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Étude expérimentale de la stabilité, sélectivité d’appariement et dynamique d’oligonucléotides DNA-DNA et LNA-DNA

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Academic year: 2021

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Texte intégral

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FACULTÉ DES SCIENCES APPLIQUÉES Service Matières et Matériaux

Ingénierie Moléculaire et Biomoléculaire

Étude expérimentale de la stabilité, sélectivité d’appariement et dynamique d’oligonucléotides DNA-DNA et LNA-DNA

Directeur de Thèse:

Prof. Kristin Bartik

Année académique 2007-2008

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur

en Sciences Appliquées Marina Boccongelli

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Tout d’abord, je tiens à remercier mon promoteur, Kristin Bartik, pour m’avoir accueillie au sein de son laboratoire et avoir toujours été présente pendant mes quatre ans de thèse. Chacun de mes soucis avait de l’importance pour elle, même lorsqu’elle était débordée de travail. La précision et la patience qui la caractérisent font de Kristin un guide exceptionnel. Ses discours, qui accompagnaient la

scrupuleuse correction de ma thèse, ne manquaient point d’encouragements.

Je tiens également à remercier Jacques Reisse pour ses précieux conseils et sa disponibilité lors des répétitions en vue des présentations importantes. Ensuite, je le remercie pour avoir corrigé quelques rapports annuels.

Je voudrais exprimer ma gratitude à Karim Snoussi pour le temps qu’il m’a consacré, que ce soit par e-mail, par téléphone, à l’ULB ou à l’UCL ! Ses

innombrables explications ainsi que ses conseils ont été indispensables au bon déroulement des expériences de dynamique. Je le remercie également pour les encouragements et l’énergie qu’il m’a transmise tout au long du dernier volet de mon travail de thèse.

Je suis également reconnaissante à Michel Luhmer et à son équipe : Rita,

Épiphanie et Sandrine. Michel a toujours été prêt à m’aider lors de mes petits et gros problèmes à la RMN. Il a en outre contribué à la préparation de mes

présentations en analysant pertinemment mon travail. Quant à Rita, Épiphanie et Sandrine, elles n’ont jamais hésité à proposer leur aide, surtout pendant ma

grossesse.

Au sein de mon équipe, je désire remercier de tout cœur Juliana. Tout en

s’occupant des défaillances techniques et de n’importe quel souci au labo, elle a été plus qu’une collègue pour moi.

J’accorde une attention toute particulière à Sophie, en qui j’ai trouvé une amie avec laquelle j’ai eu le plaisir de tout partager, tant sur le plan professionnel que personnel. Son dynamisme, sa disponibilité, son envie d’aider tout simplement, voilà ce qui m’amène à lui exprimer toute mon affection. Je la remercie de surcroît pour l’attention soutenue qu’elle a accordée à la relecture de cette thèse.

Je remercie Gilles pour son agréable compagnie au bureau, pour ses attentions et son aide lorsque j’en avais besoin et pour avoir patiemment corrigé ma thèse.

Je n’oublierai pas Nicole, maintenant à la pension, et les derniers arrivés Mélanie et Matthieu qui contribuent à la bonne ambiance du P2.

Un grand merci au Fonds pour l’encouragement à la Recherche dans l’Industrie et l’Agriculture (FRIA) pour m’avoir accordé la bourse qui m’a permis de réaliser ce travail de thèse. Je remercie également le Fonds De Brouckère-Solvay et le Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS) pour les bourses de voyage, ainsi que le Fonds David et Alice Van Buüren pour la bourse de fin de doctorat.

Enfin, je remercie ma famille, qui m’a aidée et soutenue jusqu’à la fin.

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Il y a dans toute forme de découverte, un saut à faire dans l'inconnu.

Au-delà de son aspect périlleux, il porte en soi le fruit de l'induction, processus au cœur de la découverte et de l'analyse.

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Résumé

Le traitement et le diagnostic de maladies d'origine génétique suscite un grand intérêt à l'heure actuelle. De par leur spécificité d'appariement avec les acides nucléiques, les oligonucléotides possèdent un grand potentiel dans ce domaine. Ils se heurtent toutefois à des limitations majeures, dont leur faible stabilité en milieu physiologique et la difficulté qu'ils ont à franchir les membranes biologiques. De nombreuses équipes de recherche s'intéressent, afin de pallier ces limitations, à la conception et à la synthèse d'oligonucléotides chimiquement modifiés. Parmi ceux-ci, les Locked Nucleic Acids (LNA), présentant une modification qui consiste en l'insertion d'un pont −O−CH2− entre l'atome C2' et l'atome C4' du sucre, constituent une famille qui semble posséder les propriétés requises.

Ils sont considérés comme des candidats très prometteurs en tant qu’agents thérapeutiques et qu’outils de diagnostic du génome. La caractérisation de la stabilité et de la sélectivité d'appariement entre les LNA et les acides nucléiques naturels est, dans ce contexte, important.

Dans ce travail, nous avons étudié la stabilité, la sélectivité d'appariement ainsi que la dynamique de la structure double brin d'un oligonucléotide hybride LNA-DNA, et nous avons comparé ces propriétés à celles d'un oligonucléotide DNA-DNA de même séquence. Ce dernier est constitué de 11 paires de bases formées par l'appariement du brin 5'- GCGTGTGTGCG-3' avec le brin 3'-CGCACACACGC-5'. Dans le cas de l'hybride, les nucléotides du second brin sont tous remplacés par des LNA.

La stabilité a été étudiée expérimentalement par différentes techniques : spectroscopie d'absorption UV, calorimétrie différentielle à balayage, résonance magnétique nucléaire et calorimétrie à titrage isotherme. Ces études montrent que la stabilité du duplexe hybride est plus importante que celle du naturel, et que ce phénomène s'explique par un terme entropique plus favorable pour la formation du duplexe LNA-DNA que pour la formation du duplexe DNA-DNA.

La sélectivité d'appariement a été étudiée en comparant la stabilité des deux oligonucléotides étudiés avec celle d'oligonucléotides présentant un mésappariement dans la séquence. Nos résultats montrent que la sélectivité d'appariement du brin LNA n'est pas significativement différente de celle du brin DNA. Ce résultat ne doit cependant pas être généralisé car nous n'avons testé qu'une position centrale pour le mésappariement.

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L'étude de la dynamique de la structure des oligonucléotides a été effectuée par RMN et porte sur la caractérisation de la cinétique de l'ouverture individuelle des paires de bases.

Nous observons que la durée de vie de l'état fermé des paires de bases G-C est supérieure dans l'oligonucléotide LNA-DNA, tandis que l'état fermé des paires A-T semble posséder une durée de vie supérieure dans l'oligonucléotide DNA-DNA.

Au cours de ce travail de thèse nous avons pu caractériser les facteurs énergétiques à la base de la stabilité accrue des oligonucléotides chimiquement modifiés de type LNA. Nous avons montré que leur sélectivité d’appariement n’est pas toujours supérieure à celle des oligonucléotides naturels et dépend des séquences impliquées. Enfin, nous avons mis en évidence les différences entre la dynamique de la structure d’un oligonucléotide possédant des LNA et celle d’un duplexe DNA.

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