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extraction de l’ADN à partir de différents supports
biologiques
Louise Painteaux
To cite this version:
Louise Painteaux. Validation de techniques de génotypage de l’ADN sans extraction de l’ADN à partir de différents supports biologiques. Génétique animale. 2019. �hal-02937920�
DUT Génie Biologique Option Agronomie
RAPPORT DE STAGE DE FIN DE DUT Validation de techniques de génotypage de l’ADN
sans extraction de l’ADN à partir de différents supports biologiques
Rapport de STAGE INRA Occitanie Toulouse
01/04/2019 – 14/06/2019
Maître de stage : Fabre Stéphane, Directeur de recherche
Je remercie Stéphane Fabre, mon maitre de stage, pour m’avoir accueillie au sein de son équipe lors de mon stage de fin de DUT, et grâce à qui j’ai pu vivre une expérience enrichissante dans un domaine dans lequel je souhaite poursuivre mes études. Je le remercie pour son aide à la rédaction de ce rapport.
Je tiens à remercier particulièrement Julien Sarry avec qui j’ai travaillé sur ce projet tout au long de ces 12 semaines de stage, pour sa patience, sa confiance, son aide et ses explications ainsi que pour tout le temps qu’il m’a consacré lors de mon stage et pour son aide à la rédaction de ce rapport.
Remerciements également à Florent, technicien de laboratoire, avec qui j’ai réalisé mes premières manipulations, pour ses explications et sa patience.
Je remercie toute l’équipe de GenROC pour leur gentillesse, leur bienveillance, leur aide et leurs conseils.
Je remercie également ma professeure de biologie moléculaire, Elodie Choque qui m’a permis d’entrer en contact avec l’INRA de Toulouse.
Introduction générale ... 1
1. Présentation de l’INRA ... 3
1.1. Présentation générale de l’institut ... 3
1.2. Présentation de l’INRA Occitanie-Toulouse et de l’équipe GenROC ... 4
2. Présentation du projet ... 5
3. Matériels et méthodes ... 7
3.1. Animaux ... 7
3.2. Prélèvements et matériels biologiques ... 8
3.2.1. Prise de sang ... 8
3.2.2. Biopsie de cartilage d’oreille ... 9
3.2.3. Ecouvillonnage buccal de la salive ... 9
3.2.4. Lait ... 10
3.2.5. Sperme ... 10
3.3. Traitement des échantillons ... 11
3.3.1. Extraction d’ADN génomique ... 11
3.3.2. Préparation des échantillons pour la procédure sans extraction d’ADN ... 11
3.4. Amplifications PCR ... 13
3.4.1. Amplification PCR « GoTaq » ... 15
3.4.2. Amplification PCR « Terra » ... 15
3.4.3. Analyse des produits PCR par électrophorèse ... 16
3.5. Génotypage RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ... 16
3.5.1. Analyse sur gel d’agarose... 17
3.5.2. Analyse par séquenceur capillaire ... 17
4. Résultats et discussion ... 18
4.1. Génotypage de la mutation FecLL à partir de sang et de salive ... 18
4.2. Génotypage de la mutation R96C à partir de lait et biopsie d’oreille ... 23
4.3. Génotypage de la mutation FecXN à partir de sperme et de sang ... 27
Conclusion générale ... 30
Bibliographie ... 32
Lexique ... 33
Table des abréviations ... 34
Table des illustrations ... 35
Introduction générale
Afin de finaliser mon DUT j’ai effectué mon stage dans l’un des laboratoires de l’INRA (Institut National de la Recherche Agronomique), au sein du centre de recherche Occitanie Toulouse. J’ai intégré une équipe qui travaille sur la génétique des petits ruminants* ovins et caprins.
La génétique est la science de l’hérédité, elle étudie les caractères héréditaires des individus, leur transmission au fil des générations ainsi que leurs variations sous l’influence des polymorphismes* de l’ADN ou mutations*. Chaque individu possède un seul génome*, c’est-à-dire qu’au sein d’un même organisme, la séquence ADN* de chaque cellule est identique. Toutefois, chaque individu de chaque espèce possède un génotype* unique (une combinaison de polymorphismes) et différent des autres individus de son espèce, c’est l’une des raisons pour lesquelles nous sommes tous différents.
Afin d’identifier une variation génétique présente ou non dans le génome d’un individu, il faut faire un génotypage. Le génotypage consiste à déterminer l’identité d’une variation génétique (on parlera alors de marqueur génétique* polymorphe) à une position spécifique sur tout ou sur une partie du génome, c’est-à-dire à définir quel est l’allèle* que possède l’organisme étudié à un locus* donné. Le génotypage va être utile dans le domaine animal pour gérer les accouplements entre animaux et leur sélection en vue d’améliorer les caractères d’intérêt pour l’élevage. Le génotypage peut se faire marqueur par marqueur ou sur quelques dizaines de marqueurs voire sur plusieurs milliers de marqueurs en même temps à l’aide par exemple de puces à SNP* haute densité. Ce type de génotypage se fait grâce à de l’ADN génomique purifié extrait à partir de tissus d’animaux à analyser. En général, ces tissus sont le sang (obtenu par une ponction veineuse à l’aiguille) ou le cartilage d’oreille (biopsie obtenue à l’aide d’un emporte-pièce).
Si cette approche de génotypage sur ADN purifié est très efficace, elle est néanmoins un peu coûteuse en temps et en argent. De plus, elle fait appel à des prélèvements de tissus sur les animaux qui font entrer cette approche dans le champ d’application de la réglementation européenne sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (directive 2010/63/UE, décret n°2013-118 du Ministère de l’Agriculture, de l’Agroalimentaire et de la Forêt). Dans ce cadre, les génotypages doivent rentrer dans une autorisation de projet délivrée par le Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche suite à l’évaluation par un comité d’éthique.
Celle-ci consiste à « Remplacer l'expérimentation animale dès que possible, et à défaut, à Réduire le nombre d'animaux utilisés et à Raffiner les procédures, c'est-à-dire optimiser les méthodologies employées pour diminuer la douleur animale tout en garantissant un niveau de résultats scientifiques élevé. De plus, cette utilisation doit être pleinement justifiée. Ainsi les avantages escomptés doivent l'emporter sur les préjudices causés aux animaux. » (source : https://agriculture.gouv.fr/animaux-utilises-des-fins-scientifiques).
C’est dans ce cadre que l’équipe d’accueil de mon stage doit gérer des milliers de génotypages par an d’ovins et de caprins pour répondre aux questionnements scientifiques et en partenariat avec les instituts techniques et les organismes de sélection de ces deux espèces. Ainsi, l’équipe est intéressée à mettre au point et tester des méthodes de génotypages sans extraction préalable d’ADN. Ceci permettrait d’une part de gagner du temps de manipulation et de réduire les coûts, et d’autre part d’étudier la possibilité de génotypage à partir d’autres tissus comme la salive, le lait ou le sperme dont le prélèvement serait moins invasif qu’une prise de sang ou encore une biopsie d’oreille.
Après avoir présenté l’INRA, nous verrons une présentation détaillée du projet de génotypage sans extraction d’ADN, puis je parlerai du protocole suivi pour mener à bien mon projet et enfin, je présenterai les résultats que j’ai obtenus ainsi que leur qualité.
1. Présentation de l’INRA
1.1. Présentation générale de l’institut
L’INRA est implanté dans 17 centres complétés par un centre-siège à Paris. Il comprend 250 laboratoires dont 45 unités expérimentales au sein de 13 départements scientifiques (chiffres de 2017). L’INRA est aussi le premier institut européen en sciences agricoles avec un réseau de laboratoires, de centres de ressources génétiques, d’observatoires de l’environnement, de plateformes technologiques et de parcelles expérimentales sans équivalent en Europe. L’INRA est également le 2ème organisme mondial en termes de publications d’articles en
sciences agronomiques et possède 340 brevets en stock ainsi que 443 variétés ou certificats d'obtention végétale.
L’INRA représente une communauté de 13 000 personnes dont 7 903 agents titulaires, 1 849 chercheurs titulaires, 2 353 stagiaires accueillis et 556 doctorants rémunérés par l'INRA en 2017.
L’INRA étant un institut public, les salaires ainsi que le budget de fonctionnement commun tels que des formations ou encore des déplacements sont financés par l’état. En ce qui concerne le financement des programmes de recherches, ils peuvent être d’origine publique ou privée. Le budget de l’INRA en France en 2017 représente 850,89 millions d’euros.
A l’INRA se trouvent plusieurs classes socio-professionnelles : les chercheurs et le personnel de soutien. Chacune de ces classes à un rôle spécifique : les chercheurs dirigent les programmes de recherche. Le personnel de soutien à la recherche est plus vaste, en effet il comprend les informaticiens qui ont pour mission de permettre l’analyse et la formulation des résultats, le personnel administratif, qui a pour objectif de gérer le personnel et le budget et enfin le personnel de laboratoire qui réalise la maintenance des équipements et/ou la manipulation ainsi que les analyses associées. Le personnel de laboratoire peut accéder à 4 niveaux de carrière : technicien, assistant ingénieur, ingénieur d’étude, et ingénieur de recherche.
1.2. Présentation de l’INRA Occitanie-Toulouse et de l’équipe GenROC
Comme indiqué précédemment, l’institut se décline en plusieurs centres régionaux. Mon lieu de stage était l’INRA Toulouse. Le dispositif de recherche de l'INRA Occitanie-Toulouse est composé de 19 unités de recherche dont 12 en partenariat avec des universités et des établissements d’enseignement supérieur et de recherche régionaux (chiffre de 2017). J’ai été accueillie par l’UMR (Unité Mixte de Recherche) GenPhySE (Génétique Physiologie et Systèmes d’Elevage) pendant ces 11 semaines de stage.
Au sein de cette UMR nous retrouvons 10 équipes de recherche, dont l’équipe qui m’a accueillie : GenROC (Génomique* des Ruminants Ovins Caprins). La mission de GenROC est de mettre en évidence des mutations génétiques chez les ovins et les caprins qui contrôlent la variabilité génétique des caractères d’intérêts comme la santé (résistance aux parasites ou aux infections), l’adaptation aux conditions d’élevage (robustesse des agneaux, qualité de la toison) et la reproduction (fertilité, prolificité). L’équipe mène plusieurs projets de recherche en parallèle. Chacun de ces projets nécessitent l’implication de différentes personnes compétentes en génétique, en biologie et en statistiques. L’équipe GenROC est composée de 4 chercheurs, 3 techniciens ou assistants ingénieurs ainsi que d’une doctorante.
2. Présentation du projet
Comme évoqué dans l’introduction, l’équipe doit réaliser de nombreux génotypages avec des résultats fiables, rendus rapidement, et dans un contexte de respect du bien-être des animaux. La méthode « classique » de génotypage, nécessitant l’extraction et la purification de l’ADN génomique, est une méthode coûteuse tant au niveau du temps de manipulation qu’au niveau financier. Il serait idéal de réduire ce coût financier tout en gagnant du temps sur les manipulations.
Si l’on prend l’exemple de 1 000 échantillons à génotyper pour un manipulateur, pour le protocole avec extraction d’ADN (voir protocole en annexe 1), il y a une limite quant au nombre d’échantillons que l’on peut mettre simultanément dans la centrifugeuse pendant le protocole (32 places), ce qui représente un maximum de 64 échantillons traitables par jour. L’extraction/purification se faisant sur 2 jours (une incubation pendant une nuit, le dosage de l’ADN et sa dilution), cela représente environ 4 semaines de travail à temps plein pour la partie extraction sans pour autant avoir génotypé les ADNs. Au niveau des coûts de réactifs, on peut utiliser un kit d’extraction commercial (kit AxyPrep Mag kit d'extraction d'ADN tissus sang 96 réactions, ref : 712285 de chez Dutscher) qui vaut 247 euros pour 96 échantillons. Cette approche d’extraction d’ADN reste indispensable pour les génotypages nécessitant l’étude de plusieurs dizaines, centaines ou milliers de marqueurs en même temps.
Cependant, pour faire face à ces coûts temporels et financiers, et avec un besoin majoritaire de génotypages marqueur par marqueur sur un grand nombre d’animaux, l’équipe a déjà mis en place une stratégie de génotypage sans extraction d’ADN à partir du sang et à l’aide d’un kit commercial : le kit Terra (Takara Bio USA, commercialisé en France par la société OZYME). Ce kit étant basé sur de l’amplification PCR* directement à partir d’une très petite quantité de sang (1 à 2 µl), il est possible de gérer 1000 échantillons en 1 journée (grâce à des plaques 384 puits) pour un coût de 340 euros (figure 2).
Figure 2 : Comparaison des 2 protocoles avec et sans extraction de l’ADN
Ainsi, les objectifs de mon stage sont :
- D’une part, de vérifier que la méthode de génotypage sans extraction d’ADN est aussi fiable que celle utilisant l’ADN purifié,
- Et d’autre part, de valider l’utilisation du génotypage sans extraction d’ADN sur des tissus biologiques autres que le sang et obtenus de façon non invasive : la salive par des écouvillons buccaux, du lait suite au contrôle laitier, ou du sperme collecté en centre d’insémination artificiel.
Pour mener à bien ces objectifs, j’ai réalisé les génotypages de 3 mutations différentes dans 3 races différentes de moutons. Par convention, les allèles sont notés « + » lorsqu’il s’agit de l’allèle sauvage et « M » lorsqu’il est mutant.
Tout d’abord, la mutation « FecLL » présente dans les moutons de race Lacaune viande. Cette
mutation se trouve dans le gène* FecL/B4GALNT2 situé sur le chromosome 11. La mutation est un polymorphisme de type SNP (T>A, noté +>M) dans un intron* du gène qui ne change pas la séquence de la protéine* codée par ce gène. L’allèle M augmente le nombre de petits par portée, c’est une mutation qui contrôle la prolificité (1 à 2 agneaux chez les femelles non porteuses contre 3 ou 4, voire plus chez les porteuses de M) (Drouilhet et al., 2013).
La seconde mutation « R96C » existe chez les moutons Lacaune lait et se trouve dans le gène SOCS2, porté par le chromosome 3. Cette mutation qui affecte la séquence de la protéine est aussi un polymorphisme de type SNP (C>T, noté +>M). L’allèle mutant M diminue la résistance aux mammites, mais entraine également augmentation de la production laitière des brebis, ainsi que de leur taille et de leur poids (Rupp et al., 2015).
Enfin, « FecXN », la troisième mutation étudiée, se trouve dans le gène BMP15 porté par le chromosome X. Elle contrôle également la prolificité, tout comme la mutation FecLL mais dans la race de mouton Blanche du Massif Central. La mutation est aussi de type SNP (A>T, noté +>M). Elle a été découverte très récemment par Louise Chantepie, doctorante dans l’équipe GenROC (Chantepie et al., en cours de rédaction).
3. Matériels et méthodes
3.1. Animaux
Pour l’ensemble de l’étude, j’ai eu à disposition :
- 20 brebis de race Lacaune viande situées sur la ferme expérimentale INRA de Langlade (à quelques kilomètres du centre INRA Occitanie-Toulouse) avec un génotype connu au locus FecL (10 brebis +/+ et 10 brebis M/+) ;
- 24 brebis de race Lacaune lait, situées sur la ferme expérimentale INRA de La Fage (près de Roquefort dans l’Aveyron) avec un génotype connu au locus SOCS2 (7 brebis +/+, 6 brebis +/M et 8 brebis M/M) ;
- 6 béliers de race Blanche du Massif Central issus d’un centre d’insémination artificiel situé à Mazeyrat d’Allier (Haute Loire) avec un génotype connu au locus FecX (3 béliers +/Y et 3 béliers M/Y).
3.2. Prélèvements et matériels biologiques
Lors de l’échantillonnage, n’étant pas habilitée à l’expérimentation animale, les prises de sang et les biopsies d’oreilles ont été réalisées par les animaliers de l’INRA. Par contre, j’ai pu réaliser moi-même les prélèvements de salive et réaliser des extractions d’ADN génomiques.
3.2.1. Prise de sang
Lors des prélèvements sanguins sur les brebis à la veine jugulaire, nous utilisons une aiguille médicale connectée à un guide, et un tube de prélèvement sous vide contenant de l’EDTA (7,2mg ; Vacutainer, Becton-Dickinson, Figure 3).
Figure 3 : Kit de prélèvement sanguin et tubes remplis de sang
Le vide dans le tube aspire 4 mL de sang qui se mélange à l’EDTA pour éviter la coagulation. Le tube est ensuite retiré du guide. Tout au long de la prise de sang, l’animal est maintenu par l’animalier et ne se débat pas. La composition du sang est principalement le plasma, liquide dans lequel nous retrouvons les plaquettes (qui servent à la coagulation) ainsi que les globules blancs et les globules rouges. Dans le sang, seules les globules blancs contiennent de l’ADN. Les tubes de sang sont conservés à 4°C avant analyse.
3.2.2. Biopsie de cartilage d’oreille
La biopsie d’oreille est faite à l’aide d’un emporte-pièce (Pince TSU, Allflex) et est directement déposée dans un tube inséré dans la pince (figure 4).
Figure 4 : Pince TSU (Allflex), Biopsie d’oreille
3.2.3. Ecouvillonnage buccal de la salive
Les cellules buccales sur des brebis sont collectées à l’aide d’écouvillons de 15 cm de long avec une tête en mousse polyuréthane assez souple (figure 5). Je me suis rendue sur le site de Langlade afin de faire les prélèvements buccaux sur les animaux. Afin de réaliser ce prélèvement, il faut tenir fermement l’animal, lui ouvrir la bouche et frotter deux fois contre la paroi interne des joues.
3.2.4. Lait
Le lait que j’ai utilisé lors de mon projet a été récupéré sur le site expérimental INRA de La Fage. Les échantillons reçus (environ 20 mL) ont été prélevés lors de la traite des brebis puis congelés à 20°C pour être conservés et permettre leur transport jusqu’au laboratoire (figure 6).Des cellules somatiques (épithélium mammaire, cellules immunitaires) sont présentes dans le lait. Le comptage des cellules somatiques dans le lait est par ailleurs un indicateur des infections mammaires, comme les mammites.
Figure 6 : Flacons de lait prélevés sur le site de La Fage
3.2.5. Sperme
Les échantillons de sperme étudiés sont issus de paillettes (0,22 mL, 350 millions de spermatozoïdes, une couleur par animal) qui nous ont été livrées à température ambiante par le centre d’insémination ovine Mazeyrat d’Allier (Haute-Loire).
3.3. Traitement des échantillons
Les différents échantillons biologiques collectés sont soit utilisés pour une extraction d’ADN génomique (sang, biopsie), soit utilisés directement purs ou en dilution pour l’analyse sans extraction d’ADN (sang, biopsie, salive, lait, sperme).
3.3.1. Extraction d’ADN génomique
L’extraction et la purification d’ADN génomique, servant de contrôle pour l’efficacité des analyses de génotypage, ont été réalisées sur des échantillons de sang (4ml) et de biopsie d’oreille. Elles suivent un protocole détaillé en annexe 1. Rapidement, les sangs ou les biopsies subissent une lyse alcaline avec un choc osmotique pour faire éclater les cellules. Les complexes nucléoprotéiques* sont ensuite traités par une protéinase pour libérer les acides nucléiques*, dont l’ADN génomique. L’ADN est ensuite précipité par une solution saturée en NaCl (Chlorure de Sodium) et mélangée avec de l’alcool (éthanol absolu) puis isolé, soit par retrait de la « pelote » d’ADN formée, soit par centrifugation à haute vitesse (10 000g (vitesse de rotation)). L’ADN ainsi extrait est placé dans une solution aqueuse de TRIS-EDTA 10/0,1, puis dosé au spectrophotomètre à 260nm. Une solution de travail d’ADN dilué est préparée à 10ng/µl.
3.3.2. Préparation des échantillons pour la procédure sans extraction d’ADN
Pour les échantillons de sang, 1 µL sert à faire directement une PCR.
Pour l’étude à partir de lait, les échantillons sont purs ou dilués au 10ème, 100ème et
1 000ème dans une solution de NaCl 0,9% (9g/L dans H2O).
Afin d’étudier le sperme, j’ai vidé une paillette de chaque animal dans un tube Eppendorf 2mL puis identiquement au lait, j’ai réalisé des dilutions allant du 10ème au 1 000ème (figure 8). Les dilutions sont testées en même temps qu’un échantillon pur.
Figure 8 : Dilution allant du sperme non dilué au sperme dilué au 1 000ème dans des tubes Eppendorf
La méthode de prélèvement de salive par écouvillons buccaux n’ayant jamais été validée au laboratoire, elle a été entièrement testée et validée au cours de ce stage. Nous avons donc dû comprendre comment récupérer l’ADN de ces écouvillons. Plusieurs méthodes ont été testées :
- L’utilisation directe d’un morceau de mousse de l’écouvillon (2x2x2mm, 8 mm3),
- La dissolution de la salive et des cellules contenues par trempage de la mousse de l’écouvillon dans 200µl de NaCl 0,9% et agitation 10sec par vortex,
- La dissolution de la salive et des cellules contenues, par trempage de la mousse de l’écouvillon dans 180µl de NaOH (Soude) à 50 nM, chauffée 10min à 95°C puis neutralisée par 20µl d’HCl à 1M et vortexée 10sec. Le NaOH a pour propriété de dissoudre le tissu et permettre plus facilement l’éclatement des cellules de manière à libérer l’ADN.
Pour chaque brebis, nous avons fait des prélèvements avec 2 écouvillons, l’un qui sera conservé à -20°C, et l’autre qui sera utilisé immédiatement pour le protocole. En effet, il est intéressant de savoir si les prélèvements écouvillons sont encore utilisables après une conservation au froid comme c’est le cas pour l’ADN et le sang.
Pour les biopsies d’oreille, l’analyse est réalisée directement sur un morceau de la biopsie (1mm3) placé dans 180µl de NaOH 50mM, chauffé 10 min à 95°C et neutralisé avec
20µl d’HCl 1M, puis vortexé 10sec.
Brebis Langlade Brebis La Fage Béliers Type d’échantillon biologique ADN Salive Sang ADN Biopsie Lait ADN Sang Sperme Tableau 1 : Tableau des différents supports biologiques à disposition pour chaque animal
3.4. Amplifications PCR
A partir des différents échantillons obtenus, j’ai fait des amplifications PCR, l’approche technique à la base des génotypages. Le but d’une PCR est d’amplifier localement et de façon ciblée de petits fragments d’ADN pour pouvoir les étudier. Pour cibler cette amplification et initier l’élongation, il est nécessaire de dessiner des amorces (= séquences d’une 20aine de paires de base) à l’aide de logiciels de bioinformatique. Ces amorces étaient déjà disponibles dans l’équipe (Tableau 2).
Gène B4GALNT2 SOCS2 BMP15
Mutation FecLL R96C FecXN
Amorce up TGCAAGAAGCTGCGGGTG AAGCTGGCTTGCAGTTTGTT TGGAAGTAGGGTGGGAACAG Amorce dn CCATGGCTTGTCTCTTGGTT AGAGATGCTGCAGAGGTGGT CACAAAGGATAGGGCAAGGA
Tableau 2 : Tableau présentant les différentes amorces utilisées selon la mutation étudiée
L’amplification PCR se fait en 3 étapes répétées sur plusieurs cycles dans un thermocycleur (figure 9) :
- Dénaturation : chauffer à 95°C pendant 5 minutes, cette étape sert à rompre les liaisons entre les 2 brins d’ADN
- Hybridation : refroidir à Tm (melting Temperature) (pouvant aller de 50 à 60°C en fonction des amorces) pendant 30 secondes pour que les amorces se fixent sur les brins, d’où elles vont servir de point de départ à l’élongation du brin
- Elongation : chauffer à 72°C pendant 30 secondes pour la synthèse des fragments d’ADN par la Taq polymérase
Figure 9 : Thermocycleurs
En fonction du type d’échantillons, deux protocoles de PCR sont utilisés, le protocole « GoTaq » pour l’ADN purifié (avec 35 cycles de PCR) et le protocole « Terra » pour les autres échantillons (avec 40 cycles de PCR). Ces réactions de PCR sont réalisées dans des plaques 96 puits adaptées aux thermocycleurs.
3.4.1. Amplification PCR « GoTaq »
Pour l’amplification à partir des échantillons d’ADN purifiés, j’ai utilisé le kit GoTaq (Promega). Le mélange réalisé par échantillon est le suivant pour un volume final de 25 µL :
- 8,9 µL d’H20 - 5 µL de Tampon GoTaq [5X] - 1,5 µL de MgCl2 [25 µM] - 2,5 µL de dNTP [2 000 µM] - 1 µL d’amorce Up [10 µM] - 1 µL d’amorce Down [10 µM] - 0,1 µL de GoTaq Flexi [5 U/µL]
- 5 µL d’ADN [10ng/µL] de nos différents animaux
3.4.2. Amplification PCR « Terra »
Pour réaliser une PCR sur les échantillons biologiques bruts ou leurs dilutions, j’ai utilisé le kit Terra « PCR Direct Polymerase Mix » (Takara Bio), spécialement dédié aux amplifications PCR sur tissus sans extraction d’ADN.
Le mélange réalisé par échantillon est le suivant pour un volume final de 25 µL :
- 8,78 µL d’H20
- 12,5 µL de Tampon Terra [2X]
- 0,216 µL de Taq Polymérase [1,25 Unités/µL] - 1,25 µL d’amorce up [10 µMolaire]
- 1,25 µL d’amorce down [10 µM]
3.4.3. Analyse des produits PCR par électrophorèse
Une fois la réaction PCR terminée, la plaque 96 puits est conservée à 15°C dans le thermocycleur. Un contrôle sur gel d’électrophorèse 1% est nécessaire afin de vérifier que l’amplification PCR a correctement fonctionné.
L’électrophorèse est une technique qui permet la séparation de l’ADN en fonction de son poids moléculaire, c’est-à-dire sa taille et sa charge. J’ai réalisé les migrations électrophorétiques des produits PCR obtenus dans une solution solidifiée d’agarose à 1% dissoute dans du TAE (Tris Acétate EDTA, composé de Tris, d’acide acétique et d’acide éthylènediaminetétraacétique) et en présence de BET (Bromure d’éthidium) [0,7 mg/mL] un intercalant fluorescent de l’ADN. Le mode opératoire est donné en annexe 2.
3.5. Génotypage RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Après vérification du bon fonctionnement de l’amplification PCR sur gel, je réalise une RFLP. La RFLP est une méthode de génotypage utilisant une enzyme de restriction (= protéine capable de couper un fragment d’ADN au niveau d’une séquence caractéristique de nucléotides*), l’enzyme va couper ou non l’ADN en fonction du génotype attendu. Sur mon projet j’ai utilisé l’enzyme HphI pour génotyper la mutation FecLL, l’enzyme MseI pour génotyper la mutation FecXN et l’enzyme MboII pour génotyper la mutation R96C (figure 11).
Les digestions enzymatiques des produits de PCR se font une nuit à 37°C dans un volume de 15 µL final. Le mélange réalisé par échantillon est le suivant :
- 8,35 µL d’H2O
- 1,5 µL de tampon de réaction CutSmart [10 X]
- 0,15 µL de l’enzyme HphI ou MseI ou MboII (New England Biolabs) [5 U/µL]
Une fois la réaction récupérée de la chambre chaude à 37°C, il faut analyser les fragments de restriction*. Pour cela, j’ai utilisé deux méthodes : sur gel d’agarose pour les mutations R96C et FecXN ou sur un séquenceur à 48 capillaires (Applied Biosystem 3730, figure 12) si on réalise les PCR avec des amorces fluorescentes comme pour la mutation FecLL.
3.5.1. Analyse sur gel d’agarose
Les fragments de restriction obtenus après digestion MseI ou MboII sont séparés sur un gel d’agarose à 3% dans du TAE (cf. mode opératoire décrit précédemment) et visualisés sous UV.
3.5.2. Analyse par séquenceur capillaire
C’est une technique rapide qui permet de génotyper un grand nombre d’échantillons en faisant migrer dans un même capillaire (rempli d’un gel d’acrylamide) jusqu’à 4 échantillons différents chacun marqué par une molécule fluorescence différente (FAM bleu, VIC vert, NED noir et PET rouge).
Cette approche fluorescente est utilisée spécifiquement pour le génotypage de la mutation FecLL des brebis Lacaune viande et pour la comparaison des 4 conditions d’échantillonnage : le sang (amorce FAM), l’écouvillon NaOH (amorce VIC), l’écouvillon NaCl (amorce NED) et l’ADN (amorce PET). Chaque amplification PCR et digestion enzymatique sont réalisées indépendamment avec une amorce fluorescente donnée, puis les 4 réactions sont groupées par animal dans une plaque 96 puits. Chaque puit de la plaque « mélange » contient 50 µL d’H2O ainsi que 5 µL des produits digérés de PCR (FAM) issus de sang, 5 µL des produits digérés de PCR (NED) issus de salive NaCl, 4 µL des produits digérés de PCR (VIC) issus de salive NaOH et 6 µL des produits PCR (PET) issus d’échantillons d’ADN. Dans une seconde plaque, on dépose 10 µL de formamide contenant un marqueur de taille (600 LIZ à 2%). La formamide est un agent dénaturant qui va permettre la séparation des deux brins d’ADN. On prélève ensuite 2 µL du mélange de produits de digestion enzymatique qu’on dépose dans cette seconde plaque. On dépose ensuite la plaque dans le séquenceur situé et géré par la plateforme génomique Get-Plage de l’INRA Occitanie-Toulouse. La lecture des échantillons se fait à l’aide d’un laser. Nous obtenons des résultats informatiques sous forme de pics d’intensité de fluorescence en fonction de la taille des fragments de digestion et indiquant quel allèle porte l’échantillon en analysant les fichiers à l’aide du logiciel GeneMapper (Thermo Fischer Scientific).
4. Résultats et discussion
4.1. Génotypage de la mutation FecLL à partir de sang et de salive
Avant le début de ce stage, les génotypages de la mutation FecLL par une approche de RFLP fluorescente sur ADN génomique (après PCR « GoTaq ») et sans extraction d’ADN à partir du sang (après PCR « Terra ») avaient été mis au point sur quelques échantillons dans l’équipe d’accueil. Il me fallait montrer que l’approche était robuste et transférable à un autre matériel biologique : la salive collectée par écouvillon buccal.
Pour cela, en même temps que la collecte des échantillons de sang sur 20 brebis de race Lacaune viande, j’ai réalisé les écouvillonnages buccaux. A cette occasion, j’ai pu observer les animaux lors des prélèvements de sang par un animalier expérimenté, les brebis restent calmes, et ne cherchent pas à fuir bien qu’une aiguille soit introduite. Toutefois, lors des prélèvements buccaux par ce même animalier, les animaux ont tendance à se débattre et à vouloir fuir lorsque l’on tente de leur ouvrir la bouche.
Lors de notre premier test avec les morceaux d’écouvillons bruts directement placés dans la réaction PCR « Terra », nous avons obtenus des résultats aléatoires (figure 13). En effet, nous pouvons voir sur l’électrophorèse de contrôle que tous les morceaux bruts testés n’ont pas donné d’amplification. Cela peut être dû au fait que certains morceaux d’écouvillons ne contiennent pas ou pas assez d’ADN.
Figure 13 : Photo du gel d’agarose 1% pour les produits PCR
Nous pouvons observer des dimères d’amorces sur l’ensemble des puits. Cela est dû à des appariements entre amorces mais cela ne perturbe pas la réalisation des génotypages par la suite.
Suite à ce résultat plutôt aléatoire, nous avons refait des prélèvements buccaux sur les animaux. J’ai donc repris le protocole au début.
Figure 14 : Gels d’agarose 1% des produits de PCR issus du second essai avec les écouvillons dans les différentes conditions de prélèvement
Dans cet essai, la figure 14 montre que les morceaux d’écouvillons bruts donnent toujours des amplifications PCR « Terra » aléatoires en comparaison des amplifications contrôles « GoTaq » avec de l’ADN purifié ou même « Terra » pour le sang pour lequel on obtient 100% des échantillons amplifiés. Il semble normal que ces échantillons amplifient, en effet la procédure était déjà au point pour ces types de sources d’ADN. Toutefois, nous avons constaté que les échantillons à partir d’écouvillons traités au NaCl ou au NaOH avaient amplifié presque à chaque fois (16/20 en NaCL et 19/20 en NaOH), ce qui est positif et ce qui signifie que l’approche d’amplification PCR « Terra » à partir d’écouvillons buccaux peut fonctionner.
Nous avons donc continué le protocole par le génotypage RFLP fluorescent sur séquenceur capillaire avec l’ADN, notre témoin positif et les échantillons de sang, et de salive traitée au NaOH ou au NaCl.
La figure 19 montre les 4 profils de fluorescence sur les 4 conditions (sang en courbe bleue, ADN en courbe rouge, écouvillon NaCl en courbe noire et écouvillon NaOH en courbe verte) pour deux brebis et nous donnent les mêmes génotypes +/+ et M/+ au locus FecL. Le tableau 3 reprend l’ensemble des génotypes pour les 20 brebis.
Animal homozygote +/+
Animal hétérozygote M/+
Tableau 3 : Tableau présentant les résultats obtenus et attendus pour les écouvillons, le sang et l’ADN
Hormis pour les quelques échantillons dont nous n’avons pas pu obtenir l’amplification PCR, les génotypages que j’ai obtenus sont tous cohérents avec les génotypes attendus et ceux obtenus par la technique de référence, le génotypage de l’ADN. Le génotypage sans extraction d’ADN directement sur le sang permet d’obtenir 100% de résultats fiables pour la mutation FecLL. Le génotypage sans extraction d’ADN directement sur la salive à partir d’écouvillons buccaux est possible, en particulier en traitant les écouvillons au NaOH. Certains fragments ne sont pas visibles sur gel d’agarose, toutefois nous arrivons à les génotyper car cette technique est plus sensible. Cette approche est prometteuse, mais doit être encore améliorée peut-être en frottant plus longtemps la paroi interne des joues pour récupérer plus de matériel biologique. Animal Race Génotype attendu au locus FecL Génotype ADN Génotype Sang Génotype salive NaCl Génotype salive NaOH
1 250055197850040 Lacaune viande M/+ M/+ M/+ M/+ M/+ 2 250055197850416 Lacaune viande M/+ M/+ M/+ ?/? +/+ 3 250055197850452 Lacaune viande +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 4 250055197850523 Lacaune viande +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 5 250055197850555 Lacaune viande +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 6 250055197861030 Lacaune viande +/+ M/+ M/+ M/+ M/+ 7 250016123261471 Lacaune viande M/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 8 250016123261486 Lacaune viande +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 9 250016123261547 Lacaune viande M/+ M/+ +/+ M/+ M/+ 10 250016123261614 Lacaune viande +/+ ?/? +/+ ?/? +/+ 11 3142903172475 Lacaune viande +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 12 3142903172477 Lacaune viande M/+ M/+ M/+ M/+ M/+ 13 3142903172484 Lacaune viande +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 14 3142903172491 Lacaune viande +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 15 3142903172492 Lacaune viande M/+ M/+ M/+ M/+ M/+ 16 3142903172505 Lacaune viande M/+ M/+ M/+ M/+ M/+ 17 3142903172517 Lacaune viande M/+ M/+ +/+ ?/? M/+ 18 3142903172540 Lacaune viande M/+ M/+ M/+ M/+ M/+ 19 3142903172549 Lacaune viande +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ 20 3142903172566 Lacaune viande M/+ M/+ M/+ M/+ M/+
En parallèle, j’ai également essayé d’amplifier l’échantillon de salive traité avec du NaCl avec le kit Terra pour vérifier que l’on peut réutiliser l’échantillon après l’avoir conservé à -20°C.
Des fragments PCR sont observables (figure 16). L’amplification PCR a donc fonctionné. Il est donc possible d’utiliser les écouvillons après leur conservation à -20°C.
Figure 16 : Gel d’agarose 1% obtenu après l’amplification PCR des échantillons conservés à -20°C
Des fragments PCR sont observables pour 18 des 20 brebis. L’amplification PCR a donc fonctionné et même mieux que lorsqu’elle a été faite avant congélation (16/20). Il est donc possible d’utiliser les écouvillons après leur conservation à -20°C et cela améliore peut-être l’accessibilité à l’ADN, en cassant les cellules par le froid.
4.2. Génotypage de la mutation R96C à partir de lait et biopsie d’oreille
Des essais avec le lait ont été faits précédemment dans l’équipe, mais ont été peu approfondis. L’information issue de ces premiers tests était de faire une dilution du lait. J’ai donc réalisé différentes dilutions, du pur au 1 000ème, des 24 échantillons de lait et réalisé les
PCR « Terra » pour l’amplification du locus du gène SOCS2. Comme le montre la figure 17, nous observons des résultats assez aléatoires, mais certains échantillons permettent toujours de visualiser un produit PCR. On observe également que la dilution au 1 000ème est peut-être trop importante. Pour les tests de génotypage, j’ai choisi la dilution au 100ème qui permet des
amplifications correctes et qui limite la présence de trop fortes concentrations de protéines du lait qui pourraient gêner.
Figure 17 : Gel d’agarose 1% après PCR pour différents essais sur lait
En complément des échantillons de lait, j’ai également utilisé des ADN génomiques purifiés préalablement obtenus par l’équipe à partir de biopsies d’oreille, et j’ai aussi utilisé des fragments de biopsie traités au NaOH pour le protocole sans extraction d’ADN.
Suite à la PCR sur les biopsies NaOH et sur l’ADN, j’ai obtenu les résultats présentés sur la figure 18 :
Figure 18 : Gel d’agarose 1% des produits PCR issus des échantillons de biopsie et d’ADN pour le locus SOCS2
Les 24 échantillons d’ADN ont bien été amplifiés, ce qui est normal, l’ADN étant notre témoin. Nous voyons que 100% des échantillons de biopsie d’oreille traités au NaOH ont eux aussi été amplifiés et qu’ils peuvent par conséquent permettre de génotyper les animaux. Ainsi, j’ai réalisé la digestion enzymatique MboII pour le génotypage RFLP sur gel d’agarose de la mutation R96C sur tous les produits de PCR. Le résultat est présenté dans la figure 19.
Figure 19 : Gel d’agarose 3% obtenu après la digestion des produits de PCR par l’enzyme MboII
Lorsque l’animal a le génotype (+/+), on observe une bande à 343 paires de bases (pb) et une à 225pb, en effet l’enzyme MboII coupe l’allèle sauvage. Si l’animal est muté homozygote (génotype M/M), on observe une seule bande à 560 pb. Si l’animal est hétérozygote (génotype M/+), on observe 3 bandes : une à 560 pb, une à 343pb et une à 225 pb. Les échantillons d’ADN et de biopsie ont bien été digérés et les fragments sont lisibles. En revanche, sur le lait, nous observons quelques bandes de faible intensité, ce résultat reste peu concluant car le résultat obtenu avec les échantillons de lait est très peu lisible.Si l’on récapitule les résultats dans le tableau 4, on peut conclure que le génotypage sans extraction d’ADN à partir de biopsies d’oreille traitées au NaOH est efficace et fiable à 100% pour la mutation R96C.
Tableau 4 : Tableau des résultats des génotypes attendus et obtenus pour les échantillons de biopsie et d’ADN
Toutefois, le génotypage sur lait reste peu concluant dû à des amplifications PCR aléatoires et assez faibles. Par conséquent les signaux sur gels pour analyser le génotypage RFLP ne nous permettent généralement pas de conclure sur le génotype des animaux. Cependant nous remarquons qu’une partie des animaux portant l’allèle muté, et donc qui sont plus sensibles à la mammite, sont parmi les échantillons qui ont amplifié. Comme dit précédemment, la mammite est une maladie de la mamelle qui induit une augmentation du nombre de cellules dans le lait. Il semble donc cohérent que les animaux sensibles à la mammite amplifient puisque que leur lait est potentiellement plus riche en cellules. Le protocole de génotypage sans extraction sur le lait sera très difficile à améliorer pour obtenir 100% de génotypage si l’amplification est dépendante de ce paramètre.
Il est également important de noter que si après quelques mises au point le lait permet de génotyper un animal, il aura pour limite de ne permettre de génotyper que des individus femelles.
Animal Race Génotype attendu au locus R96C Génotype ADN Génotype Biopsie Génotype lait
1 16286882367 Lacaune lait +/M +/M +/M ?/? 2 16286882381 Lacaune lait +/M +/M +/M +/M 3 16286882393 Lacaune lait M/M M/M M/M +/M 4 16286882478 Lacaune lait +/+ +/+ +/+ +/+ 5 16286882162 Lacaune lait M/M M/M M/M ?/? 6 16286882180 Lacaune lait M/M M/M M/M M/M 7 16286882453 Lacaune lait +/M M/? +/M M/M 8 16286882484 Lacaune lait +/+ +/+ +/+ ?/? 9 16286882343 Lacaune lait +/+ +/+ +/+ ?/? 10 16286882438 Lacaune lait M/M M/M M/M +/+ 11 16286882355 Lacaune lait +/M +/M +/M +/+ 12 16286882262 Lacaune lait +/+ +/+ +/+ +/+ 13 16286882405 Lacaune lait +/M +/M +/M ?/? 14 16286882166 Lacaune lait M/M M/M M/M ?/? 15 16286882177 Lacaune lait +/M +/M +/M +/+ 16 16286882244 Lacaune lait M/M M/M M/M ?/? 17 16286882285 Lacaune lait +/+ +/+ +/+ ?/? 18 16286882095 Lacaune lait M/M M/M M/M ?/? 19 16286882299 Lacaune lait +/+ +/+ +/+ ?/? 20 16286882469 Lacaune lait +/+ +/+ +/+ ?/? 21 16286882049 Lacaune lait +/M +/M +/M ?/? 22 16286882039 Lacaune lait +/M +/M +/M ?/? 23 16286882064 Lacaune lait M/M M/M M/M ?/? 24 16286882009 Lacaune lait +/+ +/+ +/+ +/+
4.3. Génotypage de la mutation FecXN à partir de sperme et de sang
Afin de tester la faisabilité du génotypage sans extraction d’ADN sur le sperme, nous avons fait la demande de sperme de béliers auprès d’un centre d’insémination artificiel de la race Blanche du Massif Central. Nous avons reçu des paillettes de sperme de 6 béliers de génotype connu à la mutation FecXN, 3 +/Y et 3 M/Y. Comme pour le lait, j’ai réalisé des dilutions préalables dans du NaCl 9% (du 10ème au 10 000ème) pour les amplifications PCR « Terra » du locus FecX sur sperme. Nous avions déjà des tubes de sang uniquement pour 5 de ces béliers que j’ai testés en même temps (Figure 20).
Figure 20 : Gel d’agarose 1% des produits PCR « Terra » sur sperme dilué et sur sang
Nous remarquons que l’amplification PCR sur sang a très bien fonctionné. Les amplifications sur sperme dilué au 1 000ème et au 10 000ème ont bien fonctionné également excepté pour un échantillon à chaque fois, mais pas le même, ci qui indique peut-être un problème lors du protocole. La dilution au 10ème ainsi que le sperme non dilué ont peu fonctionné, expliqué peut-être par la présence de trop de cellules (spermatozoïdes) et de protéines du sperme qui inhiberaient la PCR. L’amplification au 100ème est la dilution de sperme
qui a le mieux fonctionné. Cependant, sur la figure 20 on observe des bandes parasites pour les PCR sur sperme à un poids moléculaire supérieur au fragment PCR attendu, mais qui ne devraient pas gêner pour l’interprétation du génotypage RFLP.
J’ai réalisé le génotypage de la mutation FecXN par RFLP après digestion des produits
de PCR « Terra » avec l’enzyme MseI et analyse sur gel d’agarose (Figure 21) en parallèle du génotypage sur ADN purifié.
Figure 21 : Gel d’agarose 3% après la digestion des échantillons d’ADN, de sang et de sperme dilué
Lorsque nous observons des fragments à 190 et 151 pb, cela signifie que l’animal a le génotype +/Y, en effet l’enzyme MseI coupe lorsque l’allèle est non muté. Si on observe un fragment à 341 pb, cela signifie que l’enzyme n’a pas coupé le fragment de PCR et que l’animal a pour génotype M/Y.
Dans le tableau récapitulatif (Tableau 5) nous observons des génotypes identiques pour les échantillons sanguins ainsi que pour l’ADN et conformes avec ce que l’on attendait. Cela nous confirme une nouvelle fois que l’approche directe sur le sang est belle est bien fiable lors des génotypages. Toutefois, pour le sperme dilué au 100ème, sur l’échantillon 1, on devine que le génotype correspond au témoin (échantillon ADN) mais pour les 4 autres échantillons, le génotype de l’animal est peu lisible.
Tableau 5 : Tableau présentant les génotypes attendus et obtenus des béliers
Animal Race Couleur de paillette Génotype attendu au locus FecX Génotype ADN Génotype Sang Génotype sperme
1 35571071032 Blanche du Massif Central Blanc Y/+ Y/+ Y/+ Y/+ 2 32502572126 Blanche du Massif Central Jaune Y/+ Non déterminé Non déterminé Non déterminé 3 34513671049 Blanche du Massif Central Bleu Y/+ Y/+ Y/+ Y/M 4 18500461059 Blanche du Massif Central Rose Y/M Y/M Y/M Y/M 5 32501972308 Blanche du Massif Central Rouge Y/M Y/M Y/M Y/M 6 32503771299 Blanche du Massif Central Vert Y/M Y/M Y/M M/M
Le génotypage à partir de sperme dilué est possible mais il reste encore à être amélioré en particulier en améliorant les conditions de PCR qui donnent des bandes parasites. Cela est dû à des amplifications non spécifiques, c’est-à-dire que l’amorce s’est hybridée sur une mauvaise partie de l’ADN. Afin de résoudre ce problème, deux solutions s’offrent à nous : changer d’amorce ou modifier la température. J’ai opté pour la seconde option : faire à nouveau une PCR avec des températures d’hybridation différentes de la première. J’ai obtenu le résultat présenté dans la figure 22.
Figure 22 : Gel d’agarose 1% après PCR sur sperme dilué au 100ème et test de différentes températures d’hybridation (Tm)
Malgré le changement de température d’hybridation des amorces, les bandes parasites sont toujours observables. Il faudra donc trouver d’autres paramètres à améliorer.
Conclusion générale
Les objectifs de mon stage étaient de mettre au point les techniques de génotypage sans extraction de l’ADN afin de voir si cette méthode est aussi fiable qu’en utilisant de l’ADN purifié. J’ai pu constater à travers mon stage que la méthode de génotypage sans extraction de l’ADN à l’aide d’un kit d’amplification PCR « Terra » fonctionne très bien sur le sang et sur les biopsies d’oreille traitées au NaOH. En effet, avec seulement 1µl de ces deux supports biologiques on peut génotyper tous les animaux testés avec une fiabilité de 100%. Pour pallier à l’utilisation de ces échantillons obtenus de façon invasive (piqure, emporte-pièce), j’ai pu également vérifier la faisabilité de l’utilisation de ce kit avec des échantillons buccaux de salive, en utilisant la méthode que nous avons mise au point soit dans du NaCl 0,9% soit dans du NaOH, ce dernier traitement semblant être le plus efficace. Cependant, sur des supports tels que le sperme et le lait, quelques ajustements sont encore à faire. En effet, sur le sperme, quelques bandes parasites sont observables et avec le lait, l’intensité des fragments est faible et les amplifications sont aléatoires.
Comme indiqué ci-dessus, ce stage m’a également permis de tester si l’on peut génotyper des animaux grâce à des supports biologiques obtenus de façon moins invasive que le sang ou les biopsies. Les supports de type écouvillon permettent d’obtenir un génotypage auquel on peut se fier, de plus ce type d’échantillon permet de faire des prélèvements dans des exploitations non expérimentales avec le simple consentement de l’éleveur, ce qui représente une charge administrative moins lourde puisque le protocole n’a pas à être validé par le comité d’éthique. En revanche, la méthode de prélèvement buccal semble désagréable pour l’animal qui se débat et ce qui rend le prélèvement compliqué et long sur un nombre conséquent d’animaux. Ainsi dans le cadre du génotypage d’un nombre important d’animaux, le prélèvement à privilégier reste certainement la prise de sang. Les échantillons buccaux, de sperme ou de lait donnent des pistes encourageantes mais doivent être encore mises au point, d’un point de vue technique pour le sperme et le lait, et d’un point de vue bien-être animal pour le prélèvement de salive.
Réaliser ce stage au sein de l’équipe GenROC m’a permis d’acquérir des connaissances et des compétences pratiques en génétique moléculaire. Ce stage m’a également permis de prendre conscience de la réalité du monde du travail au sein d’un laboratoire en m’impliquant dans un projet et en ayant les responsabilités qui en découlent sur l’organisation du travail, l’autonomie, la réalisation d’un cahier de laboratoire, et la présentation des résultats à l’oral lors des réunions d’équipe et pour la réalisation de ce rapport.
Bibliographie
The Highly Prolific Phenotype of Lacaune Sheep Is Associated with an Ectopic Expression of the B4GALNT2 Gene within the Ovary.
Drouilhet, L. ; Mansanet, C. ; Sarry, J. ; Canale-Tabet, K. ; Bardou, P. ; Woloszyn, F. ; Lluch, J. ; Harichaux, G. ; Viguie, C. ; Monniaux, D. ; Bodin, L. ; Mulsant, P. ; Fabre, S.
Plos Genetics, 2013, 9 (9) : e1003809. DOI10.1371/journal.pgen.1003809
A point mutation in suppressor of cytokine signalling 2 (Socs2) increases the susceptibility to inflammation of the mammary gland while associated with higher body weight and size and higher milk production in a sheep model
Rupp, R. ; Senin, P. ; Sarry, J. ; Allain, C. ; Tasca, C. ; Ligat, L. ; Portes, D. ; Woloszyn, F. ; Bouchez, O. ; Tabouret, G. ; Le Bastard, M. ; Caubet, C. ; Foucras, G. ; Tosser-Klopp, G. Plos Genetics, 2015, 11 (12) : 1-19. DOI 10.1371/journal.pgen.1005629
Etude du gène BMP15 et de la mutation FecXN à effet majeur sur la prolificité des brebis Noire du Velay
Chantepie, L.
Mémoire. Ecole d'Ingénieurs en Agriculture. 2016. 41.p
Genome-wide identification of a regulatory mutation in BMP15 controlling prolificacy in sheep L. Chantepie, L. Bodin, J. Sarry, F. Woloszyn, F. Plisson-Petit, J. Ruesche, L. Drouilhet and S. Fabre
(En cours de rédaction)
https://agriculture.gouv.fr/animaux-utilises-des-fins-scientifiques https://www.futura-sciences.com/sante/définitions/genetique-genetique-152/ https://www.futura-sciences.com/sante/définitions/medecine-adn-87/ www.larousse.fr www.linternaute.fr www.inra.fr
Lexique
Allèle : version d’un gène.
Acide nucléique : ADN (Acide DésoxyriboNucléique) ou ARN (Acide RiboNucléique).
Fragment de restriction : produit de la digestion.
Gène : unité définie sur un chromosome, grâce à laquelle se transmet un caractère héréditaire.
Génome : ensemble de l’information génétique portée par les chromosomes.
Génomique : ce qui concerne le génome.
Génotype : ensemble de l’information polymorphique (= désigne la coexistence de plusieurs allèles pour un gène donné).
Intron : partie non codante d’un gène.
Locus : localisation d'un gène sur un chromosome.
Marqueur génétique : gène ou séquence polymorphe d'ADN facilement détectable grâce à un emplacement connu sur un chromosome.
Mutation : modification survenant dans la séquence de l’ADN d’une cellule et pouvant entrainer la disparition d’un caractère préexistant ou l’apparition d’un caractère nouveau.
Nucléoprotéine : substance qui résulte de l'association d'une protéine avec un acide nucléique.
Nucléotide ou base azotée : constituant de l’ADN (Acide DésoxyriboNucléique) et de l’ARN (Acide RiboNucléique).
PCR : technique d’amplification de l’ADN
Polymorphe : qui peut se présenter sous des formes différentes.
Protéine : grosse molécule complexe d'acides aminés, constituant essentiel des matières organiques et des êtres vivants.
Ruminant : mammifère dont l'estomac complexe permet de mâcher de nouveau des aliments revenus de l'estomac, avant de les avaler.
SNP (Single Nucleotide Polymorphism) : variation mineure du génome dans laquelle un seul nucléotide est modifié.
Table des abréviations
ADN : Acide DésoxyriboNucléique M : Muté
Pb : paire de base
PCR : Polymorphism Chain Reaction
RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism SNP : Single Nucleotide Polymorphism
Table des illustrations
Figure 1 : Localisation de l’INRA Occitanie Toulouse en France (page 4)
Figure 2 : Comparaison des 2 protocoles avec et sans extraction de l’ADN (page 6) Figure 3 : Kit de prélèvement sanguin et tubes remplis de sang (page 8)
Figure 4 : Pince TSU (Allflex), Biopsie d’oreille (page 9) Figure 5 : Ecouvillon pour prélèvement buccal (page 9)
Figure 6 : Flacons de lait prélevés sur le site de La Fage (page 10) Figure 7 : Paillettes utilisées lors des génotypages sur sperme (page 10)
Figure 8 : Dilution allant du sperme non dilué au sperme dilué au 1 000ème dans des tubes Eppendorf (page 12)
Figure 9 : Thermocycleurs (page 14)
Figure 10 : Schéma de l’amplification PCR (page 14)
Figure 11 : Coupure de l’ADN par les différentes enzymes utilisées (page 16) Figure 12 : Séquenceur Applied biosystem 3730 (page 17)
Figure 13 : Photo du gel d’agarose 1% pour les produits PCR (page 19)
Figure 14 : Gels d’agarose 1% des produits de PCR issus du second essai avec les écouvillons dans les différentes conditions de prélèvement (page 20)
Figure 15 : Présentation des résultats de génotypage pour 2 animaux de génotypes différents (page 21)
Figure 16 : Gel d’agarose 1% obtenu après l’amplification PCR des échantillons conservés à -20°C (page 23)
Figure 17 : Gel d’agarose 1% après PCR pour différents essais sur lait (page 24)
Figure 18 : Gel d’agarose 1% des produits PCR issus des échantillons de biopsie et d’ADN pour le locus SOCS2 (page 24)
Figure 19 : Gel d’agarose 3% obtenu après la digestion des produits de PCR par l’enzyme MboII (page 25)
Figure 20 : Gel d’agarose 1% des produits PCR « Terra » sur sperme dilué et sur sang (page 27)
Figure 21 : Gel d’agarose 3% après la digestion des échantillons d’ADN, de sang et de sperme dilué (page 28)
Figure 22 : Gel d’agarose 1% après PCR sur sperme dilué au 100ème et test de différentes températures d’hybridation (Tm) (page 29)
Tableau 1 : Tableau des différents supports biologiques à disposition pour chaque animal (page 13)
Tableau 2 : Tableau présentant les différentes amorces utilisées selon la mutation étudiée (page 13)
Tableau 3 : Tableau présentant les résultats obtenus et attendus pour les écouvillons, le sang et l’ADN (page 22)
Tableau 4 : Tableau des résultats des génotypes attendus et obtenus pour les échantillons de biopsie et d’ADN (page 26)
Annexes
Annexe 2 : Protocole du gel d’agarose
- Ajouter dans un erlenmeyer du TAE (Tris Acétate EDTA) ainsi que de l’agarose ; choisir les volumes et poids en fonction de la concentration voulue, à noter que plus le gel est concentré, plus ses mailles seront denses et plus les grands fragments migreront lentement
- Faire chauffer au micro-ondes jusqu’à homogénéisation
- Faire refroidir sous hotte dans l’eau froide, puis ajouter 2 gouttes de BET (Bromure d’éthidium) [0,7 mg/mL] ; le BET est un agent intercalant de l’ADN et est donc à manipuler avec des Equipements de Protection Individuelle (EPI), c’est-à-dire une blouse et des gants, et sous une hotte
- Couler ensuite le gel dans un plateau, puis ajouter des peignes qui vont servir à la formation des puits de dépôt
- Laisser le gel polymériser, puis retirer délicatement les peignes
- Déposer le gel dans une cuve contenant du TAE 1X, puis déposer les échantillons auxquels ont été ajoutés un tampon de dépôt (bleu agarose + rouge de crésol + eau) à raison de 10 µL par puit. Ce Tampon permet d’alourdir le produit PCR pour qu’il aille bien au fond des puits. Il est également nécessaire d’ajouter un marqueur de taille dans un puit de chaque ligne de manière à vérifier la taille des amplifications par rapport à celle attendue.
- Brancher la cuve à un générateur à 180 Volts pour que les échantillons migrent. L’ADN étant chargé négativement, il faut brancher le générateur de façon à ce que l’ADN se déplace vers le pôle positif ; laisser migrer 45 minutes environ
- Récupérer le gel après avoir éteint le générateur puis poser le gel sur une plaque UV afin de visualiser l’ADN ; à savoir que plus les fragments d’ADN sont grands, plus ils migreront lentement.
Résumé
Le génotypage consiste en la détermination d’allèles à un locus donné. Lorsqu’il est fait à partir d’ADN extrait, il est onéreux et long. C’est pour cette raison que mon sujet de stage a porté sur la mise au point de techniques de génotypage sans extraction préalable de l’ADN. J’ai obtenu plusieurs supports biologiques chez le mouton (sang, biopsie d’oreille) sur lesquels j’ai vérifié que la méthode de génotypage sans extraction de l’ADN est aussi fiable que la méthode avec de l’ADN obtenu par extraction. J’ai également cherché à tester cette approche de génotypage sur les tissus prélevés de façon moins invasive (salive, lait, sperme). Les essais réalisés sur les échantillons de salive obtenus à l’aide d’écouvillons buccaux permettent de réaliser un génotypage fiable et offre une alternative au prélèvement de sang et à la biopsie. En revanche, certains supports biologiques, comme le lait ou le sperme, nécessitent encore quelques mises au point.
Mots clés : ADN, génotypage, allèle, échantillons biologiques
Summary
Genotyping is the determination of the alleles at a given locus. When it is performed with extracted DNA, it is expensive and time consuming. That is the reason of the subject of my internship. I had to develop direct genotyping methods without DNA extraction. I obtained different ovine biological tissues such as blood samples and ear biopsies, in order to validate the genotyping method without DNA extraction. I found this direct method as reliable as the method with DNA extraction on this kind of samples. I have also tried to figure out how we can use this method on other tissues sampled in a less invasive way (saliva, milk and sperm). Experiments done with saliva have given very reliable genotyping results. However, milk or sperm samples needs some improvements.