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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Le Calve, B. (2011). Caractérisation des mécanismes de résistance des cellules gliales tumorales à la chimiothérapie et identification de nouvelles pistes chimiothérapeutiques potentielles (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Pharmacie, Bruxelles.

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ULB

UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES, UNIVERSITÉ D’EUROPE

Faculté de Pharmacie

Ecole Doctorale Thématique en Sciences Pharmaceutiques

Caractérisation des mécanismes de résistance des cellules gliales tumorales à la chimiothérapie et identification de

nouvelles pistes chimiothérapeutiques potentielles

Le Calvé Benjamin

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques

Promoteur : Kiss Robert

Laboratoire de Toxicologie, Faculté de Pharmacie

Composition du jury :

Prof. Isabelle Salmon (Université Libre de Bruxelles) Prof. Marc Bracke (Université de Gand)

Prof. Jean-Michel Kauffmann - Président (Université Libre de Bruxelles) Prof. Véronique Fontaine - Secrétaire (Université Libre de Bruxelles) Prof. Jacques Dubois (Université Libre de Bruxelles)

Prof. Pierre Duez (Université Libre de Bruxelles) Prof. Karim Amighi (Université Libre de Bruxelles)

Université Libre de Bruxelles

ie Académique 2011-2012

ULB

UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES, UNIVERSITÉ D'EUROPE

Faculté de Pharmacie

Ecole Doctorale Thématique en Sciences Pharmaceutiques

Caractérisation des mécanismes de résistance des cellules gliales tumorales à la chimiothérapie et identification de

nouvelles pistes chimiothérapeutiques potentielles

Le Calvé Benjamin

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques

Promoteur : Kiss Robert

Laboratoire de Toxicologie, Faculté de Pharmacie

Composition du jury :

Prof. Isabelle Salmon (Université Libre de Bruxelles) Prof. Marc Bracke (Université de Gand)

Prof. Jean-Michel Kauffmann - Président (Université Libre de Bruxelles) Prof. Véronique Fontaine - Secrétaire (Université Libre de Bruxelles) Prof. Jacques Dubois (Université Libre de Bruxelles)

Prof. Pierre Duez (Université Libre de Bruxelles) Prof. Karim Amighi (Université Libre de Bruxelles)

ABREVIATIONS...4

BUT DU TRAVAIL...6

RESUME...7

INTRODUCTION...8

1 Caractérisation du comportement biologique et clinique des glioblastomes...8

1.1 Echelle de gradation de la malignité...8

1.2 Epidémiologie...9

1.3 Traitements... 10

1.3.1 Chirurgie...10

1.3.2 Radiothérapie... 10

1.3.3 Traitement chimiothérapeutique standard... 11

1.3.4 Chimiothérapie de deuxième ligne...12

1.4 Biologie des glioblastomes... 12

1.4.1 Profils génétiques...12

1.4.1.1 EGFR...13

1.4.1.2 PTEN...13

1.4.1.3 P53...14

1.4.1.4 MGMT... 14

1.4.1.5 IDHl ... 15

1.4.1.6 Autres altérations génétiques... 15

1.4.2 Caractéristiques biologiques et moléculaires... 16

1.4.2.1 Invasion... 16

1.4.2.2 Prolifération... 17

1.4.2.3 Nécrose... 17

1.4.2.4 Angiogénèse... 18

1.4.2.5 Apoptose... 18

1.4.3 Cellules souches... 19

2 Quels sont les mécanismes de résistance à la chimiothérapie connus à ce jour pour les glioblastomes ?...20

2.1 La résistance des cellules migrantes à l’apoptose... 20

2.2 Les systèmes de détoxification cellulaire... 21

2.3 Stress du réticulum endoplasmique...22

3 Pourquoi le témozolomide offre-t-il un avantage thérapeutique par rapport à toutes les autres formes de chimiothérapies ?...23

3.1 Alkylation de l’ADN... 23

3.2 Induction de processus soutenus d’autophagie suivis d’apoptose tardive... 24

3.3 Effet anti-angiogénique... 25

3.4 Conclusion... 26

4 Quels sont les mécanismes cellulaires et moléculaires permettant aux cellules gliales tumorales de résister au témozolomide ?...26

4.1 Sur le plan cellulaire...26

4.1.1 Le métabolisme des cellules tumorales gliales...26

4.1.2 La pompe à efflux ABCBl (MDRl)... 28

4.1.3 L’hypoxie... 29

1

4.1.3.1 Hypoxie et cellules souches... 29

4.1.3.2 Hypoxie et résistance à la chimiothérapie... 30

4.2 Sur le plan moléculaire...30

4.2.1 MGMT... 30

4.2.2 HIFI a... 31

5 Quelles sont les approches thérapeutiques envisagées actuellement pour combattre les gliomes résistants au témozolomide?...32

5.1 Le cilengitide...32

5.2 La chlorotoxine...33

5.3 L’avastin... 34

5.4 L’erlotinib... 36

5.5 Autres types de molécules... 37

5.5.1 Immunothérapie...37

5.5.2 Dasatinib... 38

6 Pourquoi nous sommes-nous intéressés auxphyllostictines?...39

6.1 Origine des phyllostictines... 39

6.2 Technique d’extraction... 39

6.3 Propriétés connues à ce jour... 40

6.3.1 Pesticide... 40

6.3.2 Activités antibactérienne et zootoxique...41

MATERIEL ET METHODES...43

1 Culture cellulaire et modèles biologiques...43

1.1 Lignées cellulaires établies... 43

1.2 Lignées cellulaires résistantes au témozolomide...43

1.3 Milieux et conditions de culture cellulaire...44

1.4 Les modèles in vivo... 45

2 Les tests de croissance cellulaire et mort cellulaire...46

2.1 Le test colorimétrique MTT... 46

2.2 Analyse du cycle cellulaire... 47

2.3 Analyse TUNEL...47

2.4 La vidéomicroscopie quantitative... 48

3 Analyse de l’expression génomique...49

3.1 Puce Affymétrix...49

3.2 La reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)...50

4 Analyse de l’expression protéomique...53

4.1 L’immunofluorescence... 53

4.2 Western Blotting...55

4.3 Extinction par la technique de siRNA... 58

5 Etude de l’activité anticancéreuse de la phyllostictine A... 59

5.1 Etude de la liaison à l’ADN... 59

5.2 Etude de liaison au glutathion, la cystéine ou la N-acétyle cystéine...59

5.3 Déplétion en glutathion... 60

6 Analyses statistiques...61

6.1 Analyse de survie...61

6.2 Comparaison de groupes de données...61

RESULTAT-1...62

Erratum... 79

RESULTAT-IL...81

DISCUSSION...95

1 Nouveaux mécanismes de résistance au témozolomide... 95

1.1 Analyse de nos résultats en fonction des données déjà publiées dans la littérature 95 1.2 Implication potentielle de nos résultats sur le plan clinique : mise au point de biomarqueurs tissulaires et/ou sanguins... 97

1.3 Implication potentielle de nos résultats sur le plan thérapeutique : identification de nouvelles cibles pour combattre les gliomes malins...98

2 Développement des phyllostictines dans le but d’une stratégie de traitement des gliomes...99

2.1 Exploitations optimisées des mécanismes d’action antitumoraux originaux... 99

2.2 Caractérisation du mécanisme d’action... 100

2.3 Amélioration de la biosélectivité par vectorisation ciblée...101

3 Conclusions...103

REFERENCES...105

3

ABREVIATIONS

ABREVIATIONS

ABCCl: ATP-binding cassette sub-family C member 1 ABCG2: ATP-binding cassette sub-family G member 2 ABH: alkB homologous protein

ADN: acide déoxyribonucléique

Akrlcl, 2 et 3: aldo-kéto réductase le 1,2 et 3 ALDHl aldéhyde déshydrogénase 1

ARNm: acide ribonucléique messager ATP: adenosine tri-phosphate

BER: base excision repair

Bip: immunoglobulin-binding protein CAIX: anhydrase carbonique IX

CDKN2A: cyclin-dependent kinase inhibitor 2A CIC: canaux chlore

DMSO: diméthylsulfoxyde

dNTP: déoxynucléotides triphosphate EGF: epidermal growth factor

EGFR: epidermal growth factor receptor F.D.A: Food and Drug Administration FITC: fluorescein isothiocyanate GFAP: glial fribrilary acidic protein GSH: glutathion

HCl: acide chlorhydrique

HIF-la: hypoxia-inductible factor la HRP: horseradish peroxidase

IDHl et 2: isocitrate déhydrogénase 1 et 2 IL-8: interleukine 8

LC3: microtubule-associated protein 1 light chain 3 LDH: lactate déshydrogénase

LOH: loss of heterozygosity

MCTl et 4: mono-carboxylate transporter MDR: multidrogue résistance

MEM: minimal essentiel medium MgCl2: chlorure de magnésium

MGMT: 06-méthylguanine DNA transférase

MITC: 5-(3-méthyltriazene-l-yl) imidazole-4-carboxamide MMP-2 et -9: matrix metalloproteinase 2 et 9

MMR: mismatch repair

NADPH: nicotinamide adénine dinucléotide phosphate NFl: neurofibromin 1

NHDF: Normal Human Dermal Fibroblasts O.M.S: organisation mondiale de la santé PARK2: Parkinson protein 2

PCR: polymerase chain reaction

PCV : procarbazine, lomustine, vincristine PDGFR: Platelet-derived growth factor receptors PDKl : pyruvate déshydrogénase kinase 1

PGP: glycoprotéine P

PI3K: phosphate inositol 3 kinase

PIP2: phosphatidylinositol-4,5-biphosphate PIP3: phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate PKC: protein kinase C

PTEN: phosphatase and Tensin homolog RISC: RNA-Induced Silencing Complex RPMI : Roswell Park memorial medium

RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction SiRNA: small interfering ARN

SVF: sérum de veau fœtal

TCGA: the cancer genome atlas research network TdT: Terminal Deoxynucléotidyl Transferase TEP: tomographie par émission de positons TMZ: témozolomide

TUNEL: Terminal deoxynucléotidyl transferase dUTP nick end labeling UPR: unfolded protein response

BUT DU TRAVAIL

BUT DU TRAVAIL

Les tumeurs gliales et plus particulièrement le glioblastome, qui représente le plus haut grade de malignité, sont de très mauvais pronostic. Actuellement, la médiane de survie des patients atteints de glioblastomes est inférieure à quinze mois. Malgré les progrès des techniques chirurgicales et des moyens de radiothérapie, aucun patient n’a pu survivre à long terme à ce type de tumeur notamment à cause de son caractère invasif et agressif. Le traitement standard administré aux patients nouvellement diagnostiqués, après une résection chirurgicale la plus large de la tumeur, est un traitement concomitant radiothérapie-chimiothérapie au témozolomide suivi de cycles de témozolomide qui est la molécule qui offre le plus grand bénéfice thérapeutique au patient. Certains d’entres eux développent des résistances au témozolomide au cours de leur traitement notamment par la mise en place de mécanismes moléculaires au sein des cellules tumorales gliales.

Notre travail s’est articulé en deux étapes distinctes. Tout d’abord, nous avons essayé de caractériser les gènes impliqués dans ces mécanismes de résistance acquise au témozolomide dans le but de découvrir des marqueurs prédictifs ou de nouvelles cibles dans le traitement des glioblastomes. La deuxième étape de ce travail est d’identifier des nouvelles molécules originales, brevetables et actives contre les glioblastomes. Nous nous sommes ainsi intéressés à des molécules produites par des champignons parasites de plantes. Les diverses molécules ont été testées sur des modèles in vitro et seraient susceptibles, grâce aux résultats que nous avons obtenus, d’être introduites en essais précliniques à plus ou moins moyen terme.

Ce travail s’inscrit dans la thématique du Laboratoire de Toxicologie de la Faeulté de Pharmacie de l’Université Libre de Bruxelles qui a pour but d’identifier les mécanismes moléculaires de résistance dans divers types de cancers (gliome, œsophage,

RESUME

RESUME

Les glioblastomes sont les tumeurs cérébrales malignes les plus répandues chez l’adulte et l’enfant, et les plus agressives avec une médiane de survie inférieure à quinze mois. Deux caractéristiques biologiques rendent leur traitement particulièrement difficile.

Tout d’abord, la capacité d’invasion du parenchyme cérébral par les cellules gliales tumorales rend la résection chirurgicale totale impossible. De plus, ces cellules développent une résistance aux stimuli pro-apoptotiques rendant la plupart des agents chimiothérapeutiques peu efficaces contre ce type de tumeur. Actuellement, le seul agent chimiothérapeutique efficace dans le traitement des glioblastomes est le témozolomide.

Malheureusement des mécanismes de résistance acquise peuvent apparaître chez des patients traités avec cette molécule. Nous avons donc étudié ces mécanismes moléculaires de résistance acquise au témozolomide et dans un deuxième temps nous avons tenté de trouver de potentielles molécules susceptibles de lutter contre les gliomes.

Nous avons rendu résistants deux modèles de cellules gliales tumorales au témozolomide par un traitement incrémental durant plusieurs mois. Grâce à une analyse de type Affymétrix, nous avons comparé l’expression de l’ensemble des gènes entre les lignées normales et les lignées rendues résistantes. Deux familles de gènes sont ressorties comme impliquées dans ce processus de résistance : les transporteurs glucose et les aldo- kéto réductase IC (akrlc). Pour les transporteurs glucose, il se pourrait que leur implication se fasse au niveau du métabolisme des cellules résistantes en permettant d’apporter plus de substrat énergétique et ainsi contourner les effets pro-autophagiques du témozolomide. Dans le cas des akrlc, il semblerait que leur surexpression ait pour but d’augmenter la prolifération des cellules tumorales résistantes.

Nous avons, par la suite, étudié les propriétés anticancéreuses de métabolites fongiques, les phyllostictines, extraites du champignon Phyllosticta cirsii. Quatre métabolites naturels et deux dérivés hémisynthétiques ont été testés démontrant des activités plus ou moins importantes sans toutefois montrer in vitro de biosélectivité entre cellules tumorales et cellules normales. Les phyllostictines semblent se lier au groupement thiol libre comme nous l’avons déterminé sur le glutathion ou la cystéine. Il reste à déterminer la cible des phyllostictines dans les cellules tumorales et à améliorer la sélectivité de ces molécules.

INTRODUCTION

Origine astrocytaire

Origine oligodendrogliale

Origine ependymaire

Origine mixte

Grade I

Astroctytome pylocytique Astrocytome subependymaire à cellules géantes

Subépendymome Myxopapillaire épendymome

Grade II

Astrocytome diffus Astrocytome pylomixoide Xanthoastrocytome pléomorphique

Oligodendrogliome Ependymome Oligoastrocytome

Grade III

Astrocytome anaplasique

Oligodendrogliome anaplasique

Ependymome anaplasique

Oligoastrocytome anaplasique

Grade IV

Glioblastome

Figure 1

: Classification des différents types de tumeurs cérébrales en fonction de leur origine histologique et de leur degré de

INTRODUCTION

1 Caractérisation du comportement biologique et clinique des glioblastomes

1.1 Echelle de gradation de la malignité

La gradation des gliomes est basée sur une classification établie par l’Organisation Mondiale de la Santé (O.M.S). Elle permet d’identifier les différents types de tumeurs cérébrales en fonction de leur origine histologique ainsi que du facteur pronostic associé. L’échelle se divise en quatre grades notés de I à IV où ce dernier représente le plus haut grade de malignité. L’origine histologique fait référence aux types de cellules gliales desquelles sont issues les tumeurs. (Figure 1)

On retrouve trois grands types histologiques qui sont les plus représentés chez les patients : astrocytaire, oligodendrogliale et épendymaire. Il existe aussi des tumeurs qui peuvent présenter des origines histologiques mixtes comme les oligoastrocytomes (Figure 1).

Les tumeurs de grade I sont considérées comme bénignes du fait d’une délimitation précise et d’une croissance lente ce qui les rendent curable chirurgicalement.

Le pronostic associé est très favorable. Pour le grade II, il s’agit encore de gliome de bas grade avec un pronostic vital positif pour le patient mais qui peuvent évoluer en grade III voire IV au cours du temps. En ce qui concerne les astrocytomes de grade II, le traitement le plus approprié est basé sur une résection chirurgicale de la tumeur ainsi qu’une chimiothérapie pour certains patients inclus dans des essais cliniques, mais pas en routine. De nouvelles techniques chirurgicales sont développées chez le patient éveillé pour combattre ces astrocytomes de grade II (Smith et coll., 2008; lus et coll., 2011).

L’approche thérapeutique diffère pour les oligodendrogliomes de grade IL Elle consiste en une résection chirurgicale suivie d’une chimiothérapie. La présence de la délétion lpl9q est un marqueur de bon pronostic pour les patients atteints de ce type de tumeur (Ino et coll., 2001).

Les gliomes de haut grade regroupent toutes les tumeurs de grade III (dénommées gliomes anaplasiques) et IV (dénommées glioblastomes). Tout d’abord, le grade III nécessite un traitement par chirurgie puis l’association de chimiothérapie/radiothérapie.

8

ZCN

Figure 2

: Visualisations du caractère invasif des glioblastomes au sein du cerveau. Sur la gauche apparaît l’IRM (imagerie à résonnance magnétique) d’un patient atteint d’un glioblastome. On peut identifier sur l’image la formation d’un œdème périphérique (OP) et d’une zone centrale nécrotique (ZCN). Sur la droite, une coupe de cerveau au niveau du lobe frontal qui montre le large envahissement du lobe frontal et du corps calleux par la tumeur (Source : Organisation Mondiale de la Santé : Classification of Tumours of the Central Nervous System - 4th édition).

L’évolution est plus réservée et dans ce cas la médiane de survie, suivant l’origine histologique, peut descendre à 29 mois de part l’évolution très probable vers un gliome de grade IV. Ce dernier représente le degré de malignité le plus élevé avec un pronostic vital très sombre puisque la médiane de survie n’est que de 15 mois du fait de différentes caractéristiques cellulaires et moléculaires que nous détaillerons par la suite. Il est important de préciser que les glioblastomes sont sous catégorisés en deux groupes : les glioblastomes de novo (95% des cas) et les glioblastomes secondaires qui dérivent de tumeurs de grades inférieurs. Il a été décrit dans la littérature un autre type de sous classification des glioblastomes (Verhaak, 2010) que nous détaillerons dans la partie suivante et qui est basé sur le profil génomique des différents types de tumeurs gliales.

Le traitement associé aux tumeurs de grade III et IV est basé sur une résection chirurgicale la plus large possible du bloc tumorale rendue toutefois difficile par le caractère invasif de ces cancers au sein du parenchyme cérébral (Figure 2), suivi d’un traitement concomitant radiothérapie/chimiothérapie.

1.2 Epidémiologie

Au cours de nos travaux, nous nous sommes plus particulièrement intéressés au glioblastome. Il s’agit d’un type de tumeur qui touche préférentiellement l’adulte. La médiane d’âge des patients atteints de ce type de tumeur est de 64 ans aux USA ce qui est bien supérieure à la médiane que l’on observe dans les autres types de tumeurs cérébrales (Schwartzbaum et coll., 2006). La prévalence est de 3 à 4 nouveaux cas pour 100 000 personnes par an en Europe et aux USA (Louis et coll., 2007). C’est aussi la tumeur cérébrale la plus fréquente puisqu’elle représente 12-15% des tumeurs cérébrales et 60- 75% des tumeurs d’origine astrocytaire (Clarke et coll., 2010). Le nombre d’hommes touchés par ce type de tumeur est supérieur à celui des femmes (Holland et coll., 2010).

L’évolution peut être lente et le patient peut parfois avoir une tumeur présente depuis plusieurs mois sans qu’aucun symptôme ne se manifeste. Les signes cliniques sont souvent des nausées, migraines et vomissements liés à une augmentation de la pression intracrânienne (Gladson et coll., 2010). Dans certains cas, il peut y avoir des épisodes épileptiques. Les facteurs qui favorisent le développement de ce type de tumeur sont encore peu connus. Il s’agirait plutôt d’une origine plurifactorielle (génétique, environnementale...) (Schwartzbaum et coll., 2006).

9

Pré-opératoire Post-opératoire Après 12 mois Après 17 mois

Figure 3:

Image par résonnance magnétique (IRM) d’un patient diagnostiqué d’un glioblastome au niveau de l’occipital droit avant son opération ainsi que la même image obtenue après son opération. Le patient a subi une chimiothérapie couplée à une radiothérapie de 60 Gray. Après douze mois, l’LRM montre une récidive tumorale adjacente au premier foyer qui avait été enlevé. Après 17 mois, la récidive tumorale est de nouveau de taille comparable à celle d’origine. Le patient est décédé peu de temps après cette IRM (Source : Nakada et coll.. Cellular and Molecular Life Sciences, 2007).

1.3 Traitements

1.3.1 Chirurgie

La résection chirurgicale est la première étape du traitement pour les patients atteints d’un glioblastome. Cette étape est dépendante de plusieurs facteurs avec en premier lieu la localisation de la tumeur au sein du cerveau. En effet, suivant la zone où la tumeur se développe, il est difficile pour les neurochimrgiens de procéder à une résection totale sans endommager des fonctions motrices ou cérébrales. Pour contrer et minimiser les risques de perte de fonctions, il existe une technique de chirurgie éveillée du patient pour cartographier par électrostimulation les zones du cerveau et ainsi éviter toutes séquelles de l’opération (De Benedictis et coll., 2010). De plus le caractère invasif des glioblastomes ne permet pas une résection totale des cellules tumorales qui migrent dans le parenchyme cérébral (Figure 3). Il existe cependant une nouvelle technique qui permet de mieux visualiser les tumeurs lors des opérations. L’administration d’acide 5- aminolevulinique, commercialisé sous le nom de Gliolan® va induire la surexpression au sein des tissus malins de la protoporphyrine IX (Idoate et coll., 2011). Cette dernière permet de colorer en rouge les cellules tumorales lorsqu’elles sont exposées à une lumière bleue.

1.3.2 Radiothérapie

La radiothérapie est la deuxième étape dans le traitement des patients atteints de glioblastome. Elle a pour but d’inhiber la prolifération des cellules cancéreuses en ne ciblant que le tissu tumoral. Le protocole standard est une dose de 60 Grey fractionnée en doses de 2 Grey délivrées 5 jours par semaine pendant 6 semaines consécutives (Stupp et coll., 2005).

D’autres études cliniques ont porté sur l’augmentation de la dose globale (jusque 90 Grey) ou sur la dose quotidienne (3-4 Grey) pour évaluer si ce nouveau protocole pouvait être bénéfique pour le patient. A ce jour, cette augmentation n’a pas amélioré significativement la survie mais au contraire il a été observé une toxicité avec des effets secondaires nuisibles pour les malades (Nieder et coll., 2004).

10

Temozolomide Monomethyl triazine

^â2in-on8 nnj^

• '^-TW - ---

Methyldiazonium ions 5-aminoimidazole-4*

(DNAomethylating speoies) carboxamide

Figure 4:

Le témozolomide est converti en milieu aqueux par relargage d’une molécule de dioxyde de carbone (CO2) pour donner le composé instable appelé 5-(3- méthyltriazene-l-yl) imidazole-4-carboxamide (MTIC). L’ion méthyldiazonium se détache au contact de l’ADN et par substitution nucléophile attaque le groupement hydroxyle en position 6 de la guanine. Ce type d’alkylation peut aussi se retrouver en position 4 de la thymine (Source : Neidle et Thurston, Nature Reviews Cancer, 2005).

1.3.3 Traitement chimiothérapeutique standard

La molécule de référence est le témozolomide. 11 s’agit d’un agent alkylant de la classe des imidazotétrazines. La molécule est une pro-drogue transportant l’ion méthyldiazonium capable de fixer un groupement méthyle sur les guanines de l’ADN en position 06, N3 et N7 bloquant ainsi le cycle cellulaire des cellules cancéreuses (Figure 4). L’intérêt de cette molécule se situe au niveau de son caractère amphiphile qui lui permet de passer la barrière hémato-méningée et de sa capacité à se dissoudre facilement en milieu aqueux permettant une administration orale (Friedman et coll., 2000). Le témozolomide apporte un bénéfice thérapeutique aux patients atteints de glioblastome en traitement concomitant avec la radiothérapie (Stupp et coll., 2009) puisque la survie à deux ans passe de 11%, pour les patients traités avec radiothérapie seule à 30% dans le traitement combiné. De même, la survie à 3 ans est passée de 4% à 15%, à 4 ans de 2% à 9% et enfin à 5 ans de 1 % à 5%.

En détail, le protocole de traitement est le suivant. Un premier cycle de chimiothérapie est administré au patient en même temps que la radiothérapie à raison de 75mg/m^ par jour et ce pendant toute la durée du traitement radiothérapeutique sans excéder 49 jours consécutifs. Après 4 semaines de pause, le patient reprend la chimiothérapie par cycle (jusqu’à 6) de 5 jours de traitement consécutifs espacés de 28 jours. Les doses administrées commencent à 150 mg/m par jour et peuvent monter jusqu’à 200mg/m^ par jour selon l’apparition ou non d’effets secondaires (Stupp et coll., 2005, 2007, 2009). Les effets secondaires les plus notables sont des neutropénies conduisant à l’apparition d’infections opportunistes qui sont combattues par un traitement prophylactique d’antibiotiques (Stupp et coll., 2005).

L’efficacité de cet agent chimiothérapeutique dépend de l’activité ou non de l’enzyme de réparation 06-méthylguanine DNA méthyltransférase (MGMT). En fonction de la méthylation du promoteur du gène, la réponse au traitement standard est différente et le pronostic pour le patient est variable. 11 a été démontré qu’en cas de méthylation du promoteur, la survie des patients est significativement meilleure que pour les patients ne présentant pas cette méthylation (Hegi et coll., 2005).

11

Carboplatine Lomustine

Figure 5:

Structure chimique des différentes molécules chimiothérapeutiques administrées en première ou deuxième ligne chez les patients atteints d’un glioblastome.

Sur la ligne du haut, l’association Vincristine, Carmustine et Procarbazine constitue le traitement appelé PCV. D’autres molécules sont utilisées pour le traitement des glioblastomes comme la combinaison Etoposide-Carboplatine ainsi que la Lomustine qui fait partie de la famille des nitrosourées comme la Carmustine.

1.3.4 Chimiothérapie de deuxième ligne

Lors de l’échec du protocole standard de traitement décrit par Stupp et coll., il est possible d’employer d’autres molécules ou protocoles chimiothérapeutiques pour limiter la progression des cellules tumorales gliales. Elles sont administrées en traitement concomitant avec une radiothérapie. Tout d’abord, les nitroso-urées avec la carmustine (BCNU) et la lomustine (CCNU) présentent une alternative au traitement au témozolomide. Ce sont des agents alkylants sur la position 06 de la guanine de l’ADN (Souhami et coll., 2004). La carmustine est aussi utilisée sous forme d’implants imprégnés de cette molécule et greffés chez le patient en intracrânien. Ce procédé porte le nom de Gliadel et a été validé comme traitement de seconde ligne par les autorités de la santé Nord américaine (FDA) (Quinn et coll., 2010). L’utilisation d’un autre agent alkylant de la famille des triazènes comme la procarbazine est aussi possible. Malgré la capacité de ces molécules à alkyler les bases de l’ADN, le témozolomide reste le traitement de référence de part sa capacité à induire de l’autophagie et à inhiber les mécanismes d’angiogénèse. Une autre alternative est la vincristine (isolée de la pervenche), molécule anti cancéreuse, capable d’inhiber la polymérisation de la tubuline en microtubule (Jordan et coll., 1985). Plus généralement, la combinaison PCV (procarbazine, lomustine et vincristine) peut être utilisée dans le traitement des gliomes de haut grade (Murphy et coll., 2002) (Figure 5). D’autres combinaisons chimiothérapeutiques sont en phase clinique comme l’association carboplatine et étoposide avec un résultat limité (Franceschi et coll., 2004).

Différents paramètres de génétique moléculaire interviennent dans l’efficacité potentielle des différents traitements contre le glioblastome. Certains éléments peuvent servir au diagnostic des glioblastomes ou être des facteurs prédictifs aux traitements administrés.

1.4 Biologie des glioblastomes

1.4.1 Profils génétiques

Le processus de tumorigenèse des cellules gliales s’explique par la mutation, la délétion ou l’amplification de pro ou anti-oncogènes. 11 existe un grand nombre de gènes

12

Figure 6:

Aperçu de la voie de signalisation PBK/Akt et de ses liens avec les intégrines et les RTK {Récepteurs à Tyrosine Kinase) dont EGFR {Epidermal growth factor receptor). L’activation d’EGFR se traduit par la conversion du PIP2 (phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate) en PIP3 {Phosphatidylinositol-3,4,5- trisphosphate) par l’intermédiaire de l’enzyme PI3K (phosphatidylinositol 3 kinase). Le régulateur de cette voie est la protéine PTEN (Phosphatase and TENsin homolog) qui reconvertit le PIP3 en PIP2. Les intégrines, par intéraction avec la matrice extracellulaire, peuvent aussi activer cette voie de signalisation par l’intermédiaire de la kinase FAK (Eocal Adhesion Kinase) (Source: Guo et Giancotti, Nature Reviews Molecular Cell

impliqués dans l’évolution d’une cellule normale vers une cellule cancéreuse. Les glioblastomes présentent des altérations génétiques qui permettent de les différencier des tumeurs de grade inférieur.

1.4.1.1 EGFR

L’amplification du gène du récepteur transmembranaire à tyrosine kinase EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) est une des caractéristiques génétiques les plus fréquentes dans les glioblastomes primaires. Il existe différentes origines mais elles ont toutes pour conséquence la surexpression de ce facteur entraînant une augmentation de la chimio- et radiorésistance, du pouvoir invasif et de la prolifération cellulaire (Gladson et coll., 2010). Au niveau clinique, la surexpression d’EGFR est directement liée à un pronostic défavorable pour le patient (Shinojima et coll., 2003; Heimberger et coll., 2005). La mutation la plus fréquente rencontrée dans les glioblastomes est une délétion des exons 2-7 de l’ARNm conduisant à la traduction d’un variant appelé EGFRvIII. Ce dernier n’a plus besoin d’être sous forme dimérisée pour s’activer, à l’inverse du variant sauvage entraînant ainsi une suractivité du récepteur EGFR (Chu et coll., 1997).

Actuellement, plusieurs molécules inhibitrices d’EGFRvIlI sont en développement dans le traitement du glioblastome notamment avec le Gefitinib et l’Erlotinib qui sont en essais cliniques de phase II (Reardon et coll., 2011; van den Bent et coll., 2009).

1.4.1.2 PTEN

Le gène PTEN est un gène suppresseur de tumeur placé sur le bras long du chromosome 10. La délétion de ce gène peut être associée à une perte plus globale de matériel du chromosome 10 avec perte de l’hétérozygotie appelée LOH (Loss of Heterozygosity) et elle est très fréquente dans les glioblastomes. PTEN intervient directement dans la voie de signalisation PI3K/AKT en tant que régulateur négatif (Mellinghoff, Cloughesy et Mischel, 2007). La kinase PI3K convertit le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) en PIP3 qui va ensuite activer la protéine kinase AKT responsable de l’augmentation de la prolifération cellulaire et de l’inhibition de certaines voies de mort cellulaire (Wang et coll., 1997). La protéine PTEN va enlever un phosphate du noyau inositol du PIP3 dans le but d’inactiver la voie de signalisation (Figure 6). La délétion du gène PTEN ne

13

MMR

MMR MMR

O^-Mathyiating Agents

C ^ C Replîcatior

G “^06MeG 0“MeG

Réplication,

O^MeG

Biocko

replicati<

fbrti

moveme

▼

Cell Survival - T

MMRq---

C G

Cal! Survival

►

Csll Survivait Mutations

Figure 7:

Illustration du mécanisme d’action de l’enzyme MGMT (06-méthylguanine-DNA- méthyltransférase). Ajout d’un groupement méthyle sur le groupement hydroxyle en position 6 de la guanine créant des mésappariements entre les bases de l’ADN. Intervention de l’enzyme MGMT en collaboration avec le système de réparation MMR {mismatch repair) qui contrôle si la cellule peut se diviser et répliquer son ADN. L’induction de méthylation sur la guanine en position 06 peut induire la formation de mutations ou même dans certains cas entraîner l’arrêt de la prolifération par blocage du

permet pas d’obtenir une protéine fonctionnelle ce qui engendre une suractivation de la voie PBK/Akt (Wang et coll., 1997).

1.4.1.3 P53

La protéine p53 est une protéine régulatrice du cycle cellulaire. Les mutations de son gène situé sur le bras court du chromosome 17 sont souvent retrouvées dans les glioblastomes. Cette altération génétique est aussi présente dans les gliomes de grade II et III. La protéine P53 assure le contrôle de l’intégrité du génome (Albrechtsen et coll., 1999). Elle est aussi capable de réguler le cycle cellulaire notamment par l’intermédiaire de la protéine p21 ainsi que l’entrée de la cellule en apoptose par l’intermédiaire des caspases. Cette mutation du gène P53 se retrouve dans 28% des glioblastomes primaires et dans 65% des glioblastomes secondaires (Ohgaki et coll., 2004). On explique cette différence par le fait que les gliomes de bas grade présentent pour certains cette mutation et que l’évolution vers les gliomes de haut grade se fait en partie grâce à la présence de cette mutation.

1.4.1.4 MGMT

Cette protéine appelée 06-méthylguanine DNA méthyltransférase est une enzyme de réparation de l’ADN dont le gène est situé sur le chromosome 10. Sa fonction est d’exciser les groupements alkyles qui se fixent sur la position 06 de la guanine par transfert de ce dernier sur l’enzyme (Gerson, 2004). Une fois cette étape faite, la protéine est ubiquitinylée et dégradée par le protéasome. En temps normal, sans l’intervention de l’enzyme, le nombre de mésappariements au sein de l’ADN empêche à la cellule de se diviser et l’oblige à rentrer en apoptose (Figure 7). L’enzyme MGMT agit en coopération avec le système enz}matique MMR (mismatch repair) qui contrôle la présence et la réparation des mésappariements de l’ADN (Kaina et coll., 2007). On comprend donc que l’enzyme MGMT joue un rôle très important dans l’efficacité des traitements chimiothérapeutiques à base d’agents alkylants notamment le témozolomide qui est la molécule de référence comme nous l’avons vu précédemment (Stupp et coll., 2007).

L’activation de la protéine MGMT dépend du taux de méthylation de son promoteur (Watts et coll., 1997). Les patients atteints de glioblastome présentant cette méthylation

14

répondent de façon plus favorable au témozolomide que les patients exprimant l’enzyme de réparation (Hegi et coll., 2005).

1.4.1.5 IDHl

Un autre type de mutation a été mis en évidence dans les glioblastomes, il s’agit des mutations des gènes IDHl et IDH2 (Yan et coll, 2009). Ces gènes codent pour une famille d’enzymes, les NADP+ isocitrate déhydrogénases présentes dans le cytosol, qui intervient dans le cycle de Krebs en transformant l’isocitrate en a-cétoglutarate. Cette réaction permet la production de NADPH et par conséquent la formation de glutathion protecteur contre le stress oxydatif. En cas de mutation, l’activité de ces enzymes est fortement réduite (Yan et coll, 2009; Bleeker et coll, 2010). La diminution de NADPH induit la diminution de la formation de glutathion, ce qui augmente la sensibilité à la radiothérapie et à la chimiothérapie (Bleeker et coll, 2010). On retrouve cette mutation en proportion importante dans les gliomes de bas grades ainsi que dans les glioblastomes secondaires. Elle est présente en plus petit pourcentage dans les glioblastomes primaires (Verhaak et coll, 2010). Cependant au niveau clinique, les patients présentant une mutation sur un des deux gènes ont une espérance de survie supérieure aux patients présentant un profil non muté (Yan et coll, 2009).

1.4.1.6 Autres altérations génétiques

Il existe d’autres mutations impliquées dans le processus de cancérogénèse et que l’on retrouve dans les glioblastomes comme la protéine Ras qui se trouve en aval de la voie de signalisation de l’EGFR, la cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (CDKN2A) qui est une protéine suppresseur de tumeur notamment par la régulation du cycle cellulaire ou encore PDGFR qui fait partie des récepteurs tyrosine kinase intervenant comme EGFR dans la voie PI3K/Akt (Malla et coll, 2010).

Plus récemment, le TCGA {The Cancer Genome Atlas research network), une étude de grande ampleur menée aux USA, vise à identifier les caractéristiques moléculaires des différents types de cancer. Le premier type de tumeur à avoir été analysé est le glioblastome. Le principe de l’étude a été basé sur la sélection d’un grand

Ccll proOferation Metastaæ and invasion

ECM Angiogenesis

Roleaseof:

factors asTGF-p)

•■fiytDkinas (such as TNFJi Kfœceplors (such as )L-€RandTNFR1) ' Adhos»n motoculos

^ ‘jœÇD44andC04à

Figure 8

: Schéma d’action des MMP (Protéases extracellulaires de la matrice). La digestion de la matrice extracellulaire engendre différents phénomènes comme la prolifération cellulaire, l’invasion ou encore l’angiogénèse. La libération de facteurs de croissance comme le TNF {Tumor Nécrosis Factor) ou encore le TGF-P (Transforming Growth Factor P) vont permettre la croissance des cellules tumorales (Source : Rao J.S., Nature Reviews Cancer, 2003).

nombre de tumeurs extraites de patients, en l’occurrence 206, et clairement identifiées comme étant des glioblastomes. La suite de l’étude a porté sur l’analyse des copies d’ADN et de sa méthylation ainsi que de l’expression des gènes par utilisation de la technique Affymétrix. Le résultat de cette étude a mis en évidence de nouvelles altérations génétiques telles que les délétions homologues des gènes NF1 (neurofibromin 1) et PARK2 iparkinson protein 2) ou encore l’amplification d’AKT3 {v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 3).

Au-delà de ces caractéristiques génétiques, d’autres éléments permettent de caractériser les cellules gliales tumorales par des éléments biologiques et moléculaires.

1.4.2 Caractéristiques biologiques et moléculaires

1.4.2.1 Invasion

Le pouvoir invasif des cellules de glioblastome est caractérisé par la capacité des cellules tumorales à migrer dans le parenchyme cérébral. Cette activité résulte d’une synergie entre deux mécanismes cellulaires distincts : le remodelage de la matrice extracellulaire et la motilité des cellules gliales tumorales. Dans un premier temps, les cellules tumorales sécrètent des protéases, les MMP (protéases de la matrice extracellulaire), qui vont digérer la matriee extracellulaire (Rao et coll., 2003) (Figure 8) et relarguer des facteurs de croissance qui vont activer la prolifération, l’invasion et l’angiogénèse. Une fois la matrice extracellulaire dégradée, elles peuvent migrer grâce à des complexes d’adhésion à la matrice telle que les intégrines (Guo et Giancotti, 2004). L’activation de ces intégrines n’est possible que par le remodelage du cytosquelette de la cellule dans le but d’augmenter la motilité cellulaire (Louis, 2006). Il a été aussi démontré que les cellules gliales tumorales sont capables de modifier leurs morphologies. La surexpression de certains canaux chlorure permettent des mouvements d’eau entre le milieu intra et extracellulaire facilitant ainsi la migration des cellules tumorales en leur permettant de se glisser entre les cellules de la matrice extracellulaire. La forme et le volume des cellules se trouvent modifiés par application des lois de l’osmose. La sortie ou l’entrée d’ions va être compensée par des flux passifs d’eau à travers la membrane plasmique pour rééquilibrer le désordre ionique (Soroceanu et coll., 1999). Enfin le rôle des cadhérines

Hypoxia

Tumor

I

Hypoxie région

Migration

Migration of cells away from hypoxie eenter

Figure 9:

Présentation de la formation du cœur nécrotique ainsi que des cellules pseudopalissadiques. A) apparition d’une zone hypoxique au centre de la tumeur par manque d’oxygène et de nutriments. B) migration des cellules vers l’extérieur de la zone hypoxique. C) apparition d’une zone nécrotique entourée de cellules pseudopalissadiques {Source: Louis D.N., Annual Review of Pathology, 2006).

dans les mécanismes d’invasion a été largement démontré dans la littérature. Ces protéines transmembranaires sont impliquées dans les interactions de types cellules- cellules. Les deux principales sont les cadhérines E et N. Les cellules cancéreuses, en général, expriment les deux types de cadhérine mais lors de l’augmentation de la l’agressivité tumorale, les cadhérines E ne sont plus exprimées et sont remplacées par les cadhérines N. Ce phénomène va permettre l’augmentation de la motilité cellulaire et donc favoriser le processus d’invasion (Maret et coll., 2010). De plus, les glioblastomes expriment aussi à leur surface une forme immature de N-cadhérine (Pro-NCAM) qui n’interviennent pas dans les mécanismes d’adhésion mais au contraire favoriserait aussi l’invasion des cellules gliales tumorales (Maret et coll., 2010). Très récemment une étude a aussi montré que la cadhérine E pourrait aussi avoir un rôle dans les mécanismes d’invasion dans les tumeurs gliales de haut grade (Lewis-Tuffîn et coll., 2010).

1.4.2.2 Prolifération

La prolifération des cellules gliales tumorales est en partie due à un dérèglement du contrôle du cycle cellulaire. 11 n’y plus de régulation des points de contrôle lors de la division cellulaire. Évidemment cette prolifération est variable selon les régions de la tumeur comme nous le verrons par la suite. Cette différence d’activité mitotique est caractéristique des tumeurs cérébrales de haut grade en comparaison avec les bas grades.

1.4.2.3 Nécrose

La grande majorité d’un glioblastome, parfois jusqu’à 80% du bloc tumoral, est représentée par une large zone nécrotique centrale. La présence de nécrose est un indicateur histologique de l’agressivité de la tumeur. En effet, la demande énergétique et métabolique des cellules tumorales excède l’apport au sein de ces régions d’où le développement des ces zones. On retrouve aussi des vaisseaux sanguins présentant des thromboses en périphérie des zones nécrotiques augmentant ainsi le phénomène d’hypoxie (Louis, 2006). La réponse des cellules tumorales à ces phénomènes rend le glioblastome plus agressif. En périphérie de la nécrose, on retrouve des cellules appelées pseudopalissadiques (Figure 9). Issues du cœur de la tumeur, elles ont migré pour quitter la zone nécrotique grâce à la sécrétion de protéases extracellulaires de la matrice (MMP- 2 et -9). Les cellules pseudopalissadiques vont former le front de migration de la tumeur

(Brat, 2004; Kong et coll., 2006). La surexpression par ces cellules de certains facteurs comme Vhypoxia-inductible factor 7or(HlF-la) ou encore l’interleukine 8 (IL-8) vont favoriser les phénomènes de prolifération cellulaire et d’angiogénèse nécessaire au développement de la tumeur (Rong et coll., 2006).

1.4.2.4 Angiogénèse

La vascularisation est très importante dans le glioblastome. Ce type de tumeur est capable de développer des capillaires par migration et prolifération de cellules endothéliales (Bergers et Benjamin, 2003). Ces nouveaux capillaires sanguins tumoraux ont des caractéristiques particulières notamment par le fait qu’ils prolifèrent de façon permanente et par leurs formes anarchiques (Bergers et Benjamin, 2003). On retrouve ces nouveaux vaisseaux en bordure des zones cellulaires pseudopalissadiques et nécrotiques. La nature des vaisseaux est un indicateur de diagnostic histologique puisque dans le cas des glioblastomes, on parle de vaisseaux en glomérules en référence à leurs formes se rapprochant des glomérules rénaux (Brat et Van Meir, 2001). L’hypoxie est considérée comme le principal moteur de l’angiogénèse notamment par l’intermédiaire du facteur transcriptionnel HIF-la (Pouysségur et coll., 2006). 11 a été démontré notamment que HlF-la contrôle directement l’expression de l’angiopoïétine-2 et du vascular endothélial growth factor (VEGF) qui contrôlent l’angiogénèse (Vajkoczy et coll., 2004; Zagzag et coll., 2000). Certaines mutations génétiques peuvent être à l’origine de l’angiogénèse comme PTEN, P53 et EGFR (Brat et Mapstone, 2003) comme nous le verrons par la suite.

1.4.2.5 Apoptose

Les glioblastomes sont caractérisés par une très forte résistance à l’apoptose. Elle est due à des modifications au niveau génomique et moléculaire des cellules tumorales. De plus, il a été démontré que les cellules migrantes ont une résistance accrue à l’apoptose (Giese et coll., 2003). Ces cellules tumorales migrantes sont à la base des problèmes de récidive des patients atteints de glioblastomes. Ces mécanismes de motilité cellulaire sont induits par l’interaction entre les cellules migrantes (liaison intégrine-milieu extracellulaire) et la matrice extracellulaire (Westhoff et Fulda, 2009). En temps normal, un défaut

18

Normal CNS différentiation CNS tumor formation

Neural progsnftor

IMeoron

} Glial progenilof

Oligodendrocyte

Neural stem celi

Astrocyte

Ependymocyte

J

?

?

?

Brain cancer propagating cell

Stroma

Figure 10:

Différenciation et transformation des cellules souches neurales dans un tissu cérébral normal et tumoral. Les cellules souches neurales sont capables de s’auto- renouveler et de se différencier pour donner les sous-types cellulaires présents dans le cerveau par l’intermédiaire des cellules progénitrices. Les cellules à l’origine du processus tumoral peuvent être issues de différentes cellules normales et notamment des cellules souches et sont capables de se différencier pour donner des cellules cancéreuses différenciées (Source : Hadjipanayis et Van Meir, Trends in Molecular Medicine, 2009).

d’interaction entre la cellule à la matrice extracellulaire entraîne une forme spécifique de mort cellulaire appelée l’anoïkose. Cette dernière intervient lorsque la cellule n’adhère plus à la matrice extracellulaire, ce qui déclenche la voie apoptotique intrinsèque. Les cellules gliales tumorales migrantes sont capables de résister à ce type de mort cellulaire notamment au travers des N-cadhérines ou des intégrines qui sont capables d’activer des protéines ou des voies anti-apoptotiques (Chiarugi et Giannoni, 2008).

L’augmentation de la résistance à l’apoptose complique très sérieusement les possibilités de traitement et assombri le pronostic pour les patients car à l’heure actuelle la plupart des chimiothérapies présentes sur le marché sont de type pro-apoptotique.

1.4.3 Cellules souches

On définit par cellule souche une cellule capable de donner des cellules spécialisées par différenciation cellulaire mais aussi capable de se renouveler quasi à l’infini. On parle très souvent des cellules souches hématopoïétiques qui sont à l’origine de l’ensemble des cellules sanguines. Ce type de cellules est capable de donner un grand nombre d’organes différents (Krause et coll., 2001). Dans le cerveau, il existe différentes zones qui possèdent une population de cellules souches et des cellules progénitrices gliales qui sont capables de donner les astrocytes ou les oligodendrocytes (Figure 10). Ces cellules possèdent des caractéristiques semblables aux cellules tumorales notamment au niveau de la prolifération, de la motilité et de l’expression de certains gènes (Sanai et coll, 2005).

Les cellules souches neurales activent différents gènes pro-mitotiques et/ou anti- apoptotiques qui sont aussi nécessaires pour l’initiation et la prolifération tumorale (Sanai and coll., 2005). Il a été plus récemment démontré que la différenciation et la division des cellules souches neurales étaient sous le contrôle direct de p53 et PTEN qui sont fréquemment altérés dans les glioblastomes (Zheng et coll., 2008). Dans le cas de ces derniers, une sous population cellulaire a été isolée de différents modèles (lignées cellulaires établies ou tumeurs prélevées chez certains patients) qui expriment spécifiquement des marqueurs de cellules souches (Gilbertson et Rich, 2007; Tabatabai et Weller, 2011) tels que l’antigène de surface CD133, l’intégrine alpha 6 ou encore l’enzyme ALDHl (aldéhyde déshydrogénase 1). L’intérêt d’identifier ces populations cellulaires se situe au niveau de leur résistance aux agents chimiothérapeutiques et à la

19

radiothérapie (Liu et coll., 2006) mais aussi au niveau de leur pouvoir régulateur de l’angiogénèse (Bao et coll., 2006) ce qui constitue actuellement une cible potentielle et prometteuse dans le traitement du glioblastome (Cheng et coll., 2010).

2 Quels sont les mécanismes de résistance à la chimiothérapie connus à ce jour pour les glioblastomes ?

2.1 La résistance des cellules migrantes à l’apoptose

Dans le cas du glioblastome, il existe deux types de populations avec des fonctions et des caractéristiques biologiques et moléculaires différentes (Giese et coll., 2003) : les cellules en prolifération et les cellules invasives. Dans ce paragraphe, nous nous intéresserons aux cellules migrantes au niveau de leur résistance naturelle à l’apoptose et de leur implication dans le développement des récidives tumorales.

La migration des cellules gliales tumorales a été très tôt mise en évidence dans les gliomes notamment par le fait que les premiers patients traités chirurgicalement pour des tumeurs cérébrales subissaient une ablation complète d’un hémisphère cérébral (hémisphérectomie) sans pourtant pouvoir éviter les récidives à distance (Giese et coll., 2003). La migration des cellules gliales tumorales est basée sur la modification de l’interaction entre cellules-cellules et cellules-matrice extracellulaire induite par des modifications de la morphologie cellulaire (Demuth et Berens, 2004) et la sécrétion de protéases qui vont dégrader la matrice extracellulaire (Rao et coll., 2003). Il a été démontré que les intégrines jouaient un rôle essentiel dans les phénomènes de migration cellulaire en général (Hynes, 1992) et au sein des cellules gliales tumorales en particulier (Tarabatai et coll., 2011). De plus, le phénomène de migration est directement lié à la modification de la prolifération des cellules. Pour privilégier la migration, les cellules gliales tumorales migrantes voient leur taux de prolifération diminuer par rapport aux cellules qui constituent le cœur de la tumeur (Giese et coll., 1999). Certaines protéines qui régulent le cycle cellulaire telles que les cyclines A, B et E ont une expression très réduites dans les cellules tumorales gliales migrantes (Mariani et coll., 2001).

Mais les principales caractéristiques des cellules tumorales gliales migrantes se situent au niveau moléculaire. Le déséquilibre qui s’opère entre la diminution de la

EXTRINSIC APOPTOSIS PATHWAY (acUvatad via transmembtane racaptors)

Apoptoais-lnducing ligand (»g.Apo2UTRAIL)

D«coy raceptore (e g. DcR1. DcR2)

Pro-apoptolic recaptors (e.g. DR4 or DR5)

Cell membrane

Receptor dustering RecniHnient of the

* I adaptor protein PAOD

I

Formation of tha cell death-inducing signa ling complex (DISC)

Recruitment and activation of procaspases 8 and 10 Protsolytic I

procsssing I

Initiator caspases 8 and 10

Amplification

-►C bm

Effector caspases 3,6, and 7

INTRINSIC PATHWAY (acUvaled intracsiiularly)

I DNA damage

PUMA, NOXA : Bd'2. Bd-Xt, MCL-1

i I

Daath substrates APOPTOSIS

;

Figure 11:

Représentation des deux voies majeures d’activation de l’apoptose. La voie intrinsèque est dépendante du gène P53 alors que la voie extrinsèque est indépendante de l’expression de ce gène. La voie extrinsèque nécessite l’activation de récepteur membranaire pour déclencher, par l’intermédiaire des caspases, la cascade de réaction qui mène à l’apoptose. Dans le cas des gliomes, la sous expression de ces caspases limitent l’induction de l’apoptose. Dans le cas de la voie intrinsèque, c’est la surexpression de l’inhibiteur Bcl-2 qui entraîne une induction limitée de l’apoptose (Source: Ashkenazi, Cytokine & Growths factors, 2008).

prolifération et l’augmentation de la motilité se traduit aussi par une diminution de la sensibilité à l’apoptose dans les cellules gliales tumorales. Notamment, certains gènes contrôlant l’apoptose et la prolifération sont sous exprimés dans les cellules migrantes comme par exemple les caspases 2, 3, 6, 8 et 9 ainsi que NF-Kappa B (Zhao et coll., 2011). D’autres gènes inhibiteurs de l’apoptose, comme PKC ou Bcl-2, sont surexprimés (Zhao et coll., 2011) (Figure 11). Cette dernière protéine est située dans la membrane mitochondriale et empêche la dimérisation des protéines Bax qui est à l’origine du relargage du cytochrome C dans le cytoplasme induisant l’apoptose de la cellule (Ashkenazi et coll., 2008).

2.2

Les systèmes de détoxification cellulaire

Dans les systèmes de détoxification cellulaire, les transporteurs ABC sont les plus connus. Ces derniers sont des pompes membranaires ATP dépendante chargées d’évacuer des cellules les molécules toxiques ou les métabolites au travers de la membrane plasmique. On les retrouve dans de nombreux types cellulaires avec des fonctions très variables qui peuvent aller du transport de cholestérol, de nucléoside ou encore de fer (Dean et coll., 2001). Certaines cellules souches expriment aussi les transporteurs ABC (Zhou et coll. 2001; Bleau et coll., 2009).

Les cellules cancéreuses expriment également des transporteurs ABC notamment pour expulser les différentes molécules chimiothérapeutiques contribuant ainsi à leur résistance aux traitements conventionnels (Gottesman et coll., 2002). On parle de multidrogue résistance (MDR) car ces pompes à efflux sont capables d’éliminer plusieurs types d’agents toxiques ( Donnenberg et Donnenberg, 2005). Cette particularité a permis d’identifier des sous populations de cellules cancéreuses qui expriment les transporteurs ABC. Récemment, il a été mis en évidence que les cellules souches cancéreuses sont responsables de la MDR au travers de l’expression des transporteurs ABC (Donnenberg and Donnenberg, 2005). On a pu aussi mettre en évidence la surexpression d’ABCG2 dans la lignée cellulaire de glioblastome U373-MG (Patrawala et coll., 2005). 11 a aussi été démontré que la voie de signalisation PI3k/Akt semblait réguler l’activité d’ABCG2 dans la lignée de glioblastome U-87 (Bleau et coll., 2009). A noter qu’il a aussi été

Chemotherapeutic drugs Porphyrins

Figure 12:

Régulation de l’expression d’ABCG2 {ATP-binding cassette sub-family G member 2) par la voie de signalisation PBK/Akt dans les cellules souches de gliomes.

Les récepteurs transmembranaires à tyrosine kinase activent la voie de signalisation par l’intermédiaire de la PI3 kinase qui phosphoryle le PIP2 en PIP3 activant ainsi Akt (voir figure 5). Ce dernier va permettre la translocation du récepteur ABCG2 du cytoplasme vers la membrane cytoplasmique (Source : Bleau et coll. Cell Cycle, 2009).

montré que le témozolomide, traitement chimiothérapeutique standard des glioblastomes, n’est pas un substrat de la pompe à efflux ABCG2 (Figure 12) et que l’expression de cette dernière n’induit pas de résistance à cette molécule (Bleau et coll., 2009). Au niveau clinique, en 1998, une étude a été menée sur l’expression d’ABCCl dans des prélèvements de gliomes avant et après chimiothérapie à base de doxorubicine et vincristine (Abe et coll.,1998). Il apparaît que l’expression de cette protéine est augmentée laissant présager qu’ABCCl pourrait être impliqué dans des phénomènes de résistance acquise aux agents chimiothérapeutiques.

2.3 Stress du réticulum endoplasmique

Le réticulum endoplasmique est un organite cytoplasmique impliqué dans la maturation et le repliement des protéines sécrétées et transmembranaires (Ron et Walter, 2007). Lors de l’exposition à des agents toxiques ou en condition de stress, il s’accumule au sein de cet organite des protéines mal conformées. On parle alors de stress du réticulum endoplasmique. De nombreux facteurs extrinsèques ou intrinsèques à la cellule peuvent induire ce phénomène mais dans le cas où il est enclenché la cellule dispose d’un moyen pour rétablir son équilibre et aimihiler les effets de ce phénomène : la réponse UPR (Unfolded Protein Response). Au niveau moléculaire, la protéine chaperonne Grp78/Bip (immunoglobulin- binding protein) va se lier aux protéines mal conformées contenues dans le réticulum en se dissociant de la membrane de l’organite (Tabas et Ron, 2011). En temps normal, Grp78 inhibe d’autres protéines membranaires telles qu’IREl ou PERK mais lors de la dissociation de Bip, elles sont activées et transmettent des informations dans le cytosol. Dans le cas de IREl, la protéine va se dimériser au niveau de la membrane du réticulum et s’autophosphoryler pour devenir active. Une fois fonctionnelle, IREl va épisser l’ARNm du gène XBPl (X-box binding protein-1) qui sera à son tour traduit. XBPl est un facteur de transcription qui active différents gènes permettant à la cellule de répondre au stress endoplasmique notamment par l’induction de la synthèse de protéines chaperonnes (Ron et Walter, 2007). Une autre voie d’activation rUPR passe par la protéine PERK qui va s’homodimériser et s’autophosphoryler dans la membrane du réticulum. La cible cytosolique de PERK est la protéine EIF2a qui va être phosphorylée. Il découle de cette activation une diminution de la synthèse protéique, une

Figure 13:

Schéma récapitulatif de la réponse UPR au sein des cellules. La protéine BIP (ou Grp78), qui lie les protéines mal conformées, est le point initial de l’activation de la réponse qui au travers des différents intermédiaires (IREl, PERK) va conduire à l’activation de facteurs permettant de limiter l’impact du stress du réticulum endoplasmique sur la cellule. En cas de stress prolongé, la cellule va rentrer en apoptose par l’activation de la voie intrinsèque (Source : Ma et Hendershot, Nature Reviews Cancer, 2004).

activation du facteur de transcription NF-kB et l’inactivation de la protéine P53 (Ma et Hendershot, 2004; Ron et Walter, 2007). Lorsque le stress du réticulum endoplasmique perdure dans le temps, la cellule entre en apoptose par l’activation de la voie intrinsèque.

Cette activation passe par l’augmentation de l’expression de la protéine CHOP qui va inhiber la protéine anti-apoptotique bcl-2 (Figure 13).

Le taux de protéine GRP78 est suffisamment élevé dans les gliomes pour permettre à la cellule d’éliminer les protéines mal conformées sans pour autant lever l’inhibition des protéines PERK et IREl conduisant normalement la cellule en apoptose.

Elle fournit aux cellules gliales tumorales un moyen de résister à l’agression des agents chimiothérapeutiques (Pyrko et coll., 2007).

3 Pourquoi le témozolomide offre-t-il un avantage thérapeutique par rapport à toutes les autres formes de chimiothérapies ?

3.1 Alkylation de l’ADN

Le témozolomide est un agent alkylant de type imidazotétrazine de seconde génération capable de franchir la barrière hémato-méningée et qui ne nécessite pas de métabolisation hépatique. Il s’agit d’une pro-drogue qui ne nécessite pas d’intervention enzymatique pour être transformée en molécule active (Friedman et coll., 2000). Le mécanisme d’action principal du témozolomide est une réaction d’alkylation de l’ADN par ajout d’un groupement méthyle sur les positions Oe, N3 et N7 des guanines et sur la position O4 des thymines (Kaina et coll., 2007). L’alkylation des positions va entraîner des mésappariements au sein de la double hélice de l’ADN pouvant à leur tour entraîner l’arrêt de la division cellulaire ou la mort par apoptose. En ce qui concerne les méthylations induites sur les positions N3, N7 et O3, des systèmes de réparation de l’ADN ubiquitaire notamment le BER (Base Excision Repair) et l’ABH (AlkB Homologous Protein) vont éliminer les groupements qui se sont fixés sur ces positions et éviter à la cellule l’accumulation de mutations dans son ADN (Kaina et coll., 2007). C’est la position Oe qui provoque le plus de mésappariements à l’ADN malgré le fait qu’elle ne représente que 5% des mutations induites par le témozolomide (Friedman et coll.,2000).

Figure 14:

Représentation des différents sites de l’ADN sur lesquels des agents chimiothérapeutiques peuvent induire des modifications entraînant des mésappariements. Pour chaque position, il existe des systèmes de réparation spécifiques qui sont associés : les systèmes BER {Base Excision Repair), ABH {AlkB Homologous Protein) et MGMT {06-méthylguanine DNA méthyltransférase). Dans le cas du témozolomide, les positions Oe, N3 et N? des guanines et O4 des thymines sont alkylées (Source : Kaina et coll., DNA Repair, 2007).

M MGMT

aABH^

BER-^

Thymine Adenine

A MGMT

Mi,

A BER

ABH ▲

BER

Cytosine Guanine