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Rôle de l’environnement des spermatozoïdes de bélier dans leur transit dans le tractus génital femelle

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Academic year: 2021

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HAL Id: tel-02800534

https://hal.inrae.fr/tel-02800534

Submitted on 5 Jun 2020

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Copyright

Rôle de l’environnement des spermatozoïdes de bélier dans leur transit dans le tractus génital femelle

Clément Soleilhavoup

To cite this version:

Clément Soleilhavoup. Rôle de l’environnement des spermatozoïdes de bélier dans leur transit dans le tractus génital femelle. Autre [q-bio.OT]. Université François Rabelais (Tours), 2015. Français.

�tel-02800534�

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1

UNIVERSITÉ FRANÇOIS – RABELAIS DE TOURS

ÉCOLE DOCTORALE SSBCV

ÉQUIPE : Interactions Cellulaires et Fertilité

THÈSE

présentée par :

Clément SOLEILHAVOUP

Soutenue le : 1 Décembre 2015

Pour obtenir le grade de : Docteur de l’université François – Rabelais de Tours

Discipline/ Spécialité : Sciences de la vie/Biologie de la reproduction

Rôle de l’environnement des spermatozoïdes de bélier dans leur transit dans le tractus

génital femelle

THÈSE dirigée par :

Mr DRUART Xavier Ingénieur de Recherche, INRA Nouzilly Mme GÉRARD Nadine Directeur de Recherche, HDR, INRA Nouzilly RAPPORTEURS :

Mr HUMBLOT Patrice Professeur, HDR, Université d’Uppsala

Mr FABRE Stéphane Directeur de Recherche, HDR, INRA, Castanet-Tolosan

JURY :

Mr SANDRA Olivier Chargé de Recherche, HDR, INRA, Jouy en Josas Mr MIEUSSET Roger Maître de Conférences, HDR, CHU, Toulouse

Mme DUITTOZ Anne Professeur, HDR, université François – Rabelais de Tours Mr HUMBLOT Patrice Professeur, HDR, Université d’Uppsala

Mr FABRE Stéphane Directeur de Recherche, HDR, INRA, Castanet-Tolosan Mme GÉRARD Nadine Directeur de Recherche, HDR, INRA Nouzilly

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Je dédie cette thèse à ma famille

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Remerciements

Ce travail de thèse a été réalisé sous la direction de Xavier Druart et Nadine Gérard, dans l’équipe « Interactions Cellulaires et Fertilité » de l’unité de Physiologie de la Reproduction et des Comportements de l’INRA de Nouzilly grâce au soutien financier de la région Centre et de l’INRA.

Je souhaite remercier Florian Guillou pour m’avoir accueilli au sein de l’unité de Physiologie de la Reproduction et des Comportements.

Je remercie grandement les membres du jury : Messieurs Patrice Humblot et Stéphane Fabre pour avoir accepté d’être les rapporteurs de ce travail, ainsi que Mr Olivier Sandra, Mr Roger Mieusset et Mme Anne Duittoz pour avoir accepté de participer à l’évaluation de ce travail.

Je remercie mes directeurs de Thèse, Xavier Druart et Nadine Gérard de m’avoir offert la possibilité d’effectuer cette thèse sous leurs directions.

Je te remercie sincèrement Xavier Druart pour la confiance que tu m’as accordé et de l’autonomie que tu m’as laissé acquérir. Merci de m’avoir encadré, guidé, écouté, critiqué, de m’avoir fait voyager et surtout de m’avoir supporté durant ces 3 ans. Je n’oublierai pas tous ces moments à parler cinéma, BD et Australie.

Merci Nadine Gérard pour tous ses conseils avisés et précieux.

Je tiens à remercier Damien Capo, Olivier Lasserre, les personnels de l’élevage de l’INRA Nouzilly et Insem Ovin (centre d’insémination animale) pour leurs disponibilités constantes et leurs aides précieuses.

J’exprime tous mes remerciements à Guillaume Tsikis pour son aide technique et sa sympathie tout au long de ma thèse. Je me rappellerai toujours de ces attroupements de petits poussins qui te suivent partout quand tu manipes. Je ne désespère pas de te battre un jour au badminton même si je sais par avance que c’est peine perdue.

Merci à Karine Reynaud pour son aide et ses conseils avisés en immunohistochimie.

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Merci à Yann Locatelli pour ces réunions labo très enrichissantes organisées à la Haute Touche.

Je remercie également les béliers et brebis sans lesquels rien n’aurait été possible.

Je tiens à remercier tous les stagiaires que j’ai eu à encadrer durant ma thèse et qui ont fait avancer ce travail de thèse. Merci à Marion Lamotte, Aurélie Faloppe, Lucie Combes- Soia, Mylène Da-Silva, Valentin Paillard et Mickael Breteau. Ce fut un plaisir de travailler avec vous.

Une partie de ce travail de thèse a été réalisé en collaboration avec une équipe australienne, je remercie Simon De graff, Jessica Rickard, Jessie Maddisson pour leur aide et leur participation à ce travail.

Merci à Jean Louis Dacheux et Yvon Guérin pour leur participation à ce travail. Merci à vous d’avoir gardé des montagnes d’échantillons biologiques précieux dans les congélateurs.

Merci à Phillipa Kohnke et Simon De graff avec qui j’ai appris à m’exprimer en anglais, enfin je crois…

J’exprime tous mes remerciements aux membres de l’équipe qui m’ont chaleureusement accueilli, pour leur sympathie, leur aide, leur bonne humeur et les intéressantes conversations durant la pause café ou déjeuner. Merci à Pascal Mermillod, Nadine Gérard, Xavier Druart, Yann Locatelli, Karine Reynaud, Guillaume Tsikis, Ghylène Goudet-Guitton, Emilie Corbin, Alice Fatet, Cécile Douet, Florence Guignot, Marie Saint Dizier, Julie Lamy, Cindy Riou, Carmen Alminana, Pauline Hugon, Michael Bertoldo, Luiz Cordeiro et Agoustinho Alcantara. Cela a été un plaisir pour moi de travailler avec vous durant ces 3 ans.

Merci à la plateforme CIRE et toute l’équipe de l’hôpital-abattoir, Juliette Cognié, Gille Gomot, Christian Moussu, Frédéric Elleboudt, Luc Perrigouard, Albert Arnould et Jean- Philippe Dubois pour leur disponibilité et leur sympathie.

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J’exprime autant de remerciements qu’il y a de spectral counting identifiés dans cette thèse à Grégoire Harichaux, Valérie Labas, Lucie Combes-Soia, Mylène Da-Silva pour les analyses en spectrométrie de masse.

Merci à l’équipe de badminton de l’INRA pour m’avoir permis de garder la ligne et de me changer les idées.

J’exprime toute ma sympathie et reconnaissance à tous les thésards, ex-thésards, post doc et étudiants de Tours, pour leur participation aux nombreuses sorties et soirées.

Merci à l’ensemble de mes amis, notamment les 2 Kévin, Lyes, Arno, Virginie, Julie, Cyril et Kelly, pour leur soutien, mais aussi pour les discussions animées lors de soirées avec de nombreuses questions récurrentes comme : « A quoi servent tes recherches ?» ou

« Comment tu collectes la semence de bélier ?»….

Un grand merci à toute ma petite famille et spécialement à mes parents, pour m’avoir toujours soutenu pendant mes très longues études. Cette réussite est aussi la vôtre.

Enfin, pour clore ces remerciements, mes pensées vont à Stécie Dubourg, celle qui partage ma vie depuis de nombreuses années déjà, avec qui je passe tant de moments magiques et qui a eu l’extrême courage de me supporter durant la rédaction de cette thèse.

Cette thèse est un peu la tienne. Merci de m’avoir toujours soutenu et d’y avoir cru…

souvent plus que moi. Je te remercie du fond du cœur pour avoir lue et relue cette thèse.

Pour tout ce que tu m’as apporté, pour tout ce que nous avons vécu, mais aussi et tout simplement pour ce que tu es.

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Résumé

Chez les mammifères, le transit des spermatozoïdes à travers le tractus génital mâle et femelle est un préalable indispensable à la fécondation. Les spermatozoïdes vont rencontrer de nombreux environnements qui vont influencer leur mobilité, leur migration et leur pouvoir fécondant. Cependant chez la brebis, les mécanismes cellulaires et protéiques mis en jeu lors de ce transit sont relativement peu connus. L’objectif principal de cette thèse a été d’identifier les protéomes des différents environnements que les spermatozoïdes de bélier vont rencontrer durant leur transit à travers le tractus génital mâle et femelle.

La première étude nous a permis de caractériser le protéome du plasma séminal de bélier et d’identifier de nombreux marqueurs protéiques comme la zinc alpha glycoprotéine, capable de stimuler la mobilité des spermatozoïdes et susceptible d’intervenir dans leur transit à travers le cervix. L’analyse comparative du transit de spermatozoïdes épididymaires et éjaculés inséminés par voie cervicale a en effet montré que le plasma séminal améliorait le transit des spermatozoïdes à travers le cervix.

La deuxième étude, nous a permis d’identifier les protéomes des fluides luminaux (mucus cervical, fluides utérin et d’oviducte) au cours du cycle œstral. Nous avons identifié plus de 940 protéines dont de nombreuses protéines spécifiquement présentes en œstrus lors du transit des spermatozoïdes dans le tractus génital femelle.

Enfin, la dernière partie de ce travail a principalement résidé dans l’étude de l’interactome entre les spermatozoïdes et le mucus cervico-vaginal. Cette étude nous a permis de mettre en évidence l’interaction de plus de 50 marqueurs protéines du mucus cervico-vaginal avec les spermatozoïdes de bélier. Ces nombreux marqueurs protéiques pourront potentiellement intervenir dans le transit des spermatozoïdes dans l’appareil génital femelle.

En conclusion, ces travaux de thèse ont permis d’élargir le champ des connaissances sur la composition protéique des différents environnements que les spermatozoïdes vont rencontrer lors de leur transit dans le tractus génital mâle et femelle.

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L’ensemble de ces résultats permet d’envisager de nombreuses perspectives portant sur la caractérisation individuelle de protéines candidates en relation avec la mobilité, la migration et le pouvoir fécondant des spermatozoïdes.

Mots clés : Béliers, spermatozoïdes, mucus cervical, plasma séminal, interactome, GelC MS/MS.

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Résumé en anglais

In mammals, the sperm transit through the male and female genital tracts is essential for the success of fertilization. The spermatozoa will encounter several environments that will influence their motility and fertilizing ability. However, in sheep species, the cellular and proteins mechanisms involved during sperm transit are relatively unknown. The major objective of this thesis was to identify the proteomes from the different environments that ram spermatozoa will encounter during their transit through the male and female genital tract.

The first study was designed to characterize the ram seminal plasma proteome.

Several proteins like the ZAG, able to enhance sperm mobility, were identified and may be involved in the sperm transit through the cervix. The comparative analysis of epididymal and ejaculated sperm transit after cervical AI showed indeed that the seminal plasma improved the sperm transit through the cervix.

The second study allowed us to identify the luminal fluids proteomes (cervical mucus, uterine and oviduct fluids) during the oestrous cycle. We have identified more than 940 proteins including many proteins specifically present in oestrus during sperm transit into the female genital tract.

Finally, the last part of this work was to reveal the proteins interaction between spermatozoa and cervical mucus. This study has allowed us to identify the interaction of more than 50 proteins from cervical mucus with the ram spermatozoa. These proteins markers may potentially be involved in the sperm transit into the female genital tract.

In conclusion, our data has extended our knowledge on the protein composition of the different environments that spermatozoa will encounter during their transit in male and female genital tract.

All together these results open many perspectives on the individual characterization of candidate proteins related to motility, migration and fertilizing process.

Keywords : Rams, sperm, cervical mucus, seminal plasma, interactome

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Liste des abréviations et symboles

ACE Angiotensin I-converting enzyme ACN Acétonitrile

ADAM A Disintegrin And Metalloproteinase ADM Adrenomedullin

ADN Acide désoxyribonucléique AF Acide formique

AKAP A Kinase Anchoring Protein

ALH Amplitude de déplacement latéral de la tête AMPc Adénosine monophosphate cyclique

APO A1 Apolipoprotéine A1 AQN-1 Spermadhesin AQN-1 ATP Adénosine-5′-triphosphate AWN Sperm associated AWN protein Beta-126 Beta defensin 126

BSA Bovine serum albumin BSP Binder of sperm protein

CASA Computer aided sperm analysis CatSper2 Cation Channel Sperm Associated 2 CD109 Cluster of Differentiation 109 CD9 Cluster of Differentiation 9

CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator CLU Clusterine

cP Centipoise

CRISP1 Cysteine-rich secretory protein 1

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11 CTNNA1 Alpha-catenine

CTSD Cathepsine D CVF Cervico-vaginal fluid

DMBT1 Deleted in malignant brain tumors 1 ECM1 Extracellular matrix protein 1

EFEMP1 EGF Containing Fibulin-Like Extracellular Matrix Protein 1 EGF Epidermal growth factor

EJAC Spermatozoïdes éjaculés EPI Spermatozoïdes épididymaires Eppin Epididymal protease inhibitor FABP Fatty acid-binding protein FBP1 Fructose-1,6-bisphosphatase 1 FGA Fluorogestone

GelC MS/MS Mass Spectrometry-Based Comparative Proteomic Analysis GPI Glucose-6-phosphate isomérase

GPX5 Glutathion peroxydase 5 GST Glutathione S-transferase HCO3- Bicarbonate

HDL Lipoprotéine de haute densité HEXB Beta-N-acétyl-hexosaminidase HPA High preservation ability HRP Horseradish peroxidase HSP70 Heat shock protein 70 HSP90 Heat shock protein 90 HSPA8 Heat shock 70 kDa protein 8 HSPH1 HSP 105 kDa protein

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12 IA Insémination artificielle IdF ou IL Ile de France

IgA Immunoglobulines A IZUMO Izumo sperm-egg fusion KO Knockout

LCN5 Lipocalin 5

LIF Leukemia inhibitory factor LPA Low preservation ability LTF Lactoferrine

MC Methylcellulose MUC5AC Mucine 5AC MUC5B Mucine 5B NO Nitrites oxydes

NPC2 Niemann-Pick disease type C2 OVGP1 Oviduct-specific glycoprotein 1 PBS Phosphate-buffered saline

Pgap1 Post-GPI attachment to proteins 1 PH-20 Hyaluronidase PH-20

PIGR Polymeric Immunoglobulin Receptor PKA Protein kinase A

PMSG Pregnant Mare Serum Gonadotropin PRDX Peroxiredoxin

PSMA8 Protéasome 26S

PTGDS Prostaglandine D2 synthase R18 Octadecyl rhodamine B chloride RGD Tripeptide Arg-Gly-Asp

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13 Rom Romanov

ROS Reactive Oxygen Species SDS Sodium dodecylsulfate

SOAF Sperm-associated oocyte-activating factor SOD1 Superoxide dismutase

SP Seminal plasma SPADH1 Spermadhesin-1 SPADH1 Spermadhésine 1 SPADH2 Spermadhesin Z13 Spz Spermatozoïdes TBS Tris-buffered saline TCP1 T-Complex protein 1 TFF Trefoil factor

TPI Triose phosphate isomérase TRP Transient Receptor Potential UI Unité internationale

UPF0762 Uncharacterized protein families 0762 UPLC Ultra Haute Pression

VCL Vitesse curvilinéaire

VCP Transitional endoplasmic reticulum ATPase VEGF Vascular Endothelial Growth Factor VSL Vitesse linéaire

ZAG Zinc alpha 2 glycoprotein ZP Zone pellucide

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Table des matières

Remerciements ... 4

Résumé ... 7

Résumé en anglais ... 9

Liste des abréviations et symboles ... 10

INTRODUCTION ... 21

.I. Transit des spermatozoïdes dans l’appareil reproducteur mâle ... 22

.1. Structure du gamète mâle ... 22

.2. Transit et maturation des spermatozoïdes dans l’épididyme ... 25

.3. Le plasma séminal, milieu de transport des spermatozoïdes ... 29

II. Transit des spermatozoïdes à travers le tractus génital femelle de mammifères. ... 34

.1. Transit des spermatozoïdes à travers le cervix ... 34

.A. Composition du mucus cervico-vaginal ... 34

.B. Mécanismes physiques et moléculaires intervenants dans le transit des spermatozoïdes à travers le cervix ... 39

.2. Transit des spermatozoïdes dans l’utérus ... 44

.A. Composition du fluide utérin ... 44

.B. Mécanismes physiques et moléculaires intervenant dans le transit des spermatozoïdes à travers l’utérus ... 46

.3. Transit des spermatozoïdes dans l’oviducte ... 47

.A. Composition du fluide d’oviducte ... 47

.B. Mécanismes physiques et moléculaires intervenant dans le transit des spermatozoïdes à travers l’oviducte ... 49

.4. Conservation des spermatozoïdes et fertilité ... 57

OBJECTIFS ... 60

MATERIELS ET METHODES ... 64

.I. Animaux et protocoles expérimentaux ... 65

A. Synchronisation des brebis et collecte des fluides du tractus reproducteur femelle ... 65

B. Blocage de la spermatogénèse chez le bélier ... 67

C. Identification de béliers avec une semence d’aptitude à la conservation différente ... 68

D. Interaction des spermatozoïdes avec le mucus cervico-vaginal ... 70

.II. Imagerie des spermatozoïdes dans le tractus génital femelle ... 71

A. Protocole expérimental et observation in utero ... 71

.III. Relation entre protéome et viscosité du mucus cervico-vaginal ... 74

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A. Protocole expérimental ... 74

B. Collecte des mucus ... 74

C. Mesure indirecte de la viscosité du mucus cervico-vaginal par quantification de la mobilité des spermatozoïdes ... 74

D. Mesure de la viscosité du mucus cervico-vaginal par capillarité lamellaire. ... 75

.IV. Électrophorèse et Immunotransferts ... 76

A. Électrophorèse monodimensionnelle ... 76

B. Immunotransfert et western blot ... 76

.V. Spectrométrie de masse ... 77

A. Digestion trypsique ... 77

B. Identification par Nano LC/MS/MS ... 78

C. Interrogation des banques de données et validation des résultats ... 78

D. Quantification par Label-Free (spectral counting) ... 79

.VI. Immunohistochimie ... 79

RÉSULTATS ... 81

CHAPITRE 1 ... 82

Le plasma séminal de Bélier : étude de son protéome et de son impact sur la conservation et le transit des spermatozoïdes dans l’appareil reproducteur de brebis. ... 82

Partie A ... 83

Étude de l’impact du plasma séminal de bélier sur la conservation de la semence ... 83

ARTICLE 1 : ... 93

Ram seminal plasma proteome and its impact on liquid preservation of spermatozoa ... 93

ARTICLE 2 : ... 110

The identification of proteomic markers of sperm freezing resilience in ram seminal plasma ... 110

Partie B ... 120

Étude fonctionnelle de l’effet du plasma séminal sur le transit des spermatozoïdes dans l’appareil reproducteur femelle ... 120

ARTICLE 3 : ... 125

Seminal plasma aids the survival and cervical transit of epididymal ram spermatozoa .... 125

CHAPITRE 2 ... 136

Protéomes des fluides du tractus génital de brebis au cours du cycle œstral. ... 136

ARTICLE 4 : ... 142

Proteomes of the female genital tract during the oestrous cycle ... 142

(17)

16

CHAPITRE 3 ... 185

Protéome et propriétés mécaniques du mucus cervico-vaginal... 185

CHAPITRE 4 ... 195

Étude protéomique de l’interaction des spermatozoïdes avec du mucus cervico-vaginal de brebis en œstrus. ... 195

ARTICLE 5 : ... 200

Cervico-vaginal fluid proteome and it interaction with ram spermatozoa ... 200

DISCUSSION ... 227

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ... 241

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 244

ANNEXES ... 265

(18)

17

Liste des tableaux

Tableau 1 : Principales fonctions identifiées dans le protéome du plasma séminal. ... 32 Tableau 2 : Principales fonctions identifiées dans le protéome du mucus cervical. ... 36 Tableau 3: Liste confirmée et supposée de chimioattractants de spermatozoïdes de mammifères. . 55 Tableau 4: Nombre de protéines dont l'abondance diffère (PAD) entre l'oestrus et la phase lutéale dans le cervix, l'utérus et l'oviducte de brebis synchronisées ou spontannées. ... 140 Tableau 5: Liste des protéines corrélées avec la viscosité du mucus cervico-vaginal. ... 193 Tableau 6: Liste des protéines différentiellement abondantes entre spermatozoïdes contrôles (spz+

PBS) et spermatozoïdes incubés avec du mucus cervico-vaginal (spz+ CVF). ... 198

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18

Liste des figures

Figure 1 : Morphologie d’un spermatozoïde... 23 Figure 2 : Représentation schématique de l’épididyme de bélier. ... 25 Figure 3 : Protéines majoritaires du fluide épididymaire de bélier dans les différentes régions de l’épididyme. ... 27 Figure 4: Anatomie de l’appareil reproducteur de bélier. ... 30 Figure 5: Observation par microscope électronique à transmission de la structure du mucus cervical humain en phase oestrogénique et phase lutéale. ... 40 Figure 6: Anatomie du tractus génital femelle de brebis. ... 42 Figure 7: Représentation schématique de la motricité du col de l’utérus. ... 43 Figure 8: Représentation schématique de l'oviducte et de son implication dans le transit des

gamètes. ... 50 Figure 9: Modèle d’interaction entre les spermatozoïdes et l’épithélium de l’oviducte chez les bovins.

... 51 Figure 10: Mécanismes d'orientation des spermatozoïdes dans le tractus génital femelle. ... 54 Figure 11: Schéma de déplacement de l’irrigation sanguine dans l'utérus et l'ovaire en fonction du cycle. ... 56 Figure 12 : Schéma des quatre lots de brebis. ... 66 Figure 13: Schéma descriptif des vitesses de trajectoire mesurées par l’automate Hamilton Thorne Mobility Analyser (système CASA) dans l’analyse de la mobilité individuelle des spermatozoïdes. .... 69 Figure 14: Méthode d’observation in vivo des spermatozoïdes dans l'utérus par Cellvizio. ... 73 Figure 15 : Impact de l'élévation de la température du scrotum sur la concentration du sperme et le protéome du plasma séminal. ... 86 Figure 16 : Impact du plasma séminal sur la conservation de la semence de bélier. ... 88 Figure 17 : Immunodections et quantifications de marqueurs protéiques de conservation dans le plasma séminal issu de béliers ayant une bonne (HPA) ou une mauvaise (LPA) conservation de la semence. ... 89 Figure 18 : Effet de la Zinc Alpha glycoprotéine sur la mobilité des spermatozoïdes au cours de la conservation durant 24h à 15°C. ... 90 Figure 19: Schémas regroupant les principaux résultats de l’étude de l’impact de la composition protéique du plasma séminal de bélier sur la congélation de la semence. ... 92 Figure 20: Comparaison des paramètres de mobilité des spermatozoïdes éjaculés et épididymaires avant AI cervicale et mesure du nombre moyen de spermatozoïdes EPI et EJAC à la jonction utéro- tubaire. ... 122 Figure 21: Diagramme de Venn des protéines identifiées dans les fluides luminaux du tractus génital femelle. ... 138 Figure 22: Pourcentages des protéines différentielles au cours du cycle œstral suivant les régions du tractus génital femelle. ... 139 Figure 23 : Comparaison de deux méthodes de mesure de la viscosité d'une gamme de

méthylcellulose. ... 188 Figure 24: Mesure de la viscosité par capillarité lamellaire de plusieurs pools de mucus cervicaux. 189 Figure 25: Mesure indirecte par CASA de la viscosité du mucus cervico-vaginal de brebis par la vitesse de déplacement (VCL) des spermatozoïdes de béliers. ... 190

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19

Figure 26: Comparaison de deux différentes méthodes de mesure de la viscosité du mucus cervico- vaginal. ... 191 Figure 27: Droite de régression linéaire de la quantité de mucine 5AC en fonction de la Vitesse Curvilinéaire (VCL). ... 194

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Liste des annexes

Annexe 1: Congrès GDR Repro du 13-14-15 avril 2015, Rennes ... 266 Annexe 2 : Présentation orale au 12th International Symposium on Spermatology du 10 au 14 aout 2014 à Newcastle, Australie ... 267 Annexe 3 : 7e conférence annuelle de l’European Proteomics Association (EUPA) à Saint-Malo du 14 au 17 octobre 2013. ... 268

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21

INTRODUCTION

(23)

22

Lors de l’éjaculation, les spermatozoïdes provenant de la queue de l’épididyme, sont mélangés avec le plasma séminal, qui a une profonde influence sur leur pouvoir fécondant.

Déposés dans le tractus génital femelle, les spermatozoïdes rencontrent par la suite plusieurs milieux très différents, dont le mucus cervico-vaginal, qui constitue une première barrière de sélection. Le transit des spermatozoïdes dans le tractus génital femelle se traduit par des interactions moléculaires avec les fluides luminaux des différents compartiments (mucus cervical, fluide utérin, fluide de l’oviducte) participant à leur sélection. Cependant, la composition protéique de ces différents environnements est peu connue.

La première partie de cette introduction est consacrée à la description de la composition du fluide épididymaire et du plasma séminal, ainsi que de leurs fonctions dans le transit des spermatozoïdes dans l’appareil reproducteur mâle. La deuxième partie est dédiée à la description de la composition des différents fluides luminaux femelles, et de leurs rôles dans le transit des spermatozoïdes dans l’appareil génital femelle.

.I. Transit des spermatozoïdes dans l’appareil reproducteur mâle .1. Structure du gamète mâle

Les spermatozoïdes matures de bélier sont constitués principalement de trois segments : la tête, la pièce intermédiaire et le flagelle. La tête est composée d’un noyau dans lequel l’ADN est hypercondensé par des protamines ce qui permettra de créer une forme hydrodynamique, favorisant la mobilité et la pénétration du spermatozoïde dans l’ovule [1]. La tête est constituée de trois domaines membranaires, elle comprend l’acrosome, le segment équatorial et la région post-acrosomique (Figure 1).

(24)

23 Figure 1 : Morphologie d’un spermatozoïde.

Adapté de [2].

L’acrosome est créé à partir des vésicules golgiennes lors de la spermiogenèse afin de former un capuchon acrosomique qui s’accole au noyau du spermatozoïde. Il possède une membrane interne et une membrane externe recouvertes par la membrane plasmique.

L’acrosome est très riche en protéases comme les proacrosines, les hyaluronidases, les neuraminidases et les phosphatases acides. Il possède également des récepteurs membranaires qui permettront la fixation et la pénétration de la zone pellucide ainsi que la fusion avec l’ovule [3, 4].

Le segment équatorial joue un rôle fonctionnel dans la fécondation. Chez la souris et l’homme, il est impliqué dans la fusion avec la membrane de l’ovule à l’aide de nombreuses protéines parmi lesquelles l’equatorine et IZUMO [5, 6]. C’est également le site de rupture de l'enveloppe nucléaire du spermatozoïde durant la fécondation [7].

La région post-acrosomique constituée d’une partie de la thèque périnucléaire est composée de protéines qui auraient un rôle dans l’activation ovocytaire lors de la

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24

fécondation. La libération des SOAF (oocyte-activating factor) de la tête des spermatozoïdes dans le cytoplasme de l'ovocyte durant la fécondation, intervient dans l'activation des mécanismes d'achèvement du cycle cellulaire méiotique, la décondensation de l’ADN, le développement pronucléaire et la défense anti-polyspermie [8].

La queue du spermatozoïde est composée de quatre pièces : une pièce connective, une pièce intermédiaire, et un flagelle lui-même constitué d’une pièce principale et d’une pièce terminale (Figure 1).

La pièce connective connecte la tête à la pièce intermédiaire du spermatozoïde, elle est constituée de 2 centrioles nécessaires à la création du fuseau mitotique après fécondation.

La pièce intermédiaire est composée de neuf fibres denses de longueurs variables entourant l’axonème, ainsi que de la gaine mitochondriale, qui permettra l’apport d’énergie sous forme d’ATP. Les deux voies de production de l'ATP chez le spermatozoïde de mammifères, sont la glycolyse et la respiration mitochondriale.

La queue ou flagelle dont la structure assure la mobilité du spermatozoïde, est constituée d’un axonème de 9+2 filaments de microtubules connectés par des bras de dynéines et des protéines élastiques comme les nexines [2] (Figure 1). Le glissement relatif et périodique des doublets de microtubules est à l'origine du battement flagellaire. Suivant les différents segments de la queue, l'axonème peut être entouré par la gaine mitochondriale, les fibres denses externes ou la gaine fibreuse.

La pièce principale est composée d’un axonème entouré d’une gaine fibreuse et de seulement sept fibres denses. Le nombre de fibres denses diminue entre la pièce principale et la pièce terminale. Les fibres denses auraient un rôle dans la flexibilité et les mouvements du flagelle. Elles ont une composition similaire à la gaine fibreuse [9]. La gaine fibreuse est constituée majoritairement des protéines de la famille des AKAP (A Kinase Anchoring Protein), comme la protéine AKAP4 et AKAP3 [10]. L’absence d’AKAP4 entraine l’inhibition de la mobilité des flagelles due à une mauvaise organisation de la gaine fibreuse [11].

Vers l'extrémité distale où se trouve la pièce terminale, les fibres denses et la gaine fibreuse disparaissent et l’axonème est entouré seulement de la membrane plasmique.

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25

.2. Transit et maturation des spermatozoïdes dans l’épididyme

Chez les vertébrés, après formation et différentiation dans le testicule, le gamète mâle doit transiter dans l’épididyme qui a pour fonction d’assurer le transport, la survie, le stockage et la maturation des spermatozoïdes afin qu’ils acquièrent leur capacité de fécondation (Figure 2). L’épididyme de bélier est un organe long de 5 à 10 cm. Il est accolé au testicule et résulte de l'hypertrophie de la partie antérieure du canal de Wolff.

L’épididyme est constitué d’un tube de diamètre croissant de 70 µm à 500 µm et long de 50 à 60 mètres. Il est composé de 3 régions anatomiques : la tête, le corps et la queue.

L’épididyme est suivi du canal déférent [12] (Figure 2).

Figure 2 : Représentation schématique de l’épididyme de bélier.

TS : tubes séminifères ; RT : Rete testis ; CEF : Canaux efférents ; SI : segment initial ; TE : tête ; CE : Corps ; QE : Queue ; CD : Canal déférent. % de spermatozoïdes épididymaire mobiles. Adapté de [12, 13].

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26

Les spermatozoïdes transitent de la tête de l’épididyme où ils sont immobiles et non fécondants, jusqu'au corps et la queue où ils deviennent mobiles et fécondants. Chez le bélier, leur transit de la tête vers la queue de l’épididyme dure environ 12 jours et s’effectue sous l’action de contractions rythmiques du tubule régulées par la noradrénaline et les α1- adrenorécepteurs [13, 14].

En réponse à la stimulation par les stéroïdes sexuels (androgènes et œstrogènes), les cellules épithéliales (basales et principales) de l'épididyme synthétisent et sécrètent des protéines et molécules. Il a été montré que durant le transit dans l'épididyme, les spermatozoïdes interagissent avec le compartiment intra-luminal et les fluides épididymaires riches en de nombreuses molécules, comme des protéines, des lipides, des électrolytes et d’autres macromolécules [15-17]. Cette maturation induit des changements membranaires et métaboliques, tels que des changements dans le niveau de phosphorylation des protéines intracellulaires, ou dans le métabolisme énergétique ainsi que dans la composition membranaire des spermatozoïdes [18].

Les protéomes du fluide épididymaire ont été caractérisés chez différentes espèces et plusieurs centaines de protéines ont déjà été identifiées [18-20]. Chez le bélier, plusieurs centaines de protéines ont été caractérisées dont une vingtaine sont quantitativement majoritaires et représentent 80 à 90% des protéines totales [15, 20, 21]. Parmi ces protéines, nous retrouvons la clusterine (CLU), la glutathion peroxydase (GPX5), la prostaglandine D2 synthase (PTGDS), la spermadhésine 1 (SPADH1), la lactoferrine (LTF), l’abumine, la cathepsine D (CTSD), Niemann-Pick disease type C2 (NPC2), la galactosidase, la glutathione S-transferase (GST), la beta-N-acétyl-hexosaminidase (HEXB), la mannosidase, la lipocalin 5 (LCN5) et la cysteine-rich secretory proteins (CRISP1) [20, 21] (Figure 3).

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27

Figure 3 : Protéines majoritaires du fluide épididymaire de bélier dans les différentes régions de l’épididyme.

Adapté de [20].

Ces protéines sont sécrétées par l'épithélium épididymaire avec une régulation différente selon la région de l’épididyme. En effet, plusieurs protéines sont sécrétées dans la tête de l’épididyme comme PTGDS et GPX5 tandis que la lactoferrine, NCP2 et la gelsoline sont sécrétées dans la région du corps et de la queue de l’épididyme [18].

La protéine majoritaire du fluide épididymaire de bélier est la clusterine constituant 30 % des protéines totales. La clusterine a la particularité d’interagir avec le spermatozoïde et de s’insérer dans sa membrane plasmique. Elle favoriserait avec la lactoferrine la protection de sites actifs à la surface du spermatozoïde en empêchant leur agglutination et en participant à la protection de son glycocalix après le coït [22]. D’autres protéines sécrétées dans le fluide de l'épididyme telles que GPX5, thiorédoxine, GST, PRDX 2 à 5 et SOD1 pourraient favoriser la survie des spermatozoïdes, en réduisant le stress oxydatif (ROS), la peroxydation des lipides ainsi que les mutations de l’ADN [23, 24].

Plusieurs protéines épididymaires se lient également sur la membrane des spermatozoïdes par des interactions électrostatiques et/ou hydrophobes comme par exemple CRISP1, des cathepsines, des Beta défensines (Beta-126), des inhibiteurs de protéases (Eppin, HongrES1) , la glutathion peroxydase 5 (GPX5), la clusterine, la PH-20 et la

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macrophage migration inhibitory factor [15, 18, 25, 26]. Les interactions hydrophobes et les échanges avec la membrane plasmique du spermatozoïde ne sont pas encore bien identifiées, néanmoins il semblerait que des épididymosomes (exosome épididymaire) [27], ainsi que la présence des GPI-anchored proteins participent à ces échanges hydrophobiques [25, 28].

L’acquisition de la mobilité du spermatozoïde épididymaire s’accompagne de processus complexes de phosphorylation et de déphosphorylation de plusieurs protéines du flagelle du spermatozoïde [18]. La mobilité est également régulée par des concentrations différentielles suivant les régions de l’épididyme de bicarbonate (HCO3-), d’AMPc et de Ca2+

[18, 29, 30]. En effet, l’activation de la voie AMPc-PKA dans l’épididyme conduit à la phosphorylation des tyrosines de certaines protéines constituantes du flagelle. La sous unité régulatrice de la PKA (RII regulatory) se lie et phosphoryle l’AKAP3 et 4 (constituants majoritaires de la gaine fibreuse du flagelle) en activant plusieurs tyrosines kinases en aval, telles que la tyrosine-protein kinase ABL1, la SRC et la tyrosine-protein kinase TEC [11, 31- 34]. Ces modifications de phosphorylation des protéines du flagelle ainsi que la présence de bicarbonate (HCO3-), d’AMPc et de Ca2+ sont donc associées à la maturation des spermatozoïdes épididymaires et à l’induction du battement flagellaire [18]. Chez le rat, les taux de phosphorylation des tyrosines sont plus importants sur la tête que sur le flagelle des spermatozoïdes immatures [30]. Les taux de phosphorylation de tyrosine sur le flagelle sont à l’inverse plus importants chez les spermatozoïdes matures [35].

Les protéines testiculaires de la famille des ADAMs (ADAM1, ADAM2, et ADAM3) sont présentes à la surface des spermatozoïdes, et subissent des clivages protéolytiques au cours de la maturation épididymaire, modifiant ainsi leur taille et leur localisation membranaire [36-38]. D’autres protéines comme l’ACE (angiotensin I-converting enzyme) d’origine testiculaire se retrouvent libérées de la membrane des spermatozoïdes durant leur transit dans l’épididyme [39]. L’ACE épididymaire permet la translocation d’ADAM 3 dans la membrane des spermatozoïdes de souris [40] [41]. Cette protéine à un rôle important, car les KO d’ADAM 2 et d’ADAM 3 ainsi que l’utilisation d’anticorps anti-ADAM 2 et anti-ADAM 3 a permis d’induire chez la souris une inhibition de plus 80% de la fusion des spermatozoïdes avec l’ovule et de plus de 90% de l’adhésion des spermatozoïdes avec la zone pellucide [42]

[43]. La protéine Calmegine semble être indispensable pour permettre la présence d’ADAM

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29

3 à la surface des spermatozoïdes ainsi que dans l'assemblage du complexe ADAM1a /ADAM2 [44, 45]. La localisation correcte d’ADAM 3 sur la tête des spermatozoïdes est donc essentielle pour leur migration dans le tractus génital femelle et leur pouvoir fécondant [40].

D’autres protéines épididymaires comme la PH-20 et CRISP1 contribuent également à l’interaction spermatozoïde-ovocyte [18, 46-50].

L’interaction et la liaison de certaines protéines épididymaires à la surface du spermatozoïde de mammifère, jouent un rôle dans sa capacité future à transiter dans le tractus génital femelle et dans sa faculté à interagir et à fusionner avec l’ovocyte [20, 43].

.3. Le plasma séminal, milieu de transport des spermatozoïdes

Lors de l'éjaculation, les spermatozoïdes de la queue de l'épididyme sont entrainés dans le canal déférent où ils se retrouvent en contact avec les sécrétions des glandes annexes (ampoules, vésicules séminales, prostate, glandes de Cowper (glandes bulbo- urétrales)). Ces sécrétions constituent la majeure partie du plasma séminal d’un éjaculat de bélier [13] (Figure 4). L’activité sécrétoire des glandes annexes est étroitement régulée par les androgènes [51].

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30 Figure 4: Anatomie de l’appareil reproducteur de bélier.

Adapté de [13].

Le plasma séminal comprend un mélange complexe de protéines, de lipides, d'ions inorganiques, d'acide citrique, de sucres et de sels organiques [52]. Il est riche en fructose, substrat métabolique prédominant du spermatozoïde qui participe au maintien de la mobilité flagellaire [53, 54].

Le plasma séminal permet de neutraliser l'effet négatif de l'acidité du vagin, et ainsi préserve la mobilité et la viabilité des spermatozoïdes [55]. Chez l’homme, la présence de HCO3/CO2 et des protéines dans le plasma séminal contribue pour respectivement 24,9% et 28,5% du pouvoir tampon du plasma séminal, tandis que l'autre moitié est fournie par des composants de bas poids moléculaire tels que le citrate, le phosphate inorganique et le pyruvate [56]. La présence de prostasomes dans le plasma séminal participerait par des mécanismes non identifiés à la protection des spermatozoïdes contre l’acidité du pH vaginal [57].

Les protéomes des plasmas séminaux de plusieurs espèces ont été analysés par électrophorèse bidimensionnelle (2D) et spectrométrie de masse [52, 58-62]. Ces protéomes de plasma séminaux ont été étudiés chez le taureau [63, 64], le verrat [65, 66], le bélier [52, 58, 60], le lapin [61], les camélidés [61] et l’homme [62, 67]. Chez l’homme, ils ont été

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31

étudiés dans plusieurs conditions physiologiques, dans le cas d’infertilités et d’anomalies des spermatozoïdes [68, 69], ou durant un cancer de la prostate [70, 71].

Des études ont montré chez le bélier que l’ajout de plasma séminal après conservation et/ou cryoconservation de la semence améliore les taux de gestation après insémination artificielle (IA) cervicale [72, 73]. En effet, il a été montré que le plasma séminal et certaines de ses protéines améliorent la capacité des spermatozoïdes humains [74], de bélier [72] et de buffle [75] à migrer à travers le mucus cervical. Cependant, des analyses approfondies des mécanismes protéiques mis en jeu sont nécessaires, afin de clarifier le rôle des protéines du plasma séminal.

Les principales protéines du plasma séminal de bélier et de nombreux mammifères appartiennent à deux grandes familles, à savoir les spermadhésines et les BSPs (Binder of Sperm Proteins). La première famille, les spermadhésines, comprend les bodhésines chez le bélier et le bouc [60, 76], et l’AWN-1, l’AWN-2, l’AQN-1 et l’AQN-3 chez le verrat [58, 77, 78].

Les spermadhésines sont en grande partie sécrétées par les vésicules séminales, à l'exception de l’AWN-1 (qui est d’origine épididymaire et testiculaire) [79]. Les membres de la famille des spermadhésines sont des protéines de 12-16 kDa capables de se fixer sur les spermatozoïdes [80, 81]. Elles permettraient d’améliorer le transit des spermatozoïdes dans l’oviducte, et favoriseraient la liaison à la zone pellucide de l’ovule [82-84].

La famille des BSPs regroupe les protéines contenant des domaines fibronectine de type II [85]. Chez le bélier, seules la BSP-1 (RSVP14) et la BSP-5 (RSVP20) provenant des vésicules séminales sont retrouvées dans le plasma séminal [59, 60]. Des familles de BSPs orthologues, sont également présentes chez de nombreux mammifères comme le rat, la souris, l’homme, les bovins, caprins et porcins [61, 86, 87], ce qui en fait une famille de protéines conservée au cours de l’évolution.

Les protéines BSPs ont la propriété d'interagir avec la phosphatidylcholine de la membrane plasmique des spermatozoïdes, avec des lipoprotéines de haute et de basse densité (HDL et LDL), ainsi qu’avec l'héparine [88]. Les BSPs pourraient permettre la régulation de la capacitation durant le transit des spermatozoïdes [58, 89]. En effet, il a été montré que les BSPs interagissent avec les phospholipides membranaires du spermatozoïde

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32

tout en stimulant l'efflux de cholestérol membranaire [90]. Les BSPs protègent également la membrane des spermatozoïdes contre les dommages causés par la cryoconservation [91].

D’autres protéines ont été identifiées dans le plasma séminal, comme l'albumine, la peroxiredoxine, la superoxyde dismutase (SOD), la lactoferrine, l’apolipoprotein A1, les heat shock proteins (70 et 90 kDa), les T-complex containing proteins, la clusterin et les cathepsins [60].

Tableau 1 : Principales fonctions identifiées dans le protéome du plasma séminal.

-Protéines de protection contre le stress oxydatif (Tableau 1):

L’albumine a la particularité de protéger les spermatozoïdes contre le stress oxydatif en piégeant les radicaux libres [92]. D’autres protéines comme les peroxiredoxines et la SOD protègent également contre le stress oxydatif [93]. Des protéines chaperonnes sont également retrouvées dans le plasma séminal de bélier, comme les protéines de choc thermique HSP70, HSP90, ou d’autres comme TCP1 et la clusterine [60]. Ces protéines sont sécrétées en réponse à des dommages cellulaires et protègent les cellules en empêchant l'accumulation de protéines de mauvaise conformation [94]. HSPA2 et HSPA8 participeraient au stockage des spermatozoïdes dans l’isthme de l’oviducte et à la reconnaissance de l’ovule [95, 96].

Protéines de protection contre le stress oxydatif : Albumine

HSP70 HSP90 HSPA2 HSPA8

Peroxiredoxines Superoxyde dismutase TCP1

Protéines immunitaires : Immunoglobulines Lactoferrine α2-macroglobulin β2-microglobulin

Protéines intervenant dans les modifications membranaires : Apolipoprotein A-I binding protein

Binder of Sperm Protein Cathepsines

Cystatine C Spermadhésines

(34)

33 -Protéines immunitaires :

La lactoferrine lie et transporte le fer. Elle est sécrétée par les cellules de Sertoli, l’épithélium épididymaire et par certaines glandes annexes. Cette protéine antimicrobienne protège les spermatozoïdes en permettant la chélation du fer libre, empêchant ainsi la peroxydation lipidique [97, 98]. D’autres protéines retrouvées dans le plasma séminal interviennent dans la régulation des défenses immunitaires femelle en ayant un effet immunosuppresseur [99, 100]. Parmi ces protéines nous retrouvons la α2-macroglobulin, la β2-microglobulin et des Immunoglobulines [101] (Tableau 1).

-Modifications membranaires :

L’Apolipoprotéine A1, présente dans le plasma séminal de bélier et de bovin [60, 102], est une lipoprotéine de haute densité (HDL) qui fonctionne comme un accepteur de cholestérol et de phospholipides durant la capacitation des spermatozoïdes induite par l’interaction avec les BSPs [103]. L’Apolipoprotéine A1 se lierait également à une protéine de liaison phosphorylée, l’apolipoprotein A-I binding protein, située sur l'acrosome et la pièce intermédiaire des spermatozoïdes de souris [104], provoquant une libération de celle-ci et favorisant leur capacitation.

Des protéases présentes dans le plasma séminal comme les cathepsines participent au remodelage de la membrane des spermatozoïdes durant la capacitation [105]. Les cathepsines sont des cystéines protéases qui participent à la dégradation de protéines, au remodelage de protéines membranaires et à l'activation de précurseurs enzymatiques sécrétés dans les fluides des glandes annexes [106, 107]. Néanmoins, des inhibiteurs de cystéines protéases, les cystatines, notamment la cystatine C présente dans le plasma séminal de bélier et d’humain, pourraient exercer un rôle de régulateur, en protégeant les spermatozoïdes contre l'activité excessive des cathepsines et d'autres protéases [60, 108].

Les protéines du plasma séminal ont donc un rôle de protection des spermatozoïdes contre le stress oxydatif et les infections. De plus, elles participent à la régulation de la

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34

capacitation et de la réaction acrosomique, ainsi que dans le remodelage de la membrane plasmique et l'interaction sperme-ovocyte [101] (Tableau 1).

II. Transit des spermatozoïdes à travers le tractus génital femelle de mammifères.

Juste après le coït ou IA cervicale, les spermatozoïdes éjaculés vont rencontrer le mucus cervico-vaginal qui constituera la première barrière de sélection des spermatozoïdes.

.1. Transit des spermatozoïdes à travers le cervix

.A. Composition du mucus cervico-vaginal

Le mucus cervical est un gel produit dans le cervix par de nombreuses glandes présentes au niveau de la muqueuse tubulaire, étroitement régulées par le cycle œstral [109]. C’est un hydrogel viscoélastique composé de 95 à 99 % d’eau, d’un mélange de constituants organiques, de cellules (leucocytes, lymphocytes et cellules épithéliales), d’ions inorganiques, d’enzymes, de protéines bactéricides, de protéines plasmatiques, et surtout de mucines [110]. Il existe une grande variété de mucines puisque 11 gènes MUC ont été identifiés chez l’homme [111]. Les mucines, qui sont de très larges glycoprotéines d’une taille d’environ 500 kDa, composent l’armature de l’hydrogel. Ces glycoprotéines ont la particularité d’être glycosylées sur leurs domaines terminaux NH2 et COOH. Les O- glycosylations et N-glycosylations des domaines terminaux jouent un rôle dans l’initiation de la dimérisation, la polymérisation et dans la création de structures polymériques de 2 à 50 MDa [112]. Ces chaines glucidiques sont constituées de 9-10 unités monosaccharidiques comme la N-acétylgalactosamine (GalNAc), qui peut être liée à du galactose (Ga), de la N- acétylglucosamine (GlcNAc), et se termine par un acide sialique (NeuAc) ou du fucose (Fuc).

Le résidu N-acétylgalactosamine est toujours réduit et permet l’ancrage de la chaîne O- glycosylée liée à une sérine ou une thréonine. Les résidus N-Acétylglucosamine et galactose peuvent subir une sulfatation [113].

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35

La mucine majoritaire du mucus cervico-vaginal est la mucine 5B (MUC5B), mais il y a également la présence en plus faible quantité de MUC5AC [110, 114]. La concentration en mucine MUC5B dans le mucus cervical humain varie durant le cycle et elle atteint un maximum au moment de l’ovulation [115] [116].

Le profil protéomique et les protéomes de mucus cervicaux principalement humains ont déjà été analysés dans plusieurs conditions physiologiques en électrophorèse bidimensionnelle (2D) et spectrométrie de masse [117, 118]. Ces protéomes de mucus cervicaux humains ont été essentiellement étudiés au cours de la grossesse [119-121], au cours de pathologies comme des infections avec le papillomavirus humain [122] ou par des candida albicans [123], ainsi qu’en cas de cancer cervical [124]. Néanmoins, peu d’études ont été réalisées sur le protéome du mucus cervical durant le cycle sexuel [116, 125] et aucune n’a été faite chez l’espèce ovine. Chez le bovin, le protéome du mucus cervical et le transcriptome des cellules cervicales ont été analysés durant le cycle œstral [125, 126].

Ces protéomes ont permis d’identifier de nombreuses protéines classées en plusieurs catégories ; majoritairement des protéines issues du métabolisme, de la réponse immunitaire et du transport [121, 124] (Tableau 2).

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36

Tableau 2 : Principales fonctions identifiées dans le protéome du mucus cervical.

-Les protéines de transport :

L’albumine est une protéine de transport, elle est le composé protéique majoritaire du mucus cervical. L’albumine a la particularité de se lier à de très nombreuses protéines, acides gras, hormones et médicaments. L’albumine associée à des lipides a également la propriété d’interagir avec des glycoprotéines comme les mucines; sa présence en forte quantité permettrait d’augmenter la viscosité du mucus comme cela a été montré pour le mucus gastrique [127] [128] (Tableau 2).

Protéines de l'immunité : Céruloplasmine

Défensines DMBT1

Galectin-3 binding protein Haptoglobine

Lactoferrine Lysozyme

Protéines du métabolisme : Enzymes de la glycolyse Fatty acid-binding protein

Protéines du stress oxydatif : Glutathion S-transférases

Heat shock protein 70 alpha et beta Heat shock protein 90 alpha et beta Oxydoréductases

Peroxyrédoxines Superoxide dismutase Thiorédoxine

Protéines du cytosquelette ou d’adhésion cellulaire : Cornifine B

Desmogleine Envoplakine Fibronectine Myosines β-actine

(38)

37 -Les protéines de l’immunité :

La lactoferrine est présente en grandes quantités dans le mucus cervical ou elle pourrait avoir un rôle d’antioxydant et d’antibactériens [121] [118]. La lactoferrine participe également à l’immunité innée mucosale par sa forte action antivirale notamment en diminuant fortement la transmission et la propagation des rétrovirus et des cytomégalovirus chez la femme [129] [130]. La lactoferrine interagit avec de nombreux composés protéiques comme DMBT1 [131]. Ce dernier interagit également avec la MUC5B, les IgA et la trefoil factor 2 [131]. DMBT1 est impliqué dans l’agglutination de nombreuses bactéries Gram positive et négative [131].

D’autres protéines retrouvées dans le mucus cervical participent activement à la défense mucosale, par exemple les défensines. Les défensines sont des peptides ou petites protéines de charge cationique qui présentent des activités antivirales, antibactériennes et antifongiques [132]. Elles font partie intégrante du système de défense inné ; leurs propriétés cationiques leurs permettent de s’insérer dans les membranes où elles pourraient former des pores qui déstabiliseraient la membrane plasmique des cellules cibles [133]

[132]. Les principales défensines retrouvées chez la plupart des mammifères sont les défensines alpha et bêta. Néanmoins, chez les ovins et les bovins le gène de l’alpha défensine n’a pas été retrouvé dans leur génome [134] (Tableau 2).

La lysozyme, la galectin-3 binding protein, l’haptoglobine et la céruloplasmine dans le mucus cervical participent à l’immunité innée mucosale [135-138]. La galectin-3 binding protein est fortement surexprimée durant une inflammation ou une infection; elle a la capacité de se lier et d’activer les neutrophiles. Elle permet également de favoriser leurs extravasations par diapédèse (mouvement des leucocytes hors du système circulatoire) [139] [140].

La céruloplasmine, par sa fonction de transporteur du cuivre ainsi que par ses interactions avec des protéines de l’immunité comme la lactoferrine, participe à la défense cellulaire contre les infections et le stress oxydatif [141].

(39)

38 -Protéines du métabolisme et du stress oxydatif :

De nombreuses protéines issues du métabolisme ont été identifiées, notamment des protéines du métabolisme et du transport des acides gras comme la Fatty acid-binding protein (FABP) [122]. Neuf FABP sont à ce jour identifiées, elles ont pour fonction de se lier aux acides gras afin de faciliter leur transport dans des milieux aqueux [142].

Des nombreuses enzymes de la glycolyse comme la Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, l’enolase et la pyruvate kinase ont été identifiées dans le mucus cervical [122].

Des protéines de protection au stress oxydatif ont également été identifiées comme les Heat shock protein 70 alpha et beta, Heat shock protein 90 alpha et beta, la thiorédoxine, des peroxyrédoxines, des glutathion S-transférase et superoxide dismutase [143] [121]. Les Heat Shock Protein (HSP) sont des protéines chaperonnes ; elles ont la particularité de se lier aux protéines non conformes afin de les stabiliser. Ainsi, elles permettent le transport et la dégradation des protéines non conformes. L’expression des HSP est induite lors de changements environnementaux soudain, par exemple lors de stress thermique, ou lors d’un contact avec des oxydants, des métaux lourds ou des poisons métaboliques [144] (Tableau 2).

Des oxydoréductases et des antioxydants comme les peroxyrédoxines, les thiorédoxines, des glutathions S-transférase et les superoxydes dismutase sont retrouvés dans le mucus cervical. Les peroxyrédoxines et les thiorédoxines sont des protéines antioxydantes impliquées dans de nombreuses fonctions cellulaires, y compris dans la prolifération cellulaire, la différenciation, l'expression de gènes et l'apoptose [145, 146].

Ensemble, ces protéines forment un système de protection contre le stress oxydatif en transformant les radicaux libres comme l’O2-

en H2O2 puis en H2O à l’aide des peroxydases.

-les protéines du cytosquelette :

De nombreuses protéines associées au cytosquelette ou à l’adhésion cellulaire comme la β-actine, la cornifine B, l’envoplakine, la fibronectine, des myosines et la desmogleine ont déjà été identifiées dans le mucus cervical humain [118, 121, 122]. Chez la femme, l’épithélium vaginal subit des changements durant le cycle, notamment une légère

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