HAL Id: tel-02073625
https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-02073625
Submitted on 20 Mar 2019
HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.
L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.
dans la physiopathologie de la drépanocytose
Celine Griffon
To cite this version:
Celine Griffon. Modulation et rôle des paramètres hémorhéologiques dans la physiopathologie de la drépanocytose. Santé. Université de Lyon, 2018. Français. �NNT : 2018LYSE1278�. �tel-02073625�
N°d’ordre NNT : 2018LYSE1278
THESE de DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE LYON
opérée au sein de
l’Université Claude Bernard Lyon 1 Ecole DoctoraleED 205
Ecole Doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé
Spécialité de doctorat : Recherche clinique Discipline : Biologie vasculaire et globule rouge
Soutenue publiquement le 13/12/2018, par :
Céline GRIFFON épouse RENOUX
Modulation et rôle des paramètres hémorhéologiques dans la
physiopathologie de la drépanocytose
Devant le jury composé de:
Rapporteurs
M. BARTOLUCCI Pablo, PU-PH, Université Paris-Est Créteil Mme DA-COSTA Lydie, PU-PH, Université Paris Diderot
Examinateurs
Mme PONDARRE Corinne, MCU-PH, Université Paris XII M BERTRAND Yves, PU-PH, Université Claude Bernard Lyon 1
Directeur et co-directeur de thèse
M CONNES Philippe, Professeur d’université, Université Claude Bernard Lyon 1 M JOLY Philippe, Praticien hospitalier, Hospices Civils de Lyon
Invité
Mme FAIVRE Magalie, Chargée de recherche, Université Claude Bernard Lyon 1
Quand on vous demande si vous êtes capable de faire un travail , répondez : « bien sûr, je peux ! » Puis débrouillez-vous pour y arriver.
Théodore Roosevelt (1858-1919)
3
A mes directeurs de thèse
A mmonsieur le professeur Philippe Connes, depuis ton arrivée à Lyon en septembre 2014, la recherche sur la drépanocytose est montée en flèche et depuis ce jour tu mènes d’une main de maître l’équipe « Biologie vasculaire et du globule rouge » du Libm. Merci de m’avoir supportée et encouragée pendant mon année de master et mes 3 années de thèse. Même si je t’ai detesté un bon milliard de fois ces derniers mois, je n’aurais pas pu espérer réaliser cette thèse dans de meilleures conditions. Merci pour ta grande disponibilité et ton encadrement de qualité. Ta bonne humeur et tes blagues qui laissent à désirer (mais qui me font toujours bien rigoler) rendent le travail vraiment agréable. J’espère que ce n’est que le début d’une grande collaboration.
A mmonsieur le docteur Philippe Joly, cela fait bientôt 10 ans que l’on s’est rencontré et que tu m’as transmis tes connaissances sur les pathologies du globule rouge. Il y a 3 ans tu m’as encouragée à faire cette thèse et comme pour le professeur Philippe Connes mentionné ci-dessus, je t’ai detesté un milliard de fois ces derniers mois. Néanmoins, je reconnais que ce fut pour moi une expérience enrichissante tant sur le plan professionnel que personnel et je ne regrette pas. Merci pour la confiance que tu m’as accordée dans la réalisation de ce travail. Merci pour me faire partager tes connaissances et ton expérience dans le domaine du globule rouge mais aussi de la politique et de l’écologie. Merci de m’avoir accueillie au sein de cette UF historique 21429 (parce qu’il ne faut jamais oublier d’où l’on vient).
Merci à tous les deux pour vos précieux conseils, je mesure ma chance de vous avoir eus comme
directeurs de thèse et vous en remercie encore.
4
Aux membres du Jury
A mes rapporteurs de thèse, Madame le professeur Lydie Da Costa et M Monsieur le professeur Pablo Bartolucci, vous me faites l’honneur de lire, de juger et d’évaluer ce travail de thèse.
Je vous prie de bien vouloir trouver ici l’expression de ma sincère reconnaissance.
A M Madame le docteur Corinne Pondarre, vous m’avez initié il y a maintenant près de 10 ans à la drépanocytose en me permettant d’assister aux consultations de pédiatrie lors de mon stage de 5
èmeannée hospitalo-universitaire. Vous me faites aujourd’hui l’honneur de juger ce travail, soyez assuré de ma plus grande estime.
A M Monsieur le professeur Yves Bertrand, vous avez suivi ce travail régulièrement en participant activement aux différents comités de suivi de thèse. Je vous remercie d’avoir accepté de participer à ce jury. Veuillez trouver dans ce travail, la marque de mes plus respectueuses considérations.
A M Madame le docteur Magali Faivre, merci de m’avoir expliqué avec patience tes techniques de microfluidiques, je suis persuadé que nous aurons l’occasion de collaborer sur de nouveaux projets.
Tu me fais aujourd’hui l’honneur de juger ce travail et je t’en remercie grandement.
5
A mes collègues
A JJoelle, Martine, Caro et CCéline, les techs des hémoglobines, merci de me supporter jour après jour, toujours avec le sourire. Merci pour ces pauses-café réconfortantes et pour le placard à gouter toujours rempli. Grace à votre bonne humeur et votre motivation, le travail devient plus facile.
A S Salima, merci de ta bonne humeur ainsi que pour tous ces repas partagés. Ta rigueur et ton professionalisme sont d’une importance capitale pour le centre de référence.
A CCécile, merci pour tes petits conseils écolos et pour être toujours arrangeantes sur les plannings de cytochimie ou des hémoglobines.
A PPhilippe, la forme n’est pas à son maximum actuellement mais je te remercie d’avoir toujours essayé de répondre à mes questions lors de mes débuts en génétique.
A tous les éétudiants et stagiaires accueillis dans l’équipe des hémoglobines qui m’ont aidé de près ou de loin dans la réalisation de cette thèse.
A mmonsieur le professeur Richard Cohen et mmonsieur le professeur Armand Perret-Liaudet, mes chefs de service successifs, merci de m’avoir fait confiance et d’avoir permis mon recrutement en tant qu’assistant spécialiste.
A ttoute l’équipe de biochimie du Grand-Est, merci de me faire partager vos connaissances et
expériences, merci pour votre motivation et votre bonne humeur quotidienne.
6
A PPauline, EEmmanuelle, EEtienne, EEmeric, R Romain, M Mélanie, L Lidia, Mathilde, Fatou et surtout EElie et S Sarah qui m’ont été d’une aide précieuse sur les manips de rhéologie pendant mon congé maternité. On ne se cotoie malheureusement pas assez mais ce sont toujours de bons moments que l’on passe ensemble. A CCamille et CCyril, merci pour vos précieux conseils et àV Vincent, merci de m’avoir initié et formé aux manips de stress oxydant. Merci à tous pour ces échanges toujours constructifs.
Aux cliniciens
A mmonsieur le PProfesseur Arnaud Hot, coordonnateur du centre de référence sur les maladies constitutionnelles rares du globule rouge et de l’érythropoïèse, merci de votre implication malgré un emploi du temps chargé. Merci à tous le personnel médical et paramédical qui s’implique dans ce centre avec un merci particulier aux deux cliniciennes référentes des maladies du globule rouge mmadame le docteur GGiovanna Cannas et madame lle docteur AAlexandra Vasserot, merci de votre aide précieuse dans la réalisation de cette thèse, sans votre motivation les différentes études n’auraient pas été possible.
A mes amis
A CCharlotte et Anaïs, mes plus anciennes amies, le temps nous a un peu éloignés mais les moments passés ensemble sont toujours aussi bons. Merci pour votre soutien dans la réalisation de cette thèse.
A L Ludo & Steph, Max & Julie, Damien & Alex, Seb & Claire et Baptiste & Amélie
ainsi qu’à tous les petits loulous qui ont doublé l’effectif des repas entre amis. Merci pour tous ces
moments de rigolade passés ensemble.
7
A M Mes PParents, merci de m’avoir toujours soutenu tout au long de ces études et en particulier durant ces 3 dernières années de thèse. Merci de toujours croire en moi et de me donner autant d’amour.
Cette thèse est aussi la vôtre, trouvez dans ce travail le résultat de tout votre soutien.
A M Mes Grands-Parents, merci de vos encouragements, je mesure la chance que j’aie de vous avoir tous les 4 dans ce moment important.
A R Rémi et Aurélie, merci pour tous ces moments de complicité partagés et tous les autres à venir. Vous savez combien vous comptés pour moi et à quel point je suis fière de dire que vous êtes mon frère et ma belle-sœur.
A M Ma Belle-Famille, merci de m’avoir accueilli si chaleureusement dans votre famille. Merci pour tous les encouragements dans la réalisation de ce travail.
A mon petit nid d’amour
A mmon Lilou, merci pour tes encouragements et ton soutien irremplaçable durant ces 3 années de thèse. Merci de ta patience et merci de tout l’amour que tu me donnes au quotidien. Sans toi, la vie ne serait pas la même. Je t’aime.
A AAgathe et Coline, mes deux princesses d’amour, merci pour votre compréhension lors de ces
derniers mois où j’étais moins disponible. Merci pour votre joie de vivre et vos sourires qui illuminent
mes journées. Je suis très fière des petites filles que vous êtes déjà.
8
PARTIE 1 : REVUE DE LA LITTERATURE ... 32
Chapitre 1 : Du Globule Rouge aux Hémoglobinopathies ... 33
1. Le Globule Rouge ... 34
1.1. Caractéristiques ... 34
1.2. Production ... 34
1.3. La membrane érythrocytaire ... 35
2. L’hémoglobine... 37
2.1. Structure et fonction ... 37
2.2. Génétique ... 37
2.3. Les hémoglobines physiologiques ... 38
2.4. Les hémoglobinopathies ... 40
Chapitre 2 : Les Syndromes Drépanocytaires Majeurs ... 41
1. Présentation des différents SDM (Figure 5) ... 42
1.1. La drépanocytose... 42
1.2. La thalasso-drépanocytose ... 42
1.3. L’hémoglobinose SC ... 42
1.4. Autres SDM composites ... 43
1.4.1. S/D-Punjab ... 43
9
1.4.3. S/E ... 45
1.4.4. Cas particulier des variants S-like ... 45
2. Données historiques et épidémiologiques ... 46
2.1. Données historiques ... 46
2.2. Données épidémiologiques ... 47
2.3. Notion d’haplotypes drépanocytaires ... 48
3. Diagnostic biologique ... 49
3.1. Numération sanguine avec étude de la morphologie des globules rouges ... 49
3.2. Bilan biochimique standard de l’hémoglobine ... 50
3.2.1. CLHP par échange de cations ... 51
3.2.2. Electrophorèse capillaire ... 53
3.2.3. Autres techniques électrophorétiques ... 54
3.2.3.1. Electrophorèse sur acétate de cellulose à pH alcalin ... 54
3.2.3.2. Electrophorèse sur agarose à pH acide ... 55
3.2.3.3. Electrophorèse sur citrate-agar à pH acide ... 55
3.2.3.4. Focalisation isoélectrique sur gel de polyacrylamide ... 56
3.2.4. Test d’Itano ... 57
3.2.5. CLHP en phase inverse des chaînes de globines ... 57
10
3.3.1. Diagnostic post-natal ... 58
3.3.2. Diagnostic pré-natal ... 58
3.4. Diagnostic néonatal ... 59
4. Physiopathologie moléculaire de la drépanocytose ... 60
4.1. Polymérisation / Falciformation ... 60
4.1.1. Structure du polymère ... 60
4.1.2. Cinétique de polymérisation ... 61
4.1.3. Facteurs favorisant la polymérisation ... 63
4.1.3.1. Pression partielle en O2 ... 63
4.1.3.2. Concentration intra-érythrocytaire en HbS ... 64
4.1.3.2.1. Déshydratation cellulaire ... 65
4.1.3.2.1. Globules rouges denses ... 66
4.1.4. Cas particulier des patients SC ... 66
4.2. Vaso-occlusion ... 67
4.2.1. Augmentation de l’adhérence ... 68
4.2.2. Activation cellulaire et inflammation ... 72
4.2.3. Altérations membranaires... 74
4.3. Hémolyse et dysfonction vasculaire ... 75
11
4.3.2. Hémolyse intravasculaire ... 76
4.3.3. Biodisponibilité du monoxyde d’azote (NO) ... 77
4.3.3.1. Le rôle du NO ... 77
4.3.3.1.1. Propriétés vasodilatatrices ... 77
4.3.3.1.2. Propriétés anti-oxydantes ... 77
4.3.3.1.3. Propriétés anti-adhérentes ... 78
4.3.3.1.4. Propriétés anti-agrégants plaquettaires ... 78
4.3.3.1.5. Rôle dans la déformabilité érythrocytaire ... 78
4.3.3.2. Diminution de la biodisponibilité du NO ... 79
5. Complications cliniques de la drépanocytose... 80
5.1. Sous-phénotypes cliniques ... 80
5.2. Complications liées à la vaso-occlusion ... 81
5.2.1. La crise vaso-occlusive ... 81
5.2.2. Le syndrome thoracique aigu ... 84
5.2.3. L’ostéonécrose ... 85
5.2.4. La rétinopathie ... 85
5.3. Complications liées à la dysfonction vasculaire ... 85
5.3.1. Hypertension pulmonaire ... 85
12
5.3.3. Priapisme ... 87
5.3.4. Vasculopathies cérébrales ... 88
5.3.5. Complications cardiaques ... 89
5.3.6. Complications rénales ... 90
5.3.7. Complications hépatiques ... 91
5.4. Modificateurs génétiques ... 91
5.4.1. Alpha-thalassémie ... 91
5.4.2. Glucose-6-phosphodeshydrogénase (G6PD) ... 94
5.4.3. Hémoglobine fœtale... 94
5.4.4. Autres gènes modificateurs ... 96
6. Traitements de la drépanocytose ... 96
6.1. Prévention des infections et antalgiques ... 96
6.2. Hydroxyurée ... 97
6.3. Transfusion et échanges érythrocytaires ... 98
6.4. Greffe de moelle osseuse ... 99
6.5. Thérapie génique ... 99
6.6. Les traitements du futur ... 101
6.6.1. L-Glutamine ... 101
13
6.6.3. Inhibiteur de polymérisation ... 101
Chapitre 3 : Hémorhéologie et Syndromes Drépanocytaires Majeurs ... 102
1. Généralités sur l’hémorhéologie ... 103
1.1. Introduction ... 103
1.2. Viscosité sanguine ... 104
1.2.1. Propriétés du sang ... 104
1.2.2. Rôle de l’hématocrite ... 105
1.2.3. Viscosité plasmatique ... 107
1.3. Agrégation érythrocytaire ... 108
1.4. Déformabilité érythrocytaire ... 109
2. Altérations hémorhéologiques dans les différents syndromes drépanocytaires majeurs 111 2.1. Chez les patients SS ... 111
2.1.1. A l’état de base ... 111
2.1.2. Lors d’une complication vaso-occlusive ... 113
2.2. Chez les patients SC ... 114
2.3. Chez les patients SE+ ... 115
3. Facteurs modulant l’hémorhéologie dans les syndromes drépanocytaires majeurs .... 115
Chapitre 4 : Le Stress Oxydant dans les Syndromes Drépanocytaires Majeurs... 117
14
1.1. Les espèces oxygénées réactives ... 118
1.1.1. La chaîne respiratoire mitochondriale ... 118
1.1.2. Les voies secondaires de production de ROS ... 120
1.1.2.1. La voie de la xanthine oxydase ... 121
1.1.2.2. La voie de la NADPH oxydase ... 121
1.1.2.3. Le découplage de la NOS endothéliale ... 123
1.2. Les systèmes anti-oxydants ... 123
1.2.1. Système enzymatique ... 124
1.2.1.1. Superoxyde dismutase (SOD) ... 125
1.2.1.2. Catalase ... 125
1.2.1.3. Peroxydases ... 125
1.2.1.4. Le système de défense secondaire ... 125
1.2.2. Système non-enzymatiques ... 126
2. Le stress oxydant dans la drépanocytose ... 127
2.1. Sources de ROS ... 127
2.1.1. Auto-oxydation de l’HbS... 127
2.1.2. Hémoglobine libre ... 128
2.1.3. Ischémie-reperfusion ... 128
15
2.2. Implications cliniques ... 129
2.2.1. Dysfonction endothéliale ... 129
2.2.2. Augmentation de l’hémolyse ... 130
2.2.3. Augmentation de la coagulation ... 130
2.2.4. Augmentation de la susceptibilité aux infections ... 131
PARTIE 2 : TRAVAUX DE RECHERCHE ... 132
Objectifs et Hypothèses de Travail ... 133
Sous-Partie 1 : METHODOLOGIE ... 136
Chapitre 1 : Etude des Modulateurs Génétiques ... 137
1. Multiplex Gap-PCR, technique de recherche des délétions alpha-thalassémiques ... 138
2. Etude des courbes de fusion à haute résolution (High Resolution Melting, HRM) ... 139
3. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) ... 142
4. Séquençage selon Sanger ... 146
Chapitre 2 :Outils de Mesure de la Rhéologie Sanguine ... 149
1. Viscosité sanguine ... 150
2. Déformabilité érythrocytaire ... 151
3. Osmoscan ... 154
4. Agrégation érythrocytaire ... 156
16
4.2. Agrégation érythrocytaire sur le LORRCA® ... 157
Chapitre 3 :Mesures du Stress Oxydant et Nitrosatif ... 159
1. Produits avancées de l’oxydation des protéines (AOPP, Advanced Oxidation Protein Products) ... 160
2. Malondialdéhyde (MDA) ... 160
3. Catalase ... 160
4. Glutathion Peroxydase (GPx) ... 161
5. Superoxyde Dismutase (SOD) ... 161
6. Pouvoir anti-oxydant réducteur du fer (Ferric-Reducing Antioxidant Power, FRAP) ... 161
7. Métabolisme du NO ... 162
7.1. Nitrotyrosine ... 162
7.2. Métabolites du monoxyde d’azote (NOx) ... 162
Sous-Partie 2 : ETUDES REALISEES ... 163
Etude 1 : Importance de la standardisation des mesures de déformabilité érythrocytaire par ektacytométrie dans la drépanocytose ... 164
Etude 2 : Description de la courbe de déformabilité en milieu isotonique et cisaillement croissant : intérêt dans les pathologies du globule rouge ... 173
Etude 3 : Effet de l’âge sur la rhéologie sanguine des patients drépanocytaires SS et SC .... 192
Etude 4 : Effet des facteurs génétiques sur la rhéologie sanguine des enfants drépanocytaires ... 206
17
Etude 6 : Etude de la rhéologie sanguine chez les patients SE+... 230
PARTIE 4 : DISCUSSION ET PERSPECTIVES ... 241
PARTIE 5 : VALORISATION SCIENTIFIQUE ... 248
1. Publications internationales avec comité de lecture... 249
2. Publications en cours de révision ... 251
3. Publications soumises ... 252
4. Publications en cours d’écriture ... 252
5. Communications orales ... 252
PARTIE 6 : BIBLIOGRAPHIE ... 254
PARTIE 7 : ANNEXES ... 282
18
Figure 1: Représentation schématique de la structure membranaire d'un globule rouge ... 36 Figure 2: Représentation d'une molécule d'hémoglobine ... 37 Figure 3: Représentation schématique des clusters alpha (D) et bêta (E) ... 38 Figure 4: Evolution de la concentration des différentes hémoglobines physiologiques au cours de la vie ... 39 Figure 5: Altérations génétiques et moléculaires dans les principaux syndromes drépanocytaires majeurs ... 44 Figure 6: Incidence de la drépanocytose dans le monde ... 48 Figure 7: Distribution géographique des différents haplotypes ES dans les régions où la prévalence de la drépanocytose est élevée ... 49 Figure 8: Frottis sanguin d'un patient drépanocytaire... 50 Figure 9: Principe de la CLHP par échange de cations pour la séparation des différentes hémoglobines ... 51 Figure 10 : Exemple de tracés de CLHP par échange de cations d'un patient hétérozygote pour l'HbC obtenu au laboratoire de biologie médicale multi-site des Hospices Civils de Lyon ... 52 Figure 11 : Exemple de tracés CLHP par échange de cations d'un patient hétérozygote pour l’HbS obtenu au laboratoire de biologie médicale multi-site des Hospices Civils de Lyon ... 52 Figure 12: Principe de l'électrophorèse capillaire ... 53 Figure 13: Tracé d'électrophorèse capillaire d’un patient hétérozygote pour l’HbC obtenu au laboratoire de biologie médicale multi-site des Hospices Civils de Lyon ... 54
19
Figure 15: Migration des principales Hb pathologiques en focalisation isoélectrique ... 56
Figure 16: Test d'Itano ou test de solubilité ... 57
Figure 17: Exemple de tracé de CLHP en phase inverse des chaines de globines pour un patient hétérozygote pour l'HbS obtenu au laboratoire de biologie médicale multi-sites des Hospices Civils de Lyon. ... 58
Figure 18: Schéma d'un polymère d'HbS ... 61
Figure 19: Différents mécanismes de formation d'un polymère d'HbS ... 62
Figure 20: Influence de la cinétique de polymérisation sur la forme du globule rouge ... 62
Figure 21: Différentes conformations de l’hémoglobine. ... 63
Figure 22: Courbe de saturation en O2 de l'Hb en fonction de la pO2 ... 64
Figure 23: Mécanismes responsables de la déshydratation du globule rouge drépanocytaire ... 65
Figure 24: Morphologies du globule rouge SC ... 67
Figure 25: Représentation schématique de l'adhérence des globules rouges à l'endothélium dans la drépanocytose ... 70
Figure 26: Rôle des neutrophiles dans la physiopathologie de la drépanocytose ... 71
Figure 27: Altérations membranaires du globule rouge drépanocytaire ... 75
Figure 28: Modélisation des deux sous-phénotypes cliniques ... 80
Figure 29: Les différentes phases d'une crise vaso-occlusive ... 83
Figure 30: Ulcère de jambe chez un patient drépanocytaire ... 87
20
Figure 32: Classification des différents génotype alpha-thalassémique ... 92
Figure 33: Mécanisme de formation de la délétion alpha-thalassémique 3.7 ... 93
Figure 34: Le système CRISPR/Cas9 ... 100
Figure 35: Représentation de l'effet Fahraeus-Linqvist ... 107
Figure 36: Principaux paramètres influençant la rhéologie sanguine ... 110
Figure 37: Sources des ROS endogènes et formation des différents types de radicaux libres ... 120
Figure 38: Mécanismes d'activation de la NADPH oxydase phagocytaires (NOX2)) ... 122
Figure 39: Les espèces oxygénées réactives et les enzymes anti-oxydantes ... 124
Figure 40: Représentation schématique du cluster alpha-globine avec les principales délétions et couples d'amorces correspondants ... 138
Figure 41: Représentation schématique de l'HRM ... 141
Figure 42: Exemple de courbe obtenue pour la recherche du Variant A- ... 142
Figure 43: Principe du FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) ... 144
Figure 44: Exemple de résultats pour la recherche d'allèle ES et EC ... 146
Figure 45: Séquençage selon Sanger ... 147
Figure 46: Représentation schématique d'un viscosimètre rotatif cône-plan ... 150
Figure 47: Représentation schématique de la mesure de la déformabilité érythrocytaire par ektacytométrie ... 152
21
Figure 49: Pattern de diffraction d'une suspension de globules rouges drépanocytaires .... 153 Figure 50: Description de la courbe Osmoscan ... 155 Figure 51: Exemple de profils osmoscan caractéristiques de la sphérocytose (A) et de la xérocytose (B) ... 156 Figure 52: Syllectogramme de l'agrégation des globules rouges obtenu sur le LORRCA ... 158 Figure 53: Modulateurs de la rhéologie sanguine dans la drépanocytose ... 244
22
Table I: Gènes modificateurs potentiellement impliqués dans les complications de la drépanocytose ... 96 Table II : Amorces utilisées pour la recherche des polymorphismes HincIIH, XmnI et HincIIGpar FRET ... 145 Table III: Sondes utilisées pour la recherche des polymorphismes HincIIH, XmnI et HincIIGpar FRET ... 145 Table IV: Amorces et sondes utilisées pour la recherche des mutations ES et Ec ... 145 Table V: Séquences des amorces utilisées pour les différents séquençages ... 148
23
Liste des abréviations
1O2 Oxygène moléculaire singulet
●OH Radical hydroxyl
2,3 BPG 2,3 biphosphoglycérate (anciennement appelé 2,3 DPG) 2,3 DPG 2,3 diphosphoglycérate
A A
ADMA Diméthylarginine asymétrique ADN Acide désoxyribonucléique ADP Adénosine diphosphate AGM Aorte gonado-mesonephros ALAT Alanine aminotransférase AMP Adénosine monophosphate
AOPP Advanced Oxidation Protein Products = produits avancés de l’oxydation des protéines
ARN Acide ribonucléique
ASAT Asparatate aminotransférase ATP Adénosine triphosphate
24 AVC Accident vasculaire cérébral
B B
BFU – E Burst Forming Unit – Erythroid (Progéniteurs du globule rouge)
BH4 Tétrahydrobioptérine
C
Ca2+ Ions calcium
CCMH Concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine
CFU-E Colony Forming Unit – Erythroid (Progéniteurs du globule rouge)
CO Monoxyde de carbone
CSH Cellules souches hématopoïétiques CVO Crise vaso-occlusive
D
DTC Doppler trans-crânien
E
EI Elongation index = Index de déformabilité érythrocytaire eNOS NO synthase endothéliale
25
FF
Fe2+ Ion ferreux Fe3+ Ion ferrique
FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power = pouvoir anti-oxydant réducteur du fer FRET Fluorescence resonance energy transfer
G
G6PD Glucose-6-phosphate déshydrogénase GB Globule blanc
GMPc Guanosine monophosphate cyclique
GPx Glutathion peroxydase GR Globule rouge
GSH Glutathion réduit GSR Glutathion réductase GSSG Glutathion oxydé GTP Guanosine triposphate
GWAS Genome Wide Association Study = étude d’association pangénomique
H
H2O2 Peroxyde d’hydrogène = eau oxygénée
26
Hb Hémoglobine
HbF Hémoglobine fœtale HbS Hémoglobine S HO-1 Hème oxygénase 1
HRM High resolution melting = fusion à haute résolution
Ht Hématocrite
HTAP Hypertension pulmonaire
HU Hydroxyurée
II J K
IDM Infarctus du myocarde
IHOP Institut d’hématologie et d’oncologie pédiatrique
ISC Irreversible sickle cell = cellule falciformée de façon irréversible
L
LCR Locus control region LDH Lactate deshydrogénase
LORRCA Laser optical rotational red cell analyzer
27
M M
MDA Malondialdéhyde MO Moelle osseuse
N
NADP+ Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate oxydé NADPH Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduit NO Monoxyde d’azote
NOS NO synthase NOx Métabolites du NO
O
O2 Dioxygène
O2●- Anion superoxyde
P Q
p50 Pression partielle en O2 pour laquelle 50% de l’Hb est saturée PDE5 Phosphodiestérase 5
PK Pyruvate kinase PS Phosphatidylsérine
28 PVP Polyvinylpyrolidonne
R R
RET Taux de réticulocytes (en G/L)
ROS Reactive oxygen species = Espèces oxygénées réactives
S T
SA Semaine d’aménorrhée
SDM Syndrome drépanocytaire majeur SOD Superoxyde dismutase
STA Syndrome thoracique aigu
U V W
vWF Facteur von Willebrandt
X Y Z
XO Xanthine oxydase
29
Avant-Propos
La drépanocytose est une maladie monogénique autosomique récessive causée par une mutation ponctuelle à l’état homozygote sur le gène de la E-globine (HBB): la mutation NM_000518.4(HBB):c.20A>T(p.Glu7Val) dite mutation ES. Il existe également des syndromes drépanocytaires majeurs (SDM) causés par l’association de la mutation ES avec certaines autres anomalies du gène HBB, comme par exemple une mutation E-thalassémique ou la mutation EC. On parlera alors respectivement plutôt de thalasso-drépanocytose ou d’hémoglobinose SC. Le dénominateur commun de tous les SDM reste la mutation ES codant une hémoglobine (Hb) anormale : l’hémoglobine S (HbS). Sous certaines conditions (hypoxie, altitude, infection…), cette HbS va polymériser et provoquer la déformation des globules rouges (GR) en forme de faucille, d’où le terme de drépanocyte qui vient du grec drepanon.
Ces drépanocytes sont plus rigides et plus fragiles conduisant à une anémie hémolytique chronique sévère ponctuée de crises vaso-occlusives (CVO) plus ou moins fréquentes. La présence de la mutation ES à l’état hétérozygote n’est pas pathogène, on parle de trait drépanocytaire. Néanmoins, cette mutation est devenue très fréquente en raison d’une résistance de ces sujets hétérozygotes aux formes graves du paludisme (Allison, 1954).
Historiquement, la mutation ES était particulièrement prévalente sur le continent africain et en Asie du sud-est. En raison des flux migratoires historiques (esclavage) et contemporains (immigration économique) la mutation est maintenant largement représentée en Europe occidentale et en Amérique. En France, la drépanocytose est la plus fréquente des maladies rares avec plus de 400 naissances par an, soit environ trois fois plus que la mucoviscidose selon le bilan des données 2016 de l’Association Française pour le Dépistage et la Prévention des Handicaps de l’Enfant.
La drépanocytose se caractérise notamment par une diminution de la déformabilité érythrocytaire et l’ektacytométrie reste la technique la plus utilisée pour mesurer cette déformabilité via le calcul d’un index de déformabilité (EI). Néanmoins, cette mesure est
30
GR plus rigides qui modifient l’EI en fonction de l’ouverture du diaphragme de la caméra de l’ektacytomètre (Rabai et al., 2014). Sur le nouveau modèle de l’ektacytomètre Laser Optical Rotational Red Cell Analyzer, le LORRCA MaxSis, l’ouverture du diaphragme de la caméra n’est plus accessible manuellement mais seulement de façon électronique par le biais du gain électronique de la caméra qui modifie aussi la taille du pattern de diffraction sur l’écran d’ordinateur. Cependant, l’effet de la modification du gain électronique sur l’EI dans la population drépanocytaire n’a jamais été étudié. Bien que l’osmoscan (ektacytométrie en gradient osmotique et à cisaillement constant) soit la technique de référence pour le diagnostic des maladies de la membrane des GR, la déformabilité érythrocytaire est très souvent caractérisée en condition isotonique et à cisaillement croissant. Il est admis depuis longtemps que les modifications de la courbe en dessous de 3 Pa seraient liées à des modifications de la structure membranaire alors que les modifications au-delà de 3 Pa seraient liées à des modifications de viscosité interne (Baskurt et al., 2009). Néanmoins, cette hypothèse n’a jamais été vérifiée jusqu’à présent.
Le premier objectif de cette thèse a donc été d’améliorer les méthodes de mesures et d’interprétation de la déformabilité érythrocytaire par ektacytométrie en condition isotonique dans la drépanocytose.
Bien que la maladie soit la conséquence d’une mutation unique, les symptômes cliniques des patients sont variés, certains étant presque asymptomatiques tandis que d’autres comptabilisent plusieurs CVO par an. Depuis quelques années, il est d’usage de distinguer deux sous-phénotypes cliniques de drépanocytose : un sous-phénotype dit vaso- occlusif privilégiant les complications type CVO, syndrome thoracique aigu (STA) et ostéonécrose et un second dit hémolytique surtout associé à des vasculopathies cérébrales, des priapismes ou des glomérulopathies (Kato et al., 2007). L’alpha-thalassémie semblerait orienter davantage vers les complications vaso-occlusives tandis que le déficit en glucose-6- phosphate déshydrogénase (G6PD) pourrait augmenter la survenue des complications hémolytiques (Bernaudin et al., 2008; Cita et al., 2016; Joly et al., 2016; Lamarre et al., 2014b;
Nebor et al., 2010; Nolan et al., 2005). Les patients avec un taux d’hémolyse important sont
31
d’hème et d’hémoglobine circulants. Au-delà de ces facteurs, la rhéologie sanguine (déformabilité érythrocytaire, viscosité sanguine et agrégation érythrocytaire) joue un rôle important dans la physiopathologie de la maladie (Ballas et al., 1988; Connes et al., 2016) et il semblerait que chacun des 2 sous-phénotypes cliniques soit caractérisé par un profil hémorhéologique particulier (Bartolucci et al., 2012; Lamarre et al., 2014b, 2014a, 2012;
Lemonne et al., 2014). Néanmoins, on ne connait pas bien le rôle des facteurs génétiques sur la rhéologie sanguine et le stress oxydant des patients drépanocytaires.
Le deuxième objectif de cette thèse a été d’étudier l’influence de certains facteurs génétiques (alpha-thalassémie, déficit en G6PD, haplotypes EES) sur le niveau de stress oxydant et sur la rhéologie sanguine, en relation avec la sévérité clinique (fréquence des évènements vaso-occlusifs), chez les patients drépanocytaires.
Afin de bien introduire le lecteur aux différentes études de ce travail de thèse, une revue de la littérature a été réalisée en partie 1. La deuxième partie est une partie méthodologique qui présente les différentes techniques utilisées pour les 6 études de cette thèse, que ce soit en génétique, en hémorhéologie ou lors des dosages du stress oxydant.
Enfin, la partie 3 présente les différentes publications réalisées au cours de cette thèse en préambule d’une discussion générale en partie 4.
P ARTIE 1
R
R EVUE DE LA
L ITTERATURE
C hapitre 1
D u G lobule R ouge aux
H émoglobinopathies
34
1
1. Le Globule Rouge
1.1. Caractéristiques
Le globule rouge (GR), aussi appelé érythrocyte ou hématie, est l’élément principal du sang. C’est une cellule anucléée, de 7 μm de diamètre environ, remplie d’hémoglobine (Hb) permettant de transporter le dioxygène (O2) à l’ensemble de l’organisme. Un GR normal présente de profil une forme biconcave et ressemble de face à un disque au centre plus clair.
Cette structure avec un grand excès de surface par rapport à une sphère de même volume lui permet de se déformer facilement sans se rompre afin de passer entre des capillaires de diamètre bien inférieur au sien.
1.2. Production
La production des GR, appelée érythropoïèse, commence au stade embryonnaire au niveau du sac vitellin probablement pour les besoins précoces de l’embryon mais c’est l’aorte gonado-mesonephros (AGM) qui est à l’origine de l’hématopoïèse définitive chez l’homme (Medvinsky and Dzierzak, 1996) . Puis, à partir du 3ème mois de grossesse, le foie fœtal prend le relai puis la moelle osseuse (MO) 2 mois plus tard. Chez l’adulte, les GR sont exclusivement produits par la MO au niveau des os plats. Les cellules souches hématopoïétiques multi- potentes vont ensuite se différencier en progéniteurs : BFU-E (Burst Forming Unit –
35
Erythroid) et CFU-E (Colony Forming Unit – Erythroid) puis en précurseurs : proérythroblaste Æ érythroblaste basophile Æ érythroblaste polychromatophile Æ érythroblaste acidophile.
A ce stade-là, les cellules sont nucléées et se situent exclusivement dans la MO, sauf pathologies particulières (Zivot et al., 2018). Avant l’entrée dans la circulation sanguine, l’érythroblaste acidophile perd son noyau et devient un réticulocyte anucléé bien que des mitochondries et fragments de réticulum endoplasmique ou de l’appareil de Golgi persistent.
Après expulsion de ces résidus, le réticulocyte deviendra un GR mature. L’érythropoïèse est stimulée par l’érythropoïétine (EPO) produite au niveau rénal. La durée de vie d’un GR normal est de 120 jours.
1 1.3. La membrane érythrocytaire
C’est sa structure membranaire qui est en partie responsable de la capacité importante de déformation du GR. La membrane du GR est constituée d’une bi-couche phospholipidique et d’un cytosquelette élastique constitué de protéines. La bi-couche phospho-lipidique est majoritairement constituée sur sa face externe de phosphatidylcholine et de sphingomyéline alors que la phosphatydilsérine (PS) est majoritairement présente sur la face interne. La protéine bande 3 est une protéine échangeuse d’anions transmembranaire. Elle est présente sous la forme d’un dimère composé de deux sous-unités identiques qui traversent chacune la membrane au moins une douzaine de fois. La protéine bande 3 sert de canal pour le passage passif des ions bicarbonates (HCO3-) et des ions chlorures (Cl-) de part et d’autre de la membrane érythrocytaire (Hunter, 1977). Les ions HCO3- pénètrent dans la cellule en échange des ions Cl- qui quittent la cellule. Elle joue ainsi un rôle clé dans le mécanisme général de transport du dioxyde de carbone (CO2). En effet, quand le sang circule dans les tissus, le CO2
se dissout dans le plasma et se dissocie selon l’équation suivante : H20 + CO2 → H2CO3 → HCO3- + H+
36
En plus de sa fonction biologique majeure, la protéine bande 3 représente également un site de fixation de plusieurs protéines périphériques. Le complexe bande 3 est formé de 2 dimères de protéines bande 3 liés à la spectrine via l’ankyrine et la protéine 4.2 (Figure 1).
L'ankyrine (aussi appelée bande 2.1) a pour rôle majeur l'ancrage du squelette membranaire sur la face interne de la double couche lipidique grâce à sa fixation d'une part sur la chaîne de spectrine et d'autre part sur le fragment cytoplasmique de la protéine bande 3. La spectrine et l’actine constituent le réseau filamenteux protéique principal du cytosquelette membranaire. La protéine 4.1 stabilise l'association spectrine-actine et représente un premier point d'attache du squelette membranaire sur la face interne de la membrane par interaction avec la glycophorine C (GPC ; Figure 1). D’autres protéines telles que l’adducine, la tropomoduline, la tropomyosine et la dématine sont également retrouvées (Salomao et al., 2008).
Figure 1: Représentation schématique de la structure membranaire d'un globule rouge (Salomao et al., 2008) La membrane du GR est constituée d’une bi-couche phospholipidique et d’un cytosquelette élastique. Le cytosquelette est constitué majoritairement de spectrine (D et E) lié à la bi-couche lipidique par une protéine transmembranaire, l’ankyrine-1, qui interagit avec la protéine bande 3 par l’intermédiaire de la protéine 4.2. L’association spectrine-actine est stabilisée par le complexe 4.1R.
37
2
2. L’hémoglobine
2.1. Structure et fonction
L’hémoglobine (Hb) est la principale protéine du GR. Elle est composée de 2 chaînes de globine de type D et de 2 chaînes de globine de type E, assemblées sous forme de deux dimères DE identiques dans les conditions physiologiques. Chacune de ces chaînes de globine lie, à l’intérieur d’une poche hydrophobe, un groupement prosthétique appelé hème qui fixe une molécule d’O2 via un atome de fer ferreux (Figure 2). Une molécule d’Hb pourra ainsi fixer et transporter jusqu’à 4 molécules d’O2.
Figure 2: Représentation d'une molécule d'hémoglobine (d’après
http://beaussier.mayans.free.fr/IMG/pdf/genet_TP4_aide.pdf consulté le 11/09/2018)
La molécule d’Hb est un tétramère formé de 2 chaînes D et 2 chaînes E. A l’intérieur de chacune de ces chaînes se loge l’hème qui fixe le fer et transporte une molécule d’O2.
2.2. Génétique
Les chaînes de globine sont codées par différents gènes regroupés sous forme de cluster : le cluster alpha pour les chaînes de type alpha et le cluster bêta pour les chaînes de type bêta.
38
Le cluster alpha se situe sur le bras court du chromosome 16 (16p13.3). Il est composé de 3 gènes : HBZ (]), HBA1 (D) et HBA2 (D) (Figure 3a). Ces deux derniers gènes résultent d’une duplication ancestrale d’un même gène ; ils ont ainsi la même partie codante et diffèrent juste par leur séquence intronique. Le cluster bêta se situe sur le bras court du chromosome 11 (11p.15.5) et l’ensemble des gènes est orienté en sens inverse sur le chromosome. Il est composé de 5 gènes : HBE (H), HBG1 ($J), HBG2 (GJ), HBD (G et HBB E) (Figure 3b).
Figure 3: Représentation schématique des clusters alpha (a) et bêta (b) (modifié d’après http://pst.chez- alice.fr/protstfo.htm consultée le 18/07/2018)
2 2.3. Les hémoglobines physiologiques
La transcription globale des différents gènes décrits au paragraphe précédent est contrôlée par des régions situées en amont du promoteur, appelées LCR pour Locus Control Regions. Les gènes vont ainsi s’exprimer de façon séquentielle de 5’ vers 3’ du stade fœtal à la vie adulte. Ceci va alors conduire à une évolution des types d’hémoglobine au cours de la vie (Figure 4).
a. Cluster alpha
b. Cluster bêta
39
Figure 4: Evolution de la concentration des différentes hémoglobines physiologiques au cours de la vie (d’après http://pst.chez-alice.fr/protstfo.htm consultée le 18/07/2018)
Après l’âge de 2 ans, l’HbA (D2E2) est majoritaire et remplace progressivement l’HbF (D2J2)du nourrisson.
Au stade embryonnaire, les chaines ] et D sont toutes les deux exprimées, de même que les chaînes H et J sur le versant bêta. L’association de ces différentes chaînes se traduit par la présence d’Hb Gower 1 (]2H2) et 2 (D2H2), d’Hb Portland (]2J2) et d’Hb Fœtale (HbF ; D2J2). Au stade fœtal, seules les chaînes D restent exprimées sur le versant alpha. Sur le versant bêta, l’expression des chaînes H et ] devient nulle et l’HbF est donc exprimée de façon majoritaire jusqu’à la naissance et pendant les premiers mois de vie. Enfin, les chaînes bêta (qui ont commencé à s’exprimer quelques mois avant la naissance) deviennent progressivement majoritaires par rapport aux chaînes gamma : on parle de la commutation gamma vers bêta à l’issue de laquelle l’Hb Adulte (HbA ; D2E2) devient majoritaire, typiquement entre 6 mois et 2 ans de vie.
40
2 2.4. Les hémoglobinopathies
Il existe différents types d’anomalies de l’hémoglobine. Les anomalies quantitatives ou thalassémies sont liées à un défaut de production d’un type de chaîne de globine. On parle d’alpha-thalassémie si l’anomalie touche les gènes D-globines (HBA1 et/ou HBA2) ou de bêta- thalassémie si l’anomalie touche le gène E-globine (HBB). Les anomalies qualitatives sont liées à la synthèse d’une chaîne de globine anormale donnant naissance à des variants de l’hémoglobine. Les conséquences clinico-biologiques de ces variants sont très variables, pouvant aller de bénignes à très graves (pour la drépanocytose par exemple). D’après les données OMS 2008, 330 000 enfants naissent chaque année avec une anomalie de l’hémoglobine avec 83% de syndrome drépanocytaire majeur et 17% de thalassémie (Dahmani et al., 2017). En février 2018, 1771 anomalies de l’hémoglobine étaient recensées dans la base de données HbVar (Giardine et al., 2014; Hardison et al., 2002) mais la majorité d’entre elles sont cliniquement silencieuse.
C hapitre 2
L es S yndromes
D répanocytaires M ajeurs
42
1 1. Présentation des différents SDM (Figure 5)
1.1. La drépanocytose
La drépanocytose est une maladie monogénique à transmission récessive. Elle est due à la substitution d’une adénine par une thymine au niveau du 20ème nucléotide du gène HBB et entraine au niveau protéique le remplacement d’un acide glutamique par une valine sur le codon 7 de la E-globine : c’est la mutation ES ; NM_000518.4(HBB):c.20A>T(p.Glu7Val) (Pauling et Itano, 1949). Les patients drépanocytaires ont hérité d’un allèle muté ES de chacun de leurs deux parents ; on parle de patients SS (Figure 5).
1.2. La thalasso-drépanocytose
L’allèle ES peut également être associé à une bêta-thalassémie. Il existe 2 types d’allèles bêta-thalassémiques : (1) allèle bêta0-thalassémique avec absence totale de synthèse résiduelle de chaîne bêta et (2) allèle bêta+-thalassémique avec une synthèse partielle de chaîne bêta (Thein, 2018, 2013). Selon que l’allèle ES est associé à un allèle E0 ou E+, on parlera respectivement de patients SE0 ouSE+.Les patients SE+, du fait de la synthèse partielle d’HbA, auront en général un phénotype clinique moins sévère (Figure 5).
1.3. L’hémoglobinose SC
L’hémoglobine C est le second variant de l’hémoglobine le plus fréquent dans les populations d’origine africaine après l’HbS. Elle résulte de la substitution d’une guanine par une adénine au niveau du 19ème nucléotide du gène HBB (codon 7), entrainant au niveau
43
protéique le remplacement d’un acide glutamique par une lysine NM_000518.4(HBB):c.19G>A(p.Glu7Lys). La présence de l’HbC favorise la polymérisation de l’HbS selon des mécanismes qui seront décrits au paragraphe 4.1.4 de ce chapitre. Les patients homozygotes pour l’allèle EC ne présentent pas de syndrome drépanocytaire majeur mais plutôt une légère anémie hémolytique avec légère splénomégalie due à la formation de cristaux d’HbC dans le GR (Feeling-Taylor et al., 2004; Nagel et al., 2003) (Figure 5).
1 1.4. Autres SDM composites
1.4.1. S/D-Punjab
L’Hb D-Punjab ; NM_000518.4(HBB):c.364G>C(p.Glu122Gln), aussi appelée D-Los Angeles, est le troisième variant de l’hémoglobine le plus fréquent dans les populations d’origine africaine après l’HbS et l’HbC. Sa prévalence est importante dans la région de Punjab (d’où son nom) au nord-ouest de l’Inde mais on le retrouve aussi en Afrique. L’hétérozygotie composite S/D-Punjab donne une symptomatologie de drépanocytose car l’Hb D-Punjab potentialise la polymérisation de l’HbS (Adachi et al., 1988). A l’état homozygote, elle est en général asymptomatique mais les patients peuvent présenter une légère anémie hémolytique (Torres et al., 2015).
1.4.2. S/O-Arab
L’Hb O-Arab ; NM_000518.4(HBB):c.364G>A(p.Glu122Lys) est un variant assez répandu en Afrique et en Europe de l’Est (Bulgarie, Hongrie) et du Sud (Grèce, Italie).
L’hétérozygotie composite S/O-Arab donne une symptomatologie de drépanocytose sévère car, en plus de potentialiser la polymérisation de l’HbS (comme l’Hb D-Punjab), l’Hb O-Arab
44
stabilise les polymères d’HbS, catalysant ainsi la formation de drépanocytes irréversibles (Zimmerman et al., 1999). A l’état homozygote, elle ne donne en revanche qu’une discrète anémie hémolytique.
Figure 5: Altérations génétiques et moléculaires dans les principaux syndromes drépanocytaires majeurs (Kato et al., 2018)
L’hémoglobine normale adulte est formée de 2 chaînes bêta et de 2 chaînes alpha. La mutation ES entraine le remplacement de l’acide glutamique par une valine sur le codon 6 du gène HBB. L’association de 2 allèles ES est responsable de la drépanocytose mais l’association de l’allèle ES avec l’allèle EC ou un allèle E-thalassémique peut aussi être responsable d’un syndrome drépanocytaire majeur. La mutation ES est responsable de la formation d’une
45
Hb anormale, l’HbS, qui polymérise en conditions désoxygénées et entraine la formation de globules rouges en faucilles, les drépanocytes.
1 1.4.3. S/E
L’Hb E ; NM_000518.4(HBB):c.79G>A(p.Glu27Lys) est le variant de l’Hb le plus fréquent en Asie avec une prévalence pouvant atteindre 50% de la population dans le sud-est asiatique (Thaïlande, Laos, Cambodge). Dans cette partie du monde, la prévalence historique de l’HbS est faible mais, en raison des flux migratoires, l’hémoglobinose SE commence de nos jours à apparaître en Inde et dans la péninsule arabique (prévalence de 0,05% dans la région d’Oman) (Knox-Macaulay et al., 2007). La mutation EE crée un site donneur alternatif d’épissage non fonctionnel puisque seuls 10% environ du pré-ARNm EE sera correctement épissé, faisant de l’HbE un variant de l’Hb E+-thalassémique (Orkin et al., 1982). Par conséquent, l’hémoglobinose SE est l’équivalent clinique d’une SE+-thalassémie, soit un syndrome drépanocytaire majeur d’intensité modérée.
1.4.4. Cas particulier des variants S-like
Certains variant de l’Hb ont la même migration électrophorétique que l’HbS et sont appelés S-like. Ils se caractérisent par une seconde mutation en cis en plus de la mutation ES. On retrouve une grande variabilité clinique.
Alors que certains variants restent asymptomatique, l’Hb S-Antilles, NM_000518.4(HBB):c.[20A>T;c.70G>A](p.[Glu7Val;Val24Ile]) a la particularité de donner un syndrome drépanocytaire majeur même à l’état hétérozygote (Monplaisir et al., 1986). Alors que l’Hb C-Harlem NM_000518.4(HBB):c.[20A>T;c.220G>A](p.[Glu7Val;Asp74Asn]) est responsable d’une symptomatologie discrète à l’état hétérozygote, l’hétérozygotie composite SC-Harlem s’accompagne de manifestations identiques à celle d’un SDM (Bookchin, 1968;
Girot, 2003). L’anémie des sujets porteurs de l’HbS-Antilles à l’état hétérozygote est modérée
46
mais l’hémogramme des sujets S/S-Antilles, C-S-Antilles ou S/C-Harlem est comparable à celui des SS (Girot, 2003).
2 2. Données historiques et épidémiologiques
2.1. Données historiques
La première description clinique de drépanocytose dans la littérature scientifique occidentale a été faite en 1910 par le Dr. James B. Herrick (Herrick, 1910) . Le patient, originaire des Caraïbes, consultait pour ce qu’on appelle aujourd’hui un syndrome thoracique aigu (STA). Le médecin remarqua l’aspect caractéristique des globules rouges en faucilles sur le frottis sanguin, aspect qui donnera plus tard le nom de drépanocytose (du grec drepanon : faux, faucille) à la maladie. Dès les années 1930, Diggs décrit la physiopathologie de la crise drépanocytaire, à savoir une obstruction des capillaires sanguins par les GR anormaux (Diggs, 1971). En 1940, Pauling mit en évidence la présence d’HbS chez les patients drépanocytaires ; on parla alors pour la première fois du concept de « maladie moléculaire » (Pauling and Itano, 1949). En 1950, Ingram mit en évidence l’anomalie protéique responsable de la maladie (Ingram, 1958) puis, en 1963, Goldstein découvrit la mutation génétique en cause (Goldstein et al., 1963). Depuis, les données sur la maladie n’ont cessé d’évoluer et, même si la drépanocytose reste l’exemple parfait de maladie monogénique, la diversité des signes cliniques et les variations de leur intensité d’un patient à l’autre semblent être la conséquence de facteurs modificateurs associés. Ce sujet sera développé dans le paragraphe 5.4 de ce chapitre.
47
2 2.2. Données épidémiologiques
Le trait drépanocytaire (c’est-à-dire le fait d’être hétérozygote AS) confère un avantage sélectif en protégeant les patients contre les formes graves de paludisme à Plasmodium falciparum (neuropaludisme) (Allison, 1954). Ceci explique la prévalence historique importante de la mutation ES dans les zones impaludées (Afrique sub-saharienne et Inde).
L’esclavage ainsi que les flux migratoires économiques du XXème siècle ont conduit à l’apparition de l’allèle ES en Amérique du Nord et en Europe. On estime à 30 000 le nombre d’individus drépanocytaires dans le monde dont environ 75% en Afrique Sub-Saharienne (Kato et al., 2018)Figure 6). La drépanocytose est relativement bien prise en charge dans les pays occidentaux malgré un manque de connaissance du grand public, manque de connaissance qui tend néanmoins à se combler grâce aux actions des pouvoirs publics (publicité sur la télévision) et des associations de patients (APIPD, association pour l’information et la prévention de la drépanocytose ; CIDD, centre d’information et de dépistage de la drépanocytose ; SOS GLOBI …). L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a par ailleurs institué une journée mondiale de la drépanocytose le 19 juin depuis bientôt 10 ans.
48
Figure 6: Incidence de la drépanocytose dans le monde (Kato et al., 2018)
En rouge et orange, sont représentées les régions où l’incidence est la plus élevée ce qui correspond aux zones impaludées. Les flux migratoires et l’esclavage sont responsables de l’apparition de la maladie en Amérique du Nord et Europe de l’Ouest alors que l’Asie et l’Australie restent indemnes pour le moment.
2 2.3. Notion d’haplotypes drépanocytaires
Des études de ségrégation de polymorphismes génétiques ont permis de démontrer que la mutation ES était apparue indépendamment dans 5 régions distinctes du globe. Les 5 fonds génétiques ou haplotypes correspondants sont: Sénégal (SEN), Bénin (BEN), Bantu ou République de Centre-Afrique (CAR), Cameroun (CAM) et Arabo-Indien (ARAB) (Kulozik et al., 1986) (Figure 7). Les haplotypes SEN et ARAB semblent être les haplotypes les moins sévères dus à la présence du polymorphisme XmnI qui favorise la production d’HbF (Nagel et al., 1991).
A l’inverse, l’haplotype CAR semblent être associé à une anémie hémolytique plus importante que les autres haplotypes (Bernaudin et al., 2018).
49
Figure 7: Distribution géographique des différents haplotypes ES dans les régions où la prévalence de la drépanocytose est élevée (https://www.nature.com/scitable/topicpage/sickle-cell-anemia-a-look-at-global-8756219
consulté le 19/07/2018)
3 3. Diagnostic biologique
3.1. Numération sanguine avec étude de la morphologie des globules rouges
Les patients drépanocytaires présentent, en l’absence de transfusion récente ou d’échange érythrocytaire, une anémie hémolytique régénérative (Hb entre 70 et 90 g/L environ). L’étude du frottis sanguin est caractéristique avec la présence de drépanocytes
50
(Figure 8). Les drépanocytes ne sont observés que chez les patients atteints de syndrome drépanocytaire majeur.
Figure 8: Frottis sanguin d'un patient drépanocytaire
Le frottis sanguin d’un patient drépanocytaire est caractéristique avec la présence de nombreux drépanocytes, globules rouges en formes de faucilles. (photo tirée de http://drepano.unblog.fr/historique/ consultée le 19/07/2018)
3 3.2. Bilan biochimique standard de l’hémoglobine
Selon les recommandations du réseau de laboratoire « Pathologie héréditaire de l’érythrocyte » dépendant de la Direction Générale de l’Offre de Soins (DGOS), le diagnostic phénotypique des hémoglobinopathies (ou bilan standard de l’hémoglobine) repose sur l’association de trois techniques (NABM 1120) dont au moins une technique électrophorétique. Il s’effectue sur un échantillon sanguin recueilli sur EDTA et conservé à +4°C au maximum 7 jours après le prélèvement. L’origine géographique du patient, les résultats de la numération sanguine et du bilan martial ainsi que l’existence d’une transfusion récente doivent être mentionnés afin de faciliter l’interprétation. La technique de première intention devant permettre une quantification fiable de l’HbA2, il est donc recommandé d’utiliser soit la chromatographie liquide haute pression (CLHP) par échange de cations et/ou l’électrophorèse capillaire. Les deux autres tests phénotypiques seront choisis parmi les suivants : électrophorèse de l’Hb à pH alcalin ou acide, focalisation isoélectrique, test d’Itano ou CLHP en phase inverse des chaînes de globine (Aguilar-Martinez et al., 2010).
51
3 3.2.1. CLHP par échange de cations
La CLHP par échange de cations repose sur la fixation des molécules d’Hb chargées négativement sur une résine cationique. Le passage d’un tampon selon un gradient de pH croissant va éluer progressivement les différentes fractions d’Hb selon un temps de rétention proportionnel à leur électronégativité (Figure 9). Ainsi, l’HbC avec la charge positive de la lysine sera retenue plus longtemps (Figure 10) que l’HbS (Figure 11)
Figure 9: Principe de la CLHP par échange de cations pour la séparation des différentes hémoglobines Les variants présentant l’éléctronégativité la plus forte seront élués en premier (comme l’HbA) alors que les variants les moins électronégatifs (comme l’HbC) seront élués ensuite.
52
Figure 10 : Exemple de tracés de CLHP par échange de cations d'un patient hétérozygote pour l'HbC obtenu au laboratoire de biologie médicale multi-site des Hospices Civils de Lyon
Figure 11 : Exemple de tracés CLHP par échange de cations d'un patient hétérozygote pour l’HbS obtenu au laboratoire de biologie médicale multi-site des Hospices Civils de Lyon
53
3 3.2.2. Electrophorèse capillaire
L’électrophorèse capillaire est pratiquée dans un capillaire de silice fondu de 20 μm de diamètre interne environ. Le capillaire est rempli d’une solution tampon et chacune de ses extrémités plonge dans 2 réservoirs contenant cette même solution. Chaque réservoir est connecté à une électrode et une différence de potentiel de plusieurs milliers de volt est appliquée aux bornes de chaque capillaire pour séparer les molécules en fonction de leur rapport charge/masse (Figure 12).
Figure 12: Principe de l'électrophorèse capillaire (Blessum et al., 1999)
Les molécules migrent vers la cathode grâce au flux électro-osmotique mais plus ou moins vite selon le flux électrophorétique fonction de sa charge, sa taille et sa forme.
La détection se fait par spectrophotométrie UV à 415 nm. En fonction du pH du tampon, les groupements silanols de la silice s’ionisent et confèrent à la paroi une charge négative à l’origine du flux électro-osmotique orienté vers la cathode. Chaque molécule d’Hb chargée négativement migre néanmoins vers la cathode en raison de ce flux mais plus ou
54
moins vite en fonction de sa propre mobilité électrophorétique en sens inverse qui est fonction de sa charge, de sa taille et de sa forme.
Figure 13: Tracé d'électrophorèse capillaire d’un patient hétérozygote pour l’HbC obtenu au laboratoire de biologie médicale multi-site des Hospices Civils de Lyon
3 3.2.3. Autres techniques électrophorétiques
3.2.3.1. Electrophorèse sur acétate de cellulose à pH alcalin
L’électrophorèse sur acétate de cellulose à pH alcalin s’effectue avec un tampon Tris-EDTA- borate à pH compris entre 8,4 et 8,6. Les bandes d’Hb sont visualisées grâce à des colorants et quantifiées par densitométrie. Néanmoins, ce type d’électrophorèse n’est pas très résolutif et ne permet pas de différencier les Hb C, E et O ou les Hb S et D (Figure 14).
55
3.2.3.2. Electrophorèse sur agarose à pH acide
L’électrophorèse sur gel d’agarose à pH acide (pH entre 6,0 et 6,2) permet de distinguer les HbS et D ainsi que les HbC et E. En revanche, l’HbS ne se distingue pas de l’HbO et l’HbE migre au même niveau que l’HbA. (Figure 14).
Figure 14: Electrophorèse à pH alcalin sur acétate de cellulose et sur agarose à pH acide (Baudin, 2016) L’électrophorèse à pH alcalin (à gauche) n’est pas très résolutive et ne permet pas de distinguer les Hb S et D et les Hb C et E. La distinction de ces différents types d’Hb est possible à pH acide (à droite) mais, avec ce type d’électrophorèse, l’HbO migre au même niveau que l’HbS et l’HbE au même niveau que l’HbA.
3.2.3.3. Electrophorèse sur citrate-agar à pH acide
L’électrophorèse sur agar à pH acide s’effectue comme la précédente à un pH compris entre 6,0 et 6,2 mais l’utilisation de l’agaropectine permet une séparation différente. A pH acide, les molécules sont chargées positivement et vont se fixer à l’agaropectine chargée négativement.
La séparation va ainsi dépendre : 1) de la charge de la molécule et 2) des modifications de structure dans les régions positivement chargées qui se lient à l’agaropectine.
56
3.2.3.4. Focalisation isoélectrique sur gel de polyacrylamide
La focalisation isoélectrique (ou iso-focalisation électrique) utilise un gel de polyacrylamide contenant des molécules chargées qui permettent l’établissement d’un gradient continu de pH (entre 6 et 8 environ). Les molécules d’Hb migrent au sein de ce gel jusqu’à atteindre l’endroit où le pH est tel qu’il y a autant de charges positives que négatives : il s’agit du pH isoélectrique, spécifique (ou presque) de chaque variant de l’Hb. Avec cette technique, les HbA2, C et E migrent quasiment au même endroit mais la résolution pour la détection de variants atypiques est excellente.
Figure 15: Migration des principales Hb pathologiques en focalisation isoélectrique(Siguret and Andreux, 1997)
57
3 3.2.4. Test d’Itano
Le test d’Itano est aussi appelé test de solubilité. Le culot de GR est mélangé à un tampon phosphate de molarité importante (2 à 3 M) ce qui provoque la falciformation des GR contenant de l’HbS et une augmentation de la turbidité de la solution (Figure 16). Cette technique est sensible et spécifique de l’HbS mais elle présente l’inconvénient de ne pas pouvoir distinguer les patients homozygotes des hétérozygotes AS. De plus, chez les nouveau- nés, des faux négatifs existent si le taux d’HbS est inférieur à 20%. (Couque et De Montalembert, 2013)
Figure 16: Test d'Itano ou test de solubilité
L’ajout de phosphate provoque la polymérisation de l’HbS et augmente la turbidité de la solution. On ne distingue plus les lignes noires sur fond blanc
3.2.5. CLHP en phase inverse des chaînes de globines
Contrairement aux techniques précédentes, la CLHP en phase inverse des chaînes de globine étudie les chaînes de globines de façon isolée et leur séparation dépend de leur hydrophobicité. Schématiquement, plus une chaîne de globine sera hydrophobe et plus son temps de rétention sera important. Cette technique nous permet de prédire avec une grande probabilité la nature alpha ou bêta d’un variant avant même la caractérisation génétique selon si c’est le pic alpha ou bêta qui est dupliqué (Figure 17).
58
Figure 17: Exemple de tracé de CLHP en phase inverse des chaines de globines pour un patient hétérozygote pour l'HbS obtenu au laboratoire de biologie médicale multi-sites des Hospices Civils de Lyon.
3 3.3. Diagnostic génotypique
3.3.1. Diagnostic post-natal
Les SDM ne nécessitent en général pas de diagnostic génotypique et un bilan phénotypique suffit. Néanmoins en absence d’HbA et avec un taux d’HbS >80% une analyse génétique est nécessaire pour différencier un génotype ES/ES d’un génotypeES/E0 si l’analyse biochimique des parents n’est pas possible.
3.3.2. Diagnostic pré-natal
Le diagnostic prénatal est justifié pour les risques de SDM de type SS, S/E0, S/E+ avec une faible expression d’HbA, SD-Punjab, S/O-Arab et S/Lepore. En revanche, les risques de
hème EA
ES
DA
