Le but des travaux pratiques de microbiologie étant l' initiation aux techniques de base de microbiologie, ce polycopié est conçu pour:

Avant propos

Le but des travaux pratiques de microbiologie étant l' initiation aux techniques de base de microbiologie, ce polycopié est conçu pour:

- Définir un ensemble de termes consacrés

à

l'usage pratique en bactériologie.

. .

- Montrer quelques méthodes et techniques usuelles utilisées en bactériologie.

Par ailleurs, l'attention de l'étudiant est attirée sur les précautions particulières · et obligatoires qu'il devra prendre par mesure de sécurité contre · · tout risque de contamination de soi-même, de son matériel et de son environnement.

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~commandations

►

Sc munir d'une blouse en coton fermée (obligatoire), les cheveux longs ramassés et les ongles courts..

►

Se laver les mains au savon ou les passer

à

l'alcool obligatoirement avant chaque manipulation et

à

la fin de chaque séance.

►

Travailler assis, le plus prés possible du bec Bunsen.

►

Les objets souillés (pipettes,. Lames .. ) doivent être obligatoirement rejetés dans un récipient contenant de l ' eau de Javel.

►

Nettoyer la paillasse en utilisant l'eau de Javel au début et

à

la fin de chaque séance.

►

Laver la verrerie avec laquelle vous avez travaillé.

ORGANISATION DU POSTE DE MANIPULATIONS STERILES

►

Au centre: un bec Bunsen, destiné

à

assurer les conditions d'asepsie locale.

► A

droite : sera disposé le matériel sur lequel le travail doit être effectué:

produits

à

étudier, milieux de culture, liquide de dilution ..

► A

gauche : seront placés · 1es instruments nécessaires au travail: pipettes, anse, boîtes

de

Pétri: pour le milieu gélosé; l'étaloir en verre:

utilisé pour étaler sur boîte un ensemencement liquide.

►

Derrière le bec Bunsen : Un récipient rempli d'une solution antiseptique ( eau de Javel) pour déposer les pipettes et lames souillées.

2

OBJECTIFS:

T.P.1: INITIATIONS AUX ])IFFÈRENTES MANIPULATIONS ASEPTIQUES ET AU MATERIEL DE

. STERILISATION

►

Acquérir une dextérité manuelle lors des différentes manipulations bactériologiques.

►

Reconnaître et utiliser les différents appareillages liés aux différents modes de stérilisation.

I.

Initiations aux différentes manipulations aseptiques

► Matériel:

Bec bunsen, trépied et sa grille, béchers de 250 et 500 ml, boîtes de Pétri, pipettes graduées, , tubes à essai, anse, coton cardé, bain marie à 45°C, autoclave, Four Pasteur, Appareil de filtration.

► Produits:

Bouillon nutritif, eau distillée, _gélose nutritive. ·

► Protocoles expérimentaux :

1. Ensemencement dans la masse

*

Milieu liquide:

1 - Régler la flamine du bec BUNSEN.

2.:. Stériliser l'anse en la portant au rouge dans la flamme. Laisser refroidir dans la zone stérile . . 3- Prendre le tube contenant la culture mère dans la main gauche. Déboucher dans la zone

stérile en gardant le bouchon dans la main. Flamber l'ouverture du tube.

4 - Prélever, à l'aide d'une pipette ou de l'anse un inoculum de culture et le repiquer rapidement dans le tube sans passer dans la flamme. Rester toujours dans la zone stérile autour de la flamme.

5- Flamber l'ouverture des tubes et les boucher en enfonçant les cotons.

· 6- Repasser dàns la flamme l'anse en la portant au rouge. L'aiguille est prête pour un nouvel

. ensemencement. La pipette est mise dans la solution antiseptique et ne peut être réutilisée.

*

Milieu solide :

!-Prélever 1 ml d'inoculum liquide à l'aide d'une pipette stérile et le répartir en gouttes au fond d'une boîte de Pétri stérile vide.

2- Introduire dans chacune de ces boîtes le milieu gélosé maintenu en surfusion, avec les précautions d'asepsie habituelles. La température du milieu en surfusion ne doit pas dépasser 45°.

3- Mélanger milieu et inoculum lentement par agitation circulaire dans les deux sens puis laisser refroidir.

2- Ënsemencement en nappe ou par étalement

- Prélever à l'aide d'une pipette stérile, 0.1 ml d'inoculum

- Stériliser l'étaloir en le trempant dans de l'alcool puis le passer à la flamme

- Etaler de façon régulière en glissant l'étaloir sur la surface du milieu tout en faisant tourner la boîte.

3-Ensemencement par stries: (utilisée dans un but d'isolement des germes).

*

En boîte: consiste à ensemencer le milieu gélosé en étalant l'illoculum, déposé sur un point périphérique du milieu, par stries sur toute la boîte.

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~anse de platine

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Schéma de l'isolement par la technique des quadrants

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*

En tube: l'inoculum est déposé sur la pente de gélose à 1 cm environ de son point le plus bas pour éviter l'eau de condensation. On remonte ensuite l'anse en décrivant, sans casser la gélose, des stries tout au long de la pente.

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tube de gèlose inclinée

NB: Toutes les manipulations seront effectuées d'abord en démonstration par I' enseignant

Il- STERILISATION :Appareillage et mode de fonctionnement

Un produit est biologiquement stérile, lorsqu'il ne contient plus aucune forme de microorganisme. Cette stérilisation peut s'effectuer par plusieurs modes qui dépendent du produit à stériliser et des microorganismes à supprimer (voir TD)

A. STERILISATION PAR LA CHALEUR 1. ACTION DE LA CHALEUR SECHE

*Stérilisation à la flamme

Les bactéries sont détruits par incinération, ce mode de stérilisation convient pour : anse de platine, étaloir, pince en inox , ouverture des tubes et flacons ...

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*Stérilisation au four pasteur

Les bact~, sont détruites par déshydratation, ce mode est utilisé surtout pour la stérilisation de la verrerie vide (tubes et pipettes bouchés au coton, boîtes de Pétri ... ) qui s'effectue pendant 1 heure à 180°C ou 2h à 160°C.

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2. ACTION DE LA CHALEUR HUMIDE

* STERILISATION A L'AUTOCLAVE

Elle convient non seulement pour les récipients et objets, mais aussi les solutions et milieux de culture.

- Utilisation de l'autoclave (en démonstration)

- Temps de stérilisation: en général, il est de 20 min à 120°C

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Ccnu4'ntion.al

B. STERJL.rWATJON PAR FILTRATION

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Le principe est simple: les microorganismes, de .dimension supérieure au diamètre du ..

pore du filtre utilisé, sont retenus directement à la surface du filtre et le filtrat récupéré est stérile.

On stérilise par filtration toute solution contenant des substances altérables par la chaleur: les vitamines et certains acides aminés (cystéine, tryptophane, etc ... ) ou très peu visqueux: eau.

Les solutions sont passées à travers des filtres retenant les microorganismes. On utilise couramment des filtres Millipores dont le diamètre des pores de 0,45 micron.

APPAREILS DE FILTRATION

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TP2 : MISE EN EVIDENCE DES BACTERIES DANS DES DIFFERENTS BIOTORES

Objectif:

- Découvrir la diversité du monde microbien

I. MISE EN EVIDENCE DES BACTERIES DANS DES DIFFERENTS BIOTOPES 1. Observation d'une

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polluée par des débris de végétaux (âgée de 5 jours):

- Constater l'odeur, le trouble, la présence d'un voile, l'altération des plantes.

- Prélever, à l'aide d;une pipette, un peu de voile qui recouvre la surface. Déposer une goutte du liquide prélevé sur une lame; recouvrir d'une. lamelle.

- Observer au microscope à différentes grossissements. Ne pas oublier l'huile à immersion pour le fort grossiss_ement (x 100).

- Interprétation et conclusion. . .

- Ensemencer par étalement (voir techniques d'ensemencement au TPl), 0.1 ml de l'eau polluée dans une boîte contenant la gélose nutritive.

- Laisser incuber pendant une semaine:

2- Examen d'échantillon de terre dans de l'eau:

- Agiter pour obtenir une suspension homogène.

- Laisser décanter et prélever une goutte du surnageant. Déposer sur lame et recouvrir d'une lamelle.

- Observer. Interpréter. Conclure.

- Ensemencer par étalement 1 ml de l'échantillon dans une boite contenant la gélose nutritive.

- Laisser incuber pendant une semaine

3-Examen de tartre dentaire ou (oreille, cheveux .. ) :

- Prélever avec un coton tige, un peu de tartre dentaire à la limite de la gencive.

- Ensemencer par stries à l'aide d'un coton-tige d'une demi boîte par échantillon.

- Laisser incuber pendant une semaine.

TP 3: ETUDE MACROSCOPIQUE DES BACTERIES

OBJECTIF:

-Décrire les cri.tères morphologiques macroscopiques des différents types de bactéries I. Examen macroscopique des cultures

L'examen macroscopique des cultures est le premier examen effectué ^à partir de l'isolement après incubation. L'aspect des colonies dépend du milieu utilisé, de la durée et de

la température d'incubation .

Il ne pourra être décrit convenablement qu'à partir de colonies bien isolées.

Les colonies sont observées par transparence (1) et par réflexion (2). (voir schémas).

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Matériel

Boites de culture bactérienne présentant des colonies isolées, loupes

La description des colonies doit mentionner : 1- La taille

Elle peut être mesurée à l'aide d'une règle graduée pour les grandes colonies. Il est possible d'utiliser le microscope au grossissement le plus faible : en comparant la taille de la colonie et le diamètre du champ, on aura une idée plus précise de la taille des petites colonies.

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2-La forme

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3-L'aspect_de la surface

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4- Le contour

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5- Le relief

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6 - L'opacité

Les colonies sont décrites comme:

- Opaques (ne laissent pas passer la lumière)

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-Translucides (laissent passer la lumière mais on ne voit pas ·les formes au travers).

- Transparentes (laissent passer la lumière et voir les formes au travers)

7- La consistance

Au moment du prélèvement, il est possible d'apprécier si les colonies sont grasses,

8- Couleur (pigmentation) :

Les colonies habituelles sont de couleur crème. Une couleur différente est due à des pigments.

Mentionner sous forme de tableau, pour chaque type de colonies, les caractères décrits ci dessus.

10

.. TP 4: ETUDE MICROSCOPIQUE DES BACTERIES

OBJECTIFS:

- Connaître les différentes formes bactériennes et étudier leur morphologie.

- Maîtriser la technique de coloration de Gram

I. Examen microscopique des bacwri~.-· . . )'

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1- EXAMEN A l'ETAT FRAIS

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Pour observer les bactéries à l'état vivant et en particulier pour mettre en évidence leur mobilité (ou motilité), on doit prendre garde de ne pas détruire les flagelles bactériens lors du prélèvement et de la préparation de la lame. Il peut être pratiqué soit à partir de culture ,en milieux solides ou liquides, soit à partir de milieux naturels.

Matériel et produits

Microscope, culture bactérienne, lame, lamelle, l'huile de paraffine, anse.

Protocole expérimental : Milieu liquide:

Une goutte de culture est prélevée stérilement à la pipette Pasteur remplie par capillarité ou à l'anse de platine et déposée au milieu d'une lame propre.

On pose ensuite délicatement la lamelle, le liquide ne doit pas déborder.

On répartit Je. liquide sous la lamelle en appuyant très légèrement avec l'extrémité d'une pince ou avec l'ongle.

Milieu solide:

L'examen doit être fait dans la mesure du possible à partir de cultures jeunes.

Déposer une petite goutte d'eau stérile sur une lame.

Prélever, à l'aide d~un fil ou à l'anse, une fraction de colonie (inoculum) sur gélose,. Faire une suspension homogène dans la goutte d' eau en incorporant progressivement 1 'inoculum. La

lamelle est posée comme précédemment. ·

Observation:

- Observer rapidement en faible luminosité et à l'objectif x 40. Puis passer à l'objectif x I 00 en mettant de l'huile à immersion. ,-u,.cpe,J;.__._ &-,:__

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- Attendre, 1 minute, la disparition des mouvements du liquide sous la lamelle avant d'examiner la préparation.

- ni avec les mouvements browniens dus à des phénomènes d'attraction qui se traduisent par des mouvements désordonnés autour d'un axe, sans déplacement véritable;

- ni avec les mouvements transmis par les courants, qui entraînent toutes ]es bactéries dans le même sens.

Après l'observation, jeter la préparation dans un récipient contenant un désinfectant a large spectre ( eau de javel).

NB. Un état frais peut être coloré à l'aide de colorants vitaux {qui ne tuent pas les

bactéries observés) tels que le bleu de méthylène ou le rouge neutre.~

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2. REALISATION ET EXAMEN DE FROTTIS COLORES O' , 1. 1

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La coloration donne aux bactéries une teinte assez intense pour faciliter l'étude de la morphologie. 1L existe de très nombreuses colorations, destinées soit à observer les bactéries, soit à les classer (coloration différentielle), soit à étudier certains constituant cellulaires.

' La préparation passe par plusieurs phases:

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- Nettoyage de la lame;

- Préparation du frottis;

- Séchage; puis fixation à la flamme; - Coloration, simple ou complexe;

- Rinçage et séchage.

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a- Préparation du frottis:

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- Consiste à étaler sur la lame la goutte de suspension bactérienne ( comme pour un examen à l'état frais mais ne pas recouvrir d'une lamelle) en un film mince et régulier par un mouvement régulier et circulaire à l'aide de l'anse de platine.

- Séchage: a pour but d'éliminer ]'eau qui a servi à faire le frottis.

Laisser la lame à proximité d'une flamme douce.

- Fixation: a pour but de tuer les bactéries et à les fixer sur la lame, sans en altérer la structure.

Passer la lame sèche, lentement, dans une flamme douce du bec bunsen .. Répéter 3 fois et laisser refroidir. ·

b- Coloration de Gram

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Matériel:

Microscope, lames, une anse de prélèvement, pipette pasteur stérile, bac de coloration, . portoir de lames, papier absorbant

Produits

eau stérile, violet de gentiane, lugol, fuschine, alcool, eau de Javel, préparation microbienne.

Protocole expérimental :

- Recouvrir le frottis fixé de violet de gentiane durant une minute puis laver à l'eau.~

-Recouvrir la lame d'une solution de lugol durant 30 secondes puis laver à l'eau.

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- Recouvrir la lame d'éthanol durant 10 secondes 'r.(.P...cll:!,-n. c...e,,..';j(' - Laver rapidement et recouvrir la lame de fuchsine pendant 1 minute puis laver à l'eau.

- Sécher puis observer à l'objectif x 100 en utilisant l'huile à immersion.

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en grappe de raisin Staphylocoque

cocobacilles listeria

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TP 5: NUMERATION BACTERIENNE

Objectif:

Dénombrer la population bactérienne d'un échantillon à analyser en utilisant la technique de numération en milieu solide et celle des tubes multiples (NPP). ·.

PRJNCIPE:

La numération des bactéries en milieu solide, est basée sur l'hypothèse selon JaqueJle, chaque bactérie vivante donne naissance à une colonie repérable à l'oeil nu, après incubation dans un milieu gélosé favorable. En conséquence si un produit ou sa dilution est ensemencée dans un milieu gélosé, le nombre des colonies qui se sont déve}oppées correspond au nombre des bactéries présentes dans l'inoculum du produit d'origine.

En milieu liquide, cette numération est basée sur le fait qu'après ensemencement d'un milieu de culture liquide, toute croissance bactérienne indique la présence d'au moins une bactérie_._. ·

NB. Une colonie ne correspond pas toujours au développement d'une seule bactérie isolée:

une chaînette ou un amas bactérien ne vont donner qu'une colonie, on parle actuellement d'Unités Formant Colonie (UFC). Ceci ne met pas en cause l'exactitude de cette méthode.

Matériel

Tubes à essai, boites de pétri, pipettes graduées, agitateur.

Produits

Gélose nutritive, eau physiologique.

Protocole expérimental :

Préparation des dilutions

Une dilution du produit à étudier précède obligatoirement toute étude quantitative. Les dilutions sont généralement décimales 10·¹, 10·², 10·³,

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^{4, 10·5 ....} donc en progression géométrique de raison 1 O.

- Prévoir des tubes contenant 9 ml de liquide de dilution stérile (l'eau distillée ou physio logique), remplis à l'aide d'une pipette stérile de 10ml. · - Agiter le tube de la solution mère contenant l'échantillon à étudier et transférer à la pipette

stérile, 1 ml du liquide à tester dans le Ier tube de dilution (1

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- Mélanger à l'aide d'un agitateur de type vortex. l,, ~

- Puis transférer 1 ml du Ier tube dans k 2ème (10-²⁾ à l'aide d'une nouvelle pipette stérile, puis du 2ème dans le 3ème (1

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³⁾ à chaque fois avec une nouvelle pipette, etc ... , réalisant ainsi des dilutions plus poussées. IÎ .

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Ensemencement du milieu solide Ensemencement du milieu gélosé dans la masse ou eri nappe:

Dans la masse: · ·-· ·

-Prélever 1 ml de chaque dilution, que l'on répartit en gouttes au fond des boîtes de Pétri stériles vides.

- introduire dans chacune de ces boîtes le milieu gélosé .. en surfusion, avec les précaütions d'asepsie habituelles. La température du milieu en surfusion ne doit pas dépasser 45°.

- Mélanger milieu et inocull.im lentement par agitation circulaire dans les deux sens puis laisser refroidir.

En nappe:

- Etaler 0.1 ml de l'inoculum sur le milieu gélosé déjà répartit en boîte.

Incuber les boîtes à 30°C, après les avoir marquées, en position Ïnvyrse.

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Après 24 h d'incubation, compter le nombre de colonies par boîte et (_ _

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Technique des tubes multiples ou NPP : voir TD

déterminer le nombre de bactéries par ml Ou g d'échantil~n analysé. {f-~....,..c.e

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Ensemencement du milieu ligui~e : .

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