Détection de micro-ARNs in situ : utilisation de sondes LNA

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Détection de micro-ARNs in situ : utilisation de sondes LNA

Candice Babarit

To cite this version:

Candice Babarit. Détection de micro-ARNs in situ : utilisation de sondes LNA. XXXème congrès de l’AFH: les nouveaux mondes de l’histologie, Association Française d’Histotechnologie (AFH). FRA., Jun 2017, Nantes, France. �hal-01547549�

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23/06/2017 Congrès AFH, Nantes, 23 / 06 / 2017

Détection de micro-ARNs in situ : utilisation de sondes LNA

Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Congrès AFH, Nantes 23 / 06 / 2017

Les micro-ARNs

Ø ARNs de petite taille : 20-25 nucléotides

Ø Synthétisés à partir de l’ADN génomique Ø non traduits en protéine

Ø Acteurs clés de la régulation post-transcriptionnelle

1

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Les micro-ARNs

Ø ARNs de petite taille : 20-25 nucléotides

Ø Synthétisés à partir de l’ADN génomique Ø non traduits en protéine

Ø Acteurs clés de la régulation post-transcriptionnelle

1

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Pourquoi s’intéresse t-on aux micro-ARNs ?

ü Rôle physiologique : apoptose, différenciation cellulaire, développement …

2

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Pourquoi s’intéresse t-on aux micro-ARNs ?

ü Rôle physiologique : apoptose, différenciation cellulaire, développement …

2

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Pourquoi s’intéresse t-on aux micro-ARNs ?

Ø Implication dans les processus physiopathologiques :

2 ü Rôle physiologique : apoptose, différenciation cellulaire, développement …

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Pourquoi s’intéresse t-on aux micro-ARNs ?

Ø Implication dans les processus physiopathologiques :

2 ü Rôle physiologique : apoptose, différenciation cellulaire, développement …

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Pourquoi s’intéresse t-on aux micro-ARNs ?

Ø Implication dans les processus physiopathologiques :

• Compréhension des processus pathologiques

• Biomarqueurs diagnostiques

• Biomarqueurs d’efficacité de la réponse aux traitements

• Cibles thérapeutiques

(Gougelet Aet al, 2015)

2 ü Rôle physiologique : apoptose, différenciation cellulaire, développement …

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Techniques d’analyse des micro-ARNs

Approches globales

- Microarray

- Séquençage haut débit

3

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Techniques d’analyse des micro-ARNs

Approches globales

- Microarray

- Séquençage haut débit

Approches ciblées

- RT-qPCR

- Hybridation in situ

3

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

La détection des micro-ARNs par hybridation in situ:

un véritable challenge

Ø Nature instable des ARNs (travailler en condition RNase free)

Ø Petite taille des micro-ARNs

Ø Séquences très proches entre certains micro-ARNs

4

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Les sondes LNA : Gold standard pour la détection des micro-ARNs

5

Urbaneket al, 2015

Ø Développement de sondes oligonucléotidiques avec incorporation d’acides nucléiques modifiés

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Les sondes LNA : Gold standard pour la détection des micro-ARNs

Ø Sondes LNA: sonde ADN avec incorporation d’acides nucléiques « verrouillés » (30% de LNA)

Ø Les acides nucléiques LNA:

• augmentent l’affinité de liaison avec le nucléotide complémentaire

• augmentent la spécificité de l’hybridation

5

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

• PFA 4%

• Ethyl diéthylaminopropyl carbodiimide (EDC)

FIXATION

Détection des micro-ARNs par hybridation in situ

6

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

• PFA 4%

• EDC

• Optionnelle

• Triton X-100

• Proteinase K

FIXATION PERMÉABILISATION

6 Détection des micro-ARNs par hybridation in situ

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

• PFA 4%

• EDC

• Optionnelle

• Triton X-100

• Proteinase K

FIXATION PERMÉABILISATION HYBRIDATION

• Sonde LNA

• Marquage en 3’ ou 5’ ou 3’/5’

• Haptène ou fluorophore

• Contrôle négatif : scramble-miR

6 Détection des micro-ARNs par hybridation in situ

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

• PFA 4%

• EDC

• Optionnelle

• Triton X-100

• Proteinase K

FIXATION PERMÉABILISATION HYBRIDATION DETECTION

• Chromogénique

• Fluorescence

6 • Sonde LNA

• Marquage en 3’ ou 5’ ou 3’/5’

• Haptène ou fluorophore

• scramble-miR

Détection des micro-ARNs par hybridation in situ

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

La myopathie de Duchenne

Ø Maladie génétique provoquant une perte progressive de la masse musculaire Ø Touche 1 garçon / 5000

Ø Mutation du gène DMD codant la dytrophine

dystrophine

Muscle sain Muscle myopathe

7 Absence de dystrophine

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Absence de dystrophine

Fragilisation de la membrane

Physiopathologie de la myopathie de Duchenne

8

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Absence de dystrophine

Entrée de calcium

Activation des protéases

Physiopathologie de la myopathie de Duchenne

8 Nécrose des fibres

(22)

Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Absence de dystrophine

Entrée de calcium

Physiopathologie de la myopathie de Duchenne

8 Nécrose des fibres

Régénération

(23)

Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Absence de dystrophine

Entrée de calcium

Physiopathologie de la myopathie de Duchenne

8 Nécrose des fibres

Régénération masse musculaire

Infiltration du tissu adipeux

(24)

Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Absence de dystrophine

Entrée de calcium

Physiopathologie de la myopathie de Duchenne

8 Nécrose des fibres

Régénération masse musculaire

Infiltration du tissu adipeux

NF-κB

inflammation

fibrose Stress oxydatif

↓NO

(25)

Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Absence de dystrophine

Entrée de calcium

8 Nécrose des fibres

Régénération masse musculaire

Infiltration du tissu adipeux

NF-κB

inflammation

fibrose Stress oxydatif

↓NO

micro-ARNs et physiopathologie

miR-206 miR-133

miR-1

miR-486

miR-222

miR-29

Cacchiarelliet al 2011, Greco et al 2009, Roberts et al 2012, Liu et al 2012, Eisenberget al 2007

(26)

Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Le modèle du chien GRMD

Golden Retriever Muscular Dystrophy

Ø Phénotype clinique proche de l’Homme

Ø Taille comparable à celle des enfants dystrophiques

Ø Référence pour les essais précliniques

10

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Le modèle du chien GRMD

Golden Retriever Muscular Dystrophy

Absence de données sur l’expression tissulaire des micro-ARNs dans le muscle du chien GRMD

10 Ø Phénotype clinique proche de l’Homme

Ø Taille comparable à celle des enfants dystrophiques

Ø Référence pour les essais précliniques

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Expression tissulaire des miR-206 et miR-486 chez le chien GRMD

11 Absence de dystrophine

Entrée de calcium

Régénération masse musculaire Nécrose des fibres

miR-206 miR-486

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Démarche expérimentale

Niveau d’expression tissulaire

Transcription inverse

12

Sonde Taqman Sens

Anti-sens miRNA mature

Sonde RT

Extraction des petits ARNs

qPCR

(30)

Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Démarche expérimentale

Niveau d’expression tissulaire

Transcription inverse

12 Extraction des petits ARNs

qPCR

Localisation cellulaire et phénotypage

Sonde RT

(31)

Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Démarche expérimentale

12 Hybridation in situ

Coupes au cryostat

Précipité Bleu NBT-BCIP

Localisation cellulaire et phénotypage Niveau d’expression tissulaire

Transcription inverse

Extraction des petits ARNs

qPCR

Sonde RT

(32)

Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Démarche expérimentale

Hybridation in situ

Coupes au cryostat

Immunomarquage MyHCd

12 Localisation cellulaire et phénotypage Niveau d’expression tissulaire

Transcription inverse

Extraction des petits ARNs

qPCR

Sonde RT

(33)

Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Robriquet, Babaritet al, 2016

Expression du miR-206 chez le chien GRMD

14

Healthy GRMD

0 1 2 3 4

QR/RNU6B

miR-206

n = 5

n = 3

p = 0.6, test Mann-Whitney

(34)

Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Expression du miR-206 chez le chien GRMD

14

0 1 2 3 4

QR/RNU6B

miR-206

n = 5

n = 3

(35)

Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Expression du miR-206 chez le chien GRMD

14

Échelle: 25 µm

0 1 2 3 4

QR/RNU6B

miR-206

n = 5

n = 3

(36)

Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

16 Expression du miR-486 chez le chien GRMD

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

miR-486

QR/RNU6B

n = 5

n = 3

(37)

Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

16 Expression du miR-486 chez le chien GRMD

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

miR-486

QR/RNU6B

n = 5

n = 3

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

16 Expression du miR-486 chez le chien GRMD

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

miR-486

QR/RNU6B

n = 5

n = 3

Échelle: 25 µm

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Ø Sondes LNA : puissants outils pour la détection de micro-ARNs

Ø Description du profil d’expression tissulaire des miR-206 et miR-486 chez le chien GRMD

Ø Les techniques quantitatives ne permettent pas de détecter des dérégulations du profil d’expression

Conclusion

17

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Perspectives de développement à l’UMR703:

Hybridation in situ quantitative

Micro-ARN LNA-ELF-FISH

ARNm SM-FISH

ELF : Substrat de la phosphatase alcaline hydrolysé en précipité fluorescent

Utilisation de plusieurs sondes oligonucléotidiques pour un même ARNm

18

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Merci

UMR 703 PAnTher

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Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

Congrès AFH, Nantes 23 / 06 / 2017 sciencephotolibrairy Robriquet et al, 2015