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Submitted on 18 Sep 2018

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Complexe SWI/SNF et cancer _ Altérations génétiques et anomalies métaboliques

Julien Masliah-Planchon

To cite this version:

Julien Masliah-Planchon. Complexe SWI/SNF et cancer _ Altérations génétiques et anomalies métaboliques. Biochimie [q-bio.BM]. Université Paris Saclay (COmUE), 2018. Français. �NNT : 2018SACLS112�. �tel-01876474�

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Remerciements

Je tiens en premier lieu à exprimer toute ma reconnaissance à Olivier Delattre pour m’avoir acueilli au sein de son laboratoire et avoir accepté de diriger cette thèse.

Je remercie également Pascal FERRE et Michel VIDAUD qui ont accepté d’assumer la tâche de rapporteur de ce manuscrit ainsi que Maria Chiara MAIURI et Ivan BIECHE pour avoir examiné ce travail et Christian AUCLAIR pour avoir accepté de présider ce jury de thèse.

Je souhaite également remercier tous les membres de l’unité INSERM U830 qui ont participé à ce travail pour leur disponibilité et leurs conseils avisés.

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Table des matières

Introduction ... 5

Implication du complexe SWI/SNF dans le remodelage de la chromatine ... 9

La méthylation des histones ... 9

L’acétylation des histones ... 12

Les éléments cis-régulateurs définis par leur composition en marque d’histones ... 14

La méthylation de l’ADN ... 17

Les complexes de remodelage de la chromatine ... 19

Implication du complexe SWI/SNF en oncologie ... 21

Les tumeurs SMARCB1-déficientes ... 21

Les tumeurs rhabdoïdes ... 21

Modèle murin de tumeurs rhabdoïdes ... 24

Les tumeurs SMARCB1-déficientes non rhabdoïdes ... 25

Les tumeurs SMARCA4-déficientes ... 29

Les tumeurs rhabdoïdes SMARCA4-déficientes ... 29

Les carcinomes à petites cellules de l'ovaire de type hypercalcémiant (SCCOHT) ... 30

Les sarcomes thoraciques SMARCA4-déficients ... 31

Les médulloblastomes ... 32

Reprogrammation métabolique dans les cancers ... 34

Place du glucose dans le métabolisme et effet Warburg ... 35

Altérations métaboliques observées dans les cancers... 37

Voie de la biosynthèse de la serine dans les cancers ... 40

Résultats ... 50

Discussion et perspectives ... 77

Conclusion ... 84

Abréviations ... 85

Références bibliographiques ... 87

Annexes ... 101

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Introduction

Le complexe SWI/SNF est un complexe multi-protéique de remodelage de la chromatine qui participe à la régulation épigénétique de l’expression des gènes. Ce complexe est composé d’une douzaine de sous-unités incluant celles encodées par les gènes SMARCB1 et SMARCA4. L’avènement des technologies de criblage moléculaire à haut débit a permis de montrer que les altérations du complexe SWI/SNF concernent un grand nombre de néoplasies très diverses. Ces altérations sont en effet présentes dans plus de 20% des cancers humains ce qui fait du complexe SWI/SNF un acteur majeur en oncologie (Masliah-Planchon et al., 2015).

Les gènes codant les sous-unités du complexe SWI/SNF ont été identifiés initialement chez la levure Saccharomyces cerevisiae en criblant des souches mutantes incapables de changer de type sexuel (appelés gènes de la famille SWI pour mating type switching) ou de métaboliser le saccharose (appelés gènes de la famille SNF pour sucrose non fermenting) (Winston and Carlson, 1992). Des études génétiques ont par la suite montré que ces différentes protéines forment un seul et même complexe (Côté et al., 1994).

L’implication du complexe SWI/SNF dans l’adaptation du métabolisme, et plus particulièrement celui des sucres, a ainsi été révélée dès les premiers travaux sur ce complexe chez la levure. En effet, les levures sont capables d’utiliser une grande variété de sucres comme source de carbone et d’énergie mais elles ne métabolisent pas les sucres complexes comme le saccharose (sucrose en anglais) en présence de glucose (Figure 1). Le glucose exerce donc une répression sur l’expression des gènes impliqués dans l’utilisation des sucres complexes dont le sucrose. Dans un milieu sans glucose, les souches de Saccharomyces cerevisiae sauvages sont toutefois capables de métaboliser le saccharose grâce à une enzyme appelée invertase qui catalyse l’hydrolyse du saccharose en glucose et fructose et est encodée par le gène SUC2 (Carlson and Botstein, 1982) (Figure 1). A l’inverse, il existe des souches de levures mutantes incapables de survivre en présence de saccharose uniquement. Ces

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capables d’exprimer SUC2 et d’utiliser le saccharose. La régulation de l’expression de SUC2 par ces gènes du complexe SWI/SNF chez la levure lui permet donc d’adapter son métabolisme aux sucres présents dans le milieu.

Figure 1 : L’expression des gènes SNF2 et SNF5 du complexe SWI/SNF chez la levure peuvent lever la répression de l’expression du gène SUC2 qui code l’invertase capable de transformer le saccharose en glucose et fructose.

Ces découvertes réalisées chez la levure au début des années 80 furent les premières à souligner l’implication du complexe SWI/SNF dans le métabolisme cellulaire. Au cours de l’évolution, le nombre de sous-unités composant le complexe SWI/SNF ainsi que le nombre de paralogues a augmenté (Hargreaves and Crabtree, 2011). Cela a permis aux eucaryotes supérieurs de présenter une véritable diversité de complexes SWI/SNF possibles dont le but est d’établir des programmes d'expression génique spécifiques d’un stade de développement donné ou d’un type cellulaire donné par exemple. Pour autant, plusieurs études ont suggéré que le rôle du complexe SWI/SNF a été conservé au cours de l’évolution de la levure jusqu’aux mammifères (Koster et al., 2015).

Dans les tumeurs humaines, les altérations du complexe SWI/SNF vont compromettre de nombreux mécanismes cellulaires impliqués dans la transformation maligne tel que le

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cycle cellulaire (Betz et al., 2002), l’oncogène c-MYC (Cheng et al., 1999), la voie Sonic Hedgehog (Jagani et al., 2010), la voie WNT / β-caténine (Mora-Blanco et al., 2014) et le complexe PRC2 (Wilson et al., 2010) entre autres.

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Le but de ce travail de thèse a été d’explorer les perturbations du complexe SWI/SNF qui découlent des mutations dans les gènes SMARCA4 et SMARCB1 et plus particulièrement leurs conséquences au niveau du métabolisme. Après l’introduction des différents concepts relatifs aux modifications épigénétiques incluant le remodelage de la chromatine par le complexe SWI/SNF, des différents types de tumeurs avec des altérations des gènes SMARCA4 et SMARCB1 et des phénomènes de dérégulations métaboliques qui s’opèrent au niveau des cellules cancéreuses, les résultats de mon travail de thèse seront présentés. Au cours de ce travail nous avons exploré, à partir d’un modèle cellulaire SMARCB1-déficient, si les altérations du complexe SWI/SNF sont associées à un dérèglement métabolique qui participerait à l’oncogenèse. A travers des analyses de transcriptome, de métabolome et de suivi de métabolites isotopiques entre autres, nous avons mis en évidence que la voie de la biosynthèse de la sérine est augmentée dans les tumeurs rhabdoïdes SMARCB1-déficientes.

Nous avons également observé que le sevrage en sérine ainsi que l’inhibition de la biosynthèse endogène de sérine inhibent la prolifération de notre modèle cellulaire. Ces résultats suggèrent que le ciblage de la voie de la biosynthèse de la sérine pourrait constituer une stratégie thérapeutique prometteuse dans les tumeurs rhabdoïdes voire, plus généralement, pour les tumeurs SWI/SNF-déficientes étant donné le rôle globale que semble jouer le complexe SWI/SNF dans l’homéostasie du métabolisme de la sérine comme nous allons le montrer.

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Implication du complexe SWI/SNF dans le remodelage de la chromatine

La chromatine est la structure au sein de laquelle se trouve l'ADN dans le noyau des cellules eucaryotes. La chromatine possède plusieurs niveaux d’organisation structurale dont le premier niveau de compaction correspond au nucléosome. Le nucléosome constitue en effet l'unité fondamentale de la chromatine et il est composé de 146 paires de bases d’ADN enroulées autour d’un octamère d'histones lui-même composé d’un assemblage de deux exemplaires de chacune des histones H2A, H2B, H3 et H4 (Kornberg, 1974; Kornberg and Thomas, 1974; Luger et al., 1997). Le niveau de compaction des nucléosomes, et donc de la chromatine, est déterminant pour une cellule car il va conditionner le niveau d’expression des gènes. En outre, la chromatine est une structure dynamique dont l’état de condensation est en perpétuel équilibre entre un état relâché et un état condensé. Cet équilibre dépend de diverses activités enzymatiques qui jouent un rôle essentiel dans la dynamique chromatinienne. Parmi les enzymes capables de modifier la chromatine, on distingue celles qui vont modifier les histones, celles qui influent sur la méthylation de l’ADN et enfin celles qui utilisent l’énergie de l’ATP pour modifier directement le niveau de compaction des nucléosomes comme le complexe SWI/SNF. La structure de la chromatine est donc régulée par une grande variété de mécanismes dit épigénétiques qui constitue un outil essentiel dans la régulation de l’expression des gènes. Ces dernières années, l’expansion massive des connaissances sur les acteurs épigénétiques a révélé le rôle prépondérant joué par les dérèglements de la structure chromatinienne dans le développement et la progression des cancers (Flavahan et al., 2017;

Morgan and Shilatifard, 2015). Enfin, le caractère réversible des modifications épigénétiques, contrairement aux modifications génétiques telles que les mutations, les délétions, les fusions et les amplifications, a ouvert la voie au développement d’inhibiteurs spécifiques de certains effecteurs épigénétiques en cancérologie (Popovic and Licht, 2012; Zaware and Zhou, 2017).

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influencer l'état de compaction de la chromatine, dont la phosphorylation, l'ubiquitination et la sumoylation (Huang et al., 2014; Ning et al., 2016).

La méthylation des histones est un processus par lequel un à plusieurs groupements méthyls sont transférés aux lysines ou aux arginines des histones. Cette modification post- traductionnelle des histones peut activer ou réprimer l’expression des gènes selon l’acide aminé modifié et le nombre de groupements méthyls ajoutés. Par exemple, la triméthylation de la lysine 27 de l'histone H3 (H3K27me3) est à l’origine d’une compaction de la chromatine non favorable à l’expression des gènes (Figure 2) (Barski et al., 2007; Wu et al., 2017).

L’histone méthyltransférase EZH2 (Enhancer of zeste homologue 2) est la sous-unité catalytique du complexe PRC2 (Polycomb repressive complex 2) impliqué dans la mise en place de cette marque H3K27me3 qui réprime la transcription (van der Vlag and Otte, 1999).

EZH2 favorise la formation des tumeurs en réprimant l'expression de nombreux gènes suppresseurs de tumeurs. Ainsi, des agents pharmacologiques ciblant spécifiquement l'activité enzymatique d’EZH2 ont montré leur utilité dans différents types de cancers (Comet et al., 2016).

A l’inverse, d’autres types de méthylation sont associés à un état ouvert de la chromatine comme la triméthylation de la lysine 4 de l'histone H3 (H3K4me3) qui est retrouvée au niveau des promoteurs des gènes exprimés (Figure 4) (Koch et al., 2007) et la méthylation de la lysine 79 de l'histone H3 (H3K79me) (Figure 2). Les protéines de la famille de l'histone-lysine N-méthyltransférase 2 (KMT2) qui catalysent la méthylation de la lysine 4 de l'histone H3 dans des régions régulatrices importantes du génome permettent ainsi de moduler la structure de la chromatine pour favoriser l'accessibilité à l'ADN. Bien que cette famille de protéines aient été initialement appelée MLL (pour mixed-lineage leukemia) en raison de leur implication dans les leucémies, des études récentes de séquençage nouvelle génération ont révélé que les gènes de la famille KMT2 / MLL sont également fréquemment mutés dans de nombreux types de cancers solides (Kudithipudi and Jeltsch, 2014; Morgan and Shilatifard, 2013; Rao and Dou, 2015). De la même façon, la protéine DOT1L qui catalyse la méthylation de la lysine 79 de l'histone H3 (H3K79me) est recrutée pour activer la transcription de nombreux gènes (Min et al., 2003). En effet, la marque H3K79me créée par DOT1L au niveau de la région promotrice des gènes est corrélée à un niveau d’expression élevée (Steger et al., 2008). Il a été montré que l'inhibition de DOT1L inhibe la prolifération des cellules cancéreuses dans les cancers du sein (Zhang et al., 2014) et dans les leucémies (Daigle et al., 2013).

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Figure 2 : La méthylation des histones peut être associée à une activation ou à une répression transcriptionnelle.

Par exemple, la marque H3K27me3 qui est créée par la sous-unité EZH2 du complexe PRC2 est une marque répressive associée à une inhibition transcriptionnelle. A l’inverse, les marques H3K4me3 et H3K79me, respectivement mise en place par les méthylases de la famille KMT2/MLL et DOT1L sont des marques activatrices associées à une forte expression génique.

A l’opposé des enzymes qui rajoutent des groupements méthyls sur les queues amino- terminales des histones, d’autres classes d’enzymes ont pour fonction de déméthyler les histones. Depuis la découverte de la première histone déméthylase en 2004, l'histone déméthylase spécifique de la lysine 1 (LSD1 encodée par le gène KDM1A) (Shi et al., 2004), plusieurs classes de déméthylases ont été mises en évidence et sont souvent dérégulées dans

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L’acétylation des histones

La réaction d'acétylation correspond à un transfert d'un groupement acétyl depuis l'acétylcoenzyme A sur un substrat qui peut être de diverses natures, protéique par exemple.

Sur les histones, l’acétylation a lieu sur les résidus lysines des queues amino-terminales et est catalysée par des histone acétyltransférases (HAT ; Figure 3) (Roth et al., 2001). D’un point de vue fonctionnel, l'acétylation du groupement amine des lysines neutralise les charges positives et affaiblit ainsi les interactions entre les queues amino-terminales des histones et l'ADN chargé négativement. Cette modification conduit à une configuration chromatinienne plus ouverte qui facilite la transcription.

L’acétylation des histones est donc assurée par les HAT dont deux représentants majeurs de cette famille sont les protéines CBP et P300 respectivement encodées par les gènes CREBBP et EP300. Les mutations inactivatrices au niveau constitutionnel de CREBBP, et dans une bien moindre mesure EP300, sont responsables du syndrome de Rubinstein- Taybi. Cette maladie génétique à transmission autosomique dominante est caractérisée par un retard mental, une dysmorphie et une prédisposition à développer des cancers dans l’enfance (Milani et al., 2015). En dehors du syndrome de Rubinstein-Taybi, des mutations des gènes CREBBP et EP300 sont également observées au niveau somatique dans des hémopathies malignes et dans diverses tumeurs solides (Attar and Kurdistani, 2017; Iyer et al., 2004). La nature inactivatrice des mutations des gènes CREBBP et EP300 suggère que ces gènes fonctionnent comme des suppresseurs de tumeurs et que la perte de fonction doit toucher les deux allèles pour aboutir à une inactivation complète dans les tumeurs. Cependant, la situation est plus complexe et cela est probablement lié au fait que CBP et P300 n’acétylent pas que les histones mais également de nombreuses autres protéines comme p53 par exemple (Gu and Roeder, 1997). Une étude récente a montré qu’un seul allèle de CREBBP était généralement inactivé dans les lymphomes et que l’haplo-insuffisance (perte de fonction d’un seul allèle) de CREBBP était capable d’altérer le profil d’acétylation des histones pour mener à un effet oncogénique (Zhang et al., 2017). Il est donc possible qu’une baisse du niveau des protéines CBP ou P300, plutôt qu’une absence complète, soit capable de perturber l’acétylation des histones pour favoriser l’oncogenèse.

La désacétylation des histones est catalysée par des histone désacétylases (HDAC) et est à l’inverse plutôt associée à une chromatine condensée et à une répression transcriptionnelle. Le rôle important des HDAC dans le développement des cancers a été mis

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en évidence dès les années 70 avec l’observation que le butyrate de sodium, plus tard identifié comme un inhibiteur d’HDAC, provoquait la réversion d’un phénotype cellulaire cancéreux (Altenburg et al., 1976; Boffa et al., 1978; Riggs et al., 1977). A partir de ces observations, de nombreux inhibiteurs d’HDAC ont ensuite été mis au point. Des études ont également montré un effet potentialisant des inhibiteurs d’HDAC en association avec des chimiothérapies classiques ou avec de la radiothérapie (Ceccacci and Minucci, 2016; Dawson and Kouzarides, 2012).

L'acétylation des histones affecte donc directement la structure chromatinienne mais agit également comme un site de liaison pour des protéines qui peuvent réguler la transcription (Figure 3). En effet, les bromodomaines sont des domaines protéiques qui reconnaissent les lysines acétylées, tels que ceux des queues amino-terminales des histones (Dhalluin et al., 1999). Le bromodomaine permet donc l'ancrage de sa protéine à la chromatine acétylée pour aboutir ensuite au recrutement d'autres facteurs nécessaires à la transcription et/ou au remodelage de la chromatine (Jain and Barton, 2017). L'inhibition pharmacologique des protéines à bromodomaine montre une activité anti-cancéreuse dans divers types de tumeurs dont le neuroblastome (Puissant et al., 2013) ou le myélome (Delmore et al., 2011) et représente une option thérapeutique attrayante dans ces cancers.

Au final, l'acétylation des histones peut donc modifier la structure de la chromatine ainsi que sa fonction en fournissant des signaux de liaison pour les protéines à bromodomaine.

Ce mécanisme épigénétique joue donc un rôle essentiel dans la régulation de l’expression des gènes dans les cancers et leur ciblage (par les inhibiteurs d’HDAC et les inhibiteurs de bromodomaines) font maintenant partie de l’arsenal thérapeutique utilisé en cancérologie.

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Figure 3 : L’acétylation des lysines des histones permet de modifier la structure chromatinienne dans une conformation favorable à l’expression des gènes ainsi que la fixation des protéines à bromodomaine. HAT : Histone acétyltransférase ; HDAC : Histone désacétylase.

Les éléments cis-régulateurs définis par leur composition en marque d’histones

Les éléments cis-régulateurs sont des séquences d'ADN capables de moduler l'expression des gènes. Ils sont le plus souvent situés en amont du site d'initiation de la traduction et on peut distinguer les promoteurs, les enhancers qui permettent l'activation de certains gènes et les silencers qui sont quant à eux impliquée dans la répression des gènes.

Les enhancers sont des éléments génomiques situés à distances des gènes qui permettent une régulation spatio-temporelle précise de l'expression et en particulier des gènes impliqués dans le développement (Bulger and Groudine, 2011). Ils sont capables d'activer la transcription à de grandes distances (plusieurs Kb à plusieurs milliers de Kb) de leurs gènes cibles et comprennent des sites de liaison pour des facteurs de transcription multiples (Visel et al., 2009). Les enhancers sont définis par un enrichissement de la mono-méthylation de la

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quatrième lysine de l'histone H3 (H3K4me1) et de l'acétylation de la lysine 27 de l'histone H3 (H3K27ac) (Figure 4) (Heintzman et al., 2009). La présence de la marque d’histone H3K27ac distingue les enhancers actifs des enhancers inactifs qui contiennent uniquement la marque H3K4me1 (Creyghton et al., 2010). La mise en place de la marque d’histone H3K27ac au niveau d’un enhancer permet donc d’activer l’expression de son gène cible. Les enhancers représentent un mécanisme important pour réguler finement l'expression des gènes et leur dérégulation apparaît comme une composante clé dans l’oncogenèse. Par exemple, une étude sur des lignées de cancer du côlon a montré qu’une signature d’enhancers associée à un programme de transcription spécifique serait capable de favoriser la carcinogenèse du côlon (Akhtar-Zaidi et al., 2012). Ces enhancers dits "classiques" (par rapport aux super-enhancers décrits plus loin) ont été décrits pour la première fois dans le virus SV40 au début des années 1980 par leur capacité à modifier l'expression des gènes en recrutant des trans-régulateurs et l'ARN Polymérase II au niveau de gènes cibles (Banerji et al., 1981). Le terme de "super- enhancer" a ensuite été utilisé bien plus récemment pour décrire des régions chromatiniennes regroupant plusieurs enhancers avec des niveaux élevés d’acétylation de H3K27ac et de liaison à des facteurs de transcription. Les super-enhancers régulent l’expression de gènes plus particulièrement impliqué dans le maintien de l'identité cellulaire (Hnisz et al., 2013;

Whyte et al., 2013). L’implication des super-enhancers en cancérogenèse a été décrite peu de temps après leur caractérisation en 2013 (Lovén et al., 2013). La capacité des super-enhancers à cibler diverses voies de signalisation oncogéniques a été ensuite confirmée dans différents types de tumeurs dont les neuroblastomes (Boeva et al., 2017; van Groningen et al., 2017), les carcinomes adénoïdes kystiques (Drier et al., 2016), les leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) (Pelish et al., 2015) et les carcinomes du rein à cellules claires (Yao et al., 2017).

Les promoteurs sont des régions d’ADN situées à proximité du site d’initiation de la transcription sur lesquelles se fixe initialement l'ARN polymérase, avant de démarrer la transcription. Les promoteurs possèdent également une signature chromatinienne spécifique permettant de les identifier. Ainsi, alors que les marques H3K4me1 définissent les enhancers,

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de répression en l'absence de signaux de différenciation (Voigt et al., 2013). Cet état bivalent est maintenu par un équilibre entre l'activation conférée par les lysine méthyltransférases de la famille KMT2 / MLL (qui catalysent la triméthylation de la marque H3K4me3) et les protéines répressives du complexe PRC2 (qui catalyse la triméthylation de la marque H3K27me3).

Figure 4 : Schématisation des marques d’histone présentes au niveau des enhancers et des promoteurs et de leur profil d'immunoprécipitation de la chromatine couplée à un séquençage à haut-débit (ChIPseq). TF : Facteur de transcription.

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La méthylation de l’ADN

La méthylation de l'ADN est assurée par des méthyltransférases qui catalysent le transfert de groupements méthyls d'une S-adénosyl méthionine (SAM) sur les résidus cytosines des dinucléotides CpG. Cette méthylation des cytosines en 5-méthylcytosine (5mC) dans les régions promotrices des gènes inhibent leur transcription. Ainsi, une faible méthylation au niveau du promoteur d’un gène se traduit par une forte expression du gène, alors qu'un haut niveau de méthylation inactive le gène. De par son rôle essentiel dans la régulation de l’expression génique, la méthylation de l’ADN joue également un rôle central au cours du développement et de la cancérogenèse (Kulis and Esteller, 2010). Les cancers présentent souvent une hypométhylation globale de leur génome par rapport aux tissus sains (Feinberg and Tycko, 2004). Cependant, des hyperméthylations de régions génomiques plus spécifiques telles que les gènes VHL (Herman et al., 1994), BRCA1 (Mancini et al., 1998), CDKN2A (Merlo et al., 1995) ou RB1 (Simpson et al., 2000) ont été décrites comme étant responsables d’une sous-expression de ces gènes suppresseurs de tumeurs.

Les enzymes responsables de la méthylation de l’ADN sont au nombre de cinq chez l’homme et sont regroupées sous la dénomination de DNMT pour DNA méthyltransférase.

DNMT1 est principalement responsable du maintien de la méthylation de l'ADN au cours des divisions cellulaires successives alors que DNMT3A et DNMT3B sont plutôt responsables de la méthylation de l’ADN dite de novo qui correspond en l'établissement de nouveaux patterns de méthylation d'ADN se produisant par exemple lors du développement ou de la gamétogenèse (Okano et al., 1999). DNMT2 a été renommé TRDMT1 (TRNA Aspartic Acid Methyltransferase 1) car il s’agit d’une ARN méthyltransférase qui n’intervient donc pas dans la méthylation de l’ADN. DNMT3L n’a pas d’activité catalytique propre mais est capable de se lier à DNMT3A pour participer à la méthylation de l'ADN de novo (Jia et al., 2007). Les mutations des gènes DNMT1 et DNMT3A fréquemment observées dans les hémopathies malignes (Hou et al., 2012; Ley et al., 2010) ainsi que dans divers types de cancers solides (Scourzic et al., 2015) attestent que la méthylation de l’ADN joue un rôle important en

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thymine DNA glycosylase qui utilise la voie du base excision repair, vont ensuite éliminer les 5hmC générées par les TET pour aboutir à la réintroduction de cytosines non méthylées (He et al., 2011). En outre, les 5hmC sont mal reconnues par DNMT1 qui n'est alors pas capable d'effectuer la méthylation du brin d'ADN néosynthétisé au cours de la division cellulaire.

Ainsi, l’activité des enzymes de la famille TET se traduit par une déméthylation de l’ADN.

Les gènes de la familles TET, et en particulier TET2, sont eux aussi fréquemment mutés dans différentes néoplasies et en particulier dans des hémopathies malignes (Rasmussen et al., 2015; Yamazaki et al., 2015). Ces mutations inactivatrices de TET2 sont associées à une diminution du niveau de 5hmC et à une augmentation du niveau de 5mC. Les protéines TET sont des oxygénases dépendantes de l'α-cétoglutarate (α-CG) qui est produit à partir de l’isocitrate au cours du cycle de Krebs par l’isocitrate déshydrogénase (Figure 5). Les gènes IDH1 et IDH2 qui encodent deux des isoformes de l’isocitrate déshydrogénase sont fréquemment mutés dans les cancers et en particulier dans les gliomes (Yan et al., 2009) et les LAM (Mardis et al., 2009). Ces mutations confèrent à la protéine mutante la possibilité de synthétiser le 2-hydroxyglutarate (2-HG) à partir d'α-CG (Figure 5). Le 2-HG est un inhibiteur compétitif de l'α-CG et peut inhiber les oxygénases dépendantes de l'α-CG, comme les protéines TET. Dans les LAM, les mutations de TET2 et d’IDH1/2 sont mutuellement exclusives et les cas de LAM mutées pour TET2 ou IDH1/2 présentent une hyperméthylation similaire de leur génome (Figueroa et al., 2010). Ces résultats suggèrent que les mutations récurrentes qui confèrent la possibilité de produire du 2-HG par les isocitrate déshydrogénases ont le même effet au niveau de la méthylation de l’ADN que les mutations qui aboutissent à une perte de fonction des protéines de la famille TET.

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Figure 5 : Les mutations des gènes IDH1 et IDH2 confèrent à la protéine mutante la possibilité de synthétiser le 2-hydroxyglutarate (2-HG) à partir de l'α-cétoglutarate (α-CG). Le 2-HG est un inhibiteur compétitif de l'α-CG et peut inhiber les oxygénases dépendantes de l'α-CG comme les protéines TET. Les enzymes de la famille TET catalysent l’oxydation des 5-méthylcytosines (5mC) en 5-hydroxyméthylcytosines (5hmC) qui aboutit ensuite à une perte de la méthylation. Parmi les autres oxygénases dépendantes de l'α-CG on trouve également des enzymes impliquées dans la voie HIF/VHL et leur inhibition conduit à un état pseudo-hypoxique et à une augmentation de l’expression du VEGF.

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complexes de remodelage (Clapier and Cairns, 2009). La mobilisation des nucléosomes par les complexes de remodelage de la chromatine peut permettre la fixation de facteurs de transcription sur l'ADN et l’expression des gènes à proximité. Des combinaisons définies de sous-unités sont nécessaires pour réguler rigoureusement l'accessibilité de la chromatine et donc l’expression des gènes. Par conséquent, il n'est pas surprenant que leur dysfonctionnement soit fréquemment rapporté dans divers types de cancers. Il existe quatre familles de complexes de remodelage de la chromatine définies par la structure de leur sous- unité catalytique et des domaines protéiques qui la composent : les familles SWI/SNF, ISWI, CHD et INO80 (Figure 6). Par exemple, la protéine BRG1 du complexe SWI/SNF, encodé par le gène SMARCA4 possède un motif de type bromodomaine.

Figure 6 : Représentation des sous-unités catalytiques des quatre familles de complexe de remodelage de la chromatine (SWI/SNF, ISWI, CHD et INO80). HSA : helicase/SANT-associated domain ; Chromo : chromodomain ; DEXDc : DEAD-like helicase domain ; HELICc : Helicase superfamily c-terminal domain : SANT : Swi3, Ada2, N-Cor, and TFIIIB domain ; SLIDE : SANT-like domain ; Bromo : bromodomain.

Le complexe SWI/SNF est le mieux documenté des complexes de remodelage de la chromatine et son implication en cancérogenèse est indiscutable depuis la description de très nombreuses mutations de ses différentes sous-unités dans de nombreux types de cancers.

En amont de ce travail de thèse, nous avons réalisé un travail de recherche bibliographique et de synthèse pour colliger les données scientifiques de l’époque sur l’implication du complexe SWI/SNF dans la biologie des cancers. Ce travail a donné lieu a

HELICc Bromo

HSA DEXDc

HELICc DEXDc

HELICc DEXDc

HELICc

HSA DEXDc

Chromo

SLIDE SANT

SWI/SNF family

ISWI family

CHD family

INO80 family

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une publication d’un article de revue en 2015 dans Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease (Annexe 1) (Masliah-Planchon et al., 2015). Le manuscrit décrit de façon exhaustive les altérations de différentes sous-unités du complexe SWI/SNF dans divers types de cancers. A la lumière de la rédaction de ce manuscrit, nous avons observé que plusieurs types de cancers dits « à cellules claires » présentaient une fréquence élevée de mutations dans des gènes codants des membres du complexe SWI/SNF tel que ARID1A dans les carcinomes de l’ovaire ou de l’endomètre à cellules claires et PBRM1 dans les carcinomes du rein à cellules claires. Nous avions ainsi proposé que l’enrichissement de ce type histologique particulier lié à une accumulation de métabolites (glycogène ou de nature lipidique) pouvait suggérer que les altérations de gènes du complexe SWI/SNF pourraient être à l’origine d’une dérégulation métabolique dont nous savons qu’elle joue un rôle majeur dans l’oncogenèse.

Implication du complexe SWI/SNF en oncologie

Les tumeurs SMARCB1-déficientes

Les tumeurs rhabdoïdes

Les tumeurs rhabdoïdes ont été les premières tumeurs décrites comme ayant une altération dans un gène du complexe SWI/SNF il y a presque 20 ans (Versteege et al., 1998).

Ce sont des entités tumorales pédiatriques rares et extrêmement agressives. Elles surviennent très précocement à un âge médian inférieur à 1,2 an (von Hoff et al., 2011; Weeks et al., 1989) et la médiane de survie est inférieure à 2 ans (von Hoff et al., 2011). Les tumeurs rhabdoïdes touchent particulièrement le cerveau et le rein mais peuvent se développer possiblement au niveau de n’importe quel site anatomique. Au niveau moléculaire, ces tumeurs sont caractérisées par une inactivation bi-allélique du gène SMARCB1, observée dans

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histologique est caractéristique mais il existe de nombreuses variantes au sein des tumeurs rhabdoïdes et de nombreuses autres tumeurs peuvent avoir un aspect similaire rendant le diagnostic histologique compliqué. La perte d’expression de la protéine BAF47 (encodée par le gène SMARCB1) visible dans les cellules tumorales par immunomarquage constitue donc un critère diagnostic majeur (Figure 7).

Figure 7 : Aspect histologique caractéristique des tumeurs rhabdoïdes (image de gauche ; marquage à l’hématoxyline éosine safran) avec des nucléoles proéminents et des inclusions cytoplasmiques éosinophiles. La perte d’expression de la protéine BAF47 dans les cellules tumorales visible par immunohistochimie (image de droite) est également caractéristique des tumeurs rhabdoïdes.

La perte de SMARCB1 au niveau tumoral se traduit par une accélération anormale du cycle cellulaire (Betz et al., 2002; Zhang et al., 2002) et une activation aberrante des voies de signalisation SHH (Jagani et al., 2010), WNT/béta-caténine (Mora-Blanco et al., 2014) et du complexe PRC2 (Wilson et al., 2010) entre autres. En outre, des altérations inactivatrices mono-alléliques du gène SMARCB1 sont également retrouvées au niveau constitutionnel chez 30% des patients atteints de tumeurs rhabdoïdes (Bourdeaut et al., 2011; Bruggers et al., 2011) conférant ainsi un syndrome de prédisposition aux tumeurs rhabdoïdes (OMIM

#609322). La pénétrance est proche de 100% et seuls quelques rares cas d’individus adultes porteurs de mutations inactivatrices du gène SMARCB1 sans symptomatologie tumorale ont été décrits à ce jour.

Les tumeurs rhabdoïdes ont la particularité de présenter un fond génétique extrêmement stable. En effet, les tumeurs rhabdoïdes sont considérées comme les tumeurs

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avec le moins de mutations acquises (Lawrence et al., 2013) et, en dehors des altérations aboutissant à l’inactivation du gène SMARCB1, aucune autre altération génétique n’a été décrite de façon récurrente dans ces tumeurs (Figure 8).

Figure 8 : Profil génomique (image du haut) caractéristique d’une tumeur rhabdoïde ne montrant pas d’altération de nombre de copie en plus de la délétion homozygote du gène SMARCB1 (flèche rouge en 22q11.2). Le taux de mutations observées par séquençage d’exome dans une série de 3 083 tumeurs (image du bas) montre que les tumeurs rhabdoïdes (en rouge) présentent très peu de mutations (Lawrence et al., 2013).

Cette grande stabilité génomique est compatible avec la notion selon laquelle la

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Modèle murin de tumeurs rhabdoïdes

Nous avons récemment décrit un modèle de souris génétiquement modifiées qui développent des tumeurs rhabdoïdes intra-cérébrales.

L’administration de tamoxifène dans cette lignée de souris Smarcb1flox/flox;Rosa26-Cre permet d’inactiver le gène Smarcb1 de façon ubiquitaire mais au stade de développement voulu (suivant la date d’administration du tamoxifène). En effet, le stade de développement pendant lequel l’inactivation du gène Smarcb1 est réalisée chez ces souris a un effet considérable sur le phénotype qui en découle. L’administration de tamoxifène avant E6, à la naissance ou à l'âge de 2 mois montre le même effet que les phénotypes décrits précédemment (Guidi et al., 2001; Klochendler-Yeivin et al., 2000; Roberts et al., 2000), soit respectivement une létalité embryonnaire, une toxicité hépatique ou le développement de lymphomes T. Par contre, l’administration de tamoxifène entre E6 et E10 conduit dans 100% des cas à des tumeurs intra-crâniennes dont la morphologie et le profil d’expression sont compatibles avec les tumeurs rhabdoïdes cérébrales humaines (autrement appelées AT/RT pour atypical teratoid / rhabdoid tumor). Nous avons également mis en évidence que le profil d’expression de ces tumeurs murines se rapprochait de celui des progéniteurs neuronaux. En plus de la fenêtre étroite à un stade précoce de développement (entre E6 et E10) permettant la survenue de ces tumeurs, ces résultats suggèrent que les cellules à l’origine de ces tumeurs murines, et possiblement des AT/RT humaines, seraient des cellules neuronales (plutôt que gliales) et progénitrices (plutôt que matures). La description de ce modèle murin de tumeurs rhabdoïdes intra-crâniennes a été publiée dans la revue Nature Communications en 2016 (Annexe 2) (Han et al., 2016).

Depuis la publication de nos travaux, une autre équipe a généré différentes lignées de souris avec une inactivation conditionnelle du gène Smarcb1 à plusieurs stades de développement et/ou restreints à différents types de tissus (Vitte et al., 2017). Ces travaux ont confirmé que la perte de Smarcb1 doit survenir de façon précoce pour initier l’oncogenèse des tumeurs rhabdoïdes.

Le type cellulaire à l’origine des tumeurs rhabdoïdes aussi bien cérébrales qu’extra- cérébrales est encore à ce jour inconnu. Ainsi, les travaux visant à préciser l’identité de ces cellules devraient se révéler particulièrement bénéfiques pour approfondir notre compréhension de l’oncogenèse de ces tumeurs.

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Les tumeurs SMARCB1-déficientes non rhabdoïdes

Les altérations moléculaires du gène SMARCB1 ont été initialement décrites dans la tumeur rhabdoïdes de l’enfant (Versteege et al., 1998). Depuis lors, la perte d’expression de la protéine BAF47 (encodé par SMARCB1) en immunohistochimie a également été décrite dans divers de types de tumeurs très variées y compris chez l’adulte (Hollmann and Hornick, 2011). Parmi ces tumeurs, on dénote les schwannomes (Hadfield et al., 2008; Smith et al., 2014), les sarcomes épithélioïdes (Hornick et al., 2009; Modena et al., 2005), les carcinomes médullaires du rein (Cheng et al., 2008), les MPNST épithélioïdes (Hornick et al., 2009; Jo and Fletcher, 2015), les carcinomes naso-sinusiens SMARCB1-déficients (Agaimy et al., 2014, 2017; Bishop et al., 2014), et les chordomes pédiatriques indifférenciés (Antonelli et al., 2017; Hasselblatt et al., 2016; Mobley et al., 2010). Toutes ces tumeurs partagent plus ou moins un aspect pseudo-rhabdoïde et le diagnostic différentiel peut se révéler compliqué. En outre, le pronostic de ces différentes tumeurs est très variable et l’existence de ces différentes tumeurs SMARCB1-déficientes pose donc un véritable problème diagnostic.

Les carcinomes médullaires du rein

Parmi ces tumeurs SMARCB1-déficientes, les carcinomes médullaires du rein (CMR) sont des tumeurs très agressives et rares du rein qui surviennent habituellement chez les adultes jeunes et porteurs d’un trait drépanocytaire. Cette entité tumorale ayant été décrite relativement récemment (au début des années 90), l'origine et la pathogenèse des CMR ne sont pas encore complètement élucidées mais une perte d’expression de la protéine BAF47 a été décrite en 2008 par des techniques d’immunohistochimie (Cheng et al., 2008). Les bases moléculaires qui aboutissent à cette perte d’expression n’avaient jusqu’à maintenant pas encore été décryptées. A partir d’une analyse par RNAseq d’une série de cinq CMR, nous

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base de son clustering avec ce groupe de tumeurs à partir de données d’expression (et non sur un diagnostic histologique) mais il est possible que cette tumeur ne soit pas véritablement un CMR mais plutôt un carcinome du rein SMARCB1-déficient dont le profil d’expression se rapproche des CMR. Contrairement aux transcrits de fusion classiquement décrits en oncologie et qui ont un effet oncogénique comme BCR/ABL dans les leucémies myéloïdes chroniques (Heisterkamp et al., 1985) et EWS/FLI dans les sarcomes d’Ewing (Delattre et al., 1992) par exemple, ces translocations aboutissent à une perte de fonction du gène SMARCB1.

Les translocations sont associées à une perte d’hétérozygotie (LOH) du locus SMARCB1 dans tous les cas pour inactiver le second allèle et ainsi aboutir à une perte de fonction complète.

Nous avons publié nos résultats rapportant les translocations impliquant le gène SMARCB1 comme mécanisme d’inactivation spécifiquement observé dans les CMR dans la revue European Urology en 2016 (Annexe 3) (Calderaro et al., 2016). Ce mécanisme d’inactivation de SMARCB1 n’avait jusqu’à maintenant pas été rapporté dans les tumeurs rhabdoïdes ou dans les autres types de tumeurs SMARCB1-déficientes. La limite de notre étude réside dans le petit nombre de cas étudiés mais les translocations impliquant le gène SMARCB1 comme mécanisme d’inactivation spécifique dans les CMR ont récemment été confirmées par une autre équipe (Carlo et al., 2017).

Les tumeurs SMARCB1-déficientes de l’adulte

Comme nous l’avons déjà vu, les tumeurs rhabdoïdes sont par définition des tumeurs pédiatriques qui surviennent le plus souvent avant l’âge de 5 ans (von Hoff et al., 2011;

Weeks et al., 1989). Il existe cependant des entités tumorales d’aspect véritablement rhabdoïde et déficientes pour le gène SMARCB1 qui surviennent chez l’adulte. Du point de vue de la prise en charge des patients, il est important de savoir s’il faut considérer ces entités tumorales comme de véritables tumeurs rhabdoïdes de l’adulte ou des tumeurs SMARCB1- déficientes autres. Nous avons analysé le profil d'expression d'une cohorte de 69 tumeurs SMARCB1-déficientes incluant des tumeurs véritablement rhabdoïdes de l’enfant mais aussi des sarcomes épithélioïdes, des CMR, des chordomes indifférenciés et des tumeurs SMARCB1-déficientes de l’adulte indéterminées. Certaines des tumeurs SMARCB1- déficientes de l’adulte montrent un profil d’expression très proche des tumeurs rhabdoïdes de l’enfant et suggèrent que ces tumeurs doivent être considérées comme de véritables tumeurs rhabdoïdes même si elles surviennent chez l’adulte. Il est intéressant de noter que l’ensemble

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de ces tumeurs rhabdoïdes (de l’enfant ou de l’adulte) partage une signature embryonnaire comparativement aux autres tumeurs SMARCB1-déficientes non rhabdoïdes. Ce résultat conforte ce qui a été évoqué avec notre modèle murin de tumeurs rhabdoïdes intra-cérébrales ; à savoir que l’origine des tumeurs rhabdoïdes seraient des cellules souches/progénitrices. En plus de partager une signature d’expression embryonnaire, ces tumeurs rhabdoïdes partagent des caractéristiques génomiques communes (comme un profil plat et un nombre de mutations somatiques très réduits) quelle que soit l'âge de survenue. A l’inverse, d’autres tumeurs SMARCB1-déficientes indéterminées montrent un profil d’expression véritablement différent de celui des tumeurs rhabdoïdes de l’enfant. Cela illustre que certaines tumeurs SMARCB1- déficientes de l’adulte sont clairement différentes des tumeurs rhabdoïdes pédiatriques et que leur caractérisation reste encore à être établit comme ce fut le cas récemment pour les carcinomes naso-sinusiens SMARCB1-déficients qui forment une véritable entité tumorale depuis 2014 (Agaimy et al., 2014, 2017; Bishop et al., 2014). Cette étude a fait l’objet d’une publication en 2017 dans Oncotarget (Annexe 4) (Richer et al., 2017).

Un autre résultat intéressant que nous avons observé dans cette étude est la surexpression de TET1 et DNMT3B dans les tumeurs rhabdoïdes comparativement aux tumeurs SMARCB1-déficientes non-rhabdoïdes. Ces deux gènes codent des protéines qui sont impliquées dans la méthylation de l'ADN mais ont des fonctions antagonistes. En effet, TET1 catalyse la conversion de la 5mC en 5hmC qui correspond à une première étape vers la déméthylation de l’ADN alors que DNMT3B est une DNA méthyltransférase. En outre, TET1 (Yamaguchi et al., 2013) et les protéines DNMT3 (Hata et al., 2002; Kaneda et al., 2004) sont impliquées dans l’empreinte génomique. Il s’agit d’un mécanisme épigénétique qui permet l’expression d’un gène spécifiquement au niveau d’un des deux allèles parentaux (l’autre allèle n’étant pas exprimé). La base moléculaire de l'empreinte est la méthylation de l’ADN spécifiquement au niveau d'un des deux allèles dont l’expression est alors réprimée (Peters, 2014). Devant ce résultat, nous avons comparé l’expression des gènes soumis à empreinte (Morison et al., 2001) dans les tumeurs rhabdoïdes et les tumeurs SMARCB1-déficientes non-

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prépondérant dans l'effacement de l'empreinte génomique par déméthylation (Yamaguchi et al., 2013). En outre, il a récemment été montré que les tumeurs rhabdoïdes, aussi bien cérébrales (Johann et al., 2016) qu’extra-cérébrales (Chun et al., 2016) étaient globalement hyperméthylées. Cette hyperméthylation pourrait être liée à la surexpression de DNMT3B. En tenant compte que DNMT3B est peu impliqué dans la méthylation des gènes soumis à empreinte, leur surexpression dans les tumeurs rhabdoïdes pourrait être plutôt due à l’effacement de la méthylation par TET1 (Figure 9). Tout cela reste pour le moment hypothétique et les inter-relations entre la surexpression de TET1 et DNMT3B, la surexpression de nombreux gènes soumis à empreinte et l’hyperméthylation globale du génome observées dans les tumeurs rhabdoïdes mériteraient d’être exploré plus en profondeur.

Figure 9 : Hypothèse pour relier la surexpression de TET1 et DNMT3B dans les tumeurs rhabdoïdes à la surexpression des gènes soumis à empreinte d’une part et à l’hyperméthylation globale du génome de ces tumeurs d’autre part.

Tumeurs rhabdoïdes SMARCB1- déficientes

Surexpression de TET1 5mC 5hmC Déméthylation de l’ADN

Surexpression de DNMT3B Méthyltransférase Hyperméthylation de l’ADN

TET1

est impliqué dans l’empreinte

DNMT3B

est peu impliqué dans l’empreinte (comparativement à DNMT3A)

Déméthylation des gènes soumis à empreinte Surexpression des gènes soumis à empreinte

Hyperméthylation du gènome

Sans répression des gènes soumis à empreinte

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Les tumeurs SMARCA4-déficientes

Les tumeurs rhabdoïdes SMARCA4-déficientes

Comme décrit précédemment, 95% des tumeurs rhabdoïdes présentent une perte complète d’expression de la protéine BAF47 due à des altérations bi-alléliques du gène SMARCB1. Parmi les 5% restant de tumeurs rhabdoïdes sans perte d’expression de BAF47, des altérations bi-alléliques du gène SMARCA4 qui encode la sous-unité catalytique BRG1 du complexe SWI/SNF ont récemment été décrites. La première description de tumeurs rhabdoïdes SMARCA4-déficientes date de 2010 dans une famille avec deux enfants atteints de tumeurs rhabdoïdes sans perte d’expression de BAF47 (Schneppenheim et al., 2010).

L’analyse du gène SMARCA4 a permis de mettre en évidence une mutation non-sens commune chez les deux enfants au niveau constitutionnel et présente à l’état homozygote dans leur tumeur en raison d’une LOH du locus SMARCA4. A noter que cette mutation était héritée du père qui n’avait lui-même pas d’histoire personnelle de cancer. Deux autres cas de tumeurs rhabdoïdes cérébrales SMARCA4-déficientes ont ensuite été décrits en 2011 (Hasselblatt et al., 2011) et en 2013 (Witkowski et al., 2013). En 2014, une étude allemande a rapporté 6 cas supplémentaires de tumeurs rhabdoïdes cérébrales SMARCA4-déficientes (Hasselblatt et al., 2014).

Nous avons également décrit en 2015 un cas de tumeur rhabdoïde cérébrale qui conserve l’expression des protéines BAF47 (encodée par le gène SMARCB1) et BRG1 (encodée par le gène SMARCA4) chez un enfant de 3 ans et demi (Masliah-Planchon et al., 2016). En séquençant l’ADN extrait de cette tumeur, nous avons mis en évidence une mutation faux-sens du gène SMARCA4 qui se trouve dans le domaine HELICc qui correspond à l’activité catalytique hélicase/ATPasique de la protéine. Ce cas clinique a été publié dans la revue Pediatric Blood & Cancer en 2015 (Annexe 5) (Masliah-Planchon et al., 2016).

L’existence de tumeurs rhabdoïdes SMARCA4-déficientes avec des mutations qui ne sont pas tronquantes et sont donc associées à une conservation de l’expression de la protéine mutée

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ou de SMARCA4 et aboutiraient à une altération du complexe SWI/SNF menant à l’oncogenèse (Stanton et al., 2017). Pourtant l’existence de ce type de mutations spécifique à SMARCA4 (par rapport à SMARCB1) reste mystérieuse et devrait être d’avantage explorée.

Globalement, les tumeurs rhabdoïdes SMARCA4-déficientes représentent une entité cancéreuse peu décrite avec en tout 15 cas décrits à ce jour. Deux études rapportent également trois cas de tumeurs rhabdoïdes cérébrales (Johann et al., 2016) et un cas de tumeur rhabdoïde rénale (Chun et al., 2016b) SMARCA4-déficientes mais ces cas ne sont pas détaillés dans ces études. Comparativement aux tumeurs rhabdoïdes SMARCB1-déficientes, les tumeurs rhabdoïdes SMARCA4-déficientes auraient un comportement plus agressif et un pronostic plus sombre. En outre, la fréquence des mutations constitutionnelles serait plus élevée pour les tumeurs rhabdoïdes SMARCA4-déficientes. Cependant, ces résultats sont basés sur un nombre très limité de cas et mériteraient d’être confirmé sur des séries plus importantes. En effet, la proposition que les mutations constitutionnelles de SMARCA4 seraient plus fréquemment familiales (alors que ce n’est quasiment jamais le cas pour les tumeurs rhabdoïdes SMARCB1-déficientes) repose sur un possible biais étant donné que les premiers cas rapportés étaient familiaux et que c’est ce caractère familial qui a permis de mettre en évidence la causalité du gène SMARCA4 dans ces tumeurs.

Les carcinomes à petites cellules de l'ovaire de type hypercalcémiant (SCCOHT)

Les carcinomes à petites cellules de l'ovaire de type hypercalcémiant (SCCOHT pour small cell carcinoma of the ovary of hypercalcemic type) sont des tumeurs rares qui surviennent chez des femmes jeunes. L’âge médian de survenue est de 25 ans mais ces tumeurs peuvent être rencontrées chez des adolescentes et jusqu’à 45 ans (Young et al., 1994).

Ce sont des tumeurs extrêmement agressives, de mauvais pronostic (Young et al., 1994) et chimio-résistantes (Gamwell et al., 2013). En 2014, trois manuscrits publiés dans le même numéro de la revue Nature Genetics, ont mis en évidence des altérations bi-alléliques du gène SMARCA4 conduisant à la perte d’expression de la protéine BRG1 dans plus de 95% des SCCOHT (Jelinic et al., 2014; Ramos et al., 2014; Witkowski et al., 2014). A travers plusieurs cas familiaux, ces publications ont également montré que les mutations du gène SMARCA4 sont également présentes au niveau constitutionnel dans 30 à 40 % des cas et prédisposent ainsi au développement des SCCOHT. La mise en évidence de ces mutations prédisposant à un cancer mortel chez des femmes jeunes représente une découverte majeure et

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devrait permettre d’optimiser le conseil génétique aux femmes avec des antécédents familiaux de cancer de l’ovaire à début précoce.

Les sarcomes thoraciques SMARCA4-déficients

En 2015, notre équipe, en collaboration avec les chercheurs du centre de recherche en cancérologie de Lyon, a mis en évidence des sarcomes thoraciques avec inactivation du gène SMARCA4. A partir de deux approches complémentaires sur des sarcomes non classés et basées sur des études histopathologiques et des données de RNAseq nous avons ainsi pu identifier cette nouvelle entité tumorale (Le Loarer et al., 2015). En comparant le profil transcriptomique de ces tumeurs avec celui des SCCOHT (ayant également une perte de SMARCA4), celui de carcinomes pulmonaires et celui de tumeurs rhabdoïdes SMARCB1- déficientes, nous avons montré que ces sarcomes thoraciques SMARCA4-déficients étaient différents des carcinomes pulmonaires mais très proches des tumeurs rhabdoïdes et des SCCOHT. Depuis l’identification de cette nouvelle entité tumorale publiée en octobre 2015, plusieurs études ont permis d’augmenter le nombre de cas rapportés (Kuwamoto et al., 2017;

Sauter et al., 2017; Yoshida et al., 2017). Ces études ont permis de confirmer que ces tumeurs constituaient une entité tumorale unique caractérisée par une survenue chez des adultes jeunes (30-40 ans) et fumeurs, une prédominance masculine et un aspect rhabdoïde. L’identification de ces tumeurs, facilitée par la mise en évidence de la perte d’expression de la protéine BRG1 en immunohistochimie, s’avère cliniquement pertinentes en raison de leur mauvais pronostic et de leur résistance aux modalités actuelles de traitements. La description de cette nouvelle entité tumorale a fait l’objet d’une publication dans la revue Nature Genetics en 2015 (Annexe 6) (Le Loarer et al., 2015).

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dans les tumeurs rhabdoïdes (Bourdeaut et al., 2011), dans les SCCOHT (Jelinic et al., 2014;

Ramos et al., 2014; Witkowski et al., 2014) ou dans les sarcomes thoraciques SMARCA4- déficients (Le Loarer et al., 2015). En effet, les altérations du gène SMARCB1 décrites dans les schwannomes sont fréquemment des mutations faux-sens ou des mutations d’épissage (Smith et al., 2014) alors que ce type de mutations sont quasiment inexistants dans les tumeurs rhabdoïdes. De même, la perte d’expression de la protéine BAF47 visible en immunohistochimie n’est pas aussi franche dans les schwannomes (on parle d’expression en mosaïque) que ce qui peut être observé dans les tumeurs rhabdoïdes. Les médulloblastomes représentent un autre exemple de tumeurs avec des mutations d’un membre du complexe SWI/SNF, SMARCA4 en l’occurrence, mais qui ne sont pas à l’origine d’une perte d’expression de la protéine.

Les médulloblastomes

Le médulloblastome est la plus fréquente des tumeurs cérébrales embryonnaires. Il s’agit d’une tumeur maligne qui se développe dans le cervelet et peut métastaser dans la totalité du système nerveux central. La majorité de ces tumeurs survient chez l’enfant mais elles peuvent également se développer chez l’adulte. Il est actuellement communément admis qu’il existe quatre groupes de médulloblastome : le groupe WNT, le groupe SHH et les groupes 3 et 4 (Northcott et al., 2012; Taylor et al., 2012). Ces sous-groupes ont été définis à partir de données transcriptionnelles et épigénétiques (méthylation de l’ADN) et permettent de distinguer des sous-ensembles cliniques de patients distincts. Des mutations du gène SMARCA4 ont été décrites dans les médulloblastomes (Jones et al., 2012; Northcott et al., 2017; Pugh et al., 2012; Robinson et al., 2012). Ces mutations ont surtout été décrites dans les groupes WNT (25% des cas) et les groupes 3 (11% des cas) mais nous en avons également mis en évidence dans les médulloblastomes du groupe SHH (Figure 10). Contrairement aux mutations de SMARCA4 dans les types de tumeurs précédemment décrits (i.e. les tumeurs rhabdoïdes, les SCCOHT et les sarcomes thoraciques SMARCA4-déficients), celles présentes dans les médulloblastomes sont des mutations faux-sens ou des insertions/délétions qui respectent le cadre de lecture et qui sont situées dans le domaine hélicase de la protéine à l’état hétérozygote et n’aboutissent pas à une perte d’expression. Ce domaine hélicase correspond à la fonction catalytique de BRG1 et est associé à une fonction ATPase. Il serait également le domaine fonctionnel le plus important car son inactivation avec un criblage de

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sélection négative par CRISPR-Cas9 donne les phénotypes les plus sévères par rapport aux autres domaines de la protéine (Shi et al., 2015). Pour rappel, il existe effectivement d’autres domaines fonctionnels au niveau de la protéine BRG1, y compris un bromodomaine (Figure 6) qui permet de diriger le complexe SWI/SNF vers les histones acétylées.

Figure 10 : Mutations somatiques du gène SMARCA4 observées dans notre série de médulloblastomes. Les mutations sont des variations faux-sens hétérozygotes situées au niveau des domaines HSA, DEXDc et HELICc qui correspondent à l’activité catalytique hélicase/ATPasique de la protéine.

Une étude a récemment montré que ces mutations faux-sens dans le domaine hélicase/ATPase du gène SMARCA4 aboutissent à une occupation accrue du complexe PRC2 corrélé à une augmentation significative du niveau de H3K27me3 et plus spécifiquement au niveau des promoteurs bivalents (Stanton et al., 2017). Comme nous l’avons déjà vu, le complexe SWI/SNF agit de façon antagoniste au complexe PRC2 (Wilson et al., 2010) et la perte de SMARCB1 conduit également à une augmentation de la triméthylation de la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27me3). L’étude de Stanton et al. montre que l’effet antagoniste entre

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promoteurs bivalents. Les promoteurs bivalents régulant plutôt l'expression des gènes du développement, les altérations du gène SMARCA4 contribueraient ainsi à l'oncogenèse en dérégulant l’expression de ces gènes. Les médulloblastomes sont en effet des tumeurs embryonnaires qui dérivent de cellules souches/progénitrices neuro-ectodermiques (Manoranjan et al., 2012; Valtz et al., 1991). Il est ainsi probable qu’un mécanisme épigénétique capable d’influencer l’expression de gènes impliqués dans le développement confère un avantage prolifératif aux tumeurs embryonnaires comme les médulloblastomes.

Cette hypothèse pourrait être extrapolée aux mutations de SMARCB1 dans les tumeurs rhabdoïdes qui, comme nous l’avons déjà vu, dérivent également de cellules progénitrices.

Reprogrammation métabolique dans les cancers

En plus des caractéristiques des cancers initialement décrites comme l’échappement à la mort cellulaire, le potentiel réplicatif illimité et la capacité métastatique entre autres (Hanahan and Weinberg, 2000), il est maintenant communément admis qu’une adaptation du métabolisme pour soutenir la prolifération cellulaire est nécessaire à la formation et au maintien des cancers (Hanahan and Weinberg, 2011) (Figure 11).

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Figure 11 : Selon les critères établis par Hanahan et Weinberg en 2000 et en 2011 (Hanahan and Weinberg, 2000, 2011) les cancers reposent sur 10 caractéristiques : des signaux de prolifération soutenus, une insensibilité aux signaux antiprolifératifs, une résistance à l’apoptose, une croissance illimitée, la capacité de faire de l’angiogenèse, un caractère invasif/métastatique, une instabilité génomique, un environnement pro- inflammatoire, un échappement au système immunitaire et, ce qui nous intéresse ici, une adaptation du métabolisme énergétique.

Les cellules cancéreuses présentent en effet un métabolisme véritablement différent des tissus dont elles sont issues en raison de leur forte demande en protéines, lipides et nucléotides nécessaires à la prolifération cellulaire. Cette caractéristique des cellules cancéreuses est connue depuis longtemps et a même été à l’origine de l’utilisation du méthotrexate comme l’une des premières chimiothérapies anticancéreuses au début des années 1950. Ce composé agit en effet comme un inhibiteur compétitif de l'acide folique au niveau de la dihydrofolate-réductase bloquant ainsi la synthèse de l'ADN et donc la croissance cellulaire. D’autres antimétabolites ont ensuite été développés comme le 5-fluorouracile qui inhibe la synthèse de la thymidine ou l’hydroxyurée qui inhibe la synthèse des désoxynucléotides. Ces chimiothérapies sont aujourd’hui encore couramment utilisées dans l’arsenal thérapeutique contre le cancer (Chabner and Roberts, 2005).

Outre la place qu’a jouée le métabolisme des nucléotides dans le développement des premières chimiothérapies anti-cancéreuses, il a également été montré très tôt que le métabolisme du glucose était altéré dans les tumeurs.

Place du glucose dans le métabolisme et effet Warburg

Dans les années 1920, Otto Warburg remarqua que les cellules cancéreuses produisent une quantité anormalement élevée de lactate (Warburg et al., 1927). Cette observation fut

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Figure 12 : L’effet Warburg se traduit dans les cellules tumorales par une phosphorylation oxydative faible mais une production de lactate importante par un phénomène de glycolyse aérobie comparativement aux cellules différenciées.

Le glucose est une importante source d’énergie cellulaire et il occupe une position centrale dans le métabolisme. Sa destinée majeure dans les cellules différenciées est donc d’être oxydée dans le cytosol en pyruvate par une suite de réaction enzymatique appelée glycolyse. En présence d’oxygène, le pyruvate est ensuite transformé en dioxyde de carbone (CO2) au cours du cycle de Krebs et de la respiration mitochondriale. Cette réaction permet d'exploiter l'énergie du glucose à son maximum pour une production optimale d’ATP. À l’inverse, la conversion du glucose en lactate se déroule plutôt en condition d’anaérobiose et produit peu d’ATP (Figure 12). Le glucose est essentiel car, outre l’ATP, il fournit également des intermédiaires métaboliques qui participent à diverses réactions anaboliques dont la voie

Production d’énergie

Glucose Pyruvate

Lactate

Phoshorylation

oxydative anaérobieGlycolyse

Glucose Pyruvate

Lactate

Phoshorylation oxydative

Glycolyse aérobie Tissus tumoraux Tissus différenciés

Soutient des besoins

anaboliques

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des pentoses phosphate et la voie de la biosynthèse de la sérine. Selon l’effet Warburg, dans les cellules tumorales la production de lactate augmente donc considérablement même en présence d'oxygène et de mitochondries entièrement fonctionnelles ; on parle de glycolyse aérobie par opposition à la production de lactate qui découle d’une situation d’anaérobiose.

Ainsi, contrairement aux cellules différenciées, qui se reposent principalement sur la phosphorylation oxydative mitochondriale pour générer l'énergie nécessaire aux processus cellulaires, la plupart des cellules cancéreuses dépendent plutôt de la glycolyse aérobie. Il s’agit d’un moyen peu efficace pour générer de l’ATP, mais qui semble conférer un avantage aux cellules cancéreuses en produisant les composants de la cellule (ADN, membranes, protéines) nécessaires pour assurer une croissance cellulaire rapide. Cette reprogrammation métabolique est donc essentielle dans pour que les cellules cancéreuses puissent répondre aux exigences anaboliques et énergétiques qui accompagnent la prolifération cellulaire (Liberti and Locasale, 2016; Vander Heiden et al., 2009).

Altérations métaboliques observées dans les cancers

Depuis la démonstration de l’effet Warburg, de nombreuses études ont montré la dérégulation de diverses voies métaboliques dans les cancers (Martinez-Outschoorn et al., 2017). Par exemple, les changements métaboliques qui favorisent la prolifération cellulaire sont souvent déclenchés par des mutations dans des gènes impliqués dans des voies de signalisation oncogéniques bien connues telles que les voies de signalisation VHL/HIF (Semenza, 2010) ou PI3K/AKT/mTOR (Guertin and Sabatini, 2007).

En outre, la glutamine joue un rôle central dans le métabolisme des cellules cancéreuses. Comme nous l’avons déjà mentionné, les cellules cancéreuses soumises à l’effet Warburg voient leur pyruvate transformé en lactate plutôt qu’en acétyl-CoA et nécessitent une autre source de carbones pour maintenir la quantité des intermédiaires du cycle de Krebs. Ce

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