3 Altération de la fonction des intégrines à la surface des LTC-IC de sang mobilisé amplifiées ex vivo

3 Altération de la fonction des intégrines à la surface des LTC-IC de sang mobilisé

amplifiées ex vivo

3.1 Introduction

En culture d’expansion, l’utilisation de facteurs de croissance à action précoce tels que Flt-3 et TPO induit la mise en cycle de la majorité des CSPH incluant la sous-population cellulaire la plus primitive (Bhatia et al, 1997;Herrera et al, 2001;Glimm & Eaves, 1999;Bennaceur- Griscelli et al, 2001). A ce jour, l’amplification ex vivo des CSH a été systématiquement associée à une capacité implantatoire réduite de ces cellules chez l’hôte (Gothot et al, 1998;Yong et al, 2002;Glimm et al, 2000;Ahmed et al, 2004). L’influence du cycle cellulaire sur cette perte de fonction est toujours méconnue. Néanmoins, les CSH primitives générées ex vivo pourraient interagir différemment avec divers ligands de l’environnement médullaire comparativement aux cellules non cultivées, ce qui altèrerait leur capacité implantatoire.

Des changements de ce type ont déjà été observés au cours d’expériences menées au sein de notre laboratoire. Ainsi, la mise en cycle des CSH a induit une augmentation de l’adhérence à la Fn causée par l’activation de VLA-5. Cette adhérence ferme était également associée à un déficit migratoire au travers d’un gradient de SDF-1 in vitro (Giet et al, 2001).

De nombreux signaux générés dans le microenvironnement médullaire veillent au contrôle strict de l’hématopoïèse. Au-delà des nombreuses cytokines activatrices et inhibitrices produites majoritairement par les cellules stromales, le stroma médullaire lui-même régule la prolifération et la différenciation des CSH. Dès lors, une interaction différente des CSH vis- à-vis des ligands du stroma médullaire pourrait altérer la régulation de l’hématopoïèse.

Le simple contact entre les CSH et les cellules stromales est suffisant pour interférer sur les capacités prolifératives et différenciatives des CSH.

Un exemple typique est la « culture de Dexter » où les CSH sont cultivées sur une couche de cellules stromales adhérentes. Dans ces conditions, la différenciation des cellules souches est retardée contrairement aux divisions d’autorenouvellement qui sont promues (Bennaceur-Griscelli et al, 2001;Bennaceur-Griscelli et al, 1999). La production de cytokines inhibitrices (TGF-β (Eaves et al, 1991), MIP-1α (Eaves et al, 1993), SDF-1 (Cashman et al, 2002a) ou MCP-1 (Cashman et al, 1998)) par les cellules supportives ne semble pas être en cause ; l’inhibition de la prolifération des LTC-IC étant conservée au contact d’un stroma fixé à la glutaraldéhyde qui ne produit aucune cytokine activatrice ou inhibitrice(Verfaillie &

Catanzaro, 1996). Le contact direct entre les LTC-IC et le stroma est donc suffisant pour inhiber la prolifération cellulaire.

De manière identique, l’engagement des récepteurs d’adhérence par les protéines de la MEC contribue au contrôle de la prolifération des CSH.

Sous condition physiologique, la culture de cellules CD34+ en présence de Fn empêche leur

entrée en phase S du cycle cellulaire. Cet effet anti-prolifératif n’est observé qu’en présence

76 de faibles concentrations de cytokines. En effet, l’utilisation de doses massives de cytokines en culture d’expansion outrepasse l’inhibition médiée par la Fn (Jiang et al, 2000a;Jiang et al, 2000b). Les mécanismes moléculaires mis en œuvre sont une inactivation de la kinase cycline-dépendante (cdk)-2, une diminution de la concentration cellulaire en cycline E et une augmentation du taux de la protéine p27

(figure 3.1.).

Un effet antiprolifératif similaire est observé lors de l’engagement des sous-unités α 4 ou β 1 des intégrines par un anticorps monoclonal ; ceci indique que les signaux responsables de la quiescence mitotique sont transmis par VLA-4 (Hurley et al, 1997).

D’autres récepteurs cellulaires, dont les sialomucines PSGL-1 (Levesque et al, 1999), CD164 (Zannettino et al, 1998b), CD43 (Bazil et al, 1995b;Bazil et al, 1996) et CD44 (Ghaffari et al, 1995), sont également impliqués dans le contrôle de la prolifération des CSPH.

Le maintien de la quiescence mitotique des CSH, processus faisant partie intégrante des mécanismes de contrôle de l’hématopoïèse, s’effectue donc sous l’action combinée de cytokines et de l’attachement aux cellules et protéines du stroma médullaire.

Figure 3.1. Mécanismes de régulation du cycle cellulaire, les complexes protéiques cycline/CDK et P27

.

A. Contrôle du cycle cellulaire par les couples cycline/CDK. La transition entre chaque étape du cycle cellulaire est régulée selon la concentration intracellulaire en complexes protéiques cycline/CDK particuliers. Ainsi la phase G1 se caractérise par une concentration importante en cycline D/CDK4-6, cycline E/CDK2 et par la libération du facteur de transcription E2F. Les complexes protéiques cycline A/CDK1 et cycline B/CDK1 deviennent prédominants à la phase G2/M.

B. Inhibition de la mise en cycle par la Fn. L’adhérence à la Fn stimule la production de P27

, une protéine occupant un rôle majeur dans le contrôle de la prolifération cellulaire. En effet, elle inhibe la formation du complexe cycline D / CDK4-6 responsable de la phosphorylation de la protéine Rb. Cette protéine, sous sa forme non phosphorylée, séquestre le facteur de transcription E2F. La phosphorylation de Rb s’accompagne de la libération du facteur de transcription E2F à l’origine de la synthèse d’un grand nombre de protéines essentielles à la mise en cycle cellulaire.

A B

3.2 Objectifs de travail

Les récepteurs d’adhérence des CSH contribuent au maintien de nombreuses fonctions cellulaires. L’altération de leur activité, à la suite d’une manipulation ex vivo, peut compromettre les capacités prolifératives, différenciatives et implantatoires des CSH in vivo.

Nous avons donc étudié la répercussion de la mise en cycle ex vivo des CSH sur leurs interactions statiques et dynamiques vis-à-vis de différents ligands du stroma médullaire.

La stratégie mise en œuvre consiste à comparer la motilité, les capacités d’adhérence et le potentiel prolifératif des LTC-IC non stimulées ou ayant accompli 1 ou 2 divisions d’autorenouvellement ex vivo. Le comportement des 3 populations cellulaires a été évalué sur 7 matrices caractéristiques de l’endothélium et du stroma (CH-296, H-296, C-274, sélectine-E, sélectine-P, VCAM-1, ICAM-1). Ceci nous renseignera sur les modifications d’expression ou d’affinité des récepteurs membranaires correspondants après division cellulaire ex vivo.

Afin de distinguer, après culture d’expansion, les cellules restées quiescentes des cellules ayant entamé une ou plusieurs divisions mitotiques, nous avons utilisé la méthode du « cell tracking » accessible grâce à la cytométrie en flux. Cette technique permet de visualiser, avec une haute résolution, les diverses populations cellulaires ayant chacune accompli un nombre défini de divisions.

3.3 Résultats

3.3.1 « Cell tracking » : mise au point.

3.3.1.1 Cinétique de prolifération cellulaire

Afin d’évaluer l’activité des intégrines au cours de divisions d’autorenouvellement

successives, il était capital de pouvoir identifier les cellules restées quiescentes et les cellules

ayant parcouru 1 ou 2 cycles de divisions. Nous avons donc utilisé la technique du « cell

tracking » au CFSE par cytométrie en flux (cfr matériels et méthodes, point 2.2.1) (Nordon et

al, 1997;Glimm & Eaves, 1999;Kulka & Metcalfe, 2005;Bennaceur-Griscelli et al, 2001). Après

culture d’expansion, celle-ci a permis de visualiser avec une haute résolution les populations

cellulaires quiescentes ou ayant entrepris un nombre précis de divisions cellulaires (figure

3.2.).

78

T

T

T

Figure 3.2. Cinétique de prolifération cellulaire après marquage au CFSE.

Après marquage au CFSE, les cellules ont été analysées au FACS à l’initiation de la culture et après 72 et 96 heures de culture. Au cours de chaque division mitotique, le marqueur intracellulaire est réparti uniformément entre les 2 cellules filles. Après 72 heures de culture, la dilution linéaire et progressive du CFSE à chaque génération cellulaire est visualisée par cytométrie en flux sous la forme de pics d’intensité correspondant chacun à une population cellulaire ayant accompli un nombre précis de divisions. Ceux-ci nous ont permis d’identifier et d’isoler physiquement les populations cellulaires d’intérêt.

Après marquage au CFSE, les cellules CD34+ ont été placées en culture d’expansion supplémentée des cytokines SCF, TPO, Flt-3, Il-6 et G-CSF. Après 72 heures, les cellules amplifiées se sont réparties en 4 populations distinctes. La proportion de cellules restées quiescentes correspondait à 8.5% des cellules cultivées, celles ayant subi 1 division à 60%, 2 divisions à 28% et 3 divisions à 3.5%. Les cellules non divisées, proliférant lentement, ont disparu après 24 heures de culture supplémentaire. Par cytométrie en flux nous avons séparé et isolé les cellules ayant accompli 1 et 2 divisions. La motilité, l’adhérence et le contrôle de la prolifération de ces 2 populations cellulaires ont été comparés aux cellules n’ayant été soumises à aucune stimulation ex vivo par des cytokines.

3.3.1.2 Toxicité du CFSE sur les progéniteurs

Nous avons évalué l’influence du CFSE sur la croissance des progéniteurs hématopoïétiques

(figure 3.3.).

0 10 20 30 40 50 60

0 5.10-6 10-5

[CFSE, M]

# p ro g é n it e u rs

Figure 3.3. : Effet du CFSE sur la croissance des progéniteurs clonogènes.

Des cellules CD34+ de sang de cordon ont été marquées aux concentrations indiquées en CFSE, puis reclonées en milieu semi-solide. Le nombre de progéniteurs viables à chaque concentration testée est indiqué pour 300 cellules ensemencées (n=4).

Ces tests nous ont montré l’effet toxique du CFSE sur les cellules progénitrices. Cette toxicité paraît être dose-dépendante et minimale à la concentration de 5.10

M utilisée pour ce travail.

3.3.1.3 Activité LTC-IC au cours des divisions cellulaires

Nous avons déterminé si l’activité LTC-IC globale des cellules AC133+ marquées au CFSE différait entre les populations cellulaires D0, D1 et D2.

0 5 10 15 20 25 30 35

D0 D1 D2

a c ti v it é L T C -I C

Figure 3.4. Activité LTC-IC de cellules AC133+ au cours de divisions cellulaires.

Un nombre défini de cellules AC133+ natives (D0) ou obtenues après 1 ou 2 divisions ont été

ensemencées en culture à long terme. L’activité LTC-IC est représentée par le nombre de

progéniteurs secondaires pour 100 cellules ensemencées en culture à long terme (n = 6).

80 L’activité LTC-IC des cellules en D1 et D2 était respectivement de 27.9 et 28.9 CFC secondaires / 100 cellules, ce qui était semblable à l’activité LTC-IC mesurée pour la population D0 native (28.5 CFC / 100 cellules) (figure 3.4.).

Malgré l’hétérogénéité des vitesses de prolifération des cellules amplifiées ex vivo, les cellules ont principalement exécuté des divisions d’autorenouvellement.

3.3.2 Activité des intégrines au cours de cycles cellulaires successifs

3.3.2.1 Interférence des ligands sur le développement des cultures à long terme.

Pour déterminer les capacités d’adhérence des LTC-IC, des plaques de culture ont été coatées avec différentes protéines de matrice. Des cellules hématopoïétiques furent alors déposées sur ces surfaces et, après élimination des cellules non adhérentes, les cellules adhérentes ont été recouvertes de cellules stromales pour initier une culture à long terme. Il était important de vérifier que la présence des protéines de matrice n’interfère pas sur le développement ultérieur des LTC-IC. Pour ce faire, des cellules CD34+ ont été déposées dans des puits coatés avec les différents ligands testés (matériels et méthodes, tableau 2.2.) ou dans un puits non coaté et ensuite, additionnées de cellules stromales MS-5 pour initier la culture à long terme. L’activité LTC-IC obtenue a été comparée dans ces différentes conditions.

Figure 3.5. Effet des protéines de matrice sur l’activité LTC-IC de cellules CD34+.

L’activité LTC-IC des cellules a été mesurée dans des puits recouverts des protéines indiquées

(le puits contrôle n’est pas coaté) n=1. L’activité LTC-IC représente le nombre de progéniteurs

secondaires pour 100 cellules ensemencées.

Par comparaison avec le contrôle, on constate que les matrices ont eu peu d’effet sur la prolifération des LTC-IC à l’exception de la sélectine-P, pour laquelle une diminution importante du développement des LTC-IC fut relevée (figure 3.5.).

La couche stromale MS-5, nécessaire au maintien des cultures à long terme, se décrochait systématiquement du fond des puits préalablement couverts de sélectine-P. Seule cette matrice nous a posé ce problème. Pour y remédier lors de nos expériences d’adhérence, un ajout hebdomadaire de cellules MS-5 fut apporté afin de limiter au maximum les effets engendrés par cette perte de support stromal pour les LTC-IC.

3.3.2.2 Altération des propriétés d’adhérence dépendantes des intégrines après amplification ex vivo des LTC-IC

Afin d’évaluer la contribution spécifique de VLA-4 et de VLA-5 dans les processus de migration, d’adhérence et de contrôle de la prolifération, différents fragments de fibronectine générés par recombinaison génétique ont été mis à notre disposition par la société Takara (van der Loo et al, 1998). Le fragment CH-296 (rétronectine) est reconnu par VLA-4 au niveau du domaine CS-1 et par VLA-5 via son domaine CBD. Le fragment H-296 ne contient que le domaine CS-1 liant VLA-4 tandis que le fragment C-274 ne contient que le domaine CBD liant VLA-5 (voir introduction, figure 1.11).

L’adhérence des LTC-IC natives ou ayant accompli 1 ou 2 divisions en culture d’expansion a

été mesurée au contact des fragments de Fn CH-296 (VLA-4 et VLA-5), H-296 (VLA-4) et C-

274 (VLA-5), des sélectines-E et -P ainsi que sur VCAM-1 et ICAM-1 (schéma expérimental,

voir matériels et méthodes point 2.2.3).

82 Figure 3.6. Adhérence des LTC-IC après divisions ex vivo.

Le taux d’adhérence des LTC-IC sur les protéines de matrice indiquées a été mesuré avant culture et après exécution d’1 ou 2 divisions d’autorenouvellement ex vivo (n = 3).

* : P<0.05 par rapport aux cellules natives (D0) (test de Student).

Le taux d’adhérence des LTC-IC natives au fragment CH-296 était de 19.7±0.6%. Comme nous (Huygen et al, 2002) et d’autres groupes (van der Loo et al, 1998;Hurley et al, 1995) l’avions déjà montré, cette adhérence est dépendante de l’intégrine VLA-4 (adhérence à H- 296 : 28.3±2.6%), contrairement à VLA-5 qui n’y contribue pas (adhérence à C-274 : 10±1.6%). Les taux d’adhérence à VCAM-1 et ICAM-1 étaient respectivement de 33.5±4.8%

et 19.8±2.9%. Le taux d’adhérence à la sélectine–E était de 24.3±2.5%. Par contre, les cellules n’adhéraient pas à la sélectine–P.

Après avoir entrepris 1 ou 2 divisions d’autorenouvellement ex vivo, l’adhérence des LTC-IC sur la fibronectine CH-296 (p<0.05) a augmenté. Celle-ci semblait dépendante d’une activation de VLA-5 (Giet et al, 2001), comme en témoignait l’augmentation d’adhérence au fragment C-274. Le VLA-4 était pour sa part inactivé, l’adhérence au fragment H-296 et à VCAM-1 étant diminuée (p<0.05). Le taux d’adhérence à ICAM-1 était également réduit après culture (p<0.05). Aucune modification de l’adhérence sur la sélectine–E et ICAM-1 n’a été observée. Les LTC-IC étaient restées également non adhérentes à la sélectine–P après expansion (figure 3.6.).

* *

* *

* *

*

3.3.2.3 Altération des interactions dynamiques dépendantes des intégrines après amplification ex vivo des LTC-IC La motilité des LTC-IC natives ou amplifiées ex vivo a été évaluée par migration dirigée vers un milieu conditionné par la lignée stromale MS-5. Les matrices testées étaient la fibronectine, les sélectines–E et –P ainsi que le VCAM-1 et l’ICAM-1 (schéma expérimental, voir matériels et méthodes point 2.2.4).

Figure 3.7. Migration des LTC-IC après divisions ex vivo.

Le taux de migration des LTC-IC vers un gradient chimioattractant et au travers des protéines de matrices indiquées a été mesuré après 1 ou 2 divisions ex vivo (n = 3) et comparé aux taux de migration avant culture (cellules natives, D0).

* : P<0.05 par rapport à D0 (test de Student).

La migration des LTC-IC natives était efficace au travers du fragment CH-296 (52.8±3.63%) et VCAM-1 (43.4±4.3%). La migration au travers de Fn semblait dépendre principalement de VLA-4 au dépend de VLA-5 comme l’attestait la migration importante au travers du fragment H-296 (35.7±2.4%) et minimale via le fragment C-274 (11.4±2.6%) (figure 3.7.). La sélectine–E (22.2±3.2%) et ICAM-1 (20.5±0.2%) étaient des supports moyennement efficaces pour soutenir la motilité des LTC-IC non cultivées.

Après amplification ex vivo, les interactions dynamiques médiées par VLA-4 avec les fragments H-296 et VCAM-1 ont été inactivées et ce, dès la première division (p<0.05). Par contre la migration au travers de C-274 est augmentée dès la première division (p<0.05).

* *

* *

* *

* *

* *

84 L’activation de VLA-5 n’était apparemment pas suffisante pour rétablir la migration au travers de CH-296 (p<0.05), fragment porteur des sites de liaisons pour VLA-4 et VLA-5.

Une diminution significative de la migration a également été observée au travers d’ICAM-1 (p<0.05). Aucune modification de migration à travers la sélectine–E n’a été observée. Enfin, nous signalons l’absence de migration à travers la sélectine–P par rapport à la migration contrôle sur BSA.

3.3.2.4 Altération du contrôle de l’hématopoïèse dépendant des intégrines après amplification ex vivo des LTC-IC

Nous avons enfin évalué si, en plus des modifications d’adhérence statique et dynamique, l’amplification ex vivo altérait le rôle régulateur du stroma sur la croissance des CSH.

Inhibition de l’activité LTC-IC par les ligands du stroma médullaire.

Des CSH AC133+ de SP natives ou amplifiées ont été incubées aux contacts des matrices reprises au tableau 2.2 du chapitre « matériels et méthodes » en présence de faibles concentrations de cytokines durant 7 jours. Au terme de cette période, l’activité LTC-IC a été mesurée et comparée à la culture contrôle réalisée sur un support de BSA (schéma expérimental, voir matériels et méthodes point 2.2.5).

Nous avons constaté une inhibition de la prolifération des cellules AC133+ natives de 48% en

présence du fragment de Fn CH-296 ; ce qui confirmait les résultats obtenus par d’autres

équipes (Hurley et al, 1995;Jiang et al, 2000a). Cet effet était dépendant de l’intégrine VLA-4,

comme en attestait l’absence d’activité inhibitrice du fragment C-274 (12% p>0.05) et

l’inhibition de la prolifération importante observée au contact du fragment H-296 (56%,

p<0.05). L’expansion sur VCAM-1 était réduite de 19%. Comme cela avait été décrit par

Levesque et al. (Levesque et al, 1999), la sélectine-P réduisait également l’expansion

cellulaire. La sélectine–E et ICAM-1 n’avaient, pour leur part, aucun effet sur la prolifération

des LTC-IC (figure 3.8.).

Figure 3.8. Inhibition de la prolifération des LTC-IC par les ligands du stroma médullaire avant et après expansion.

L’activité LTC-IC de CSH AC133+ natives ( ) ou amplifiées ex vivo ( ) a été déterminée après une culture secondaire sous faible stimulation par les cytokines et au contact de fragments purifiés de la MEC. Celle-ci a été ensuite comparée à l’activité LTC-IC contrôle obtenue sur BSA afin d’évaluer l’impact des protéines de matrice sur la prolifération des LTC- IC.

* : % inhibition statistiquement significatif par rapport à BSA (p<0.05)

# : Différence significative entre les % inhibition des LTC-IC natives et amplifiées

Les LTC-IC préalablement amplifiées ont montré un comportement prolifératif différent sur ces divers fragments de matrices. Le fragment de Fn a conservé sa capacité inhibitrice sur les LTC-IC amplifiées. Néanmoins, cet effet est moins prononcé par rapport aux LTC-IC natives (32% d’inhibition) et il est dépendant de VLA-5 (C-274 : 40% d’inhibition) contrairement à l’engagement de VLA-4 qui semble dépourvu d’effet (H-296 : 13% d’inhibition). La sélectine–

P et VCAM-1 ont pour leur part perdu toute activité.

Inhibition de l’activité LTC-IC par les fragments de Fn sous différentes conditions de stimulation par les cytokines

L’effet suppresseur des divers fragments de Fn sur l’hématopoïèse a été étudié plus en

profondeur en comparant l’impact des fragments CH-296, H-296 et C-274 sur la mise en

cycle des LTC-IC natives ou amplifiées ex vivo soumises à de faibles ou fortes concentrations

de cytokines (schéma expérimental, voir matériels et méthodes point 2.2.5) (figure 3.9.).

86 Figure 3.9. Inhibition de la mise en cycle des LTC-IC par divers fragments de Fn sous différentes conditions de stimulation par les cytokines.

L’activité LTC-IC de CSH AC133+ natives ou amplifiées a été évaluée après une culture secondaire sous condition de stimulation par les cytokines variées et au contact de fragments purifiés de Fn. Celle-ci a été ensuite comparée à l’activité LTC-IC contrôle obtenue sur un support de BSA.

* : inhibition des LTC-IC pour le fragment indiqué significativement différente en comparaison de l’inhibition des LTC-IC natives sous faible stimulation par les cytokines (p<0.05).

# : inhibition des LTC-IC significativement différente en comparaison de l’inhibition des LTC-IC natives sous faible stimulation par les cytokines (p<0.1).

L’inhibition de l’activité LTC-IC par le fragment CH-296 est observée pour les cellules natives sous faible stimulation par les cytokines (48%) et est uniquement dépendante de VLA-4 (H- 296 : 56%, C-274 : 12%). La stimulation par des doses massives de cytokines avant (H-296 : 18%) ou pendant (H-296 : 20%) le contact avec le fragment H-296 abolit l’effet inhibiteur sur la prolifération. Nous pouvons donc conclure que l’inactivation de VLA-4 est fonction de la durée et de l’intensité de la stimulation des récepteurs aux cytokines.

Par contre l’inhibition de l’activité LTC-IC par le fragment C-274 est maximale lorsque les LTC-IC sont préalablement amplifiées et soumises à une stimulation minimale par les cytokines au moment du contact avec le fragment. Donc l’activation du VLA-5 dépend d’une stimulation initiale intense par les cytokines. Les effets inhibiteurs des fragments de Fn sur les LTC-IC sont les mieux observés sous faible stimulation par les cytokines.

L’ensemble de ces observations suggère que les changements d’état d’activation des récepteurs d’adhérence après manipulation ex vivo induisent des modifications d’adhérence et de motilité vis-à-vis des protéines du stroma médullaire mais modifient également la

↓ ↑ ↓ ↑

réponse des cellules progénitrices primitives aux signaux générés par le microenvironnement médullaire et contrôlant l’hématopoïèse.

3.3.3 Expression des intégrines VLA-4, VLA-5 et LFA-1 au cours des divisions cellulaires successives

L’expression du VLA-4, VLA-5 et LFA-1 au cours des divisions successives des CSPH AC133+ a été évaluée par cytométrie en flux et comparée à l’expression initiale observée sur les cellules AC133+ natives (figure 3.10.).

Figure 3.10. Expression de VLA-4, VLA-5 et LFA-1 sur cellules AC133+ au cours de divisions cellulaires successives.

A. Expression de VLA-4, VLA-5 et LFA-1 sur les cellules AC133+ natives.

B. Identification des générations cellulaires successives (D0, D1 et D2) après coloration des cellules AC133+ au CFSE et culture d’expansion de 72 heures.

C, D, E. Expression de VLA-4, VLA-5 et LFA-1 par les cellules AC133+ cultivées ayant parcouru 0 (C), 1 (D) ou 2 (E) cycles de division cellulaire.

En blanc : isotype contrôle.

88 Nous avons observé que l’intensité de fluorescence moyenne de tous les récepteurs testés est significativement augmentée après culture ex vivo en comparaison des cellules natives.

Ces accroissements se font indépendamment du nombre de cycles cellulaires parcourus.

Même les cellules restées indivisées après 3 jours de culture ont une augmentation similaire de leur densité en récepteurs de surface. Ceci pourrait être dû au retrait des cellules de leur environnement physiologique et à leur transfert dans un milieu de culture sans sérum dépourvu des ligands appropriés. Afin de tester cette hypothèse nous avons cultivé les cellules AC133+ pendant 3 jours en présence du fragment de Fn CH-296, de VCAM-1 ou d’ICAM-1. Nous avons ensuite observé la répercussion de la présence de ces ligands sur la densité des récepteurs de surface concernés après expansion (tableau 3.1.).

Récepteur Ligand MCFR

VLA-4 / 13 ± 0.4

CH-296 7.1 ± 0.2 *

VCAM-1 13.5 ± 0.5

VLA-5 / 6.7 ± 0.2

CH-296 5.6 ± 0.1

LFA-1 / 15.5 ± 0.2

ICAM-1 17.6 ± 0.2

Tableau 3.1. Mean channel fluorescence ration (MCFR) des protéines d’adhérence après amplification ex vivo.

L’expression de VLA-4, VLA-5 et LFA-1 a été mesurée à la surface des cellules AC133+ après une culture de 3 jours en présence de hautes concentrations de cytokines. Les cellules étaient cultivées en l’absence de contact ou en présence du fragment CH-296, VCAM-1 ou ICAM-1 (n=3).

* : p<0.05 vs absence de ligands

Nous avons observé une diminution significative de l’expression de l’intégrine VLA-4 lorsque les cellules étaient cultivées en présence de CH-296. Une diminution modérée mais non significative de VLA-5 était également mesurée au contact de ce même fragment.

Afin d’évaluer au mieux l’impact de l’environnement médullaire sur l’expression des

protéines d’adhérence, nous avons établi une culture de cellules AC133+ au contact de

cellules stromales murines MS-5. Après 3 jours de culture d’expansion, la densité

d’expression de VLA-4, VLA-5 et LFA-1 a été estimée par cytométrie en flux (figure 3.11.).

Figure 3.11. Densité d’expression des intégrines VLA-4, VLA-5 et LFA-1 sous différentes conditions de culture.

L’expression des intégrines a été mesurée par cytométrie en flux avant culture ( ), après culture en suspension ( ) et après culture au contact de cellules stromales MS-5 ( ).

* : significativement différent par rapport aux cellules non cultivées (p<0.05).

# : significativement différent par rapport aux cellules cultivées en suspension (p<0.05).

Après 3 jours de co-culture, l’expression de toutes les intégrines testées était nettement

inférieure à celle observée après culture en suspension. L’expression de VLA-4 reste

néanmoins accrue par rapport aux cellules natives tandis que VLA-5 et LFA-1 ne sont que

très légèrement augmentés (P>0.05).

90

3.4 Discussion

Selon de nombreuses études, la mise en cycle des CSH serait à l’origine de leur déficit d’implantation médullaire (Traycoff et al, 1995;Berardi et al, 1995). Les stimuli prolifératifs transmis par les récepteurs aux cytokines semblent contribuer à cette défaillance en modulant la densité et l’état d’activation de récepteurs d’adhérence impliqués dans le contrôle de l’hématopoïèse et de la motilité cellulaire (Glimm et al, 2000;Gothot et al, 1998;Huygen et al, 2002). Ces changements pourraient être à l’origine d’une migration préférentielle des cellules primitives infusées vers des tissus non hématopoïétiques ou, tout du moins, affecter l’accès des CSH amplifiées aux niches stromales médullaires correspondant à leur niveau de différenciation. Nous avons donc entrepris d’évaluer, au cours de divisions cellulaires successives, la fonction de récepteurs impliqués dans l’adhérence, la migration et le contrôle de la prolifération.

Nous avions besoin d’une technique permettant d’identifier et de séparer physiquement des CSPH ayant accompli un nombre précis de divisions cellulaires tout en excluant les cellules non divisées en culture. Le « cell tracking » par cytométrie en flux semblait le mieux adapté car il permet de visualiser jusqu’à 8 pics de divisions avec une haute sensibilité (Traycoff et al, 1995;Berardi et al, 1995;Nordon et al, 1997;Oostendorp et al, 2000). Nos données montrent qu’une culture d’expansion de 72 heures dans un milieu dépourvu de sérum et supplémenté des cytokines SCF, TPO, Flt-3, Il-6 et G-CSF est optimale pour obtenir une large proportion de cellules ayant entrepris 1 (D1) ou 2 (D2) cycles cellulaires. Moins de 10% des cellules initiales sont restées indivisées et disparaissent complètement après 24 heures supplémentaires(Glimm & Eaves, 1999) de culture. Le comportement des populations cellulaires D1 et D2 préalablement isolées a été évalué sur 7 matrices caractéristiques de l’endothélium et du stroma (CH-296, H-296, C-274, sélectine-E, sélectine-P, VCAM-1, ICAM- 1) puis comparé aux cellules non stimulées ex vivo (D0).

Des tests d’adhérence de progéniteurs humains cultivés à différents ligands ont déjà été publiés. Une augmentation (Prosper et al, 1998) et une diminution (Ramirez et al, 2001) d’adhérence à la Fn ont ainsi été documentées. Ces résultats divergents peuvent être interprétés par l’utilisation de sources cellulaires, de conditions de culture et de méthodes de mesure d’adhérence différentes. De plus, le sérum présent dans la culture peut être une source de ligands solubles tels que VCAM-1 ou Fn et peut interférer sur les propriétés adhésives des progéniteurs.

L’utilisation de facteurs de croissance spécifiques pour la mise en cycle des CSPH stimule également la maturation et la différenciation cellulaire (Lambert et al, 2003). Celles-ci s’accompagnent de modifications d’adhérence à la Fn (Verfaillie et al, 1991). Pour cette raison, les mesures d’adhérence et de migration dans cette étude ont été déterminées pour les LTC-IC, population cellulaire à un stade de différenciation primitif et homogène.

Nos données indiquent qu’après 1 ou 2 divisions d’autorenouvellement, l’adhérence des

LTC-IC à la Fn était augmentée en comparaison des LTC-IC natives. Une relation, entre cet

accroissement d’adhérence cellulaire et la proportion de LTC-IC présentes dans les

populations D1 et D2 en phase S du cycle, a déjà été démontrée par notre groupe (Giet et al,

2002). Contrairement aux LTC-IC natives, l’adhérence à la Fn après amplification ex vivo est médiée par VLA-5, VLA-4 étant devenu inactif. Cette inversion fonctionnelle entre ces 2 intégrines prend effet dès la première division et est irréversible (Giet et al, 2001;Huygen et al, 2002).

Des changements similaires de l’activité des intégrines VLA-4 et VLA-5 ont été constatés lors des épreuves migratoires. La migration au travers du fragment H-296 (VLA-4) était compromise après division contrairement à la migration au travers de C-274 (VLA-5) qui était augmentée. La motilité au travers de CH-296 qui dépend de l’interaction combinée de VLA-4 et VLA-5 était également affectée après division. La motilité cellulaire semble donc dépendante de VLA-4 ; son inactivation au cours de l’expansion ne peut être compensée par l’activation de VLA-5.

Comme suggéré par d’autres travaux, l’activation de VLA-5 observée après culture serait à l’origine de l’adhérence excessive à CH-296 ; celle-ci perturberait alors la motilité cellulaire (Giet et al, 2002;Palecek et al, 1997b). Cette hypothèse est confortée par des résultats précédemment publiés où l’activation de la sous-unité effectrice β 1 des intégrines par un anticorps monoclonal TS2-16 était à l’origine d’une augmentation d’adhérence des CSH à la Fn. Celle-ci s’accompagnait d’une réduction du repeuplement médullaire par ces cellules, natives ou amplifiées, chez la souris NOD/SCID (Ramirez et al, 2001).

On constate également que l’adhérence et la motilité des LTC-IC sur VCAM-1 sont réduites après expansion, principalement après 2 divisions. Ceci est une indication supplémentaire de l’inactivation fonctionnelle de VLA-4 après culture.

La Fn (Peled et al, 2000;van der Loo et al, 1998) et VCAM-1 (Papayannopoulou et al, 1995) sont généralement décrits comme 2 ligands essentiels pour l’implantation médullaire des CSH. La motilité réduite sur ces supports pourrait expliquer le déficit d’implantation médullaire habituellement décrit à la suite de l’amplification ex vivo des LTC-IC.

Aucun changement notable d’adhérence et de migration n’a été observé entre les LTC-IC manipulées et ICAM-1.

Enfin l’adhérence et la migration au travers des sélectines–E et –P ne sont pas différentes entre les LTC-IC amplifiées et quiescentes, l’adhérence spontanée à la sélectine–P étant particulièrement labile. Ces résultats concordent avec le rôle connu des sélectines dans la margination plutôt que l’adhérence endothéliale ferme.

Les récepteurs d’adhérence, et plus particulièrement les intégrines β 1, ont un rôle connu dans le contrôle de l’hématopoïèse en générant des signaux intracellulaires inhibiteurs sur la prolifération des CSH (Hurley et al, 1997;Jiang et al, 2000a). Sous concentration physiologique en cytokine, VLA-4 est un récepteur capable de produire cet effet (Hurley et al, 1995). Nos résultats obtenus à partir des LTC-IC natives confirment cette fonction importante de VLA-4. Après expansion des LTC-IC, la Fn conserve son potentiel inhibiteur.

Néanmoins, il ne semble plus dépendant de VLA-4, comme en atteste la perte de l’inhibition sur H-296 et VCAM-1, mais de VLA-5.

En comparant l’effet inhibiteur des fragments de Fn sous différentes concentrations de

cytokines, nos données indiquent que des stimuli mitogènes intenses, fournis avant ou

pendant le contact avec le ligand, inactivent VLA-4. Que ce soit pour les cellules natives ou

92 amplifiées, la présence de fortes concentrations de cytokines durant la phase de contact altère l’effet antiprolifératif produit par le ligand.

Nous suggérons que l’inhibition de la prolifération des LTC-IC natives résulte de l’engagement de VLA-4. Celui-ci génère divers signaux intracellulaires conduisant à l’inactivation de CDK-2, à la diminution de la concentration cellulaire en cycline-E et à l’augmentation du taux de la protéine p27

décrite par Jiang et al (Jiang et al, 2000a). Les voies de signalisation utilisées par VLA-5 pour interférer sur la prolifération des cellules amplifiées restent inconnues. Tout comme VLA-4, VLA-5 pourrait inhiber la mise en cycle en modulant les protéines contrôlant le cycle cellulaire. Néanmoins, VLA-5 pourrait également augmenter la sensibilité cellulaire aux signaux pro-apoptotiques ou stimuler la différenciation cellulaire à l’origine d’un appauvrissement en cellules souches.

Par cytométrie de flux, nous avons montré que l’expansion ex vivo est associée à une augmentation générale de la densité de tous les récepteurs testés. Combinés aux résultats d’adhérence et de migration, ces résultats soutiennent le concept selon lequel les intégrines existent sous un état de faible ou de forte affinité indépendamment de leur densité membranaire.

Contrairement à la culture en suspension, l’amplification des CSH en présence de cellules

stromales MS-5 sous forte stimulation de cytokines réduit significativement la densité

membranaire des récepteurs testés. Les modulations de la densité des récepteurs

d’adhérence sont donc fonction de la disponibilité des ligands en culture.

4 La perte de fonction du VLA-4 sur les cellules souches hématopoïétiques après

expansion ex vivo résulte d’une affinité excessive pour VCAM-1 et d’une

sensibilité réduite aux stimuli activateurs.

4.1 Introduction

Les CSH sont définies fonctionnellement sur base de leur capacité à migrer dans le microenvironnement de la MO et à repeupler durablement l’hôte en générant une descendance lymphoïde et myéloïde (Morrison et al, 1995;Sutherland et al, 1995;Ogawa, 1993).

Sous conditions de culture définies, la plupart des CSH transplantables exécutent de multiples divisions d’autorenouvellement (Glimm & Eaves, 1999;Dao et al, 1997). Celles-ci présentent néanmoins un déficit d’implantation dans la MO hôte attribué à leur état prolifératif (Gothot et al, 1998;Cashman et al, 2002b). L’activité repeuplante des CS transplantables semble en effet restreinte à la population en phase G0/G1 du cycle cellulaire (Glimm et al, 2000), ce qui suggère que les CSH amplifiées, présentes en phase S/G2/M, pourraient avoir une capacité repeuplante réduite. Les mécanismes causant ce déficit sont inconnus à ce jour.

Dans le chapitre précédent, l’évaluation de l’adhérence des LTC-IC in vitro sur les fragments de Fn et VCAM-1 a permis d’identifier une altération irréversible de l’état d’activité de VLA-4 et VLA-5 après expansion. Les adhérences statiques et dynamiques médiées par VLA-4 sur le VCAM-1 et la Fn étaient compromises tandis que l’activité de VLA-5 était augmentée après expansion. Ces observations s’accordent aux résultats obtenus précédemment par notre groupe (Giet et al, 2001;Giet et al, 2002). Contrairement à l’adhérence dynamique, les changements d’adhérence statique se sont révélés être réversibles lors de la mise en cycle synchronisée de cellules CD34+ et de LTC-IC, ce qui témoigne d’une relation avec la progression dans le cycle cellulaire (Huygen et al, 2002). De même, une oscillation séquentielle de l’activité repeuplante des CSH murines a pu être corrélée avec le passage en cycles synchronisés des cellules (Habibian et al, 1998).

Le rôle déterminant tenu par VLA-4 dans l’implantation et la rétention des CSH natives dans la MO hôte a été largement documenté lors d’études in vivo (Scott et al, 2003;Papayannopoulou & Nakamoto, 1993), tandis que VLA-5, pour sa part, semble être moins important.

Le SDF-1 est le seul agent chimioattractant agissant sur les CSH humaines CD34+ CD38-/low et murines Sca-1

Thy-1

kit

Lin

(Aiuti et al, 1997;Peled et al, 1999b;Wright et al, 2002).

Il est constitutivement exprimé par divers tissus incluant l’endothélium des sinusoïdes

médullaires humains et murins, l’endosteum et les cellules stromales (Nagasawa et al,

94 1994;Imai et al, 1999;Ponomaryov et al, 2000). Il est également sécrété par les progéniteurs engagés CD34+ CD38+ (Aiuti et al, 1999).

L’interaction entre le SDF-1 et son récepteur CXCR-4 induit l’activation des CSH. Les mécanismes moléculaires sous-jacents sont partiellement connus ; ils aboutissent, par l’intermédiaire d’une signalisation « inside-out », à une augmentation de l’état d’affinité de VLA-4 (Kinashi et al, 2004). Le VLA-4, de haute affinité pour VCAM-1, facilite l’adhérence des CSH à l’endothélium vasculaire et leur migration selon le gradient de concentration en SDF-1 préétabli (Peled et al, 2000).

L’administration d’anticorps neutralisant le SDF-1, avant ou peu après l’infusion des cellules CD34+, conduit à une diminution importante de l’implantation médullaire de ces cellules (Peled et al, 1999b). Inversement, l’injection de SDF-1, dans la MO ou dans la rate, améliore significativement l’implantation de ces cellules aux sites d’injection. Enfin, la surexpression du CXCR-4 humain sur les cellules CD4 murines améliore l’implantation médullaire de ces cellules (Sawada et al, 1998).

Ces données illustrent l’importance du couple CXCR-4 / SDF-1 dans l’implantation et la rétention des CSH.

L’implantation des CSH CD34

CD38

humaines chez la souris NOD/SCID et NOD/SCID β 2

(Peled et al, 1999b;Ponomaryov et al, 2000;Kollet et al, 2001;Kollet et al, 2002) se déroule via des processus SDF-1/CXCR-4 dépendants, grâce à une homologie entre les SDF-1 humain et murin.

4.2 Objectifs de travail

Dans le chapitre précédent, nous avons fait mention d’une altération de la fonction des

intégrines β1 après culture et de ses répercussions sur la motilité et la prolifération des CSH

in vitro. VLA-4, initialement actif sur les cellules CD34+ natives, était inactivé après culture

dévoilant ainsi la fonction substitutive de VLA-5 dans l’adhérence et la motilité cellulaires. Il

était important de déterminer les répercussions de ces changements sur la régénération

hématopoïétique in vivo par les CSPH amplifiés. Nous avons donc transplanté des cellules

CD34+ aux souris NOD/SCID β2

afin de déterminer si l’implantation des CSPH amplifiés se

faisait indépendamment de VLA-4 et si l’activation de VLA-5 pouvait compenser la perte de

VLA-4.

4.3 Résultats

4.3.1 Mécanismes d’implantation médullaire des SRC amplifiées ex vivo : transplantation à la souris NOD/SCID ββββ 2

4.3.1.1 Modulation du repeuplement et de l’implantation médullaires médiés par les intégrines α4 et α5 après culture ex vivo des cellules CD34+

Fonction de VLA-4 et VLA-5 dans le repeuplement médullaire à long terme

Le rôle de VLA-4 et VLA-5 dans le repeuplement médullaire a été déterminé en appliquant le schéma expérimental repris au point 2.3.1 du chapitre « matériels et méthodes ». Les greffons natifs étaient constitués de 150-200.10

cellules CD34+ de SC tandis que les greffons amplifiés étaient obtenus après une culture d’expansion de 3 jours en présence des cytokines suivantes : SCF, TPO, Flt-3, Il-6 et G-CSF. Au terme de la culture, le coefficient d’amplification (CA) moyen des cellules CD34+ était de 2,4. Ainsi les greffons cultivés étaient constitués de 150-200.000.10

x CA cellules. La neutralisation spécifique de VLA-4 ou VLA-5 avant transplantation nous a permis d’estimer leur contribution respective dans l’implantation et le repeuplement médullaire.

Figure 4.1. Fonction de VLA-4 et VLA-5 dans le repeuplement médullaire de souris NOD/SCID β2

par des greffons natifs ou amplifiés ex vivo.

Préalablement à la transplantation, les CSPH CD34+ de SC ont été traités par un anticorps anti-CD34 comme contrôle, un anti-VLA-4 ou un anti-VLA-5. Les chimérismes ont été mesurés après 6 semaines par FACS via l’identification des cellules CD45+ humaines dans les MO murines.

A : Chimérisme obtenu après 6 semaines à partir de greffons non cultivés.

B : Chimérisme observé après transplantation de greffons cultivés ex vivo.

* : p<0.05 par rapport au contrôle

96 Après transplantation des greffons non cultivés, le chimérisme moyen observé était de 37.6±11.4%. La neutralisation de VLA-4 par Mab P4C2 induit une diminution significative de l’activité repeuplante : 1.6±0.9% (P<0.05). Par contre, la neutralisation de VLA-5 par Mab P1D6 ne provoque qu’une diminution modérée et non significative des chimérismes.

(22.9±9.9% p>0.05).

Contrairement à ce qui a été observé pour les CSH non cultivées, la neutralisation de VLA-4 n’a eu aucun effet significatif sur le repeuplement par les cellules amplifiées (48.9±7.4%

p>0.05 ; chimérisme contrôle : 36.7±9.3%). Par contre, la neutralisation de VLA-5 a entraîné une diminution du repeuplement à long terme (2.7±1.1% p<0.05) (figure 4.1.).

Nous signalerons enfin que les chimérismes obtenus après 6 semaines à partir des greffons natifs ou amplifiés sont très similaires (greffons natifs : chimérisme contrôle 37.6±11.4% ; greffons cultivés : chimérisme contrôle 36.7±9.3%)

Une absence d’amplification des SRC au cours de la culture peut expliquer cette absence d’expansion. Une autre hypothèse serait que les SRC sont réellement multipliées en culture mais qu’elles ont perdu, partiellement, leur capacité d’implantation.

Cellules CD34+ non cultivées

Neutralisation VLA-4 Neutralisation VLA-5

CD45-APC CD45-APC

CD33-FITC CD33-FITC

C D 1 9 -P E

C D 1 9 -P E

Cellules CD34+ cultivées

Neutralisation VLA-4 Neutralisation VLA-5

Figure 4.2. Repeuplement médullaire lympho-myéloïde obtenu chez la souris NOD/SCID β2

après neutralisation de VLA-4 ou de VLA-5.

La descendance lymphoïde et myéloïde issue des leucocytes humains CD45+ a été identifiée par marquage CD19 et CD33. Après transplantation de greffons natifs ou cultivés, une population lymphocytaire B (CD45/19) et myéloïde (CD45/33) a été observée que ce soit après neutralisation de VLA-4 ou de VLA-5.

Nous avons également analysé le potentiel différenciatif des leucocytes humains CD45+

repeuplant les MO murines 6 semaines après la greffe. Une population lymphocytaire B (CD19) et myéloïde (CD33) coexistent dans toutes les MO murines testées (figure 4.2.). Ces observations suggèrent que l’activité SRC mesurée après 6 semaines résulte du repeuplement médullaire par des CSH primitives multipotentes et non à des progéniteurs différenciés.

Fonction de VLA-4 et VLA-5 dans l’implantation médullaire

Les modulations de l’activité des intégrines VLA-4 et VLA-5 observées après expansion pourraient compromettre l’implantation médullaire précoce des CSH. Nous ne pouvons néanmoins exclure une seconde hypothèse selon laquelle les CSH migrent correctement dans la MO mais s’implantent dans des niches stromales non fonctionnelles, incapables de maintenir une hématopoïèse durable.

Afin de tester ces deux hypothèses, nous avons réalisé des mesures d’implantation à court terme de cellules CD34+ natives ou amplifiées selon le schéma expérimental décrit précédemment.

La contribution de VLA-4 et VLA-5 a été déterminée en traitant les greffons, préalablement à la transplantation, par les anticorps neutralisant le VLA-4 et VLA-5.

C D 1 9 -P E C D 1 9 -P E

CD33-FITC CD33-FITC

CD45-APC

CD45-APC

98 Figure 4.3. Fonction de VLA-4 et VLA-5 dans l’implantation à court terme de cellules CD34+ natives ou amplifiées, chez la souris NOD/SCID β2

.

Préalablement à la transplantation, les CSPH CD34+ de SC ont été traités par un anticorps anti-CD34 comme contrôle, un anti-VLA-4 ou un anti-VLA-5. Le taux de cellules humaines primitives CD34+/45+ implantées après 20 heures dans les MO murines a été mesuré par cytométrie en flux.

A : Chimérisme obtenu à partir de cellules CD34+ natives.

B : Chimérisme observé après transplantation de cellules CD34+ cultivées ex vivo

* : P<0.05 par rapport au contrôle

Au cours des transplantations de cellules CD34+ non cultivées, on constate une inhibition significative de l’implantation médullaire à court terme lorsque VLA-4 est neutralisé (contrôle : 0.124±0.036% ; anti-VLA-4 : 0.004±0.001% ; p<0.05). Par contre, la neutralisation de VLA-5 n’induit qu’une légère diminution non significative du taux de migration (anti-VLA- 5 : 0.082±0.011% ; p>0.05).

La situation s’inverse lorsque les greffons sont constitués de cellules CD34+ amplifiées pendant 72h. En effet, la neutralisation de VLA-4 n’interfère plus sur l’implantation des cellules (contrôle : 0.072±0.015 ; anti-VLA-4 : 0.048±0.004 ; p>0.05) contrairement à la neutralisation de VLA-5 qui, cette fois, l’inhibe (anti-VLA-5 : 0.016±0.004% ; p<0.05) (figure 4.3.).

Ces résultats corroborent les observations obtenues au cours des repeuplements à long

terme. Les intégrines β1 VLA-4 et VLA-5 ont un rôle prépondérant dans l’implantation et la

rétention médullaires des CSH. L’implantation et le repeuplement sont initialement

dépendants de VLA-4. Après expansion, le VLA-4 est inactivé tandis que le VLA-5 devient

prépondérant. L’amplification ex vivo des CSH est donc associée à une altération de la

fonction des intégrines à l’origine du déficit d’implantation médullaire observé.

4.3.1.2 Diminution du repeuplement et de l’implantation médullaires médiés par CXCR-4 après culture ex vivo des cellules CD34+

Fonction de CXCR-4 dans le repeuplement médullaire à long terme

La fonction du CXCR-4 dans le repeuplement médullaire, avant et après amplification ex vivo des CSH, a été déterminée en appliquant le schéma expérimental repris au point 2.3.1 du chapitre « matériels et méthodes ».

Des greffons constitués de cellules CD34+ de SC natives ou cultivées ont été traités par un anticorps neutralisant anti-CXCR-4. Les chimérismes ont été mesurés par cytométrie en flux après 6 semaines et comparés aux valeurs contrôles obtenues après neutralisation du CD34.

Figure 4.4. Fonction de CXCR-4 dans le repeuplement médullaire de souris NOD/SCID β2

par des cellules CD34+ natives ou amplifiées ex vivo.

Des cellules CD34+ natives ou amplifiées traitées par un anticorps neutralisant anti-CD34 comme contrôle ou anti-CXCR4 ont été transplantées chez la souris. Le repeuplement à long terme a été déterminé après 6 semaines par FACS via l’identification des leucocytes humains CD45+.

A : Chimérisme obtenu à partir de cellules CD34+ natives.

B : Chimérisme observé après transplantation de cellules CD34+ cultivées ex vivo

* : p<0.05

Après transplantation de greffons non cultivés, on observe une inhibition du repeuplement à long terme lorsque le CXCR-4 est neutralisé (contrôle : 25±4.05% ; anti-CXCR-4 : 0.66±0.29% ; p<0.05). Par contre, la neutralisation du CXCR-4 sur les CSH amplifiées n’induit qu’une légère diminution non significative de l’activité repeuplante à long terme (anti-CXCR-4 : 24.1±7.67% ; contrôles : 36.9±12.42%, P>0.05) (Figure 4.4.).

Nous observons donc une perte de fonction de CXCR-4 sur les SRC amplifiées ex vivo.

100 Cellules CD34+ non cultivées Cellules CD34+ cultivées

Neutralisation CXCR-4

Figure 4.5. Repeuplement médullaire lympho-myéloïde obtenu chez la souris NOD/SCID β2

après neutralisation de CXCR-4.

La descendance lymphoïde et myéloïde obtenue 6 semaines après infusion de cellules CD34+

traitées par un anti-CXCR-4 neutralisant a été identifiée par marquage CD19 et CD33.

L’analyse du potentiel différenciatif des leucocytes humains CD45+ colonisant les MO murines témoigne d’une reconstitution lymphocytaire B et myéloïde (figure 4.5.). L’activité SRC des greffons, natifs ou amplifiés, traités par l’anti-CXCR-4 provient vraisemblablement de l’implantation des CSH primitives multipotentes.

Fonction de CXCR-4 dans l’implantation médullaire

La perte de fonction du CXCR-4 observée précédemment peut compromettre l’implantation médullaire précoce des CSH amplifiées. Néanmoins, les modulations d’activité de CXCR-4 peuvent également interférer sur le maintien de la viabilité et sur le contrôle de la prolifération des CSH (Lataillade et al, 2002).

Dès lors, nous avons mesuré l’implantation à court terme de cellules CD34+ natives ou amplifiées. La contribution de CXCR-4 a été déterminée en traitant les greffons avec les anticorps neutralisants anti-CXCR-4.

CD45-APC CD45-APC

CD33-FITC CD33-FITC

C D 1 9 -P E

C D 1 9 -P E

Figure 4.6. Fonction de CXCR-4 dans l’implantation à court terme de cellules CD34+

natives ou amplifiées, chez la souris NOD/SCID β2

.

Préalablement à leur infusion aux souris NOD/SCID β2

, les CSPH CD34+ de SC ont été traités par un anticorps anti-CD34 comme contrôle ou un anti-CXCR-4. Le taux de cellules humaines primitives CD34+/45+ implantées dans les MO murines après 20 heures a été mesuré par cytométrie en flux.

A : Chimérisme obtenu à partir de cellules CD34+ natives.

B : Chimérisme observé après transplantation de cellules CD34+ cultivées ex vivo

* : P<0.05

L’implantation à court terme des cellules CD34+ non cultivées (valeur contrôle : 0.202±0.053%) est significativement réduite après neutralisation du CXCR-4 (0.038±0.010% ; p<0.05). Par contre, l’implantation des cellules CD34+ amplifiées est similaire après marquage contrôle (0.254±0.052%) ou neutralisation du CXCR-4 (0.218±0.054% ; p>0.05) (figure 4.6.).

L’implantation et le repeuplement sont initialement dépendants de CXCR-4. Après culture ex

vivo des CSH, nous observons une perte de fonction du CXCR-4 à l’origine du déficit

d’implantation médullaire.

102 4.3.2 Mécanismes d’implantation médullaire des SRC

amplifiées ex vivo : transplantation à la souris NOD/SCID

4.3.2.1 Maintien de la fonction des intégrines α4 dans le repeuplement et l’implantation médullaires après culture ex vivo des cellules CD34+

Parallèlement aux expérimentations réalisées chez la souris NOD/SCID β2

, la fonction des intégrines alpha 4 et alpha 5 ainsi que du CXCR-4 sur le repeuplement médullaire par des CSH natives ou amplifiées a été déterminée sur la lignée murine NOD/SCID.

Fonction de VLA-4 et VLA-5 dans le repeuplement médullaire

Figure 4.7. Fonction de VLA-4 et VLA-5 dans le repeuplement médullaire de souris NOD/SCID par des greffons natifs ou amplifiés ex vivo.

Préalablement à la transplantation, les CSPH CD34+ de SC ont été traités par un anticorps anti-CD34 comme contrôle, un anti-VLA-4 ou un anti-VLA-5. Les chimérismes ont été mesurés après 6 semaines par FACS via l’identification des cellules CD45+ humaines dans les MO murines.

A : Chimérisme obtenu après 6 semaines à partir de greffons non cultivés.

B : Chimérisme observé après transplantation de greffons cultivés ex vivo.

* : p<0.05

Nous avons constaté que l’inhibition de VLA-4 sur les cellules CD34+ natives réduit significativement le repeuplement médullaire des souris NOD/SCID (anti-VLA4 : 3.3 ± 0.85%, contrôle 41.45 ± 10.18%, p<0.05) ; la neutralisation de VLA-5 n’ayant pas d’effet significatif (45.35 ± 7.28%).

Après culture ex vivo, la capacité des greffons à repeupler ces souris est significativement

compromise après la neutralisation du VLA-4 (anti-VLA-4 : 0.19 ± 0.06%, contrôle : 4.47 ±

1.22%, p<0.05). De plus, la neutralisation du VLA-5 n’interfère pas sur le repeuplement médullaire (anti-VLA-5 : 3.39 ± 1.16%) (figure 4.7.).

L’amplification ex vivo est également associée à une nette diminution de l’activité SRC des greffons (contrôle non cultivé : 41 ± 10.18%, contrôle cultivé : 4.47 ± 1.22%).

Le repeuplement médullaire des souris NOD/SCID par les greffons natifs est donc dépendant de VLA-4. Contrairement à ce que nous avions observé chez la souris NOD/SCID β2

, son activité semble à présent maintenue sur les cellules CD34+ cultivées, le VLA-5 demeurant inopérant au cours du repeuplement médullaire.

Fonction de VLA-4 et VLA-5 dans l’implantation médullaire

Figure 4.8. Fonction de VLA-4 et VLA-5 dans l’implantation à court terme de cellules CD34+ natives ou amplifiées, chez la souris NOD/SCID.

Préalablement à la transplantation, les CSPH CD34+ de SC ont été traités par un anticorps anti-CD34 comme contrôle, un anti-VLA-4 ou un anti-VLA-5. Le taux de cellules humaines primitives CD34+/45+ implantées après 20 heures dans les MO murines a été mesuré par cytométrie en flux.

A : Chimérisme obtenu à partir de cellules CD34+ natives.

B : Chimérisme observé après transplantation de cellules CD34+ cultivées ex vivo

* : P<0.05 par rapport au contrôle

Les résultats des chimérismes mesurés à court terme corroborent les observations obtenues au cours des repeuplements à long terme. On observe une inhibition significative de l’implantation médullaire à court terme lorsque VLA-4 est neutralisé sur les cellules natives et cultivées (cellules natives : contrôle = 0.278±0.039% ; anti-VLA-4 = 0.097 ± 0.027% (p<0.05) ; cellules cultivées : contrôle = 0.047±0,010%, anti-VLA-4 = 0.026±0.003%

(p<0.05)). La neutralisation de VLA-5 n’induit qu’une légère diminution non significative du

taux de migration des 2 types de greffons (cellules natives : anti-VLA-5 : 0.202 ± 0.058% ;

(p>0.05) ; cellules cultivées : anti-VLA-5 : 0.035 ± 0.004% ; (p>0.05)) (figure 4.8.).

104 4.3.2.2 Maintien de la fonction de CXCR-4 après culture ex

vivo des cellules CD34+

Fonction de CXCR-4 dans le repeuplement médullaire

La fonction de CXCR-4 au cours de l’implantation médullaire à court terme des CSH natives ou amplifiées a été déterminée sur la lignée murine NOD/SCID.

Le rôle clé tenu par le CXCR-4 dans le repeuplement médullaire par les cellules CD34+

natives chez la souris NOD/SCID ayant déjà été largement documenté dans la littérature (Lapidot & Kollet, 2002;Kollet et al, 2002;Peled et al, 1999b), l’investigation de la fonction de CXCR-4 sur les cellules CD34+ natives n’a pas été reproduite dans ce travail.

Figure 4.9. Fonction de CXCR-4 dans le repeuplement médullaire de souris NOD/SCID ou NOD/SCID ββββ ²

par des greffons amplifiés ex vivo.

Préalablement à la transplantation, les CSPH CD34+ de SC ont été cultivés puis traités par un anticorps anti-CD34 comme contrôle ou un anti-CXCR-4. Les chimérismes ont été mesurés après 6 semaines par FACS via l’identification des cellules CD45+ humaines dans les MO murines.

A : Chimérisme obtenu chez la souris NOD/SCID β ²

B : Chimérisme obtenu chez la souris NOD/SCID

* : p<0.05 contrôle vs anti-CXCR-4

# : P<0.05 NOD/SCID vs NOD/SCID β2

Au cours des transplantations à la souris NOD/SCID de CSH cultivées, nous avons constaté

que la neutralisation de CXCR-4 conserve son effet inhibiteur sur le repeuplement médullaire

(contrôle : 39.24 ± 14.22%, anti-CXCR-4 : 1.00 ± 0.35%, p<0.05) (figure 4.9). Contrairement à

ce qui a été observé chez la souris NOD/SCID β2

, le repeuplement médullaire par les

greffons amplifiés est cette fois dépendant de CXCR-4.

Fonction de CXCR-4 dans l’implantation médullaire

Figure 4.10. Fonction de CXCR-4 dans l’implantation à court terme de cellules CD34+

amplifiées, chez la souris NOD/SCID ou NOD/SCID ββββ ²

^.

Des greffons amplifiés ex vivo ont été traités à l’aide d’un anticorps anti-CD34 (contrôle) ou anti-CXCR-4 avant d’être transplantés aux souris NOD/SCID. Les chimérismes obtenus ont été mesurés par FACS après 20 heures via l’identification des cellules humaines CD34+ 45+.

A : Chimérisme obtenu chez la souris NOD/SCID β ²

B : Chimérisme obtenu chez la souris NOD/SCID

* : P<0.05 contrôle vs anti-CXCR-4

# : P<0.05 NOD/SCID vs NOD/SCID β2

La neutralisation de CXCR-4 sur les cellules CD34+ cultivées compromet l’implantation médullaire (contrôle : 0.33 ± 0.03% ; anti-CXCR-4 :0.04 ± 0.01% ; P<0.05) chez la souris NOD/SCID (figure 4.10). Pour rappel, l’inverse avait été observé chez la souris NOD/SCID β 2

.

Pour expliquer la différence entre les deux modèles, (NOD/SCID vs NOD/SCID β 2

), on peut

se reporter à l’étude comparative réalisée par Glimm et al (Glimm et al, 2001). La souris

NOD/SCID β 2

est permissive au repeuplement par des CSH en cycle et hors cycle, tandis

que la souris NOD/SCID « traditionnelle » est sélectivement repeuplée par des CSH hors

cycle. Ceci suggère que les modulations d’activité de VLA-4 et de CXCR-4, observées chez la

souris NOD/SCID β 2

mais pas chez la souris NOD/SCID, n’affectent que les CSH en phase

active du cycle cellulaire.

106 4.3.3 Contrôle des effets indirects des anticorps

neutralisants sur les cellules CD34+

4.3.3.1 Persistance de la fixation des Ac neutralisants

Il était important de s’assurer de la stabilité du marquage neutralisant pendant l’entièreté de la phase d’implantation des CSH chez l’hôte murin.

Pour cela, nous avons mesuré l’intensité de fluorescence obtenue après marquage anti-VLA- 4, anti-VLA-5, anti-CXCR4 sur des cellules CD34+ maintenues en culture sous faible stimulation cytokinique. Les fluorescences obtenues après 8 heures, 24 heures et 48 heures ont été ensuite comparées aux valeurs obtenues à l’initiation de la culture (T

) (schéma expérimental, voir matériels et méthodes figure 2.7).

Cellules CD34+ non cultivées

Cellules CD34+ cultivées

Figure 4.11. Intensité de marquage anti- αααα ^{4, anti-} αααα 5 et anti-CXCR4 à la surface des cellules CD34+ au cours du temps.

Les cellules ont été incubées en présence des anticorps dirigés contre α ^4, α 5 et CXCR-4.

L’intensité de fluorescence initiale a été mesurée par cytométrie en flux et comparée à

l’intensité de fluorescence obtenue après 48h de culture à faible concentration en cytokines.