Article original
Contribution a` l’e´tude de l’enzyme glyce´ralde´hyde-3-phosphate de´shydroge´nase chez des sujets atteints de diabe`te type 2
Contribution to the study of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in patients with type 2 diabetes
N. Senhaji, B. Elkhalfi, A. Soukri *
Laboratoiredephysiologieetge´ne´tiquemole´culaire,faculte´ dessciencesAinChock,Km8RouteEljadidaBP5366Maarif,Casablanca20100,Maroc
1. Introduction
Aujourd’hui, toutes les e´tudes s’accordent a` dire que les maladiesme´taboliquesetnutritionnelleseta` leurteˆtelediabe`te sontentraindeprendredesproportionsalarmantes.Eneffet,en INFO ARTICLE
Historiquedel’article: Rec¸ule7septembre2013 Accepte´ le19mars2014 Motscle´s:
GAPDH Diabe`tetype2 E´rythrocytes Band3
Keywords:
GAPDH Type2diabetes Erythrocytes Band3
RE´ SUME´
Lediabe`teestreconnucommeunproble`memajeurdesante´ publique,responsabled’unemorbidite´ et d’unemortalite´ pre´cocesavecunepre´valenceplane´taireenpermanenteaugmentation.Lediabe`tede typeII,anciennementappele´ diabe`tenoninsulino-de´pendant,repre´senteenviron90%del’ensembledes formesdediabe`teetsecaracte´risepardesanomaliesquiaffectentl’insulino-se´cre´tionetl’actionde l’insuline et par conse´quent, induit une hyperglyce´mie. L’objectif de ce travail consiste a` e´tudier l’implicationd’uneenzymecle´ delaglycolyse,laglyce´ralde´hyde-3-phosphatede´shydroge´nasedansle diabe`tedetype2.Cetravailcomprendunee´tudebiochimique,cine´tiqueetl’e´tudedel’expressiondela GAPDHchezdessujetsatteintsdudiabe`tedetype2.Autermedenotree´tude,onapuclasserlessujets diabe´tiquesendeuxcate´gories:lapremie`recomprenantdessujetschezlesquelleslaGAPDHposse`de uneactivite´ spe´cifiqueetunprofile´lectrophore´tiquesemblableauxsujetssains,etladeuxie`mechez laquelleonnoteuneinhibitiondelaGAPDH.Nosre´sultatssugge`rentquechez60%denossujetsatteints dediabe`tedetype2,onassistea` uneinhibitionre´versibledelaGAPDHme´die´eprobablementparune interactionioniquedecettedernie`reaveclaprote´inemembranairee´rythrocytaire,band3.
ß2014ElsevierMassonSAS.Tousdroitsre´serve´s.
ABSTRACT
Diabetesisrecognizedasamajorpublichealthproblemresponsibleforearlymorbidityandmortality withaworldwide prevalencein permanentincrease. ThetypeII diabetesonce callednon-insulin dependent diabetes, accounts for about 90 % of all forms of diabetes and is characterized by abnormalitiesthataffectinsulinsecretionandinsulinactionandthus,induceshyperglycemia.Theaim ofthisworkistostudytheinvolvementofakeyenzymeofglycolysis,glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenaseintype2diabetes.Thisworkincludesabiochemical,kineticstudies,andthestudyofthe expressionofGAPDHinsubjectswithtype2diabetes.Fromourstudy,wecouldclassifythediabetic subjectsintotwocategories:thefirstone,consistingofsubjectsinwhomGAPDHhasaspecificactivity andanelectrophoreticprofilesimilartohealthysubjects,andthesecondone,inwhichthereisan inhibitionofGAPDH.Ourresultssuggestthat,in60%ofourpatientswithtype2diabetes,areversible inhibitionofGAPDHisobserved.Thisinhibitionisprobablymediatedbytheionicinteractionwiththe erythrocytemembraneprotein,band3.
ß2014ElsevierMassonSAS.Allrightsreserved.
* Auteurcorrespondant.
Adressese-mail:ab.soukri@gmail.com,a_soukri@hotmail.com(A.Soukri).
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ScienceDirect
www.sciencedirect.com
http://dx.doi.org/10.1016/j.patbio.2014.03.002
0369-8114/ß2014ElsevierMassonSAS.Tousdroitsre´serve´s.
2001,lenombredediabe´tiquese´taite´value´ a` 177millions[1]et l’OMSpre´voitunepopulationde366millionsdediabe´tiquespour 2030[2].
Ve´ritable e´pide´miemondiale,commele de´critl’Organisation mondiale de la sante´, le diabe`te est la premie`re maladie non transmissiblereconnueparlesNationsuniescommeunemenace pourlasante´ mondialeaussigravequelese´pide´miesinfectieuses, tellesquelepaludisme,latuberculoseetlesida[3].
AuMaroc,latendancedelapre´valencedudiabe`teestpasse´ede 6,1 % en 2003 a` 10,3 % en 2009 [4]. L’enqueˆte mene´e par le ministe`redelaSante´ amontre´ unepre´valenceglobaledudiabe`te de6,6%chezlespersonnesaˆge´esde20ansetplus(4,7–8,6%chez leshommeset5,1–8,1%chezlesfemmes) Cettepre´valenceest diffe´renteselonlemilieu:9,0%(7,1–10,8%)enmilieuurbainet 4,4%(3,0–5,8%)enmilieurural[4].
Lediabe`tesucre´ repre´senteuneaffectionchroniquere´sultant de nombreux facteurs, environnementaux ou ge´ne´tiques, qui agissentleplussouventensemble[5].Ilestde´finiparunde´sordre me´taboliqued’e´tiologiesdiverses,quisepre´sentehabituellement accompagne´ d’une perturbation des me´tabolismes glucidique, lipidiqueetprote´ique,re´sultantd’unde´fautdese´cre´tiond’insu- line, de son activite´ ou des deux associe´es, provoquant une augmentation de la glyce´mie qui conduit aux complications diabe´tiques.
Lediabe`teprovoqueunevarie´te´ dechangementspathologiques danslesarte`res,lescapillairesetlesnerfspe´riphe´riques.Plusieurs e´tudesont montre´ qu’il existeune forte relation entrele taux d’hyperglyce´mie et a` la fois, l’apparition et la progression des complications microvasculaires diabe´tiques dans la re´tine, les reins et les nerfs pe´riphe´riques [6–8]. L’hyperglyce´mie semble aussi avoir un roˆle important dans la pathogene`se du diabe`te macrovasculaire[7,8].
L’hyperglyce´miechronique[9]s’accompagned’uneaugmenta- tion de l’entre´e cellulaire de glucose. L’augmentation de la glycolyse ae´robie est responsable d’une augmentation de la productionderadicauxlibresoxyge´ne´s[10]parlamitochondrie quiactivelaPARP(Poly-(ADPribose)-polyme´rase)ets’accompagne d’uneaccumulationdeme´tabolitesinterme´diairesdelaglycolyse quisede´tournentversquatrevoiesme´taboliquesde´le´te`respourla cellule:l’activationdelaPKC(prote´inekinaseC)vialeDAG(Diacyl glyce´rol) ; la synthe`se de me´thylglyoxal qui conduit a` une productionrapided’AGEs;l’activationdelavoiedeshexoamines (quiconduita` laformationd’UDP-nacetylglucosamine)etcelledu sorbitol.
Laglyce´ralde´hyde-3-phosphate de´shydroge´nase (GAPDH)est l’unedesenzymescle´sdelaglycolyselesmieuxcaracte´rise´esau niveaubiochimiqueetstructural[11–14].Ellecatalysel’oxydation phosphorylantere´versibleduD-glyce´ralde´hyde-3-phosphate(D- G3P)enacide1,3-diphosphoglyce´rique(1,3dPG)enpre´sencedu NAD(H)commecofacteur.
LaGAPDHintervientdanslaglycolyse,lecycledeKrebsetla voiedespentosesphosphate,intervenantainsidanslestroisvoies dume´tabolismecentralducarbone[15].Endehorsdesafonction glycolytique la GAPDH phosphorylante pre´sente des activite´s diverses selon sa localisation membranaire, cytoplasmique ou nucle´aire[16,17].
Unese´ried’investigationsamontre´ l’implicationdelaGAPDH dans divers me´canismes et pathologies : l’apoptose, le stress oxydatif,lesmaladiesneurode´ge´ne´ratives,lecancer...[18].
Danslebutd’e´luciderl’implicationdesenzymesglycolytiques danslediabe`tedetype2,«diabe`tenoninsulino-de´pendant»,on s’est inte´resse´ a` l’e´tude d’une enzyme cle´ de la glycolyse, la glyce´ralde´hyde-3-phosphatede´shydroge´nase(GAPDH).Cetravail comprend une e´tude biochimique, cine´tique et l’e´tude de l’expressiondelaGAPDHchezdessujetsatteintsdudiabe`tede type2.
2.Mate´rieletme´thodes 2.1.1.Mate´riel
Lesexpe´rienceseffectue´eslorsdecettee´tudeonte´te´ re´alise´esa` partirdusangfrais, provenantd’untotalde27sujetsrecrute´saucentredepre´le`vementauCHUde Casablancaeta` l’InstitutPasteurduMaroc(IPM),dont16diabe´tiqueset11sujets sains.Pourchaquesujet,4mLdusangpe´riphe´riqueonte´te´ pre´leve´ssuruntubeEDTA.
2.2.Me´thodes
2.2.1.Obtentiondel’extraitenzymatique
2.2.1.1.Traitement du sang.On proce`ded’aborda` une centrifugation (2500g, 15min)del’e´chantillonsanguinafind’obtenirunese´parationentroiscouches distinctes.Ensuite,one´limineleplasmaetlesglobulesblancsparaspiration.On proce`dealorsaulavagedeshe´matiesaveclese´rumphysiologique(NaCl0,9%).
2.2.1.2.Lysedeshe´maties.Cinqvolumesd’eaudistille´eglace´eonte´te´ ajoute´sau culotglobulairelave´ etconserve´sa` 48Cpendant10min.L’extraitprote´iquebrutest obtenuapre`scentrifugationa` 13200gpendant30min.
2.2.1.3.De´gradationdelamembrane.Unagentlytiquedese´rythrocytes(Quaterna- ryAmmoniumSalts:19–26g/L.Isopropanol:1–2%.Potassiumcyanide:0,15–
0,5g/L)ae´te´ ajoute´ auculotglobulairelave´ poureˆtreensuitecentrifuge´ a` 13200g pendant30min.
L’extraitprote´iquebrut,obtenuparlesdeuxme´thodesdelyse,serviraa` l’e´tude biochimiquedelaGAPDH.
2.2.1.4.Isolement desmembranesdes he´maties.Lesmembranessont pre´pare´es selonlame´thodedeDodgeetal.modifie´e[19].Apre`slysedesglobulesrougeset apre`scentrifugation,leculotcontenantlesmembranese´rythrocytairesestlave´
dansletamponphosphate[0,05M,pH5,8].Unefoisquelesurnageantdevient incolore,onarreˆteleslavages,onl’e´limineetonresuspendleculotdansun tamponphosphate(0,01MpH8,0),onincube1ha` 48C,apre`soncentrifugeafin d’e´liminerl’he´moglobinedesmembranes.Puis,onleslave3foisavecdutampon phosphate(0,005M,pH8,0).
2.2.1.5.Solubilisationdesprote´inesmembranaires.Reprendreleculotmembranaire dansletampon[Tris–HCl,0,1M,EDTA5mM,pH9,0],refroidia` 48C,me´langer doucement,puisincuberletoutpendant2ha` 48Cetcentrifugationa` 13200g pendant15min.
Lessurnageantsetculotsservirontaudosagedesprote´ines,a` lade´termination del’activite´ enzymatiqueeta` l’e´lectrophore`seenconditionsde´naturantes(SDS- PAGE).
Remarque:touteslesproce´duresonte´te´ effectue´esa` 4–58Cettoutesles solutionsutilise´espourcettepre´parationsontpre´alablementporte´esa` 48C.
2.2.2.E´tudebiochimiquedelaGAPDH
2.2.2.1.Dosagedesprote´inestotales.Lesprote´inesonte´te´ quantifie´essuivantla techniquedeBradford[20].Danslapre´sentee´tude,laBSA(BovinSerumAlbumine) estutilise´ecommeprote´inestandard.
2.2.2.2.De´terminationdel’activite´ delaGAPDHphosphorylanteNAD+de´pendante. - L’activite´ enzymatique de la GAPDH phosphorylante NAD+ de´pendante est de´termine´eparspectrophotome´triea` 258Cenmesurantl’apparitionduNADHa`
340nm[21].
Lare´actionenzymatiqueae´te´ initie´eparadditionde5a` 10mLdelapre´paration enzymatiqueaume´langere´actionnelcontenantletamponTricine-NaOH50mM (pH8,5), le NAD+ 10mM, le DL-G3P 1mM et l’Arsenate de sodium 10mM (Na2HASO4).
LeDL-G3PestobtenuparhydrolyseacideduseldisodiqueDL-glyceraldehyde-3- phosphatediethylace´talsuivantlesindicationsdufournisseur(Sigma).
Danslare´actionsuivie,lesubstrat(G-3-P)donnedu1,3bisphosphoglyce´rate tout en consommant du NAD+. La variation d’absorption mesure´e a` 340nm (spectrophotometermodel6405,Jenway,Dunmow,UK)corresponda` ladiminution delaconcentrationencofacteur(NAD+).
2.2.2.3.E´lectrophore`seenconditionsde´naturantes(PAGE-SDS).Lesprote´inesonte´te´
se´pare´espare´lectrophore`severticalesur geldepolyacrylamide12%(w/v)en conditionsde´naturantesenpre´sencedusodiumdodecylsulfate(SDS-PAGE)selon lame´thodede´criteparLaemmli[22]l’e´lectrophore`seestre´alise´edansunappareil: mini-protean-II(Bio-Rad)adapte´ pourmini-gel(810cm),avecdescalesd’une e´paisseurde0,75mmenutilisantlemarqueurdepoidsmole´culaire(SDS-PAGE MolecularWeightStandards,BroadRange,Bio-Rad).
2.2.2.4.Immunode´tectionparWesternblot.L’Immunode´tectionae´te´ effectue´eapre`s e´lectrophore`se sur gel de polyacrylamide SDS-12 %. Les prote´ines ont e´te´
transfe´re´essurunemembranedenitrocellulose(Schleicher&Schuell,Keene,E´tats- Unis)parlatechniqueduwesternblot[23].Letransfertestre´alise´ a` l’aidedu syste`me de transfert Bio-Rad Trans-Blot. La membrane est pre´alablement e´quilibre´e dans le tampon de transfert Tris–HCl 25mM (pH8,3), glycine 192mM,SDS1,3mMetleme´thanol20%(v/v).Apre`ss’eˆtreassure´ del’efficacite´
dutransfert,lamembraneestincube´edansunesolutiondeBSAa` 5%(p/v)en pre´senced’azidedesodiuma` 0,05%(p/v)sousagitationdoucependantunenuita`
tempe´ratureambiante.Parlasuite,lamembraneestlave´eauTBSTris–HCl20mM (pH7,5),NaCl150mMpuisincube´ependant2hsousagitationenpre´sencede l’anticorpspolyclonalmonospe´cifiqueprimairedilue´ au1:500dansleTBS.Apre`s 4lavagesde15minchacunavecleTBSt(TBScontenantleTween-20a` 0,05%(v/v), lamembraneestincube´ependant1havecl’anticorpssecondaire(AticorpsAnti-IgG delapinconjugue´ a` laperoxydase,SIGMA)a` unedilutionde1/1000dansduTBSt.
Ensuite,lamembraneestlave´eavecleTBSt3foispendant15min,puisrince´e avecleTBSpendant15min,elleestensuitere´ve´le´edansunesolutionde12mgde 4-chloro-1-naphtoldissousdans4mLdeme´thanol,16mLdeTBSet100mLde H2O2a` 30%(v/v).De`squelesbandessombresapparaissent,lare´actionestarreˆte´e parlavagea` l’eaucourante,puis lamembraneestse´che´eentredeuxpapiers Whatman.
3. Re´sultatsetdiscussion
L’objectifde notretravail,e´tant d’e´tudier l’implication dela glyce´ralde´hyde-3-phosphatede´shydroge´nase dansle diabe`te de type2.
Tout d’abord, nous avons proce´de´ au dosage d’activite´ de l’enzymeGAPDHphosphorylanteNAD+de´pendantedansl’extrait brutdese´rythrocytesdessujetssains.
Lamoyenned’activite´ spe´cifiquedelaGAPDHdusurnageant des globules rouges lyse´s par la 1re me´thode (lyse par l’eau), mesure´e chez des sujets sains e´tait de 0,020
m
mol/min/mg de prote´ine.Ils’agittoutdemeˆmed’unefaibleactivite´ compare´ea`cellemesure´edansd’autresorganestelle,danslecerveauouelle estapproximativemente´gale a` 1,8(
m
mol/min/mg de prote´ine) [24].Cette faible activite´ est explique´e par le fait qu’a` l’e´tat physiologiquenormal, 60–70%del’ensembledela GAPDHdes e´rythrocytes se trouve associe´e a` la membrane [25], cette associationinduit une interaction ionique inhibitrice reversible delaGAPDH[26–31].
Parlasuitenousavonsdose´ l’activite´ spe´cifiquedelaGAPDH chezlessujetsdiabe´tiques,leTableau1indiquelesmoyennesdes activite´s spe´cifiques chez les diffe´rents patients pre´sentant un profildiabe´tique.
Selon les re´sultats obtenus, on a pu classer les sujets diabe´tiques,recrute´sdanslapre´sentee´tude,endeuxcate´gories:
une 1recate´gorie quicomprenddes sujetsdiabe´tiques (40%) ayantunemoyenned’activite´ spe´cifiquedelaGAPDHdel’ordre de0,019(U/mgdeprote´ine),pratiquemente´galea` cellemesure´e chezlessujetssains;
etune2ecate´goriequicomprenddessujetsdiabe´tiques(60%) chezlesquelsl’activite´ delaGAPDHestpratiquementnulle.
L’absenced’activite´ chez60%denossujetsdiabe´tiquespeut eˆtre explique´e par plusieurs hypothe`ses parmi lesquelles une associationa` lamembranedes e´rythrocytesquiconcerneraitla majorite´ delafractioncytosoliquedel’enzyme,contrairementa`
l’e´tat physiologique normal ou` on observe un pourcentage d’associationallantde60–70%del’ensembledelaGAPDH.
Cette absence d’activite´ peut eˆtre e´galement due a` une de´fisciencedel’enzymecause´eparl’actiondediffe´rentscompose´s quiexercent des effets viades me´canismes diffe´rents tels que l’oxydationdirectedu NADH, lastimulation dela translocation re´versiblemembrane-cytoplasmique,oul’inductiondelaliaison duNAD+(H)a` l’enzyme[31–38].
Afin de ve´rifier la 1re hypothe`se qui explique l’absence de l’activite´ delaGAPDHparsaliaisona` lamembranee´rythrocytaire, nousavonsproce´de´ a` l’utilisationd’untamponayantunecapacite´
lytiquepermettantainsidelibe´rerlescomposantesmembranaires deshe´matiesende´gradantleurmembrane.
Lamoyenned’activite´ spe´cifiquedelaGAPDH mesure´echez les sujets sains, retrouve´e apre`s de´gradation de la membrane e´rythrocytaireestdel’ordrede0,324U/mgdeprote´ine.Ainsi,on constatequ’onobtientunevaleurseizefoissupe´rieurea` celleobtenu sansde´gradationdelamembranee´rythrocytaire(0,020U/mg).
Cere´sultatrenforcel’ide´equel’enzymedanslese´rythrocytes est souvent associe´e a` la membrane. On peut admettre que la raison de cette association serait la proximite´ d’enzymes glycolytiques comme source d’e´nergie pour le transport actif [39,40].Sachantquesone´lutionpouractivationesttre`ssensibleau pHeta` laforceionique[41].
Parlasuite,nousavonsutilise´ cemeˆmeproce´de´ chezlessujets diabe´tiques,notammentceuxdela2ecate´gorie(60%denossujets diabe´tiques)chezquil’enzymee´taitinhibe´e.
Ainsimontre´ danslaFig.1nousavonsconstate´ quechezles meˆmessujetsquin’avaientpasd’activite´ deGAPDH,onretrouve unemoyenned’activite´ spe´cifiquede0,119(U/mgdeprote´ine),ce re´sultatvientconsolidernotrehypothe`se,sachantqueletampon delyseestunagentlytiquee´rythrocytaire,ayantlacapacite´ de de´grader la membrane des globules rouges, et par conse´quent libe`re les prote´ines membranaires ou celles incorpore´es a` la membrane,son utilisationa puprobablementlibe´rerla GAPDH membranaire,cequinousapermisderetrouveruneactivite´.
Afin de mieux re´pondre, d’une part a` la proble´matique de liaisona` lamembrane,etd’autrepartdanslebutdeconforternos arguments avance´s en ce qui concerne lesdiffe´rentes activite´s observe´eschezlessujetsdiabe´tiques,notammentpourlacate´gorie 2, nous avons effectue´ ungel SDS-PAGEdes diffe´rentsextraits obtenuschezlessujetsdecettecate´gorie.
Lesextraitsprote´iquesde´pose´sonte´te´ pre´alablementdose´spar lame´thodedeBradfordafindede´terminerlaquantite´ deprote´ines a` de´poser. Dans cette e´tude, pour chacune des fractions, nous avonsde´pose´ l’e´quivalentde40
m
gdeprote´ines.La localisation de la bande de la GAPDH a e´te´ ve´rifie´e en utilisantl’anticorpsanti-GAPDHhumainquireconnaituneseule banded’unpoidsmole´culairede36KDa.
Ainsi montre´ dans la Fig. 2, le gel regroupe le profil e´lectrophore´tique des fractions solubleset membranairesobte- nuesapre`slysedesglobulesrougechezlessujetsdiabe´tiquesdela cate´gorie2.
On remarque a` premie`re vue que chez cette cate´gorie de patients,lesfractionsmembranairessontbeaucoupplusrichesen prote´inesquelesfractionscytosoliques.
Il est a note´ qu’en ce qui concerne la GAPDH cytosolique, l’intensite´ de la bande chez les patients de la cate´gorie 1 est similairea` celledessujetssains(re´sultatnonmontre´).Cependant, chez les patients de la 2e cate´gorie, la bande esttre`s faible et pratiquement inexistante, ce qui est en accord avec l’activite´, pratiquementnulle,mesure´echezcettecate´gorie.
Afindeve´rifierladiffe´renced’activite´ obtenueavantetapre`sla de´gradationdelamembrane,nousavonseffectue´ ungelSDS-PAGE Tableau1
Activite´ spe´cifiquedelaGAPDH,apre`slysedesglobulesrouge,chezlessujetssains etdiabe´tiques.
Cate´gorie Activite´ spe´cifique (mmol/min/mgde prote´ine)
p t-test
Sujetssains 0,021(0,016–0,026) Re´f
Sujetsdiabe´tiques: cate´gorie1
0,019(0,012–0,025) 0,31 1,109 Sujetsdiabe´tiques:
cate´gorie2
0,001(0,001–0,005) <0,0001 19,636
des extraits obtenus chez les sujets diabe´tiques de la cate´gorie1 et 2. Ainsi montre´ dans la Fig. 3, on constate que l’intensite´ dela bandeGAPDH diffe`reentre lesdeux classesde sujets diabe´tiques et c’est selon la fraction cytosolique ou membranaire.
En effet, on remarque que d’une part, il y a une diffe´rence d’intensite´ delabandeentrelesurnageantetl’extraitmembra- nairecorrespondant(aetb,dete).D’autrepart,labandeGAPDH chezlesujetdela2ecate´goriedesdiabe´tiquesestpratiquement absentedans lesurnageantde lalyse, tandis quedans l’extrait obtenu apre`s la de´gradation de la membrane, on observe une bandenettementvisible(detf)etquirestemalgre´ toutfaiblepar rapporta` celleobserve´echezlacate´gorie1desdiabe´tiques(c).
Ces observationssont en accordavecles activite´s mesure´es danslesdeuxextraitsetdanslesdeuxconditionsdelyse.
Toutes les observations a` partir de nos re´sultats : dosage d’activite´s et gels, nous montre que chez 60 % des sujets diabe´tiquesde la pre´sente e´tude, l’enzyme GAPDH estinhibe´e parsaliaisona` lamembranedese´rythrocytes.
Cependant,beaucoupdequestionsrestenta` eˆtresouleve´es,a`
savoirpourquoichezla1recate´goriedediabe´tiquesl’enzymeest activetandisquechezla2eelleestinhibe´e?Qu’est-cequiinduit cetteinhibition?Quellessontlesconse´quencesphysiologiquesde cetteinhibition?Ilsembleraitdoncquedenouvellesperspectives s’ouvrentenvuedecettee´tude,afindere´pondrea` cesquestions,il
seraite´galementplusapproprie´ defaireunee´tudeselonlesexe,le poidsetl’aˆgedupatient.
A` noter qu’il y a peu d’informations rencontre´es en ce qui concernel’utilisationdusangtotalcommemate´rield’e´tude.Tous lestravauxeffectue´sonte´te´ re´alise´ssoitsurdesligne´escellulaires oudesmode`lesanimaux[41].
Afin deve´rifier si cetteinhibition est re´versible,nousavons proce´de´ a` lasolubilisation dela GAPDHmembranairechezdes sujetsdiabe´tiquesappartenanta` ladeuxie`mecate´gorie,l’e´lectro- phore`se del’extraitenzymatiquecorrespondantestrepre´sente´e danslaFig.4:
Onde´tecte danslessurnageants desfractions membranaires solubilise´es,lapre´senced’unebandea` faibleintensite´ correspon- dantea` lasous-unite´ delaGAPDH.Danscesmeˆmesurnageantsde solubilisation,onapumesureruneactivite´ spe´cifiquedelaGAPDH del’ordrede0,016U/mgdeprote´ine.Destravauxsimilairesde Reynolds etTrayer [42]ontsolubilise´ 90 %des prote´inesdela membranedel’e´rythrocytehumainparcontactdurant96ha` 208C avecunesolutionaqueused’EDTA5mMa` pH7,5.
Cere´sultatconfirmelapre´senced’uneactivite´ re´versibledela GAPDHdanslamembranedel’e´rythrocytehumain,dissociablepar unde´tergentouunche´1ateur.L’effetdesche´1ateurssugge`redes interactionsioniquesdanslaliaisondel’enzymea` lamembrane.
Fig.1.Comparaisondesmoyennesdel’activite´ spe´cifiquedelaGAPDH(U/mgde prote´ine)dessujetssainsetdiabe´tiquesdela2ecate´goriedontlesangae´te´ lyse´
sansetapre`sladestructiondelamembrane.
Fig.2.E´lectrophore`sesurgeldepolyacrylamideenconditionsde´naturantes(PAGE- SDS)desextraitsbrutsdusanglyse´ parla1reme´thodechezlessujetsdelacate´gorie 2:(a:Surnageant;b:culot).LaGAPDHcorresponda` labandeenfacedesfle`ches.
Fig.3.E´lectrophore`sesurgeldepolyacrylamideenconditionsde´naturantes(PAGE-SDS)montrantlesextraitsbrutsde:sujetdiabe´tique[1recate´gorie](a;b:surnageantet culotdusanglyse´ ;c:sanglyse´ aveclade´gradationdelamembrane);sujetdiabe´tique[2ecate´gorie](d;e:surnageantetculotdusanglyse´ sansde´gradationdela membrane;f:sanglyse´ avecde´gradationdelamembrane).LaGAPDHcorresponda` labandeenfacedesfle`ches.
Lade´shydroge´nase lie´eestlocalise´esurlafaceinte´rieureou cytoplasmiquedelamembraned’unetellemanie`requ’ellen’est pasenmesuredecontactersonsubstratlorsquelamembraneest imperme´able[25].
L’ensembledesinterpre´tationsdesre´sultatsdel’expressionde l’enzymeGAPDHdanslesdiffe´rents casdesujetse´tudie´seten fonction de la fraction cytosolique ou membranaire ont e´te´ a`
nouveaureconfirme´sparleWesternblot(re´sultatnonmontre´).
L’implicationde la GAPDH dans plusieurspathologies a e´te´
e´galementmiseene´vidence,enparticulierdanslescancersdela prostateetlapathogene`sevirale[43].Elleeste´galementlacible uniquedel’oxydenitrique[44].
Parailleurs,d’autrese´tudesde´montrentsonimplicationdans l’apoptose, les troubles neurode´ge´ne´ratifs et les cancers [16].
L’inactivationdelaGAPDHdanslemuscled’animauxdiabe´tiquesa e´galemente´te´ observe´e[18].
L’implication de la GAPDH dans ces pathologies engage plusieurschangementsa` savoirlechangementdesonexpression, l’apparitiondenouveauxisoformes,ouencoredesmodifications post-traductionnellesdeladiteenzyme.
4. Conclusion
Au terme de notre e´tude, la premie`re re´alise´e sur le sang humain,onapuclasserlessujetsdiabe´tiquesendeuxcate´gories,la 1re(40%)comprenantdessujetschezlesquelleslaGAPDHposse`de uneactivite´ spe´cifique etunprofile´lectrophore´tique semblable auxsujetssains,etunedeuxie`me(60%)ou` onnoteuneinhibition de la GAPDH par liaison a` la membrane des e´rythrocytes. Ces re´sultatssugge`rentquechezunecertainetranchedediabe´tiques de type 2, on assiste a` une inhibition reversible de la GAPDH me´die´e par une interaction ionique de cette dernie`re avec la prote´inemembranairee´rythrocytaire,band3.
De´clarationd’inte´reˆts
Les auteurs de´clarent ne pas avoir de conflits d’inte´reˆts en relationaveccetarticle.
Remerciements
Nossince`resremerciementsa` Mr AbderrazakEssari,respon- sableducentredupre´le`vementa` l’hoˆpitaluniversitaireIbnRochd (CHU), a` Dr. M. Bellik, me´decin biologiste, centre de biologie
me´dicale,IPMeta` Mlle.JihaneALLEM,pourleurcontributiondans lare´alisationdecetravail.
Re´fe´rences
[1]AmosAF,McCartyDJ,ZimmetP.Therisingglobalburdenofdiabetesand itscomplications:estimatesandprojectionstotheyear.DiabetMed2010;14:
1–85.
[2]WildS,RoglicG,GreenA,etal.Globalprevalenceofdiabetesestimatesorthe year2000andprojectionsfor2030.DiabetesCare2004;27:1047–53.
[3]IDF.InternationalDiabetesFederation;http://www.idf.org/about-diabetes.
[4]MS.,DELM..Projetplannationalstrate´giquedepre´ventionetdecontroˆledu diabe`te2010–2015;2009.
[5]DerotM.Diabe`te.In:EncyclopaediaUniversalis.6.Paris:EncyclopaediaUni- versalisFranceSA;1985.p.66–70.
[6]Thediabetescontrolandcomplicationstrialresearchgroup.Theeffectof intensivetreatmentofdiabetesonthedevelopmentandprogressionoflong- term complicationsininsulin-dependent diabetes mellitus.N EngJMed 1993;329:977–86.
[7]UKProspectiveDiabetesStudy(UKPDS)Group.Intensiveblood-glucosecon- trolwithsulphonylureasorinsulincomparedwithconventionaltreatment andriskofcomplicationsinpatientswithtype2diabetes(UKPDS33).Lancet 1998;352:837–53.
[8]WeiM,GaskillSP,HaffnerSM,Stem MP.Effectsofdiabetes andlevelof glycemiaonall-causeandcardiovascularmortality.TheSanAntonioHeart Study.DiabetesCare1998;21:1167–72.
[9]ParvingHH.Diabeticnephropathy:preventionandtreatment. KidneyInt 2001;60:2041–55.
[10]RitzE,RychlikI,LocatelliF,HalimiS.End-stagerenalfailureintype2diabetes:
amedicalcatastropheofworldwidedimensions.AmJKidneyDis1999;34:
795–808.
[11]SoukriA,MouginA,CorbierC,WonacottA,BranlantC,BranlantG.Roleofthe histidine 176 residue in glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase as probedbysite-directedmutagenesis.Biochemistry1989;28:2586–92.
[12]FillingerS,Boschi-MullerS,AzzaS,DervynE,BranlantG.Twoglyceralde- hydes-3-phosphatedehydrogenaseswithoppositephysiologicalrolesina nonphotosyntheticbacterium.JBiolChem2000;275:14031–7.
[13]IddarA,ValverdeF,SerranoA,SoukriA.Expression,purificationandcharac- terizationofrecombinantnon-phosphorylatingNADP-dependentglyceralde- hyde-3-phosphatedehydrogenasefromClostridiumacetobutylicum,protein expressionandpurification;25.2002;p.519–26.
[14]RoitelO,VachetteP,AzzaS,BranlantG.PbutnotR-axisinterfaceisinvolvedin coopertivebindingofNADontetramericphosphorylatingglyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus. J Mol Biol 2003;326:1513–22.
[15]Fothergill-GilmoreLA,MichelsPAM.Evolutionofglycolysis.ProgBiophysBiol 1993;95:105–35.
[16]SiroverMA.Newinsihtofanoldprotein,CellcycleregulationofDNArepair enzymesandpathways. In:MiloGE,CastoBC,editors.Transformationof human fibroblasts:molecularand geneticmechanisms.BocaRaton: CRC Press;1999.p.29–54.
[17]SiroverMichaelA.Mazola.Newnuclearfunctionsoftheglycolyticprotein, glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,inmammaliancells.JCellBio- chem2005;95:45–52.
[18]Tristan C, Shahani N, Sedlak TW, Sawa A. The diverse functions of GAPDH:viewsfromdifferentsubcellularcompartments.CellSignal2011;
23:317–23.
Fig.4.E´lectrophore`sesurgeldepolyacrylamideenconditionsde´naturantes(PAGE-SDS)montrantlesfractionsmembranairesdelaGAPDHde3sujetsdiabe´tiquesdela 2ecate´gorie(a;b;c:culotdusanglyse´ parla1reme´thode);etlessurnageantsdesolubilisationrespectivementdestroissujets,(d;e;f:prote´inesmembranaires solubilise´es).
[19]DodgeJT,MitchellC,HanahanJ.ArchBiochemBiophys1963;100:119–1305.
[20]BradfordMM.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogram quantities ofprotein utilizing theprincipleof protein-dyebinding. Anal Biochem1976;72:248–54.
[21]Iglesias AA, Losada M.Purificationand kinetic and structuralproperties of spinach leaf NADP-dependent non-phosphorylating glyceraldehyde-3- phosphatedehydrogenase.ArchBiochemBiophys1988;260:830–40.
[22]LaemmliUK.Cleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyofthehead ofbacteriophageT4.Nature1970;227:4668–73.
[23]BurnetteWN.‘‘Westernblotting’’:electrophoretictransferofproteinsfrom sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelstounmodifiednitrocelluloseand radiographicdetectionwithantibodyandradio-iodinatedprotein A.Anal Biochem1981;112:195–203.
[24]KishSJ,Lopes-CendesI,GuttmanM,FurukawaY,PandolfoM,RouleauGA, etal.Brainglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseactivityinhuman trinucleotiderepeatdisorders.ArchNeurol1998;55:1299–304.
[25]KantJA,SteckTL.Specificityintheassociationofglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenasewithisolatedhumanerythrocytemembranes.JBiolChem 1973;248(24):8457–64.
[26]MallozziC,DiStasiAMM,MinettiM.Freeradicalsinducereversiblemem- branecytoplasmtranslocationofglycerdehyde-3-phosphatedehydrogenase inhumanerythrocytes.ArchBiochemBiophys1995;231:345–52.
[27]GalliF,RovidatiS,GhibelliL,CanestraiF.S-Nitrosylationofglyceraldehyde-3- phosphatedehydrogenasedecreasestheenzymeactivitytotheerythrocyte membrane.NitricOxide1998;2:17–27.
[28]LowPS.Structureandfunctionofthecytoplasmicdomainofband3:centreof erythrocytemembrane–peripheralproteininteractions.BiochimBiophysActa 1986;864:145–67.
[29]RogalskiAA,SteckTL,WaseemA.Associationofglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenasewiththeplasmamembraneoftheintacthumanredcell.JBiol Chem1989;264:6438–46.
[30]MaretzkiD,ReimannB,RapoportSM.Areappraisalofthebindingofcytosolic enzymestoerythrocytemembranes.TrendsBiochemSci1989;14:93–6.
[31]AlbertiniMC,TeodoriL,AccorsiA,SoukriA,CampanellaL,BaldoniF,etal.
Sulphurousmineralwateroraltherapy:effectsonerythrocytemetabolism.
FoodChemToxicol2008;46:3343–50.
[32]McDonaldLJ,MossJ.StimulationbynitricoxideofaNADlinkagetoglyceral- dehyde-3-phosphatedehydrogenase.ProcNatlAcadSci1993;90:6238–41.
[33]DimmelerS,BruneB.Nitricoxidepreferentiallystimulatesauto-ADP-ribosy- lationofglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenasecomparedtoalcoholor lactatedehydrogenase.FEBSLett1993;315:21–4.
[34]KotsAY,SkuratAV,SergienkoEA,BularginaTV,SeverinES.Nitroprussidestimu- latesthecysteine-specificmono(ADP-ribosylation)ofglyceraldehyde-3-phos- phatedehydrogenasefromhumanerythrocytes.FEBSLett1992;300:9–12.
[35]KawamotoRM,CaswellAH.Autophosphorylationofglyceraldehyde-3-phos- phatedehydrogenaseandphosphorylationofproteinfromskeletalmuscle microsomes.Biochemistry1986;25:656–61.
[36]MinettiM,PietraforteD,DiStasiAM,MallozziC.Nitricoxide-dependentNAD linkagetoglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase:possibleinvolvement ofacysteinethiolradicalintermediate.BiochemJ1996;319:369–75.
[37]Soukri A,Valverde F, HafidN,Elkebbaj MS,Serrano A. Occurrenceofa differentialexpression of theglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase geneinmuscleandliverfromeuthermicandinducedhibernatingjerboa (Jaculusorientalis).Gene1996;181:139–45.
[38]BatthyanyC, SchopferFJ, BakerPR, DuranR, Baker LM,HuangY, etal.
Reversiblepost-translationalmodificationofproteinsbynitratedfattyacids invivo.JBiolChem2006;281:20450–63.
[39]SchrierSL.Studiesofthemetabolismofhumanerythrocytemembranes.JClin Invest1963;42:756–66.
[40]GreenDJ,MurerE,HultonHO,BaumH.Associationofintegratedmetabolic pathwayswithmembranes.I.Glycolyticenzymeofredbloodcorpuscleand yeast.ArchBiochemBiophys1965;112:635–47.
[41]McD,KirtleyME,TannerMJA.Theinteractionofglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenasewithhumanerythrocytemembranes.JBiolChem1974;249:
6478–85.
[42]BlatnikM,FrizzellN,ThorpeS,BaynesJW.Inactivationofglyceraldehyde-3- phosphatedehydrogenasebyfumarateindiabetes.Diabetes2008;57.
[43]ElkhalfiB,SenhajiN,BenomarH,SoukriA.Studyofglyceraldehyde-3-phos- phatedehydrogenaseexpressioninthetumorprocessof:breast,cervixand prostatecancers.AdvBiolChem2012;02:335–40.
[44]ReynoldsJA,TrayerH.Solubilityofmembraneproteinsinaqueousmedia.J BiolChem1971;246(23):7337–42.
