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Développement d’un microdispositif magnétique pour le
contrôle et la détection de complexes immunologiques à
base de nanoparticules magnétiques
Olivier Lefebvre
To cite this version:
Olivier Lefebvre. Développement d’un microdispositif magnétique pour le contrôle et la détec-tion de complexes immunologiques à base de nanoparticules magnétiques. Micro et nanotechnolo-gies/Microélectronique. Université Paris Saclay (COmUE), 2018. Français. �NNT : 2018SACLS537�. �tel-02426019�
Développement d’un microdispositif
magnétique pour le contrôle et la
détection de complexes
immunologiques à base de
nanoparticules magnétiques
Thèse de doctorat de l'Université Paris-Saclay
préparée à l’Université Paris-Sud
École doctorale n°575: electrical, optical, bio : physics and engineering (EOBE)
Spécialité de doctorat: Electronique et Optoélectronique, Nano et Microtechnologies
Thèse présentée et soutenue à Orsay, le 10/12/2018, par
Olivier Lefebvre
Composition du Jury :Laurent Malaquin
Dr, Université Paul Sabatier (LAAS) Rapporteur
Jean-François Manceau
Pr, Université de Franche-Comté (Femto-St) Rapporteur
Yong Chen
Dr, Ecole Normale Supérieure (IPGG) Examinateur
Olivier Français
Pr, Université Paris-Est Marne-La-Vallée (ESIEE) Président du jury
Josep Samitier Marti
Pr, Université de Barcelone (IBEC) Examinateur
Claire Smadja
Pr, Université Paris-Sud (IGPS) Examinateur
Mehdi Ammar
Maître de conférences, Université Paris-Sud (C2N) Directeur de thèse
Emile Martincic
Maître de conférences, Université Paris-Sud (C2N) Co-encadrant
NNT
:
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8
S
A
CL
S
5
3
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Université Paris-Saclay
Espace Technologique / Immeuble Discovery
Route de l’Orme aux Merisiers RD 128 / 91190 Saint-Aubin, France
Titre : Développement d’un microdispositif magnétique pour le contrôle et la détection de complexes
immunologiques à base de nanoparticules magnétiques
Mots clés : Détection magnétique, ovalbumine, Nanoparticules magnétiques, simulation, microfabrication,
microfluidique
Résumé : L’objectif de cette thèse est la fabrication d’un microdispositif magnétique pour la détection et la manipulation d’éléments biologiques à base de nanoparticules magnétiques en conditions microfluidiques. Il a pour but d’intégrer des fonctions de base de contrôle et détection magnétique, pour atteindre des mesures spécifiques, stables, rapides et reproductibles. En effet, la technique d’immunodosage couplée à des nanoparticules magnétiques, bien connue dans la littérature, nécessite un contrôle du déplacement de ces dernières pour les fonctionnaliser efficacement et créer un complexe biologique encapsulant une molécule cible (biomarqueur). Dans notre cas une molécule modèle pour le domaine de la biodéfense a été utilisée : l’ovalbumine. Pour contrôler le champ magnétique nécessaire pour la capture des complexes magnétiques, nous avons opté pour l’utilisation de microbobines intégrées aux dispositifs fluidiques et comparé cette technique originale avec d’autres plus conventionnelles. Pour détecter un complexe biologique, la fluorescence est largement utilisée en biologie, mais cette technique ne permet pas une intégration complète pour un dispositif autonome. Dans cette optique, nous proposons la détection des complexes à base de nanoparticules magnétiques en relevant la variation de l’inductance d’un microcircuit magnétique refermant une chambre microfluidique contenant ces complexes immunologiques. Le dimensionnement des microbobines de contrôle par simulation a permis de déterminer les paramètres permettant d’obtenir le champ magnétique le plus adapté au contrôle des complexes biologiques.
Dans le cas des microbobines utilisées pour la détection, des branches magnétiques micrométriques ont été insérées autour des microbobines pour créer un circuit de détection magnétique encore plus sensible. La réalisation de ces dispositifs a impliqué l’intégration de matériaux et de structures de nature fortement hétérogène, et leur assemblage a nécessité de résoudre de nombreux verrous technologiques. L’enjeu a été de déterminer l’ensemble des étapes successives et nécessaires pour un procédé de microfabrication fiable et reproductible. Pour montrer l’intérêt des dispositifs de capture des nanoparticules magnétiques, des tests immunologiques ont été réalisés tout d’abord en microtubes pour les comparer à ceux réalisés dans un circuit fluidique à l’aide d’aimant externe puis de microbobines intégrées. Dans ce dernier cas, une optimisation considérable a été validée en termes de réduction de temps d’incubation, de reproductibilité des mesures et de limites de détection équivalentes à l’état de l’art pour l’ovalbumine. Pour le dispositif de détection magnétique, des premières expériences de caractérisation électrique ainsi que des études en concentration de nanoparticules magnétiques ont été réalisées et comparées aux résultats obtenus par simulation. Pour la preuve de concept, un démonstrateur de détection de complexes magnétiques a été également finalisé validant la possibilité d’intégration du microcircuit magnétique dans un dispositif fluidique. Il a validé également l’obtention d’une gamme de sensibilité remarquable corrélée à la présence des complexes magnétiques. Ses caractéristiques ont été confrontées à celles obtenues par les simulations et discutées en tenant compte de toutes les étapes critiques du procédé de microfabrication.
Université Paris-Saclay
Espace Technologique / Immeuble Discovery
Route de l’Orme aux Merisiers RD 128 / 91190 Saint-Aubin, France
Title : Development of a magnetic microdevice for the control and detection of immunological complexes based
on magnetic nanoparticles
Keywords : Magnetic detection, ovalbumin, Magnetic nanoparticles, simulation, microfabrication, microfluidic Abstract: The objective of this thesis is the
fabrication of a magnetic microdevice for the manipulation and detection of biological elements based on magnetic nanoparticles under microfluidic conditions. The microdevice aims to integrate basic functions of control and magnetic detection, to obtain specific, stable, fast and reproducible measurements. Indeed, the immunoassay technique coupled to magnetic nanoparticles, which is well known in the literature, requires a control of the displacement of magnetic nanoparticles to effectively functionalize them and create a biological complex to encapsulate a target molecule (biomarker). In our case, a model molecule “ovalbumin” for biodefense application was used. To control the magnetic field which is necessary for the capture of magnetic complexes, we opted for the use of microcoils integrated in the fluidic devices and compared this original technique with more conventional ones. To detect a biological complex, fluorescence is widely used in biology, but this technique does not allow a complete integration for an autonomous device. In this context, we propose the detection of complexes based on magnetic nanoparticles by acquiring the variation of the inductance of a magnetic microcircuit close to a microfluidic chamber containing these immunological complexes. The design of the trapping microcoils by magnetic simulation made possible to determine the parameters allowing to define the most adapted magnetic field to the manipulation of the biological complexes.
In the case of microcoils used for detection, micrometric magnetic branches were inserted around the microcoils to create more sensitive magnetic sensing circuit. The realization of these devices involved the integration of materials and structures of highly heterogeneous nature, and their assembly has required to solve many technological bottlenecks. The challenge was to determine all the successive and necessary steps for a reliable and reproducible microfabrication process. To show the added value of magnetic nanoparticle capture devices, immunoassays were first performed in microtubes to compare with those made in a fluid circuit using an external magnet and integrated microcoils. In the latter case, considerable optimization has been validated in terms of reduction of incubation time, reproducibility of measurements and limit of detection comparable to the state of the art for ovalbumin. For the magnetic detection devices, first experiments of electrical characterization, as well as concentration studies of magnetic nanoparticles, were carried out and compared to the results obtained by simulation. For the proof of concept, a demonstrator of detection of magnetic complexes was also finalized by the integration of the magnetic microcircuit in a fluidic device. We also validated a remarkable range of sensitivity correlated with the presence of magnetic complexes. The obtained characteristics were compared to those extracted from the simulation and discussed taking into account all the critical steps of the microfabrication process.
Remerciements
Ces travaux de thèse ont été réalisés à l’Institut d’Electronique Fondamentale (IEF) devenu par la suite le Centre de Nanosciences et de Nanotechnologies (C2N) lors de sa fusion avec le Laboratoire de Photonique et de Nanostructures (LPN).
Je tiens à remercier André DE LUSTRAC, directeur de l’IEF pour son accueil au laboratoire à mon arrivée. Je tiens également à remercier Giancarlo FAINI, directeur du C2N ainsi que toute la nouvelle équipe de direction du C2N.
Je remercie vivement mon directeur de thèse M. Mehdi Ammar, maître de conférences à l’Université Paris-Sud, ainsi que mes encadrants Mme Claire Smadja, professeure à l’Université Paris-Sud et M. Emile Martincic maître de conférences à l’Université Paris-Sud pour avoir dirigé et encadré mes travaux de thèse. Ces trois années de thèse m’ont permis d’apprendre énormément à votre contact et je les remercie pour la confiance et l’autonomie qu’ils m’ont été accordées.
J’exprime mes sincères remerciements à M. Yong Chen, directeur de recherche à l’Ecole Normale Supérieure pour avoir accepté de présider mon jury de thèse. Je remercie M. Laurent Malaquin, directeur de recherche à l’Université Paul Sabatier et M. Jean-François Manceau, professeur à l’Université de Franche-Comté pour l’intérêt qu’ils ont porté à ce travail en acceptant d’en être les rapporteurs. Je souhaite également remercier M. Olivier Français, professeur à l’Université Paris-Est Marne-La-Vallée, M. Josep Samitier, professeur à l’Université de Barcelone et Mme Claire Smadja, professeure à l’Université Paris-Sud d’avoir accepté d’examiner mes travaux. Je remercie M. Emile Martincic, maître de conférences à l’Université Paris-Sud d’avoir accepté d’assister à ma soutenance en qualité de membre invité.
Je remercie Alain Bosseboeuf, chercheur CNRS et responsable du département Micro Nano Bio et Microsystèmes de l’IEF pour m’avoir accueillie à mon arrivée au sein du département et m’avoir permis de découvrir le Japon grâce à l’école NAMIS. Je tiens également exprimer ma gratitude envers Pierre-Yves Joubert, professeur à l’Université Paris-Sud, directeur adjoint du C2N et responsable du département MicroSystèmes et NanoBiofluidique.
Je remercie bien sûr tous mes collègues du département pour m’avoir intégrer dans l’équipe avec gentillesse et bienveillance. J’ai toujours eu beaucoup de plaisir à discuter et travailler avec eux. Je pense surtout à Marion Woytasik pour son aide lors des expériences de la techno salle blanche; à Philippe Coste pour son aide lors de mes trois années de monitorat à l’IUT. A Fabien Parrain, Johan Moulin, Elie Lefeuvre, pour la bonne humeur qu’ils transmettent dans le département ainsi que Filippo Fabbri, Bernard Bartenlian, Elisabeth Dufour-Gergam, Jean-Michel Lourtioz, Hervé Matthias, Souhil Megherbi, Gilles Reno, Seonho Seok, Ming Zhang, Julien Rizzi et Sylvain Perrot. J’aimerais également remercier Gregory BARBILLON pour m’avoir fait découvrir le badminton et qui a suivi avec intérêt mes résultats de thèse.
Un grand merci à tous les doctorants et docteurs, stagiaires et apprenti de l’équipe : Adrien Piot, Sylvani Lemettre et Baptiste Rousset pour ces années en 174, Sarah Risquez et Thi Hong Nhung Dinh pour leurs conseils en salle blanche leur gentillesse, Claire Galland pour son toute son aide sur la partie bactérie, Bogdan Vysotskyi pour m’avoir accompagnée et motivée tout au long de ma thèse, mais aussi Jean-François Bryche, Jie Wei, Seiffeddine Maaroufi, Zhichao Shi, Hong Ha Cao, Gayathr Masilamany, Maité Do Vale, Mengze Wang, Jingbo Xu, Alexis Brennes, Rafael Corder-Alvarez, Ming
Wu, Thomas Sohier, Hadrien Philippe, Gwendoline Duchemin, Lucas Blanc, Clément Bessouet, Lucas Bonin, Giulia Rizzo, Gwennael Becan, Sylvie Bilent.
Je souhaite également remercier tous les autres membres de l’IEF et du C2N dont j’ai eu le plaisir de croiser dans les couloirs ou en salle blanche durant mes trois années de thèse. Je remercie entre autres le personnel de la Centrale de Technologie Universitaire (CTU) pour m’avoir formée sur les équipements de la salle blanche avec rigueur et méthode, pour votre disponibilité et pour votre un soutien technique quotidien. Abdelhanin Aassime, Fabien Bayle, Benoît Belier, David Bouville, Jean-René Coudevylle, Samson Edmond, Frédéric Hamouda, Etienne Herth, Nathalie Isac, François Maillard, Antoine Martin, Jean Luc Perossier, Marie-Paule Planté, Cédric Villebasse.
Je souhaite remercier toute l’équipe d’administration notamment Ophélie BOUZID, Isabelle DALAC, Alain CLEMENT, Ingrid FREY, Lydia PACTOLE, Sylvie LAMOUR, Maxime PROVENZIANO, Annie ROY, et Amanda TREPAGNY ainsi que l’ensemble du personnel du bureau d’étude mécanique Abdelkader BOULKRIT, Serge JACOB, Zouhire LAOUDIHI, Alexis POIZAT, et plus particulièrement Koro SOKHONA pour sa bonne humeur.
Je tiens à remercier mes parents Isabelle et Patrice, ma sœur Aurélie et mon frère Stéphane ainsi que ma belle-famille Christine, Éric, Anna et Andrea qui m’ont encouragée, soutenue et supportée durant ces trois années.
Table des matières
Introduction générale ... 7
Chapitre 1 Etat de l’art / Problématique ... 9
I - Les tests immunologiques et l’intérêt de l’utilisation des nanoparticules magnétiques ... 9
I - 1 - Les tests immunologiques ou immunodosages ... 9
I - 2 - L’utilisation de nanoparticules magnétiques dans les tests immunologiques ... 10
II - La microfluidique et les laboratoires sur puce………. 14
II - 1 - Définition de la microfluidique ... 14
II - 2 - L’apparition de la microfluidique et des laboratoires sur puce ... 14
II - 3 - Présentation des laboratoires sur puce ... 15
II - 4 - Les technologies de fabrication des laboratoires sur puce ... 15
II - 5 - Comparaison des laboratoires sur puce par rapport aux techniques traditionnelles ... 16
II - 6 - L’avenir des laboratoires sur puce ... 18
III - Balayage des techniques de contrôle de nanoparticules magnétiques ... 19
III - 1 - Les différents moyens de créer un champ magnétique ... 19
III - 2 - Le blocage et le transport de nanoparticules magnétiques ... 21
III - 3 - Le tri et la séparation des nanoparticules magnétiques ... 24
III - 4 - L’auto-assemblage et la structuration de nanoparticules magnétiques ... 25
IV - Présentation de la détection en immunodosage par fluorescence et par des capteurs magnétiques………. ... 27
IV - 1 - La détection en immunodosage par fluorescence ... 27
IV - 2 - Les techniques de détection magnétique pour des applications médicales ... 31
V - Etat de l’art des applications utilisant des complexes biologiques à base de nanoparticules magnétiques……….42
V - 1 - La détection protéinique et génomique ... 42
V - 2 - La détection en biologie cellulaire ... 48
V - 3 - La détection en bactériologie ... 50
VI - Conclusion du chapitre 1……….51
VII - Bibliographie………54
Chapitre 2 Conception et dimensionnement des microbobines en vue de leurs intégrations en laboratoire sur puce ... 61
I - Introduction……….61
II - Force magnétique et force fluidique………..62
II - 1 - L’étude d’un fluide par le nombre de Reynolds particulaire ... 62
II - 2 - Forces dans un fluide ... 63
III - Dimensionnement des microbobines……….67
III - 1 - Champ magnétique crée par un fil ... 67
III - 2 - Conséquences sur les applications des microbobines ... 69
III - 3 - Synthèse ... 71
IV - Dimensionnement de la microbobine de capture ... 72
2
IV - 2 - Résultats de simulation pour une microbobine simple ... 73
IV - 3 - Microbobine avec une couche de matériau magnétique doux ... 76
IV - 1 - Etude par simulation d’une microbobine avec une couche de matériau magnétique doux ……….77
IV - 2 - Conclusion du dimensionnement des microbobines de capture ... 80
V - Optimisation des performances de la détection magnétique : matériau magnétique ... 81
V - 1 - Introduction ... 81
V - 2 - Présentation du dispositif ... 81
V - 3 - Eléments de dimensionnement du dispositif magnétique ... 82
V - 4 - Etude du champ magnétique et du facteur de mérite de puissance après l’insertion d’un circuit magnétique ... 85
V - 5 - Application à la détection de nanoparticules magnétiques ... 91
VI - Conclusion du chapitre 2………..100
VII - Bibliographie……….101
Chapitre 3 Procédés de fabrication d’un dispositif fluidique intégrant des microbobines de contrôle et de détection de nanoparticules magnétiques ... 103
I - Introduction………..103
II - Etat de l’art de la microfabrication des dispositifs fluidiques intégrant des composants pour le contrôle du déplacement des nanoparticules magnétiques et la détection magnétique ... 104
II - 1 - La fabrication de dispositifs fluidiques ... 104
II - 2 - La fabrication de systèmes de contrôle et de manipulation de nanoparticules magnétiques ………..107
II - 3 - La fabrication de systèmes de détection de nanoparticules magnétiques ... 109
II - 4 - Conclusion de l’état de l’art de la microfabrication des dispositifs de capture et de détection magnétique ………..110
III - Procédé de fabrication des microcanaux fluidiques... 111
III - 1 - Réalisation des moules en résine ... 111
III - 2 - Réalisation des canaux en PolydiméthylSiloxane ... 114
III - 3 - Collage entre le capot en PDMS et un substrat recouvert de PDMS ... 116
IV - Procédé de fabrication des microbobines de contrôle du déplacement des nanoparticules magnétiques ………119
IV - 1 - Procédé global de fabrication ... 119
IV - 2 - Finalisation du dispositif de contrôle du déplacement des nanoparticules magnétiques 125 V - Procédé de fabrication du dispositif de détection magnétique ... 128
V - 1 - Procédé global de fabrication ... 128
V - 2 - Croissance sur trois niveaux des microbobines de détection ... 130
V - 3 - L’utilisation de polyimide en tant que couche isolante structurable ... 132
V - 4 - Croissance de FeNi par dépôt électrolytique ... 138
V - 5 - Fabrication des plots en FeNi ... 148
V - 6 - Croissance et méthode de transfert des branches de FeNi ... 150
V - 7 - Finalisation du dispositif de détection ... 159
VI - Conclusion du chapitre 3………..163
3 Chapitre 4 Etude et caractérisation des dispositifs de contrôle et de détection de nanoparticules
magnétiques ... 167
I - Introduction………..167
II - Présentation du projet de la thèse : Analyse MultiModale pour la Biodéfense (AMMIB) ... 169
III - Etude préliminaire dans les circuits fluidiques………..171
III - 1 - Rappel du principe d’immunodosage ... 171
III - 2 - Protection des canaux microfluidiques par traitement de surface ... 177
III - 3 - Etude des dispositifs de capture en utilisant les nanoparticules magnétiques ... 185
IV - Immunodosage dans les dispositifs microfluidiques ... 195
IV - 1 - Développement d’un immunodosage en conditions microfluidiques : application à la détection d’Ovalbumine. ... 195
IV - 2 - Comparaison des immunodosages en microtube et en conditions fluidiques en utilisant un aimant permanent ... 197
IV - 3 - Comparaison des immunodosages en utilisant des microbobines centimétriques et millimétriques ……….199
IV - 4 - Discussion des résultats obtenus du contrôle des nanoparticules magnétiques ... 204
V - Application à la capture de bactéries « E. Coli » ……….205
V - 1 - Réalisation du complexe « bactérie – nanoparticules magnétiques » ... 205
V - 2 - Étude du complexe « bactérie – nanoparticules » ... 208
VI - Étude des dispositifs microfluidiques de détection des nanoparticules magnétiques ... 214
VI - 1 - Rappel du contexte de la conception d’un circuit magnétique pour la détection de nanoparticules magnétiques ... 214
VI - 2 - Présentation de la plateforme microfluidique de test pour la caractérisation des dispositifs de détection magnétique ... 216
VI - 3 - Caractérisation de la résistivité des dispositifs de détection magnétique ... 217
VI - 4 - Caractérisation des dispositifs de détection magnétique par variation d’inductance ... 220
VII - Conclusion du chapitre 4………..228
VIII - Références………..229
5
Glossaire
AC : Alternating Current AFP : Alpha-FoetoProtein
AM : Atomic Magnetometer
AMMIB : Analyse MultiModale pour la Biodéfense AMR : Anisotropic MagnetoResistance
AND : Acide DésoxyriboNucléique ANR : Agence Nationale de la Recherche ARN : Acide Ribonucléique
ARNm : Acide Ribonucléique messager BLBVB : Bouillon Lactosé Bilié au Vert Brillant BSA : Bovin Serum Albumin
C2N : Centre de Nanosciences et de Nanotechnologies CEA : CarcinoEmbryonic ANtigen
CNT : Carbon NanoTubes COC : Cyclic Olefin Copolymer CTC : Circulatig Tumor Cell
DC : Direct Current
DGA : Direction Générale de l’Armement DMPMS : Dimethyl-MethylPhenylMethoxy Siloxane E. Coli : Escherichia Coli
EDC : 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)Carboxyl EDX : Energy Dispersive X-ray spectrometry PHE: Effet Hall planaire
ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay FFF : Field Flux Fraction
FITC : Fluorescein IsoThioCyanate GFP : Green Fluorescent Protein GMI : Giant MagnetoImpedance GMR : Giant MagnetoResistance IBE : Ion Beam Etching
IC : Integrated Circuited ICP : Inductively Coupled Plasma IgG : Immunoglobuline G
6 IL-5 : Interleukine 5
ILV : Institut Lavoisier de Versailles
ITODYS : Interfaces Traitements Organisation et Dynamique des Systèmes L.D.D. : Limite De Détection
MbB : Microbobines avec une Base de permalloy
MbBP : Microbobines avec une Base et un Plot de permalloy
MbBPB : Microbobines avec une Base, un Plot et des Branches de permalloy Mbs : Microbobines seules
MEMS : Micro-Electro-Mechanical Systems MES : acide 2-(N-Morpholino)EthanoSulfonique MMIC : Monolithic Microwave Integrated Circuit MOEMS : Micro-Opto-Electro-Mechanical Systems NHS : N-HydroSulfosuccinimide
NPM : NanoParticules Magnétiques PCB : Printed Circuit Board
PCR : Polymerase Chain Reaction PDMS : PolyDimethylSiloxane
PECVD : Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition PEO : PolyEthylen Oxyde
pH : Potentiel d’Hydrogène PM : Particules magnétiques PMMA : PolyMethylMethAcrylate PSA : Prostate Specific Antigen PTH : ParaThyroidiebbe Hormone
RF : Radio Fréquance
RIE : Reactive Ion Etching
RMN : Résonance Magnétique Nucléaire RMS : Roughness Mean Square
SPIONs : SuperParamagnetic Iron Oxide Nanoparticles SQUID : Supraconducting QUantum Interference Device TMR : Tunnel MagnetoResistance
U.V. : Ultra-Violet
UFC : Unités Formant Colonies
μRMN Résonance Magnétique Nucléaire miniaturisée μTAS: Micro total analysis system
7
Introduction générale
L’évolution des techniques de microfabrication a permis aux MEMS(Micro-Electro-Mechanical Systems) de devenir des systèmes multifonctionnels clés capables d’appréhender l’environnement physique. Les MEMS actuels intègrent une multitude de fonctions au sein d’une même puce, notamment des fonctions de mesure, actionnement et de contrôle, voire de calcul. La réalisation de ces systèmes implique l’intégration de matériaux (magnétiques, piézoélectriques, polymères, III-V, CNT, nanomatériaux) et de structures (composants optiques, mécaniques, acoustiques, fluidiques, électromagnétiques, optoélectronique) de nature fortement hétérogène. De nombreux verrous technologiques limitent l’assemblage de ces éléments. Le but de la recherche d’aujourd’hui est de débloquer ces verrous en développant de nouveaux procédés pour obtenir des systèmes toujours plus performants. L’objectif de cette thèse est de réaliser le démonstrateur d’un microcapteur intégré ayant pour but la détection d’éléments biologiques.
Les biocapteurs sont constitués d’un élément de reconnaissance biologique, ou l’un de ses dérivés à un élément transducteur (Wa et al. 2012). De manière simple, une réponse biologique doit être détectée et convertie d'une manière ou d'une autre en un signal électrique.
Depuis quelques années, l'utilisation de nanoparticules magnétiques (NPM) fonctionnalisées, suite à une immobilisation magnétique, a ouvert la voie à l’utilisation des méthodes d’immunodosages dans les laboratoires sur puce. Dans la littérature, l’utilisation combinée des dispositifs fluidiques et des NPM a permis d’atteindre une sensibilité plus élevée pour la détection d’éléments biologiques (Ramadan et al. 2004; Lacharme et al. 2009).
Pour contrôler un champ magnétique et capturer des NPM l’une des techniques les plus répandues est l’utilisation de microbobines. Le plus souvent, les microbobines sont planaires (Miao et al. 2014; Pawinanto et al. 2014; Kakri-Bouchet & Zahraoui 2017; Pancharoen et al. 2015; Yunas et al. 2015) et quelques auteurs ont amélioré la capture par l’adjonction de matériaux magnétiques, le plus souvent avec une couche mince de matériaux magnétiques(Zhi et al. 2014; Hosseini et al. 2017; Zhu et al. 2018) ou un plot (Ramadan et al. 2006).
Pour détecter un immunocomplexe utilisant des NPM la méthode la plus utilisée est la fluorescence. Cette technique est facile à prendre en main et permet des analyses quantitatives. En revanche, cette méthode nécessite un microscope à fluorescence, qui est un instrument difficilement intégrable. Une autre méthode consiste à venir détecter la présence de NPM, plusieurs techniques peuvent être utilisées : SQUIDS, fluxgates, GMI, GMR, microbobines. Dans l’objectif de réaliser un dispositif entièrement intégré, l’utilisation des microbobines est l’une des pistes les plus intéressantes. Le paramètre que nous avons utilisé pour détecter la présence de NPM est l’inductance. En effet, la présence de nanoparticules perturbe le champ magnétique des microbobines et donc fait varier l’inductance de ces dernières.
L’objectif idéal pour les deux types de microbobines (capture et détection) serait d’obtenir un circuit magnétique quasiment fermé, ne présentant qu’un faible entrefer. Si ces dispositifs sont courants dans le monde macroscopique (transformateurs ou inductances d’alimentation à découpage notamment), leur intégration en petite taille dans une géométrie quasiment planaire est très difficile. Il n’existe que sept réalisations de transformateurs ou d’inductances avec un noyau magnétique fermé dans la littérature (Sirotkin et al. 2014; Kim et al. 2015; Anthony et al. 2016; Ã et al. 2007; Woytasik et al. 2006; Yoon et al. 1998; Wang et al. 2005) et aucune réalisation comportant également un circuit
8 microfluidique. L’intérêt d’un tel circuit magnétique « 3D » est très grand, puisqu’il pourrait fortement réduire le courant nécessaire à la capture et donc l’échauffement de la puce lors de la capture. De plus, il pourrait également fortement augmenter la capacité de détection des microbobines ainsi fabriquées. Ce travail de thèse a été mené dans le cadre du projet ANR AMMIB 2014-2018 (Analyse MultiModale Intégré pour la Biodéfense). Quatre partenaires se sont regroupés pour proposer ce projet : l’Institut Galien Paris Sud (IGPS), l’Institut Lavoisier de Versailles (ILV), le laboratoire Interfaces Traitements Organisation et DYnamique des Systèmes (ITODYS) et le Centre de Nanosciences et de Nanotechnologies (C2N). L’objectif du projet était de proposer un dispositif intégré pour la détection de bactéries avec deux types de détection : magnétique et optique.
Dans ce contexte, les travaux présentés dans cette thèse portent sur le développement d’un microdispositif magnétique pour le contrôle et la détection de complexes immunologiques à base de nanoparticules magnétiques. L’originalité de cette thèse réside dans la fabrication d’un dispositif fluidique comprenant une microbobine entourée d’un circuit magnétique pour la détection de NPM.
Le chapitre 1 présente l’état de l’art des laboratoires sur puce, en présentant tout d’abord les tests immunologiques et l’intérêt d’ajouter des NPM dans ces tests. Les différentes techniques de fabrication de dispositifs fluidiques et les avantages et inconvénients des laboratoires sur puce sont exposés. Enfin les différentes techniques de contrôle de NPM et les méthodes de détection des complexes biologiques créés sont présentées.
Le chapitre 2 est consacré à la simulation et au dimensionnement des microbobines de contrôle et de détection magnétique. Grâce au logiciel ANSYS de simulation d’éléments finis, l’ensemble des paramètres des microbobines peuvent être simulés. Les paramètres de base sont d’abord étudiés tels que le nombre de spires, la largeur et l’épaisseur des spires, etc. L’ensemble des simulations permettent de dimensionner les microbobines de capture pour obtenir le champ magnétique le plus adapté pour le contrôle de NPM. Puis l’insertion de matériau magnétique est abordée pour le contrôle de NPM et en particulier dans le cas de la détection magnétique. Le dimensionnement du circuit de détection (microbobine et circuit magnétique) est réalisé en faisant varier l’ensemble des paramètres par simulation. Pour déterminer les paramètres optimaux pour la détection de NPM, le calcul de la variation d’inductance Lest modélisé.
Le chapitre 3 est dédié à la fabrication des dispositifs de contrôle et de détection magnétique en salle blanche. Leur conception repose sur une fabrication sur plusieurs niveaux avec différents matériaux et procédés tels que le dépôt électrolytique de cuivre et de fer-nickel, la pulvérisation cathodique de titane et de cuivre, etc. L’enjeu de ce chapitre est de proposer un procédé fiable et reproductible pour la fabrication de dispositifs de contrôle et de détection magnétique. Cette démarche passe par l’identification et la résolution de nombreux verrous technologiques, tels que la croissance de fer-nickel de plusieurs dizaines de microns ou l’alignement des différents niveaux.
Le chapitre 4 est focalisé sur la caractérisation et l’utilisation des dispositifs fabriqués en salle blanche. La première étape est de démontrer la possibilité de manipuler des NPM dans les circuits fluidiques. Puis des tests immunologiques sont réalisés tout d’abord en microtubes puis dans un circuit fluidique à l’aide d’aimants externes puis de microbobines intégrés. En parallèle, des études préliminaires sont réalisées pour la capture de bactérie E. Coli, à l’aide d’un dispositif fluidique et un aimant non-intégré. Enfin les premières expériences de caractérisation des dispositifs de détection de NPM sont exposées avec une discussion des différents paramètres ayant une influence sur la sensibilité de détection.
9
Chapitre 1
Etat de l’art / Problématique---
Etat de l’art / Problématique
---
I - Les tests immunologiques et l’intérêt de l’utilisation des
nanoparticules magnétiques
I - 1 - Les tests immunologiques ou immunodosages
I- 1 - a - Le début de l’immunodosage
Les immunodosages regroupent l’ensemble des méthodes analytiques quantitatives mettant en jeu la réaction antigène-anticorps. La nature des anticorps et de leur liaison avec les antigènes étant bien caractérisée, cette réaction est devenue un outil performant d’exploration et de quantification. Yalow et Berson réalisèrent, en 1960, le premier dosage immunologique de l’insuline humaine dans le plasma (Yalow & Berson 1960). En 1975, les travaux de Köhler et Milstein ont permis d’obtenir des anticorps monoclonaux (MAb), produits par un seul clone de lymphocytes (Köhler & Milstein 1975), dont l’utilisation améliore notablement la spécificité et la sensibilité des techniques. Cette découverte a permis la possibilité de fabriquer des anticorps monoclonaux, parfaitement homogènes et de spécificité donnée, pouvant être produits en grande quantité. Les progrès de l’immunologie ont permis d’obtenir des anticorps polyclonaux de bonne qualité, dirigés aussi bien contre des petites molécules que contre des molécules de masse moléculaire élevée. Pour pouvoir suivre, à l’échelle macroscopique, ces associations antigène-anticorps, un troisième élément est utilisé : le traceur. Celui-ci résulte de la modification de l’anticorps ou de l’antigène par ajout d’un marqueur. Pendant longtemps, seuls les marqueurs radioactifs ont été utilisés, dont la qualité essentielle est liée à leurs propriétés d’émission non modifiées par l’environnement physicochimique, et à la sensibilité de la détection. Cependant, l’utilisation de la radioactivité présente un inconvénient majeur puisqu’elle est dangereuse et donc restreinte aux seuls laboratoires agréés pour la manipulation de radioéléments. Des développements méthodologiques importants ont permis de remplacer les éléments radioactifs par des enzymes. Ainsi, des dosages immunoenzymatiques (ELISA) ont été développés par Engvall et Perlmann en 1971 (Engvall et al. 1971). Aujourd’hui, les marqueurs enzymatiques et les marqueurs luminescents ont pris une réelle importance en pratique courante et ont supplanté les traceurs radioactifs. D’autres approches sont développées en complément des immunodosages comme les marqueurs fluorescents ou encore l’amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction).
I- 1 - b - Le principe de l’immunodosage
Un test immunologique est un test biochimique qui mesure la concentration d'une molécule cible dans une solution, principalement grâce à l'utilisation d'anticorps. Il existe différent types d’immunodosages. Ils peuvent être réalisés en mélangeant simplement les réactifs et l'échantillon puis en réalisant une mesure physique. Ces tests sont appelés dosages immunologiques homogènes. Ils peuvent aussi être réalisés par étapes en ajoutant des réactifs qui sont ensuite éliminés (ou séparés) plus tard. Ces tests par étapes multiples sont appelés dosages immunologiques hétérogènes.
10 Les tests immunologiques reposent sur la capacité d'un anticorps à reconnaître et à se lier de façon spécifique à une molécule cible. En immunologie, la molécule cible liée par un anticorps est appelée antigène. Dans certains cas, un test immunologique en solution peut utiliser un antigène pour détecter la présence d'anticorps qui reconnaissent l'antigène.
En plus de la liaison d'un anticorps à son antigène, l'autre caractéristique majeure de tous les tests immunologiques est de présenter un moyen de produire un signal mesurable en réponse à la liaison. La plupart des tests immunologiques impliquent ainsi une liaison chimique anticorps-antigène associée à un marqueur détectable. Un grand nombre de marqueurs existent et ils permettent une détection par différentes techniques : optique, chimique, électriques etc.(Blake & Gould 1984)
Les méthodes d’immunodosage peuvent être regroupées en méthodes quantitatives et qualitatives. Les méthodes qualitatives consistent à fixer un anticorps spécifique sur l’antigène d’intérêt puis à révéler sa présence. Les méthodes quantitatives permettent de quantifier cette présence.
I - 2 - L’utilisation de nanoparticules magnétiques dans les tests
immunologiques
L’utilisation de particules magnétiques pour des applications dans les biotechnologies, l’industrie pharmaceutique ou la médecine est devenue de plus en plus fréquente (Tamanaha et al. 2008; Gao 2014; Jamshaid et al. 2016). Les particules magnétiques ont vu le jour il y a déjà une vingtaine d’années et connaissent aujourd’hui un essor particulier, intimement lié aux objectifs de miniaturisation des analyses. Leur taille, allant du nanométrique au micrométrique, et la possibilité de les manier à l’aide d’un simple champ magnétique, en font un outil bien adapté à la manipulation de molécules biologiques. De nombreuses sociétés (Dynal, Ademtech,…) fournissent une large variété de microbilles à la surface desquelles il est possible de greffer spécifiquement toutes sortes de molécules d’intérêt. Dans le cas d’une manipulation "macroscopique" de ces particules, le protocole général d’utilisation se résume à l’enchainement de plusieurs cycles d’incubation (greffage et/ou dé-greffage de molécules), de rinçage et de séparation. La manipulation de ces particules grâce à un simple champ magnétique (aimant permanent ou électroaimant) confère donc à cette approche de réels avantages en termes de temps, d’équipements et de coût.
Une nanoparticule est définie comme un objet ayant une dimension inférieure au micromètre. Une nanoparticule magnétique peut générer ou subir un champ magnétique. Il existe plusieurs types de nanoparticules magnétiques : nanoparticule avec une structure cœur-écorce, le cœur présentant les propriétés magnétiques et l’écorce protégeant le cœur ou qui permet à l’aide de ligand d’adapter la nanoparticule magnétique aux besoins des utilisateurs, ou nanoparticule ayant une structure avec une inclusion de nanoparticule magnétique dans la matrice polymère (Figure 1.1).
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Figure 1.1 : Les différentes structures des nanoparticules magnétiques(Reddy et al. 2012).
Dans le cadre de la réalisation d’immunodosages, l’usage de nanoparticules magnétiques nécessite un greffage en surface des premiers éléments du complexe biologique visé. Il est nécessaire d’utiliser des nanoparticules magnétiques présentant des fonctions (amine, carboxyle, …) permettant ce greffage.
Les anticorps spécifiques sont immobilisés sur la surface des nanoparticules magnétiques et permettent de « capturer » les cellules / protéines / virus cibles. Ensuite, ces nanoparticules magnétiques peuvent être séparées dans la solution en utilisant une force magnétique (généralement un aimant) ou venir compléter un immunodosage sur phase solide c’est-à-dire reconnaitre un anticorps lié de manière covalente à une surface.
I- 2 - b - Introduction de nanoparticules magnétiques fonctionnalisées Dans les applications actuelles, les particules utilisées peuvent être classées en deux types principaux : non magnétique (billes de silice et de polymère) et magnétique / superparamagnétique (oxyde de fer - Fe2O3 ou Fe3O4, alliage ou terres rares - NbFeB ou SmCo). La majorité de ces particules sont superparamagnétiques, c'est-à-dire qu'elles n'ont pas de rémanence magnétique, c’est à dire que le champ interne est nul en l’absence de champ magnétique externe, ce qui limite les phénomènes d’agrégation. La taille de ces particules peut jouer un rôle important. Elles de l'ordre de quelques nanomètres à quelques micromètres (pour ces dernières, l’appellation nanoparticules est un abus de langage).
12 La surface des particules peut également être fonctionnalisée : on peut y greffer des groupes fonctionnels spécifiques correspondant aux objectifs des processus d'analyse (Dave & Gao 2009; Sant & Wang 2011). Quelques méthodes et techniques de fonctionnalisation sont présentées en Figure 1.2. Il existe de nombreux types de nanoparticules superparamagnétiques commercialisées pour de nombreuses applications (Sant & Wang 2011). Dans notre étude, nous utilisons des nanoparticules magnétiques carboxyliques commerciales de 200 nm, 300 nm et 500 nm de diamètre (Carboxyl-Adembeads, fournies par Ademtech). Ces particules sont des nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques uniformes, la Figure 1.3 montre la structure de la coque des carboxyl-Adembeads.
Figure 1.3 : Schéma de la structure des nanoparticules magnétiques Ademtech.
Les différentes caractéristiques physiques des nanoparticules magnétiques Ademtech utilisées dans ces travaux sont présentées dans le Tableau 1.1.
Diamètre 200 nm (CV max 20%) 300 nm (CV max 20%) 500 nm (CV max 25%)
Densité 2,0 g / cm3 2,0 g / cm3 2,0 g/cm3
Magnétisation à
saturation env. 40 emu / g env. 40 emu / g env. 40 emu / g
Surface spécifique 15 m2 / g 15 m2 / g 5 m2/g
Teneur en oxyde de
fer env. 70% env. 70% env. 70%
Densité COOH > 350 μmol / g > 350 μmol / g > 275 μmol/g
Teneur en solide 30 mg / ml (3%) 30 mg / ml (3%) 50 mg/ml (5%)
Tableau 1.1 : Présentation des caractéristiques des nanoparticules magnétiques de 200, 300 et 500 nm de diamètre (Ademtech).
I- 2 - c - Propriétés magnétiques des matériaux composant les noyaux des nanoparticules magnétiques
Généralement, les matériaux super-paramagnétiques sont préférés pour fabriquer les noyaux des nanoparticules magnétiques. Ce matériau adopte deux comportements que l’on retrouve dans le paramagnétisme et le ferromagnétisme et qui sont respectivement :
l'absence d'aimantation lorsque le champ magnétique externe est supprimé.
les niveaux relativement élevés d'aimantation atteints sous l'influence d'un champ magnétique faible.
D’autres propriétés des nanoparticules magnétiques sont leur temps de relaxation court dans lequel la magnétisation devient quasiment nulle après l'effet d'un champ magnétique externe (les valeurs typiques sont d'environ 10-9-10-10s). Sous un champ magnétique externe alternatif, leur moment magnétique est rapidement réorienté. Une comparaison des propriétés magnétiques entre
13 les matériaux ferromagnétiques et superparamagnétiques est montrée sur la Figure 1.4, il est observable en particulier que les nanoparticules superparamagnétiques ne montrent aucune aimantation rémanente (Mr).
Figure 1.4 : (a) Les moments magnétiques des nanoparticules ferromagnétiques et
superparamagnétiques sous un champ magnétique externe / pas de champ magnétique ; (b) Courbes d'aimantation typiques des particules ferromagnétiques (ligne noire) et
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II - La microfluidique et les laboratoires sur puce
II - 1 -
Définition de la microfluidique
La microfluidique est la science qui traite des écoulements de liquides dans des canaux de taille micrométrique. Il suffit qu’une dimension du canal soit de l’ordre du micromètre ou de la dizaine de micromètres pour qu’un système appartienne à la microfluidique. Deux aspects complémentaires sont importants dans la microfluidique :
La science qui est l’étude du comportement des fluides dans des microcanaux, La technologie qui correspond à la fabrication de dispositifs microfluidiques.
II - 2 -
L’apparition de la microfluidique et des laboratoires sur puce
L’apparition de la microfluidique a été possible par l’avancée des technologies silicium développées pour miniaturiser les transistors et fabriquer les microprocesseurs. Ces techniques ont été adaptées pour la réalisation des microcanaux.
Les premiers transistors ont été développés dans les années 50. A partir des années 60, la recherche spatiale a permis le financement et le développement de la miniaturisation des calculateurs permettant de partir dans l’espace. Ces avancées, qui ont pu être réalisées grâce au développement de technologies comme la photolithographie, ont permis la miniaturisation et l’intégration de milliers de transistors sur des substrats de silicium. Ces recherches ont permis la fabrication des premiers circuits intégrés et avec eux, des premiers microprocesseurs.
Au cours des années 80, l’utilisation des procédés de gravure du silicium développés pour l’industrie microélectronique a permis de fabriquer les premiers dispositifs contenant des micro-éléments mobiles intégrés sur un substrat de silicium. Ces nouveaux types de dispositifs appelés MEMS (Micro Electro Mechanical Systems) ont donné naissance à des applications industrielles (capteurs de pression, accéléromètres, vannes de contrôle microfluidiques …).
Dans les années 90, de nombreuses recherches ont été menées pour appliquer les microsystèmes aux domaines de la biologie, de la chimie et du biomédical. Ces applications nécessitant de contrôler des mouvements de liquides dans des microcanaux ont considérablement contribué au développement de la microfluidique.
En parallèle des avancées microfluidiques, beaucoup de recherches ont été effectuées sur la miniaturisation des opérations biochimiques telles que la PCR, l’électrophorèse, les puces à ADN, l’étape de prétraitement, la lyse cellulaire, etc. Finalement, les chercheurs ont commencé à intégrer toutes les étapes nécessaires de la collection de l’échantillon à l’analyse finale sur la même puce, exprimant ainsi le potentiel réel des technologies de laboratoires sur puce. Ces types de dispositifs de laboratoires sur puce qui permettent aux chercheurs d’effectuer toutes les opérations de collecte de l’échantillon à analyser est généralement appelé en anglais Micro Total Analysis System (μTAS).
A cette époque, la majorité des dispositifs microfluidiques étaient encore fabriqués en silicium ou en verre et nécessitaient de ce fait les lourdes infrastructures de l’industrie microélectronique. A partir des années 2000, les technologies basées sur le moulage de micro-canaux dans des polymères comme le PDMS ont connu un fort développement. La réduction des coûts et du temps de fabrication des dispositifs a permis à un grand nombre de laboratoires de mener des recherches en microfluidique.
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II - 3 -
Présentation des laboratoires sur puce
Un laboratoire sur puce est un dispositif miniaturisé qui intègre au sein d’une simple puce une à plusieurs analyses (le séquençage ADN ou bien la détection d’agents biochimiques) qui sont communément réalisées en laboratoire. La miniaturisation d’opérations biochimiques communément effectuées en laboratoire possède de nombreux avantages comme la réduction des coûts, la parallélisation des expériences, l’ergonomie, la vitesse du diagnostic et sa sensibilité.
Les technologies microfluidiques utilisées dans les dispositifs de laboratoires sur puce permettent la fabrication de nombreux microcanaux, chacun mesurant quelques micromètres (ou dizaine de micromètres), sur une seule puce de taille réduite. Les microcanaux permettent la manipulation de fluides dans de faibles quantités (jusqu’au picolitre), ainsi que la réalisation de réactions biochimiques dans de très petits volumes. Pour devenir des systèmes complétement intégrés, ils requièrent également l’intégration de pompes, d’électrodes, de vannes, de générateurs de champs électriques et de l’électronique de contrôle et de traitement.
Le but d’un laboratoire sur puce est d’intégrer sur une seule puce un nombre maximal de réactions biochimiques. Ainsi, de nombreux diagnostics pourront être à partir d’une seule goutte de sang afin d’obtenir un diagnostic précis et rapide des maladies potentielles.
Beaucoup de recherches ont été et sont menées sur les laboratoires sur puce :
mesure des coefficients de diffusion moléculaire (Kamholz et al. 2001); pH (Atwe et al. 2014), coefficients de liaison chimique (Kamholz et al. 1999),
cinétique de la réaction enzymatique (Duffy et al. 1999),
électrophorèse capillaire (Kameoka et al. 2001),
immunodosage (Otieno et al. 2014),
cytométrie en flux (Piyasena & Graves, S 2014),
injection de protéines pour analyse par spectrométrie de masse (Figeys et al. 1998),
amplification PCR (Geng & Mathies 2015),
analyse ADN (Yang et al. 2014),
analyse cellulaire (Iv et al. 2015),
formation de gradient chimique (Dertinger et al. 2001), diagnostics cliniques (Otieno et al. 2014; Kim et al. 2015).
II - 4 -
Les technologies de fabrication des laboratoires sur puce
II- 4 - a - Laboratoire sur puce en Silicium
Le premier laboratoire sur puce a été réalisé en silicium : les microtechnologies sont fondées sur le travail du silicium. Les laboratoires sur puces en sont un produit dérivé. Aujourd’hui, le silicium n’est que peu utilisé pour les laboratoires sur puce, principalement pour trois raisons :
Le coût des procédés sur silicium est relativement élevé,
Il n’est pas optiquement transparent (sauf pour le rayonnement infrarouge)
La cohabitation des technologies de microfabrication sur silicium (notamment MEMS ou CMOS) avec les procédés et matériaux de la microfluidique ne va pas de soi.
16 II- 4 - b - Laboratoire sur puce en PDMS
Les laboratoires de recherche utilisent fréquemment le PDMS pour le prototypage des laboratoires sur puce. Le PDMS (PolyDiMéthylSiloxane) est un élastomère transparent et flexible. Le PDMS est très largement utilisé car il est très facile et peu coûteux à la fabrication. Bien qu’il soit amplement utilisé pour le prototypage des laboratoires sur puce, le PDMS montre d’importantes limitations à la production industrielle. En effet, ce matériau est sujet au vieillissement, il est perméable à l’eau, il est flexible et demande un temps de fabrication (réticulation) plus long (que le PMMA par exemple).
II- 4 - c -Laboratoire sur puce en Thermopolymères (PMMA, PS…)
Les polymères thermoplastiques sont abondamment utilisés par les chercheurs pour fabriquer des laboratoires sur puce. Même s’ils piègent plus facilement les éléments biologiques et sont plus chers à implémenter que le PDMS, les thermoplastiques sont de bons candidats à la fabrication de laboratoires sur puce. En effet, ils peuvent être transparents, compatibles avec la lithographie de taille micrométrique et plus inertes chimiquement que le PDMS pour différents solvants.
II- 4 - d - Laboratoire sur puce en Verre
Le verre est un excellent candidat pour l’industrialisation des laboratoires sur puce car il présente des propriétés remarquables : il est transparent, compatible avec les dispositifs de taille micrométrique, chimiquement inerte, avec un vaste rayon de surfaces de traitements chimiques et une intégration d’électrodes reproductibles. Du point de vue de la recherche, la fabrication de laboratoires sur puce en verre nécessite l’accès à des salles blanches et une adaptation des procédés de microfabrication sur les technologies du verre.
II- 4 - e - Laboratoire sur puce en Papier
Les systèmes de laboratoires sur puce basés sur les technologies en papier pourraient avoir de fortes incidences sur les applications qui exigent des coûts très bas. Les laboratoires sur puce en papier utilisent généralement les forces de capillarité pour la circulation des fluides et des réactifs colorés. Ils n’utilisent donc pas de véritable microcanal. Ils peuvent être produits par des techniques d’imprimerie et sont donc très bien adaptés à une production de masse.
II - 5 -
Comparaison des laboratoires sur puce par rapport aux
techniques traditionnelles
Pour montrer l’intérêt des laboratoires sur puce il est intéressant de la comparer aux techniques plus traditionnelles.
II- 5 - a - Les différents avantages des laboratoires sur puce
Bas coût : L’intégration permet de réaliser de nombreux tests sur la même puce, réduisant le coût
de chaque analyse individuelle.
Haute parallélisation : Grâce à sa capacité à intégrer des microcanaux, la technologie des
17 puce. Cela permet de cibler des maladies à partir d’un seul échantillon et d’obtenir une réponse plus rapide et efficace de la part du personnel soignant.
Simplicité d’utilisation et compacité : Les laboratoires sur puce permettent l’intégration d’un grand
nombre d’opérations à l’intérieur d’un petit volume. A terme, une puce de seulement quelques centimètres carrés associée à un ordinateur permettra de faire des analyses comparables à celles réalisées dans des laboratoires d’analyses entiers. Les diagnostics utilisant les laboratoires sur puce nécessiteront beaucoup moins de manipulations non automatisées et dans la plupart des cas, ils pourront être réalisés sur place.
Réduction des erreurs humaines / Accroissement de la reproductibilité : Le diagnostic réalisé en
utilisant un laboratoire sur puce diminuera le risque d’erreur humaine en comparaison avec les procédés d’analyse classiques réalisés en laboratoires.
Temps de réponse et diagnostic plus rapide : A l’échelle micrométrique, la diffusion de produits
chimiques, la commutation de flux et la diffusion de chaleur est plus rapide. On peut changer la température en quelques centaines de millisecondes (ce qui permet, par exemple une amplification ADN plus rapide en utilisant la PCR) ou le mélange de produits chimiques par diffusion en secondes (pour permettre des réactions biochimiques plus rapides par exemple).
Faible volume des échantillons : Parce que les systèmes de laboratoires sur puce nécessitent
seulement une petite quantité de solution pour chaque analyse, cette technologie diminue le coût des analyses en réduisant l’utilisation de réactifs chimiques. De plus, les quantités de sang nécessaires, par exemple, sont également réduites.
Automatisation : les équipements de laboratoires sur puce sont amenés à être utilisés dans des
environnements extérieurs pour la surveillance, par exemple, de l’air et de l’eau en continu sans nécessité d’une intervention humaine.
II- 5 - b - Les faiblesses des laboratoires sur puce
Industrialisation : La plupart des technologies de laboratoires sur puce ne sont pas encore prêtes à
être industrialisées.
Rapport signal/bruit : Pour certaines utilisations, la miniaturisation accentue le rapport signal/bruit
et par conséquent, les laboratoires sur puce fournissent des résultats moins précis que les techniques conventionnelles.
Les laboratoires sur puce requièrent des systèmes périphériques pour fonctionner : Même si les
systèmes de laboratoires sur puce peuvent être petits et puissants, ils nécessitent un équipement spécifique comme des systèmes de contrôle des flux ou électroniques pour être en mesure de fonctionner correctement. Cs équipements externes augmentent la taille finale et le coût du système. Par comparaison, le packaging des circuits intégrés représente de 40 à 70% du coût final.
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II - 6 -
L’avenir des laboratoires sur puce
Il serait long d’énumérer toutes les recherches actuelles en cours sur les laboratoires sur puce. La recherche contemporaine sur les laboratoires sur puce se focalise sur trois aspects principaux :
L’industrialisation des technologies de laboratoires sur puce pour les préparer à la commercialisation. Cela inclut l’adaptation des processus de fabrication, le dimensionnement des surfaces de traitement spécifiques, les systèmes de contrôle des flux, etc.
L’augmentation du nombre maximum d’opérations biologiques aptes à être intégrées dans la même puce et l’augmentation dans la parallélisation pour réaliser la détection de centaines de pathogènes dans la même « capsule » microfluidique.
La recherche fondamentale sur certaines technologies à fort potentiel d’impact comme la lecture ADN à travers de nanopores, ce qui nécessite davantage d’études avant de pouvoir être utilisable.
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III - Balayage des techniques de contrôle de nanoparticules
magnétiques
Pour la manipulation dans les canaux microfluidiques, deux approches peuvent être prises : (i) des aimants permanents classiques ou des électroaimants sont placés à l'extérieur de la
micropuce,
(ii) des aimants permanents ou des électro-aimants sont incorporés dans la micropuce. L'approche (i) présente l'avantage évident de facilité de fabrication et de faible coût. L'approche (ii) permet un contrôle spatial beaucoup plus étroit de la distribution du champ et permet également souvent une plus grande proximité de l'aimant au microcanal.
III - 1 - Les différents moyens de créer un champ magnétique
III- 1 - a - L’utilisation d’aimants conventionnels
Les aimants permanents utilisés dans les applications microfluidiques sont généralement de petits aimants en Néodyme-Fer-Bore (NdFeB) présentant des densités de flux magnétique allant jusqu'à 500 mT en surface.
Ces aimants permettent la manipulation de particules magnétiques ou de cellules à l'intérieur d'un microcanal même lorsque l'aimant est placé à plusieurs millimètres du canal. Selon l'application, des aimants de tailles et formes diverses sont requis. Par exemple pour le pompage magnétohydrodynamique, toute la zone du canal doit être soumise à un champ magnétique homogène, c'est-à-dire que les aimants utilisés ont des dimensions comparables à celles du canal (Homsy et al. 2005). Pour que des particules magnétiques forment un bouchon dans le canal, des aimants placés à quelques millimètres du canal ont été utilisés (Furdui & Harrison 2004). La rotation du matériau magnétique à l'intérieur d'un microcanal peut être réalisée par un aimant externe rotatif par exemple avec une plaque d'agitation conventionnelle (Yuen et al. 2003; Lu et al. 2002; Grzybowski & Campbell 2004).
Les électro-aimants présentent souvent des noyaux de matériaux magnétiques concentrateurs de flux de formes coniques afin d'obtenir des champs magnétiques et des gradients élevés (Rida & Gijs 2004; Barbic 2002; Joung et al. 2012). Bien qu'ils puissent être allumés et éteints et que leur champ puisse être modulé, les électro-aimants restent difficiles à utiliser. Un petit électroaimant avec une intensité de champ comparable à celle d'un petit aimant NdFeB requiert un courant généralement impossible à injecter pour cause d’échauffement bien trop élevé. Même en ayant pour objectif un champ magnétique bien plus faible, le chauffage par effet Joule est un problème pour l’intégration dans un dispositif à défaut de l’être pour l’électro-aimant lui-même.
III- 1 - b - L’utilisation d’aimants microfabriqués
L'intégration d'aimants microfabriqués dans des dispositifs microfluidiques implique un nombre considérable d'étapes de fabrication, et un coût élevé. D'un autre côté, de petits aimants intégrés permettent un contrôle très précis du champ magnétique. Lorsqu'ils sont positionnés à proximité du microcanal, les exigences de résistance du champ sont également réduites.
20 Les techniques de fabrication des électro-aimants ressemblent à celles employées pour la fabrication de puces microfluidiques. Les couches métalliques sont obtenues soit par dépôt électrolytique, soit par pulvérisation cathodique (Inglis 2004), par galvanoplastie (Ryu et al. 2004), par évaporation (Gradients et al. 2004) ou par dépôt en phase vapeur (Ramadan et al. 2004). La lithographie et les résines photosensibles sont utilisées pour la structuration en combinaison avec des techniques de gravure et de lift-off.
Les substrats sont principalement en silicium (Rida et al. 2014; Lee et al. 2001; Sorli et al. 2004), ou en verre (Massin et al. 2003; Wensink et al. 2005; Walton et al. 2003; Choi et al. 2001).
Dans de nombreux cas, une couche d’accroche est nécessaire pour obtenir une bonne adhérence entre le métal désiré et le substrat. L'isolation électrique entre le substrat et les motifs déposés peut être réalisée par enduction avec du polyimide (Gradients et al. 2004) ou en déposant une couche d'oxyde de silicium (Gradients et al. 2004; Lee et al. 2001; Sorli et al. 2004).
Figure 1.5 : Mélange magnétique avec un rotor en Permalloy© (longueur 400 mm) commandé par un agitateur classique(Ryu et al. 2004).
Les matériaux ferromagnétiques doux tels que le Permalloy©(Ryu et al. 2004; Choi et al. 2001; Choi et al. 2000) ou le nickel (Inglis 2004) utilisés avec les aimants permanents peuvent être utilisés comme noyaux pour les électro-aimants.
Les électro-aimants les plus simples sont planaires. Ils se composent d'un fil conducteur électrique et peuvent être fabriqués facilement en déposant un matériau tel que le cuivre (Rida et al. 2014; Massin et al. 2003), l’or (Gradients et al. 2004; Walton et al. 2003; Deng et al. 2001; Lee et al. 2004) ou l’aluminium (Ramadan et al. 2004; Wensink et al. 2005).
Lors de la conception d’un électroaimant, certains paramètres doivent être étudiés : l’échauffement par effet Joule, l’isolation des conducteurs électriques et la connexion à l'alimentation externe.
Des aimants plus complexes avec un noyau et un fil enroulé autour d'eux, nécessitent des étapes de fabrication supplémentaires, souvent avec des couches sacrificielles (Walton et al. 2003; Ahn & Allen 1996). Choi et Ahn ont été des pionniers dans ce domaine. Afin de piéger les particules magnétiques dans le flux, plusieurs structures d’électro-aimants intégrés en méandre Permalloy© doublé d’un méandre de cuivre (Choi et al. 2000)ou d’une structure de bobine de cuivre en spirale (Choi et al. 2001) avec cœur magnétique de FeNi semi-encapsulé.
Une autre approche pour obtenir un contrôle précis et de forts gradients dans un microcanal est de créer des structures de matériau magnétique doux à proximité du microcanal et de les magnétiser avec un aimant externe (Deng et al. 2001; Mirowski et al. 2005). Par exemple, Deng et al. ont réalisés des piliers en nickel fabriqués au bas d'un canal PDMS (Deng et al. 2002) et Inglis et al. ont fabriqué
21 des bandes de nickel étroites à motifs sur le fond d'une microchambre (Inglis 2004). Ces structures ont ensuite été magnétisées avec des aimants externes NdFeB.
L’utilisation d’aimants permet de concevoir des procédures ou des protocoles de manipulation, qui sont à la base des applications des nanoparticules magnétiques dans les laboratoires sur puce. La Figure 1.6 montre des schémas représentant des manipulations de base de nanoparticules magnétiques dans des systèmes microfluidiques :
Lors de la séparation (Figure 1.6.a), les nanoparticules magnétiques sont retenues d'un flux en
focalisant un champ magnétique sur le canal en utilisant des électro-aimants, des bobines ou des aimants permanents.
Le transport magnétique (Figure 1.6.b) est plus difficile, car il nécessite des forces magnétiques plus importantes et à longue portée pour déplacer les nanoparticules magnétiques dans le liquide, sans avoir besoin d'un écoulement microfluidique.
L'utilisation de nanoparticules magnétiques comme éléments pour la détection est
représentée sur la Figure 1.6.c. Ici, les nanoparticules magnétiques sont liées à la surface du microcanal, et un capteur de champ magnétique surveille le champ magnétique. Lorsque la particule arrive dans la zone de détection un changement d’induction est observé.
Une propriété particulièrement intéressante des nanoparticules magnétiques est qu'elles peuvent être suspendues magnétiquement dans un canal microfluidique en adaptant des forces magnétiques. Lorsque des champs magnétiques locaux sont appliqués alternativement, une agitation dynamique des nanoparticules magnétiques est possible. Cette agitation peut être utilisée pour mélanger les motifs d'écoulement essentiellement laminaires dans un canal microfluidique (Figure 1.6.d).
Figure 1.6 : Schémas représentant des manipulations de base de nanoparticules magnétiques dans des systèmes microfluidiques. (a) séparation ; (b) transport magnétique ; (c) détection ; (d)
agitation.
III - 2 - Le blocage et le transport de nanoparticules magnétiques
Les particules magnétiques peuvent être transportées en les attirant d'un électroaimant à l'autre. Dans un premier exemple, un agglomérat de particules de 2,8 µm a été déplacé le long d'un capillaire par une commutation consécutive de plusieurs électroaimants coniques externes (Joung et al. 2012).
22 Le même principe a été utilisé à plus petite échelle pour transporter les particules le long des méandres d’un fil d'or (Deng et al. 2001). Ici, les maxima du champ magnétique local ont été obtenus en combinant le champ magnétique des spires avec un champ magnétique uniforme présent en arrière-plan. Un bouchon de particules de 4,5 µm a été formé en suspension dans la zone de 200 µm x 200 µm d'un méandre et a été déplacé le long par commutation entre les fils.
A plus grande échelle, le transport de billes magnétiques (1 µm) sur une distance de 40 mm a été rapporté en utilisant des électro-aimants se chevauchant, chacun de 3,5 mm de diamètre (Rida et al. 2014), Figure 1.7. Un autre exemple est fourni par (Gradients et al. 2004) : un bourrelet unique (2 mm) a été piégé à l'endroit du gradient de champ le plus élevé, c'est-à-dire au bord d'un élément à cliquet. En alternant le courant entre les fils à 0,1 Hz, le cordon a été tiré d'un élément à cliquet à l'autre à une vitesse de 20 mm.s-1. Il est important de considérer lors de l’utilisation d’électro-aimant l’échauffement dû aux pertes par effet Joule. Plus le courant sera élevé, permettant une attraction pus forte, plus l’échauffement des spires sera élevé.
Figure 1.7 : Les particules magnétiques peuvent être transportées avec des champs électromagnétiques variant dans le temps. Ceci peut être réalisé (a) le long d'une piste de fils d'or en méandre, 28 (b) le long d'un fil d'or en dents de scie et (c) le long d'un treillis métallique
en or (Rida et al. 2014).
Dans (Del Giudice et al. 2015), les auteurs réalisent un dispositif microfluidique modulable ayant pour but la déviation de billes magnétiques d’un flux présentant des impuretés ou des contaminations. Les billes magnétiques sont déviées à l’aide d’un aimant cubique, qui est positionné de façon à avoir ses lignes de champ seulement présentes dans une des branches (voir Figure 1.8). Les auteurs ont cherché à obtenir un alignement des particules, qui est un point important pour réaliser une déviation efficace. Ils ont ainsi pu tester deux milieux : un milieu newtonien et un milieu non newtonien1. Dans un milieu newtonien en absence d’aimant, les particules se déplacent d’une façon désordonnée en suivant le courant principal (vers le bas) avec des vitesses différentes (Figure 1.8.a). En présence de l’aimant, certaines nanoparticules suivent le champ magnétique et se déplacent vers le haut et d’autres suivent le courant et vont vers le bas (Figure 1.8.b). Dans le cas du milieu non-newtonien et
1 Fluide non newtonien : liquide dont la viscosité ne dépend ni de sa vitesse de cisaillement, ni du temps
pendant lequel le liquide est cisaillé
