui est possible pour les deux sexes, plus fréquentes chez l’homosexuel masculin et ensuite la femme suite à l’avènement de nouvelles pratiques sexuelles anales.

 Primo-infection cutanée :

Plusieurs localisations sont possibles : au niveau des fesses, digitale : « panaris herpétique » qui est souvent discret et rarement étendu acquis lors de l’âge adulte (contamination sexuelle ou professionnelle « profession de santé ») et souvent confondu avec une infection bactérienne comme le panaris staphylococcique.

 Primo-infection oculaire :

Kérato-conjonctivite ou kératite unilatérale aiguë caractérisée par : ± œdème, érythème, vésicules herpétiques au niveau des paupières avec ± des adénopathies prétragiennes. La prise en charge spécialisée doit être démarrée le plutôt possible vu les complications gravissimes : uvéite, ulcérations de cornée avec séquelles visuelles (favorisées par la corticothérapie locale).  Primo-infection de la sphère ORL :

Angine herpétique et rhinite aiguë érosive (obstruction nasale, vésicules péri-narinaires et adénopathies cervicales).

b. Formes cliniques des récurrences herpétiques :

 La primo-infection stimule une réponse immunitaire locale et générale avec l'apparition d'anticorps (séroconversion). Après guérison de ce premier épisode, de nombreux patients ont des récurrences, dans le même territoire que la primo-infection, malgré la présence d'anticorps. On note que l'infection est plus limitée que durant la primo-infection et généralement moins parlante.

 Les facteurs favorisants : infection générale fébrile ; UV ; règles ; stress traumatisme chirurgie régionale ; et injection de morphine intrathécale ;

 Manifestations cliniques ( tableau clinique est moins bruyant qu’au cours de la primo-infection) ; Localisation : siège de la primo-infection herpétique :Labial > génital > cutané, nasal, oculaire.

 Les récurrences cliniques surviennent chez 20 à 50 % des patients porteurs d’anticorps anti-HSV, elles sont plus fréquentes dans les 18 mois suivant la primo-infection, après une primo-infection grave ou quand elle survient à un âge précoce, et on note fréquence des récurrences est plus élevée en cas d’herpès génital HSV-2 que HSV-1.

c. Formes cliniques graves de l’infection herpétique :

- Lésions cutanéo-muqueuses extensives, nécrotiques, persistantes avec altération de l’état général, fièvre

- Atteintes viscérales possibles (méningo-encéphalite, pneumopathie, hépatite, pancréatite). - Récurrences fréquentes, atypiques et prolongées

 Méningite herpétique[39], [40] :

Observée au décours d’une infection à HSV-2 : Fréquente lors de la primo-infection génitale à HSV-2, elle peut survenir lors de récurrences, sans lésions génitales symptomatiques.

 Encéphalite herpétique[39], [40] :

Due quasi exclusivement à HSV-1 : encéphalite aiguë nécrosante focale survenant à tout âge, en dehors de la période néonatale. Le traitement urgent est impératif pour diminuer la mortalité spontanée (> 70 %) et le risque de séquelles.

III. Infection matérno-fœtale ++++++[15], [39], [40], [41]–[42] :

IV. Symptomatologie clinique de l’infection maternelle :

La plupart des manifestations cliniques de l’infection herpétique (primo-infections ou récurrences) sont similaires chez la femme enceinte et non enceinte. En plus, quelques complications ont été décrites chez la femme enceinte. Il s’agit d’une part de l’encéphalite herpétique, néanmoins très rare pendant la grossesse puisque 20 cas ont été décrits entre 1966 et 1998, et d’autre part, de l’hépatite herpétique.

Mais le fait sans doute le plus important est que, dans 70 % des cas, les mères de nouveau-nés développant un herpès néonatal n’ont pas d’historique de signe clinique d’herpès génital.  Encéphalite herpétique :

Les cas d’encéphalite herpétique pendant la grossesse sont rarement décrits. Les points communs de ces différents cas sont une présentation neurologique associée à de la fièvre, voire une présentation psychiatrique. Le symptôme initial était le plus souvent une crise convulsive. Il s’agit donc d’un diagnostic différentiel de la crise d’éclampsie. Démarrer un traitement de façon probabiliste en cas de suspicion de méningite ou d’encéphalite herpétique, en attendant les résultats des éventuels examens biologique ou radiologique semble indiqué pour diminuer les conséquences de l’infection.

Au total, devant tout tableau évocateur d’encéphalite fébrile, l’encéphalite herpétique doit être évoqué et un traitement antiviral démarré le plus tôt possible.

 Hépatite herpétique :

Les hépatites herpétiques sont rares et potentiellement graves. Le premier cas d’hépatite herpétique chez l’adulte a été décrit en 1969 chez une femme enceinte à 28 SA et avec une MFIU[43].

La séroprévalence d'HSV1 et 2 reste élevée dans la population de femmes enceintes. L'hépatite herpétique est favorisée par la grossesse se développant le plus souvent au 3ème trimestre, mais parfois en post-partum précoce

chez toute femme enceinte atteinte d'une hépatite aigue surtout fébrile et anictérique et impose l'administration empirique du traitement (sans attendre les résultats virologiques) car le retard thérapeutique est le principal facteur de mortalité maternelle qui peut atteindre 80 %.

V. Conséquence de l’infection matérno-fœtal :

VI. lors de la transmission par voie transplacentaire : infections congénitales : A- Fausses couches :

Certaines études ont laissé entendre que l’infection primaire survenant au 1er _{ou au 2}ème trimestre était associée à une augmentation du risque d’avortements spontanés et/ou de prématurité et de retard de croissance intra-utérin ce qui n’est pas confirmé par des études plus récentes. Exemple de deux études montrant un lien possible entre l’HSV et les fausses couches :- Dans 95 produits de fausse couche spontanée étudiés, l’HSV est retrouvé dans 43,5 %[44]- Les patientes ayant une sérologie HSV-2 positive ont plus d’antécédent de fausses couches que les autres[45].

B- Menace d’accouchement prématuré :

Une étude a montré que le fait d’avoir un herpès non traité était associé à une augmentation du risque de prématurité et particulièrement pour les accouchements prématurés liés à une rupture des membranes[46]

C- Fœtopathie herpétique :

Les fœtopathies herpétiques sont exceptionnelles et peuvent être dues à des infections primaires comme non primaires, à HSV-1 ou 2, en présence ou non de symptômes maternels

D- Les signes échographiques les plus souvent décrits étaient au cours du 1er et 2ème trimestre :

retard de croissance, anomalies ventriculaires (ventriculomégalie, hydrocéphalie) porencéphalie, intestin hyperéchogène, myocarde hyperéchogène, hypoplasie de membre. Très rarement, anomalies ophtalmologiques (microphtalmie), agénésie du corps calleux, anomalies cutanées, foie hyperéchogène et oligoamnios.

E- A la naissance:

Les manifestations cliniques observées chez le nouveau-né se résument en une triade

 Atteintes cutanées (lésions actives, cicatrices, hyper- ou hypopigmentation, aplasie ectodermique),

 Atteintes oculaires (choriorétinite, microphtalmie, atrophie optique) le retard de croissance fœtale et mort fœtale ont également été rapportés[47], [48].

VII. Lors de la transmission en péripartum : infection néonatale proprement dite[15], [40], [41], [42], [47], [48]:

Il s’agit d’une infection très rare mais très grave ayant une mortalité et morbidité élevées. L’apparition des signes cliniques se fait en moyenne entre j5 et j12 jusqu’à j17 selon les dernières mises à jour de vie: Le nouveau-né n’est quasiment jamais symptomatique à la salle d’accouchement ni durant le séjour en maternité. La reconnaissance des symptômes d’alerte s’avère primordiale et décisive pour une prise en charge précoce et efficace du nouveau-né : il s’agit de tout syndrome fébrile sans cause bactérienne, avec troubles neurologiques (présents dans 47 % des cas : troubles de la conscience, convulsions, hyporéactivité), vésicules cutanées, insuffisance hépatique et/ou pneumonie. Cependant, les signes de début ne sont pas spécifiques lorsque les lésions cutanées manquent, et la fréquent eabsence d’historique d’herpès maternel au moment de l’accouchement favorise le retard au diagnostic.

On distingue trois formes cliniques :

 Forme localisée atteinte cutanéomuqueuse et/ou oculaire (45%)  Forme localisée au système nerveux central (30 %)

 Forme disséminée (25 % des cas)

 Lors de la transmission en postpartum :

L’infection post-natale cause des symptomatologies d’infections néonatales similaires à celles des infections acquises en peripartum.

VIII.

Diagnostic virologique:

L’infection génitale herpétique sous ses différentes formes est le plus souvent assez évocatrice pour que le diagnostic clinique seul soit suffisant. Néanmoins, il existe des situations où ce diagnostic peut être pris en défaut soit par manque de sensibilité (excrétion asymptomatique) soit par manque de spécificité (nombreuses formes atypiques) notamment dans le cas des ulcérations génitales dont la différenciation entre ses différentes étiologies, infectieuses non infectieuses, s’avère capitale. De plus, cette infection peut dans certains cas être grave, soit en raison du terrain (femme enceinte, nouveau-né, immunodépression), soit en raison de la localisation et il conviendra de s’appuyer largement sur le diagnostic virologique pour prouver cette infection avec certitude afin de pallier les faux positifs et les faux négatifs. Le diagnostic virologique a longtemps été considéré comme inadapté à une prise en charge efficace de la pathologie herpétique : lenteur, coût et faisabilité de l’isolement, absence de test de détection « rapide » d’antigène, sérologie non informative dans une pathologie latente. Cependant, le développement et la commercialisation récente de nouvelles techniques doit nous inciter à réviser notre position et ainsi démystifier le diagnostic biologique de l’herpès.

Plusieurs tests au niveau du laboratoire sont disponibles pour le diagnostic de l’infection génitale par l’HSV et ils se divisent en 2 catégories :

 Ceux permettant la détection virale (détection d’antigènes, culture virale et Techniques d’amplification des acides nucléiques)

 Ceux permettant la détection d’anticorps spécifiques de type contre le VHS-1 et VHS-2 au niveau sanguin (sérologie spécifique de type).

 Recommandations du diagnostic virologique :

 Le diagnostic de l’herpès génital au laboratoire est recommandé dans diverses situations :

 Confirmation de l'herpès génital cliniquement suspecté.  Présentation variable de l'herpès génital.

 Infection grave nécessitant un diagnostic rapide sensible et spécifique

 Infection atypique ou asymptomatique (herpès génital) où des mesures préventives s’imposent (prévention de la transmission materno-foetale et dépistage précoce de l’herpès néonatal)

 Complications extra-génitales de l'herpès génital.

 Diagnostic différentiel avec d'autres infections sexuellement transmissible ulcéreuses.  Infections chroniques où une information au patient sur l’histoire naturelle de sa

maladie est importante.

 Diagnostic différentiel avec d'autres ulcérations génitales dans le cadre des dermatoses (maladie de Crohn, syndrome de Behçet ou éruption médicamenteuse fixe).

1. Prélèvements :

La sensibilité des tests de détection virale dépend de la qualité du prélèvement, de sa conservation et de son transport au laboratoire dans des conditions optimales.

Les spécimens adéquats pour la détection virale sont l’écouvillonnage ou la biopsie d’une lésion cutanée ou muqueuse telles que l’endocol, le vagin, l’urètre, et le rectum.

i. Ecouvillons:

Les différents types d’écouvillons sont énumérés ci-dessous :

 Les écouvillons acceptables : Dans un souci de simplification pour le professionnel

effectuant le prélèvement, il importe d’uniformiser le type d’écouvillon choisi dans chaque milieu pour que ce dernier soit adéquat.

 Écouvillons recommandés :

 écouvillon de dacron  écouvillon de rayonne

 écouvillon en nylon velouteux (flocked swab)  avec tige en plastique ou en aluminium  Écouvillons mis en garde :

 écouvillons de coton : l’utilisation de ce type d’écouvillons n’est pas mise hors de toute doute pour la recherche de l’HSV. Une étude, réalisée en 1980 et qui a bénéficié de l’intérêt de plusieurs microbiologistes, avait pour but de quantifier la baisse de l’inoculum de l’HSV-2 à divers intervalles de temps lorsque le virus était conservé à 4°C dans des suspensions contenant différentes fibres d’écouvillons. Cette étude a démontré :

 Une baisse de concentration de l’HSV-2 comparable pour les suspensions contenant du coton, du polyester, du dacron, de la rayonne et celle sans fibres (témoin).

 Les titres viraux de l’HSV-2 avaient subi une baisse significative dans les suspensions de coton ayant subi une sonication après conservation à 4°C durant 24 heures.

Certains auteurs se sont appuyés sur cette étude pour ne pas recommander l’utilisation d’écouvillons de coton pour effectuer une recherche de l’HSV. Toutefois, ce type d’écouvillon figure comme alternative acceptable dans le guide du laboratoire de l’Organisation mondiale de la santé (OMS).

Compte tenu qu’il existe sur le marché des écouvillons de polyester ou contenant d’autres fibres synthétiques ayant démontré des performances fiables pour cette recherche virale, il est préférable de ne pas utiliser d’écouvillon de coton pour rechercher l’HSV (accord professionnel).

 Les écouvillons inacceptables :

Les écouvillons d’alginate de calcium sont toxiques pour plusieurs virus enveloppés, interfèrent avec les tests d’immunofluorescence et sont inhibiteurs pour les TAAN

L’étude citée précédemment a démontré une baisse significative du nombre des particules virales de l’HSV lorsque celui-ci était en contact plus de 6 heures avec l’alginate de calcium. Il semblerait que l’alginate de calcium se lie à l’HSV, le rendant non infectieux.

Les tiges en bois ne doivent pas être utilisées, car elles peuvent contenir des toxines et des substances inhibitrices et peuvent absorber une certaine quantité du liquide.

Figure 9 : Conservation de l’HSV avec des fibres d’écouvillon : effet sur le décompte viral[49]

Les écouvillons (rayonne, coton, Dacron, polyester et alginate de calcium) ont été finement découpés et 1 g de chacun a été mélangé avec 4 ml de milieu Eagle. Puis, 0,1 ml de HSV-2 a été ajouté à chaque suspension. Les suspensions ont été agitées avec un mélangeur magnétique, et à des intervalles de 0,3 ml, des aliquotes ont été prélevées et centrifugées à 1,000 g pendant 15 min à 4 ° C avant que le virus résiduel ne soit quantifié dans les cellules rénales Vero dans des plaques de microtitration pour culture tissulaire. Chaque point est la moyenne de huit expériences. On remarque une chute de la courbe qui représente l’écouvillon en alginate de calcium contrairement aux autres échantillons. Ce qui signe la toxicité de cet écouvillon pour l’HSV-2

 Milieux de transport:

Différents milieux de transport sont disponibles et destinés à la recherche virale. Ces milieux existent sous forme liquide et sont nécessaires pour :

 Éviter la dessiccation du spécimen

 Préserver la viabilité de l’HSV et l'intégrité des acides nucléiques  Retarder la croissance de microorganismes contaminants.

Le milieu de transport viral contient les éléments suivants :

 Des protéines stabilisatrices (albumine sérique bovine ou gélatine)

 Des agents antimicrobiens pour minimiser la contamination bactérienne et fongique (gentamicine, pénicilline, streptomycine, vancomycine, amphotéricine B ou nystatin)  Une solution saline équilibrée pour maintenir un pH neutre, ainsi qu’un indicateur de

pH.

 Trois à cinq billes de verre qui facilitent la libération du virus des cellules et de l’écouvillon lors de l’agitation du liquide (vortex).

 Cependant, Il ne doit pas contenir d’inhibiteurs qui interfèreraient avec les TAAN. Les tubes de transport contiennent habituellement 2 à 3 ml de liquide. Certains contiennent un plus grand volume de liquide (5 à 7 ml) pour les spécimens tissulaires ou de biopsie. Il est important d’employer le plus petit volume nécessaire lorsqu’un écouvillon est utilisé afin d’éviter un effet de dilution qui pourrait diminuer la sensibilité des tests effectués.

Figure 11 : écouvillons et son milieu de transport spécifique[51]

Le clinicien doit suivre les recommandations fournies par le laboratoire concernant le type de milieu de transport à utiliser pour la recherche de l’HSV et l'entreposage du milieu de transport avant, pendant et après le prélèvement de l'échantillon clinique.

Les deux types d’herpès peuvent être récupérés par écouvillonnage cutanéo-muqueux directement à partir des lésions manifestes ou à partir des sites cutanéo-muqueux génitaux précédemment infectés chez les patients présentant une infection asymptomatique.

Pour collecter des échantillons de lésions, un écouvillon acceptable pour le prélèvement est utilisé, préférentiellement l’écouvillon en nylon car ses fibres de nylon perpendiculaires jouent le rôle d’une brosse douce qui permet une meilleure collecte et libération des prélèvements.

Les étapes suivantes sont nécessaires pour la qualité d’un bon prélèvement :

 Enlever les débris nécrotiques et l’exsudat des muqueuses ou des lésions avant le prélèvement sans faire saigner préférablement.

 Nettoyer le site à prélever avec de la saline physiologique stérile afin d’éviter la contamination microbienne qui peut interférer avec la culture.

 Ne pas utiliser d’antiseptique.

 Pour les lésions récentes et actives, la collectiondu liquide des vésicules ou d’exsudat est la méthode de choix puisqu’il contienne une haute concentration virale. Ceux-ci se fait avec l’une des 2 méthodes suivantes :

 Aspirer du liquide de la vésicule avec une seringue à tuberculine et rincer le contenu de la seringue dans 1 ml de milieu de transport liquide.

 Rompre la vésicule avec une aiguille stérile et collecter le liquide à l’aide d’un écouvillon, puis frotter la région vigoureusement afin de prélever les cellules infectées à la base de l’ulcère.

 Si plusieurs vésicules ou lésions sont présentes, effectuer un prélèvement sur plusieurs sites afin d’augmenter les chances de retrouver le virus.

 Comme les différents milieux de transport sont adaptés pour recevoir un seul écouvillon, utiliser un tube de milieu de transport pour chaque échantillon prélevé. Autrement, si plusieurs

écouvillons sont insérés dans un seul tube, le bouchon risque de ne pas fermer hermétiquement et entrainer une perte de liquide.  Pour les lésions non vésiculeuses ou non pustuleuses :

o Prélever les cellules à la base de la lésion avec un écouvillon humidifié avec de la saline physiologique stérile.

o Les monographies des milieux de transport indiquent clairement qu’il n’est pas recommandé d’utiliser le liquide contenu dans le tube pour humidifier l’écouvillon avant d’effectuer le prélèvement.

 Les écouvillons doivent être déchargés ou transportés dans un milieu de transport approprié :

 Enlever le bouchon du tube de transport en évitant de le contaminer  Insérer l’écouvillon dans le tube

 Casser l’écouvillon dans le milieu de transport

 Identifier correctement le tube et inscrire les informations requises par le laboratoire serveur

Figure 13 : Les différentes étapes du prélèvement vaginal[53].

ii. Prélèvement sanguin: tube sec transporté à température ambiante au

iii. LCR par ponction lombaire

 Généralement pratiquée entre L4-L5 ou L5-S1, exceptionnellement chez les nouveau-né par ponction tranfontanellaire ou ponction ventriculaire directe

 Matériel parfaitement stérile, de préférence à usage unique  Asepsie rigoureuse

 Conservation et stockage des prélèvements :

La conservation du spécimen se fait selon les recommandations ci-dessous :d’après le manuel de référence en microbiologie Garcia et le CLSI qui recommandent que

 Le spécimen doit soit être réfrigéré (2 à 8°C) ou gardés sur glace suivant le prélèvement et durant le transport au laboratoire dans le meilleur délai possible

 Si on prévoit un délai de plus de 48 heures avant l’arrivée au laboratoire, il est préférable de congeler le spécimen à -70°C et d’éviter la congélation à plus haute température mais surtout d’éviter le cycle congélation-décongélation : Des études ont démontré que, pour les virus en général, la perte d’infectiosité est supérieure quand la conservation est à -20°C plutôt que -70°C ou plus froid.

 Le document de l’OMS précise que la culture est recommandée dans les situations où il est possible d’expédier le spécimen au laboratoire dans les 4 heures suivant le prélèvement. Au-delà de ce délai, le spécimen doit être réfrigéré et acheminé au laboratoire sur glace, au maximum 48 heures après avoir effectué le prélèvement[54].

2. Techniques de recherche directe de l’HSV : a. Culture cellulaire:

IX. Généralités et performances :

La culture cellulaire avec typage viral a été, jusqu’à la diffusion de la PCR en temps réel, la technique incontournable, considérée comme le gold-standard par les laboratoires pour le diagnostic direct de l’infection herpétique. Cependant, elle demeure un test diagnostic abordable et primordial dans la pratique courante compte tenu des limites de sa première rivale. La culture virale reste la seule technique qui permet d’isoler la souche virale et donc d’effectuer ultérieurement un antivirogramme grâce à des tests de sensibilité aux antiviraux et/ou la réalisation du génotypage de résistance en identifiant des mutations géniques au niveau de UL23 ET UL30. La spécificité de cet examen est excellente et avoisine les 100 % si un test de confirmation est effectué. Toutefois, en raison de la forte positivité de certains échantillons, le risque de contamination croisée en culture cellulaire existe ; ce qui justifie les bonnes pratiques de travail et de décontamination afin de minimiser ce risque. Ainsi, si la spécificité de la culture virale est très flatteuse, sa sensibilité reste discutable et conditionnée par :

 Le maintien de la chaîne de froid lors de la conservation et du transport du spécimen  Les lignées cellulaires utilisées

 Le type des lésions prélevées  Le stade de l’infection

Tableau V : Sensibilité de la culture virale en fonction du stade de l’infection/types des

lésions[16], [29]

X. Principe de la culture virale : XI. Culture non orientée :

La culture virale consiste à inoculer le spécimen sur des lignées cellulaires permissives pour le virus de l’herpès simplex. A partir d’échantillons cliniques, différents types de cellules peuvent être utilisés pour l’isolement de ce virus et parmi lesquels :

 les cellules Vero (cellules du rein de singe)

 les cellules HEp-2 (cellules de carcinome laryngé humain)

Stade de l’infection/types des lésions Sensibilité

Primo-infection 80 % Récurrence 25-50 % Lésions vésiculeuses Lésions pustuleuses Lésions ulcéreuses 94 % 87 % 70 % Lésions croûteuses 25 %

 les cellules de rein de lapin

 les cellules ML (cellules du poumon de vison)

 les cellules A-549 (cellules du carcinome épidermoïde du poumon humain)  les cellules HNK (cellules du rein néonatal humain)-les fibroblastes diploïdes humains

(cellules MRC-5)

A partir des échantillons cutanéo-muqueux, l’effet cytopathique (ECP) causé par l’HSV se développe usuellement en 24-72h après l’inoculation. Une lecture quotidienne du tapis cellulaire est effectuée à la recherche de cet effet qui se caractérise par des cellules bien rondes en foyer. Le temps d’incubation dépend de la richesse de l’échantillon clinique en virus. Les cultures doivent être conservées jusqu’à sept à dix jours avant d’être rendues

négatives en l’absence de détection virale.

Tout effet cytopathique doit être confirmé. Cette confirmation se fait par l’intermédiaire d’un test d’immunofluorescence directe en utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre des

antigènes spécifiques de type marqués à la fluorescéine ce qui permet éventuellement de différencier l’infectionl’ infection par l’HSV type 1 et type 2[16], [29], [49].

XII. Culture orientée :

La culture orientée ou la culture rapide est une méthode de culture avec centrifugation combinée avec un marquage, par des anticorps monoclonaux spécifiques de type.

Cette technique est réalisée avant que l’effet cytopathique n’apparaisse dans le but de réduire le temps d’isolement viral. Ainsi, La culture rapide permet de réduire le temps de culture à seulement 16-48h[49].

Figure 14 : effet cytopathique de l’HSV en culture cellulaire (culture non orientée ) [11]

Les cellules épithéliales de rein de singe et les fibroblastes humains embryonnaires sont permissifs aux HSV. Initialement, les cellules sont adhérentes et apparaissent confluentes en nappe lorsqu’elles ne sont pas infectées (A, B). L’effet cytopathique des HSV, rapidement observable, est fait de cellules ballonnisées et réfringentes (grossissement fois 40) (C, D)

Figure 15 : Étapes de la culture virale par centrifugation sur lamelle (culture orientée) [55]

b. Biologie moléculaire :Détection du génome viral par réaction de polymérisation en chaine (PCR):

XIII. Avantages et performances :

La détection de l’HSV par les méthodes d’amplification d’acides nucléiques (TAAN) qui reposent pour la plupart sur la PCR (polymerase chain reaction), s’est largement diffusée et remplace vraisemblablement progressivement la culture grâce à sa sensibilité 95–98 % mais aussi sa spécificité 95–99 %. La PCR présente en effet de nombreux avantages comparativement à la culture virale :

 plus grande sensibilité-plus grande rapidité-plus grande simplicité de réalisation -une moindre dépendance aux conditions de transport et de stockage des prélèvements -une détection des particules virales non viables (la stabilité des acides nucléiques facilite le transport des échantillons)

 une possibilité de détecter une co-infection par les deux types de l’HSV[40], [49].

Une étude[56] réalisée en 2003, a été dédiée à la comparaison entre le taux de détection de l’HSV par PCR en temps réel et par culture virale dans 36 471 prélèvements cutanéo-muqueux (différentes localisations, différents stades de lésions) issus de 296 patients infectés par l’HSV-1 et/ou HSV-2 (confirmés sérologiquement). Pour cela, les prélèvements ont tous été testés par PCR et culture :

 Sur 4 464 prélèvements ayant obtenu au moins un test positif : 76 % ont été positifs uniquement par PCR -1 % uniquement par culture 23 % avec les deux techniques.

 Comparée à la PCR, la culture a obtenu 76 % de résultats faussement négatifs

 Comparée à la culture, la PCR a obtenu 1 % de faux négatifs démontrant clairement la sensibilité très supérieure de la PCR.

Parallèlement, sur plus de 1 000échantillons de patients négatifs pour l’HSV-1 et l’HSV-2, la PCR n’a obtenu aucun résultat positif, soit une excellente spécificité, de 100 % pour cette étude. Toutefois, et tout comme la culture virale, la sensibilité du TAAN est affectée par l’âge des lésions et leur morphologie lors du prélèvement. Une étude[57] effectuée chez des patients avec clinique suggestive d’herpès génital, dans le but aussi de comparer entre les deux techniques, a démontré :

 un taux de détection global de l’HSV par TAAN 24 % supérieur à celui par culture.  une augmentation de la sensibilité du TAAN comparativement à la culture de 13 % pour les lésions vésiculeuses, de 27 % pour les ulcères et de 20 % pour les lésions croûtées

XIV. Principe de la PCR :

Cette technique consiste à détecter l’HSV par l’amplification d’une région génétique propre au virus (ADN polymérase, thymidine kinase, glycoprotéine B, C, D, G) et la caractérisation du type par digestion enzymatique, par sonde spécifique ou par détermination de la température de fusion. De nombreux réactifs sont disponibles, et en général reposent sur les principes de la PCR temps-réelpermettant d’effectuer conjointement la détection et la

quantification de l’ADN viral grâce à l’utilisation d’une sonde fluorescente et permettant aussi de diminuer le risque de contamination par les produits amplifiés grâce à l’utilisation de systèmes clos empêchant les manipulations post-amplification évitant ainsi les faux positivescomparativement avec les techniques de PCR « classiques ».En plus, les faux négatifs sont aussi possibles avec les différentes TAAN et qui sont secondaire à :

 la présence d’inhibiteurs dans le spécimen  un prélèvement de mauvaise qualité  une faible quantité de particules virales

 des variations de séquences dans les régions ciblées par les amorces.

En plus, à côté des techniques conventionnelles de PCR temps-réel qui se font en deux temps et qui prennent quelques heures (fonction de l’organisation des laboratoires), se sont développés des automates qui permettent l’extraction du génome et l’amplification en une étape et d’obtenir ainsi un résultat qualitatif en moins de 2 heures.Avec ces techniques, la différentiation HSV-1 et HSV- 2 est en général systématique. Malgré ses avantages très flatteuses, l’utilisation de la PCR reste limitée du point de vue coût élevé del’équipement et aussi le test, permettant à la méthode de culture virale de garder toute son importance[40], [52], [56]–[58],[59].

c. Examen cytologique et détection antigénique :

Ces méthodes visent la détection directe de l’HSV par :

 Les changements caractéristiques des cellules infectées (frottis de Tzanck) ou  La détection d’antigènes communs ou spécifiques aux HSV-1 et HSV-2 par

immunofluorescence.

Ces méthodes demandent moins d’expertise que la culture ; elles peuvent être pratiquées par les laboratoires qui ne peuvent maintenir des lignées cellulaires, par les laboratoires éloignés pour lesquels les conditions et délais de transport des spécimens seraient sous-optimaux pour la culture virale ou lorsqu’un résultat rapide est nécessaire. Bien que leur sensibilité soit moindre, ils demeurent une alternative à la culture virale ou au TAAN [40], [58].

XV. Examen cytologique : frottis de Tzanck, coloration Papanicolaou ou Romanovsky:

Ces tests consistent en une coloration des cellules épithéliales afin de mettre en évidence des changements caractéristiques causés par l’HSV et qui sont parfois visibles, à savoir la présence de cellules géantes multinucléées avec inclusions virales, mais sans pouvoir différencier entre les deux types. Toutefois, ces tests manquent de sensibilité et de spécificité et ne sont donc pas recommandés de routine comme tests diagnostiques d’une infection génitale herpétique.