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Texte intégral

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Dépôt Institutionnel de l’Université libre de Bruxelles / Université libre de Bruxelles Institutional Repository

Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Salomon, F. (1978). Etude des interactions hôte-virus par l'analyse de la défectivité du phage lambdoide 21 sauvage dans un mutant bactérien affecté dans l'ARn polymérase (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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U N I V E R S I T E LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DES SCIENCES

LABORATOIRE DE G E N E T I Q U E

ETUDE DES INTERACTIONS HOTE-VIRUS PAR L'ANALYSE DE LA DEFECTIVITE DU PHAGE LAMBDOIDE 21 SAUVAGE DANS UN MUTANT BACTERIEN AFFECTE DANS L'ARN POLYMERASE

T hè s e p r é s e n t é e oour l'obtention d u grade légal de d o c t e u r en s c i e n c e s S e c t i o n : B i o l o g i e m o l é c u l a i r e

S A L O M O N Françoise

1978

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FACULTE DES SCIENCES

LABORATOIRE DE G E N E T I Q U E

ETUDE DES INTERACTIONS HOTE-VIRUS PAR L'ANALYSE DE LA DEFECTIVITE DU PHAGE LAMBDOIDE 21 SAUVAGE DANS UN MUTANT BACTERIEN AFFECTE DANS L'ARN POLYMERASE

T h è s e p r é s e n t é e oour l'obtention du grade légal de

d o c t e u r en s c i e n c e s S e c t i o n ; Biologie m o l é c u l a i r e

S A L O M O N Françoise

1978

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T H E S E A N N E X E

P e r s p e c t i v e s de r e c h e r c h e s c o n c e r n a n t le c o n t r ô l e b i o l o g i q u e des p o p u l a t i o n s de la c h e n i l l e p r o c e s s i o n n a i r e

du pin ( T h a u m e t o p o e a p i t y o c a m p a S c h i f f ) par B a c i l l u s t h u r i n q i e n s i s (Berl.).

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Merci à Monsieur THOMAS qui m'a permis de travailler dans son service et dont la rigueur,tant dans son enseignement que dans son tra­

vail de chercheur,m'a beaucoup appris,Le^chef" a,de plus,toujours suivi mon travail avec intérêt et bienveillance.

Je ne sais comment exprimer ma reconnaissance à Christine DAMBLY, qui a été la patronne d'abord de mon mémoire de licence,ensuite de ma thèse.Et Christine est une patronne formidable qui a mis beaucoup de son temps et de son coeur à travailler et à discuter avec raoi.J'ai beaucoup fait appel à elle durant toutes ces années et Christine a été réellement disponible pour m'aider^tant scientifiquement qu'humainement.Merci à Christine pour son amitié.. . . .

Je vaudrais remercier.tout particulièrement Annette RESIBOIS,Lucie OESMET et Anne­Marie GATHOYE,que j'ai également souvent sollicitées et qui m'ont offert leur collaboration avec beaucoup de gentillesse et d'efficacité­.

Merci également aux.autres personnes du laboratoire et spéciale­

ment à Jean­Pierre LECCCG,Jean DE LAFONTEYNE et Michel FAELEN,avec qui les discussions sont toujours agréables et enrichissantes.

Merci également à Madame PELSENEER qui m'a si chaleureusement accueillie dans son laboratoire et qui a mis à ma disposition toute sa documentation concernant la lutte, biologique.Je lui suis particulièrement reconnaissante d'avoir tout fait pour faciliter les contacts avec les différentes personnes travaillant dans son domaine.

Toute ma reconnaissance va également à Madame GOREUX pour ses ta­

lents de dactylo et sa gentillesse qui m'a souvent remonté le moral.

Tous mes remerciements vont aussi aux copains,copines,beaux­frères et voisine qui,durant la rédaction de ce travail,m'ont dispensée de nom­

breuses vaisselles,lessives etc...pour que.je puisse me consacner à A et qui ont grandement facilité mes trajets.

Merci à mes parents de m'avoir donné la possibilité de poursuivre mes études et de m'organiser comme Je l'entendais.

Merci enfin à ABSLAM qui a participé à toutes les étapes de l'élaboration de.ce travail,prenant part à toutes les joies et épongeant toutes les peines que celui­ci a entraînées.

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RESUME.

La régulation de l'expression des différents gènes d'un bactériophage nécessite l'intervention coordonnée de produits viraux

et bactériens. La nature et les mécanismes de ces interactions entre le virus et son hôte sont encore souvent mal connus au niveau molécu- laire et font l'objet de nombreuses recherches.

Une des méthodes permettant de mettre en évidence de telles interactions consiste à isoler des mutants bactériens dans lesquels le comportement d'un phage est modifié et à analyser l'effet de leur mutation sur l'expression des diverses fonctions du virus et de l'hSte.

Dans ce cadre, nous avons étudié le comportement du phage tempéré lambdoîde 21 sauvage dans un mutant de son hote EéchoAi-ChMl

Co£/Cportant une altération de 1 'ARNpolymérase. En effet, dans ce mutant appelé RpoB518, le développement du 21 sauvage est inhibé alors que d'autres lambdoïdes (A ,21hy, 434hy, 80,...) s'y perpétuent normalement.

Nous avons abordé l'étude de cette inhibition par trois voies différentes :

1° Etude de la défectivité. Nous avons analysé comment le phage 21 ex- prime ses différentes fonctions dans le mutant bactérien RpoB518. En particulier, nous avons regardé dans quelle mesure il est capable de s'absorber, de se répliquer, de produire des particules phagiques et de lyser son hôte.

2° Construction de nouveaux hybrides. Nous avons construit, par recom- binaison génétique, différents hybrides entre un phage défectif ^21) et un phage non défectif ). L'analyse de ces hybrides et plus

précisément de la correspondance entre d'une part, leur croissance

« Dans RpoB518.

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responsable de la défectivité.

3" Les mutants 21 vin . A partir du 21 sauvage, nous avons isolé trois dérivés, appelés 21 vinl, 2 et 3, insensibles à l'inhibition, c'est-à-dire capables de se développer dans le mutant RpoB518.

Leur mutation a été caractérisée et localisée par rapport à différent marqueurs du phage 21 et, en particulier, par rapport à trois muta-

tions conditionnelles également sélectionnées au cours de ce travail.

Une hypothèse concernant la façon dont la mutation bacté- rienne affecte le développement du phage est proposée et discutée.

(8)

3.

- I N T R O D U C T I O N -

(9)

0.1. INTRODUCTION GENERALE.

0.1.1. Un exemple de système complexe : P-imUi haZapamAJ), ThaumQXopOQ.a p-ltyocampa, EacuZlLU, thjuJvinQiami^.

Dans de vastes étendues du bassin méditerranéen, le pin d'Alep (PXlia6 haJiQ,p<iyiliAJ> Mill) peut former des forêts assez denses où il vit en

association avec de multiples espèces animales et végétales. Les re- présentants de toutes ces espèces établissent entre eux divers types de relations (concurrence, prédation, parasitisme, symbiose,...) dont

l'ensemble détermine un équilibre stationnaire tel que les effectifs de chaque groupe demeurent quasi constants. Par contre, dans certaines sous-régions particulières où les facteurs du biotope* ne sont, en apparence, guère différents, les peuplements de pin d'Alep sont endom- magés et, à la limite, mis en péril par une forte augmentation de la

densité d'une des espèces de l'écosystème*, la chenille processionnaire du •giTx(Jhaim(Ltopoe.a. p-ctyocampa Schiff), insecte défoliateur dont l'adap- tation à l'environnement est favorisé par l'organisation sociale marquée.

Devant l'extension de cette peste et vu les nombreux inconvé- nients des pesticides chimiques, des recherches ont été entreprises pour réduire les populations de la chenille processionnaire en favorisant son attaque par un de ses parasites naturels, le BaciZZlU) thaAÀngA,^vU>^i

(Berliner). Cette bactérie présente en effet les différentes caracté- ristiques requises pour être utilisée comme agent de contrôle biologique et, entre autres :

* L'écosystème = le biotope (ensemble des facteurs abiotiques) + les biocénoses (ensemble des populations d'organismes vivants).

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1?) l'inocuité envers la plupart des autres espèces de l'écosystème et, en particulier, envers les prédateurs (oiseaux) et parasites (virus, hyménoptères, coléoptères et diptères) naturels de la chenille processionnaire (critère de spécificité).

2") une nocivité élevée envers cette peste (Franz et Krieg, 1967).

Cette nocivité est essentiellement due â la synthèse, par le bacille, de deux toxines différentes. L'une, appelée ^ endotoxine, est

produite, sous forme cristalline, au moment de la sporulation du bacille (revue : Norris, 1971). Son action est connue au niveau phy- siologique (revue : Cooksey, 1971) : elle provoque une paralysie du tube digestif puis du corps entier de l'insecte parasité, en agissant sur le pH sanguin et sur la conduction nerveuse. L'autre, appelée

p exotoxine thermostable (revue : Bond et al., 1971), a surtout été étudiée au niveau moléculaire. Elle est constituée, entre autres, d'une base purique proche de l'adénine, d'un ribose et de phosphate.

Il semble qu'elle agisse en inhibant la progression de 1'ARNpolymerase sur la matrice d ADN de l'organisme hôte (Sebesta et al., 1969).

L'étude des interférences existant entre le développement du pin, de la chenille et du bacille pose, de façon typique, deux pro- blèmes fondamentaux de la biologie :

1°) quelle est la structure de la matière vivante et comment cette structure rend-elle compte des différentes fonctionsréalisées par les organismes vivants ?

2°) quelle est l'influence de l'environnement sur la matière vivante ? - comment les facteurs du milieu déterminent-ils, par exemple, les associations entre organismes et leur répartition géographique

(variations dans l'espace) ?

- par quels mécanismes apparaissent de nouvelles formes mieux adaptées

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à leur milieu, et, d'une façon générale, par quelle suite de transfor- mations, par quelle évolution le monde vivant a-t-il atteint son état actuel (variations dans le temps) ? La vie a développé des structures d'une très grande diversité mais qui semblent, en majorité, répondre à un "but" commun. On observe, en effet, que les modifications que subit une espèce, qu'elles soient génotypiques ou phénotypiques, vont généralement dans le sens d'assurer au mieux sa survie, en s'adaptanç, de la façon la plus économique, aux fluctuations de son milieu.

Une propriété intéressante des systèmes biologiques est égale- ment illustrée dans l'exemple cité : la matière vivante est organisée

en niveaux d'intégration successifs, allant de structures microscopi- ques jusqu'à la biosphère entière. On peut définir les niveaux suivants, classés suivant leur degré de complexité :

la molécule la cellule

l'individu (pluricellulaire) la population

la biocénose la biosphère

Chaque niveau résulte, le plus souvent, de l'intégration d'un grand nombre d'éléments du niveau inférieur (une cellule d ' E4 cfi£/U.C^(X

g

CoiÀ. est composée d'environ 5.10 molécules, eau exclue; un individu 12

humain comporte environ 5.10 cellules, etc..., d'après Watson, 1968).

A ce saut quantitatif correspond un changement qualitatif : les diffé- rents niveaux d'intégration sont caractérisés par une structure, une histoire, un fonctionnement propre, nécessitant donc des techniques d'étude différentes. De plus, chacun d'entre eux, du moins à partir du niveau cellulaire, présente un ensemble de processus de régulation servant à maintenir un équilibre entre ses différents constituants et lui permettant de s'adapter à certaines transformations du milieu .

(12)

7.

Cet exemple, quoique fort simplifié, nous donne également une idée de la complexité des relations pouvant exister entre les organis- mes vivants. Au sein de l'écosystème, chaque individu interagit, direc-

tement ou indirectement, avec des représentants d'un grand nombre d'es- pèces, appartenant éventuellement à des règnes différents*.

Les relations alimentaires en constituent l'exemple le plus parlant : la matière organique, élaborée par les végétaux, est utilisée par certaines espèces appelées consommateurs primaires. Ceux-ci, à leur tour, peuvent servir de nourriture à d'autres consommateurs, appelés secondaires, et ainsi de suite. Une telle suite de relations unidi- rectionnelles est appelée"chaîne trophique". Dans les écosystèmes naturels, ces chaînes sont généralement branchées (une espèce est consommée par plusieurs autres), connectées (une espèce consomme plu- sieurs autres) et refermées sur elles-mêmes (par l'intermédiaire des décomposeurs qui minéralisent la matière organique). De plus, l'exis- tence d'autres fonctions (protection, nettoyage, fourniture d'02,...) rend les relations multidirectionnelles.

La notion de réseau d'interactions qui en découle, notion qui semble ne s'être généralisée que depuis quelques dizaines d'années, permet une vision intégrée, plus réaliste et plus nuancée, du fonction- nement d'un écosystème. Dès lors, l'ancienne classification manichéiste en espèces utiles et en espèces nuisibles a été partiellement abandonnée puisqu'elle ne considère que les influences directes sur l'homme, en négligeant les diverses interactions avec d'autres organismes. De plus, c'est en fait l'importance quantitative de la population d'une espèce par rapport aux autres qui, en déterminant l'existence d'un état parti- culier de l'écosystème, peut être globalement favorablement ou défavora- ble à l'homme.

Une autre constatation importante est que plus un écosystème est complexe (grand nombre d'espèces différentes et nombreuses interac- tions entre elles), plus il est stable (voir, par exemple, Ramade,1976).

* par exemple, ici: interactions entre un végétal(le pin),un animal(la chenille)et un protiste(le bacille).(classification adoptée, entre autres, par Stanier et al.,1971).

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Ces deux derniers points - l'interdépendance de tous les éléments d'un écosystème et l'importance de sa complexité - influencent évidemment la façon dont les interventions de l'homme se répercutent dans son environnement.

0.1.2. Les différents types de relations entre organismes vivants.

Nous avons vu que chaque individu établit de nombreuses rela- tions avec d'autres organismes vivants au cours de l'accomplissement de ses différentes fonctions vitales. Voyons, à présent, quelles sont les caractéristiques de ces relations unissant des représentants soit de la même espèce, soit d'espèces différentes.

1°) Au sein d'une même espèce, il existe quasi toujours des relations de compétition entre individus et/ou entre groupes. Ces derniers (colonies, familles, sociétés,...), fondés le plus souvent sur des liens de filiation, peuvent présenter des degrés variables d'organisation,de collaboration entre leurs membres, allant du simple groupement jusqu'à une vie sociale complexe*.

2") En dehors des relations de compétition, les associations entre espèces différentes sont généralement classées en quatre groupes

(bien que leurs limites soient difficiles à définir) suivant les avantages et inconvénients qu'en retirent les partenaires. Elles peuvent être schématisées comme suit :

x Par exemple, les chenilles processionnaires d'une même colonie présentent une organisation relativement poussée :

elles coopèrent pour la recherche de la nourriture, la construction du nid, la régulation thermique, e t c . . sans toutefois présenter de

spécialisation dans le travail, ni de hiérarchisation marquée.

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 B

synecie où A et B sont les deiix partenaires

commensalisme + 0

0

+ + = avantage

parasitisme + - = inconvénient

symbiose

0 = relation neutre

Dans le cas de la synécie, les deux partenaires fréquentent le même biotope, mais sans interagir directement l'un avec l'autre.

Cette relation peut évoluer vers une compétition si l'un des facteurs essentiels (O2» lumière,... )commun aux deux partenaires devient limitant.

Dans le cas du commensalisme, un des deux partenaires profite de la présence ou de l'activité de l'autre, sans lui nuire ni lui

procurer un quelconque avantage (par exemple, en récupérant les reliefs de ses repas; en s'y cachant; en l'utilisant comme moyen de transport;

...).

Dans le cas du parasitisme, un des deux partenaires vit aux dépens de l'autre. Dans ce type de relation, on distingue générale- ment :

1°) les parasites au sens strict, généralement plus petits que leur hôte, établissant avec lui une relation plus ou moins prolon- gée et qui aboutit parfois à la mort de celui-ci (ce qui est finalement défavorable au parasite lui-même).

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2°) les prédateurs, généralement plus grands que leur proie, qui établissent avec celle-ci une relation occasionnelle et aboutis- sant à sa mort rapide.

Le parasitisme (au sens large) est sans doute le type de relation le plus fréquent dans le monde animal. Il y remplit une

fonction importante en contrôlant quantitativement et qualitativement les populations de nombreuses espèces.

Dans le cas de la symbiose, les partenaires bénéficient tous deux de leur association. Cette relation, qui représente sans doute chaque fois un stade ultérieur d'évolution d'une relation de parasi- tisme, est plus satisfaisante puisqu'elle respecte l'existence des deux partenaires.

Les trois derniers types de relation -commensalisme, parasi- tisme et symbiose - peuvent en outre être caractérisés, d'une part, par le degré de dépendance des partenaires : l'association peut être facultative ou obligatoire; et, d'autre part, par leur degré d'intimi- té : les deux organismes peuvent être soit indépendants, soit accolés, soit, à l'extrême, l'un dans l'autre (leurs tissus sont parfois si bien imbriqués que leur individualité est difficile à déceler). La pression sélective agit le plus souvent en augmentant la dépendance et l'intimité entre les partenaires.

Souvent aussi, les organismes associés développent différentes adaptations, qu'elles soient morphologiques, physiologiques ou compor- tementales, caractéristiques de leur association. Par exemple, dans le cas de parasitisme ou de symbiose obligatoires, les organismes développent des mécanismes, parfois fort complexes, permettant à leur descendance de conserver ou de retrouver leur hôte ou leur symbionte.

(16)

11.

Notons pour conclure que, d'une façon générale, le commensal, le parasite et le symbionte, en faisant accomplir certaines de leurs fonctions par leur partenaire, rencontrent le principe d'économie.

0.1.3. La place de la biologie moléculaire dans une étude globale.

L'intervention de l'homme dans la lutte contre la chenille processionnaire, ainsi que dans tout autre problème agronomique, para-

sitologique, etc,... nécessite, comme nous l'avons vu, une connaissance approfondie des différents facteurs de l'écosystème considéré, de

manière à pouvoir prévoir les conséquences directes et indirectes de toute modification d'un de ces facteurs.

Il apparaît immédiatement que l'étude globale de systèmes aussi complexes est impossible vu qu'ils font intervenir des éléments trop nombreux, appartenant à des niveaux d'intégration différents et requérant donc des méthodes d'approche différentes.

Leur étude est donc tout naturellement divisée entre les divers domaines traditionnels de la biologie. L'un d'entre eux, la biologie moléculaire, correspondant au niveau d'intégration le plus simple, le plus fondamental, étudie le fonctionnement des cellules au niveau moléculaire. C'est ce domaine qui sert de cadre à notre travail.

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0.2. INTRODUCTION DE BIOLOGIE MOLECULAIRE.

0.2.1. Généralités.

Les recherches en biologie moléculaire ont souvent été réalisées sur des organismes unicellulaires relativement simples comme les bactéries, les virus et les levures. Ces micro-organismes présentent en effet l'avantage d'être faciles à manipuler, à conser- ver et leur temps de génération très court permet d'obtenir une des- cendance importante en peu de temps. De plus, il est possible d'ob- tenir, au sein d'une cellule, au moins une partie de leur information génétique sous forme soit haploïde, soit diploide.

L'étude de ces micro-organismes a permis d'aboutir à de re- marquables conclusions sur l'organisation de la matière vivante. La

généralisation de certaines d'entre elles à l'ensemble des êtres vivants a conduit à mettre en évidence les caractères fondamentaux

communs à des organismes aussi différents que, par exemple, une bacté' rie, un insecte et un arbre.

Parmi les grands apports de la biologie moléculaire et, plus spécialement, de la génétique moléculaire, notons en particulier les points suivants :

1°) Le schéma d'organisation des constituants essentiels de la matière vivante (ADN, ARN et protéines) et les mécanismes de leur synthèse (réplication, transcription et traduction) sont vraisembla- blement universels et répondent au schéma suivant :

réplication

> ^

ADN ^ ARN ^ protéines

transcription traduction

(les flèches donnent le sens du passage de l'information)

(18)

13.

(Remarquons néanmoins que certains virus font exception à cette règle, cfr. Jeener et Rosseels, 1953; Gierer et Schram, 1956; Jeener, 1957 et Fraenkel-Conrat et al., 1957).

Le code génétique, correspondance entre une séquence de nucléotides et un acide aminé, semble lui aussi universel.

2°) La diversité des ADN, ARN et protéines, responsable, en dernière analyse de la diversité macroscopique du monde vivant, est obtenue par l'ordre dans lequel sont agencés leurs quelques éléments constitutifs : 20 acides aminés seulement suffisent pour former toutes les protéines; 5 nucléotides seulement suffisent pour former tous les acides nucléiques (sauf rares exceptions).

3°) Les moyens mis en oeuvre pour réguler les différentes activités cellulaires revêtent une grande diversité. Les effecteurs de régulation agissent en effet à des niveaux différents (sur l'ac-

tivité et/ou sur la synthèse des enzymes; aux étapes de transcription et/ou de traduction) et de façon négative ou positive (voir §0.2.3.1.) D'autres mécanismes interviennent également dans l'harmonisation des fonctions cellulaires. Par exemple, le groupement de certains gènes permet leur expression coordonnée (une telle situation est souvent observée pour des gênes participant à une même fonction; voir, par exemple, fig. 0.1. A et B). Remarquons également qu'une même chaîne métabolique peut être régulée de manière fort, différente chez divers organismes (voir, par exemple, la régulation de 1'aspartokinase chez PémdomoyicU, et E^ckzfu.ckia.;citêe :-par Stanier et al., 1971).

(19)

4°) La cellule - le plus simple des niveaux d'intégration possédant toutes les caractéristiques de la vie - présente déjà une grande complexité par le nombre de ses constituants (Watson (1968) estime entre 3.000 et 6.000 le nombre d'espèces moléculaires diffé- rentes dans une cellue à^E.coZ^; certaines présentes à un grand nombre d'exemplaires) et de leurs interactions (voir, par exemple, le § 0.2.3.3. : 1'ARNpolymérase).

5") Les réactions chimiques du métabolisme cellulaire pré- sentent un très haut degré de spécificité. En règle générale, chaque enzyme (ou, plus précisément, chaque site actif enzjonatique) inter- agit avec un substrat et lui seul, reconnu avec une grande précision.

Par exemple, certains enzymes sont capables de discriminer des subs- tances aussi peu différentes que des isomères L et D .

0.2.2. Les méthodes de l'analyse génétique.

Les mutants défectifs conditionnels.

L'outil principal du généticien dans 1'élucidation de la fonction des gènes, de leur localisation sur le génome et des mécanis- mes contrôlant leur expression est la recherche et l'analyse des mutants.

Il est généralement aisé de sélectionner des mutations alté- rant soit la morphologie d'un organisme (ou d'un clone d'organismes), soit d'autres propriétés n'interférant pas avec sa viabilité.

Toutefois, les mutations les plus instructives sont souvent celles qui affectent une de ses fonctions vitales. Vu leur nature létale, il est alors nécessaire d'employer une astuce permettant de perpétuer l'orga- nisme affecté. Une de ces astuces consiste à sélectionner des muta- tions ne s'exprimant que dans certaines conditions particulières

(20)

15.

et appelées, pour cette raison, mutations défectives conditionnelles."

Les mutations défectives conditionnelles les plus couramment utilisées sont :

l") les mutations thermosensibles, chez lesquelles, à haute température, le produit codé par le gène muté est inactif (c'est à cette température que l'on étudie les effets de la mutation), alors qu'à basse température , le produit synthétisé est fonctionnel

(c'est à cette température que l'on perpétue le mutant).

2°) les mutations suppressibles qui s'expriment ou non sui- vant certaines caractéristiques génétiques de la cellule. Les méca- nismes rendant compte de leurs propriétés demandent quelques mots d'explication.

Nous avons vu que la traduction est le mécanisme permettant l e passage de l'information (contenue sous forme de séquence) des ARNmessagers aux protéines. Le code génétique est la correspondance

entre la séquence des nucleotides dans ces ARN et la séquence des acides aminés dans les protéines : à chaque groupe de 3 nucleotides sur le mARN (un tel groupe est appelé codon) correspond soit un acide aminé, soit un signal de ponctuation de la traduction (début de

chaîne : codon AUG ou GUG; fin de chaîne : codons UAG (encore appelé amber), UAA (ochre) et UGA (opale) qui ne correspondent à aucun acide aminé et qui sont, pour cela, appelés codonsnon sensé).

X Une autre astuce consiste à perpétuer l'organisme par une voie ne nécessitant pas la fonction affectée. Ainsi, la lysogénie (voir § 0.3.2.) permet de perpétuer des bactériophages mutés dans une fonction essentielle au cycle lytique.

(21)

Pratiquement, cette correspondance est assurée par les ARN de transfert (tARN) qui, en interagissant avec le complexe formé par un mARN et des ribosomes, permettent la traduction du mARN en protéines : au niveau d'un codon significatif, il y a insertion de l'acide aminé correspondant; et au niveau d'un codon de ponctuation, il y a initiation ou terminaison de la traduction.

Dans un gêne, une mutation peut faire apparaître un codon non sensé à la place d'un codon significatif. A ce niveau, aucun acide aminé ne sera inséré, les ribosomes se détacheront du mARN et seul un tronçon de la protéine sera synthétisé. Celle-ci ne pourra donc remplir sa fonction.

D'autre part, certaines mutations peuvent altérer la spéci- ficité des tARN. En particulier, certains tARN mutés deviennent capables de placer un acide aminé en face d'un codon amber, ochre ou opale. Une telle mutation de tARN est appelée suppresseur (sup.amber, sup.ochre ou sup.opale suivant le codon non sensé supprimé). Sa

présence aura pour résultat de supprimer l'effet d'une mutation non sensé* puisqu'un acide aminé sera inséré en face du codon non sensé.

En résumé, les mutations non sensé sont des mutations condi- tionnelles suppressibles puisqu'elles s'expriment dans une cellule sauvage alors qu'elles sont supprimées dans une cellule possédant un suppresseur.

3t pour autant que l'acide aminé inséré convienne au fonctionnement de la protéine.

(22)

17.

0.2.3. Un exemple d'organisme bien connu au niveau moléculaire : E^ak^Alckia coti. • •

E^tChoAickiCL coti, ou colibacille, est une bactérie Gram de la famille des Enterobacteriaceae qui vit dans le gros intestin de certains mammifères et entre autres de l'homme. Longtemps consi- dérée comme une espèce commensale facultative* parfois parasite**, il s'avère que cette bactérie établit normalement une relation sjnn- biotique avec l'homme. Dans le tube digestif de ce dernier, E.coti est à l'abri de la dessication et bénéficie d'un apport régulier de nourriture et d'une température constante à laquelle elle s'est adaptée (température optimale de croissance : 37°C.) En retour, il semble que sa présence protège l'homme de la pullulation d'autres micro-organismes indésirables dans le tube digestif. De plus, E.coli fournit à son hôte des vitamines que celui-ci ne peut synthétiser.

L'homme acquiert, dès sa naissance, une flore intestinale d' E.coZÀ. symbiotiques qui s'introduisent, par voie orale, dans le

tube digestif, vraisemblablement à partir de la flore commensale du vagin de la mère (Lefèbvre,communication personnelle).

E.CoLi est l'un des organismes vivants dont la structure gé- nétique et biochimique a été la plus étudiée. Un grand nombre de ses voies métaboliques, impliquées dans les synthèses, les dégradations et le transfert de l'énergie, ont été analysées à ce jour : on connaît maintenant, parfois avec beaucoup de détails, les réactions qui les composent et les régulations auxquelles elles sont soumises.

jt Heureusement pour les chercheurs, t.doLi est aussi capable de crois- sance saprophytique sur milieux synthétiques. C'était évidemment un critère indispensable à son choix comme matériel de laboratoire.

*X E.CoLi, présent accidentellement dans un autre organe que l'intes- tin (par ex., la vessie) peut être pathogène. De plus, dans 1'intes' tin même, certaines souches à^E.coti peuvent être la cause de diar- rhée (souches contenant un plasmide producteur d'une entérotoxine).

Ceci illustre bien qu'un organisme vivant ne peut être considéré in- trinsèquement comme favorable ou nuisible à une autre espèce.

(23)

Dans les paragraphes qui suivent, après avoir parlé de la régulation cellulaire, nous allons voir plus particulièrement deux mécanismes de synthèse fondamentaux - la réplication et la transcrip-

tion - qui ont été choisis parce qu'ils interviennent à plusieurs reprises dans notre travail.

0.2.3.1. La régulation cellulaire.

Les processus de régulation sont nécessaires à la cellule pour coordonner l'activité de ses très nombreuses chaînes de réactions.

Certains de ces mécanismes de contrôle lui permettent en outre, de fonctionner de façon économique.

1°) la cellule contrôle quantitativement ses différentes réactions métaboliques grâce à des mécanismes régulant 1'activité des enzymes (voir, par exemple, la rétroinhibition par le produit final d'une réaction : revue : Stanier et al., 1971).

2") la cellule tend à ne synthétiser,à chaque moment, que les enzymes qui lui sont réellement nécessaires, vu les caractéristi- ques de son milieu et les fonctions qu'elle doit remplir. Cette situation est réalisée grâce à des mécanismes rendant l'expression des enzymes de nombreuses voies métaboliques soit répressible (régu-

lation négative : Jacob et Monod, 1961) soit inductible (régulation positive : Englesberg et al., 1965; Thomas 1965, 1966; Hofnung et Schwartz , 1971)*. Comme l'ont montré ces auteurs, de tels mécanismes

existent au niveau de la transcription des différents groupes de gènes et font intervenir deux éléments génétiques : d'une part, un "produit régulateur" (répresseur ou activateur) codé par un "gène régulateur";

* Chez les organismes supérieurs, cette situation est, de plus, réalisée par la différentiation cellulaire.

(24)

19.

et, d'autre part, son site d'action. Une telle unité génétique d'expression coordonnée est appelée opéron (Jacob et Monod, 1961).

Le milieu environnant la bactérie étant changeant, ces mécanismes doivent être,et sont effectivement en règle générale,

réversibles. Les signaux qui les déclenchent sont de petites molé- cules dont la présence est fonction de la composition du milieu et qui modifient l'affinité du régulateur pour son site d'action.

Par exemple, pour la régulation négative, ces molécules sont appelées soit inducteurs, soit corépresseurs suivant qu'elles agissent en inactivant le répresseur (cas des processus cataboliques) ou, au contraire, en le rendant actif (cas des processus anaboliques).

0.2.3.2. La réplication chez E.CotL.

La réplication est le mécanisme par lequel les molécules d'ADN se recopient exactement lors de la duplication du génome d'un organisme ou d'une cellule, de telle sorte que l'information généti- que qu'elles portent soit transmise intégralement et fidèlement aux descendants.

C'est en 1944 qu'Avery et ses collaborateurs ont fourni la première preuve directe du fait que l'ADN est responsable de la transmission des caractères héréditaires. Ils ont, en effet, montré que la substance chimique vecteur de l'information dans les expérien- ces de transformation de SiA.iip.toc.ocCiJi{> pnuanoyiiaz est insensible aux enzymes protéolytiques et à l'ARNase mais est sensible à l'ADNase.

En 1952, à l'aide d'un système où l'acide nucléique et les protéines d'un virus sont discriminés par marquage isotopique, Hershey et Chase montrent que c'est l'acide nucléique qui est nécessaire et suffisant

pour induire, dans la bactérie hôte, la synthèse d'acide nucléique et de protéines virales.

(25)

L'année suivante, en 1953, Watson et Crick élucident la structure de l'ADN et en déduisent d'emblée le principe de la réplication semi-conservative qui rend compte de la constance des caractères héréditaires lors de leur transmission d'une génération à l'autre et qui fut démontrée, plus tard, par les travaux de Meselson et Stahl (1958) et de Cairns (1963).

En 1963, Jacob et ses collaborateurs proposent le.concept de rëplicon pour désigner un segment d'ADN se comportant comme unité de réplication soumise au contrôle d'un site d'initiation unique.

L'identité des différents réplicons réside dans la spécificité de l'interaction entre le site d'initiation et l'initiateur, produit diffusible codé par un des gènes du réplicon (Jacob et al., 1963;

Jacob et Brenner, 1963).

La réplication d'E.C0-6c a été (et est encore) intensivement étudiée et apparaît actuellement comme un processus complexe, non entièrement élucidé, qui nécessite l'activité coordonnée de très nombreuses protéines (revues : Gefter, 1975; Alberts et Sternglanz,

1977). Elle peut être divisée en plusieurs étapes appelées respecti- vement : l'initiation (formation d'une fourche réplicative); l'élon- gation (progression de cette fourche) et la terminaison (séparation des molécules filles).

a) l'initiation.

La séquence complète de l'ADN d'E.Co£i,molécule bicaténaire 9

circulaire de 2,8,10 daltons (revue : Bonhoeffer et Messer, 1969) est soumise consécutivement à la réplication à partir d'un site unique où interviennent, vraisemblablement comme initiateurs, les produits

(26)

21.

spécifiques codes par les gènes dnaA,dnaC* (revue : Gefter, 1975) et dnaP (Wada et Yura, 1974). Le chromosome

d^E.coLi

constitue donc un réplicon.**

L'initiation de la réplication nécessite, de plus, la présence d'un "primer", séquence monocaténaire ribonucléique (ou désoxyribonu- cléique ou mixte, McMacken et al., 1977; Wickner, 1977; Rowen et Kornberg, 1978) de 50 à 100 bases, à laquelle 1'ADNpolymérase ajoute des nucléotides complémentaires d'une des fibres de l'ADN parent pour former le nouvel ADN.

Notons que c'est au niveau de l'initiation qu'est régulé le taux de synthèse d'ADN de la cellule (Maal«5e, 1961) : généralement, un cycle de réplication s'achève avant que ne soit entamé le suivant.

Cependant, dans des conditions permettant une croissance rapide (temps de génération ^ 40 minutes), la cellule réinitie une nouvelle réplication avant qu'un premier cycle ne soit achevé; dans ce cas, le cycle cellulaire peut être plus court que la durée de la réplication.

b) 1.'é^lo.ng_at_io_n_^

Comme de nombreux autres réplicons, E.coLL forme, au niveau de son site origine, deux fourches réplicatives qui se déplacent en sens opposés (réplication bidirectionnelle : Masters, 1970).

5t Le produit du gène dnaC semble être aussi requis de façon continue durant l'étape d'élongation (Wechsler, 1975).

** Les chromosomes des organismes supérieurs (eucaryotes) sont, eux, constitués de nombreux réplicons.

(27)

La progression de ces fourches associée à la synthèse d'ADN nécessite l'intervention d'une machinerie importante (13 facteurs au moins ont été identifiés à ce jour) dont la complexité reflète sans doute des impératifs de fidélité (en moyenne, une seule erreur est

9 10

faite durant la réplication de 10 à 10 paires de bases). Cette

machinerie comprend, entre autres, différents enzymes présentant une activité polymerasique associée à une activité nucléasique et plu- sieurs protéines permettant la détorsion de l'ADN et son maintien dans cet état, une fois l'hélice relaxée.

Durant 1'élongation, 1'ADNpolymérase responsable de la répli- cation procède le long de l'ADN dans le sens 5' vers 3' (revue :

Bonhoeffer et Messer, 1969). Comme les deux fibres d'ADN sont anti- parallèles, une de ces fibres au moins doit être répliquée de façon discontinue au niveau de chaque fourche, donnant lieu à de petits fragments d'ADN (Okazaki et al., 1968). L'initiation de chacun de ces fragments semble nécessiter également la présence d'un primer ribo- nucléique. Celui-ci est vraisemblablement ultérieurement dégradé et remplacé par de l'ADN, avant qu'une ADNligase ne réalise l'assemblage des différents segments.

c) la_terminaison.

Peu de données sont actuellement disponibles en ce qui concer- ne la séparation des molécules d'ADN néoformées à la fin d'un cycle de réplication chez E.co-ti. On sait seulement que la terminaison de la réplication a lieu en un site unique.

Différents auteurs (De Lafonteyne, 1974; Gefter, 1975; Sogo et al., 1976) ont proposé des modèles pouvant rendre compte de la terminaison de la réplication.

(28)

23.

0.2.3.3. La transcription chez

E.toLi.

La transcription est le mécanisme par lequel l'information génétique, contenue dans l'ADN , est transmise aux ARN qui sont les copies complémentaires d'une des fibres de l'ADN.

Contrairement à la réplication, la transcription est initiée et terminée en de nombreux endroits de l'ADN et procède donc par

petits segments de longueur variable, appelés opérons (voir § 0.2.3.1.

Le fait que ces opérons puissent être transcrits à différents taux constitue un des moyens utilisés par la cellule pour moduler l'ex- pression de ses gènes.

Chez E.COZA^, l'ensemble des transcriptions cellulaires*

nécessite la présence d'une enzyme unique, 1'ARNpolymérase, qui, en se fixant en certains sites de l'ADN appelés promoteurs, permet l'initiation de la transcription des différents groupes de gènes.

Au niveau d'autres sites, appelés sites terminateurs, 1'ARNpolymérase s'arrête, se détache de l'ADN, libérant ainsi les molécules d'ARN néoformées (nombreuses références citées par Pironio, 1973; Lecocq,

1975).

Burgess (1969) a montré que 1'ARNpolymérase purifiée est constituée de plusieurs sous-unités :

0( : dont la fonction est encore inconnue, mais dont le gène de structure (appelé RpoA) a été localisé près de la région spc-str (Nomura, 1976), à 72 minutes sur la carte du chromo- some d'E.CO-£i. (Bachmann et al., 1976).

* à l'exception de la synthèse de certains primers ribonucléiques qui nécessite le produit du gène dnaG.

(29)

qui contient vraisemblablement le site catalytique de l'enzyme (Zillig et al., 1970). Le gène de structure de cette sous-unité, (appelé RpoB) identifié, entre autres, par des mutations de résistance à la rifampicine (Heil et Zillig, 1970) est situé entre les marqueurs argH et purD

(Babinet et Condamine, 1968), à 89 minutes sur la carte

d'E.coU.

qui semble contenir le site d'attachement primaire de l'ARN- polymérase à l'ADN (Zillig et al., 1970; Lecocq, 1975).

Le gène de structure de p', (appelé RpoC) est localisé à côté celui de p (Kirschbaum et Scaife, 1974) et est transcrit en même temps que lui (Errington et al., 1974).

qui intervient dans la spécificité de l'initiation de la transcription (Burgess, 1969; Berg et al., 1969; Bautz et al.

1969; et la revue de Chamberlin, 1974). •

7^ 8i m

0< -l-T-3'^>n

(30)

25.

De plus, un grand nombre de facteurs, agissant avec 1'ARN- polymerase et impliqués dans la régulation de certaines transcrip-

tions, ont été décrits :

facteur responsable de la terminaison de la transcription en certains sites spécifiques (certains sites de terminaison particuliers) (Roberts, 1969). Son gène de structure a été localisé dans la région ilv (Ratner, 1976), à 83 minutes sur la carte d^E.co-ti.

CAP : facteur qui, en association avec 1'AMPcyclique, est néces- saire à la transcription des opérons cataboliques (Emmer et al., 1970; Zubay et al., 1970).

CO, , D, H, M, ... (voir Lecocq, 1975 et la revue de Scaife, 1973) différents facteurs modulant la transcription de régions particulières de l'ADN bactérien.

De ce qui précède, il ressort que 1'ARNpolymérase est une enzyme clef de la régulation cellulaire* et qui interagit, directement ou indirectement, avec un grand nombre d'autres molécules : l'ADN, les différents ribonucléosides triphosphate, les ARN, les différents ions nécessaires à son fonctionnement, et les nombreux facteurs cités plus haut. Puisque 1'ARNpolymérase intervient dans toutes les trans- criptions de la cellule, il n'est pas étonnant que les mutations qui l'affectent puissent avoir un effet hautement pléiotrope. De nom- breuses mutations affectant 1'ARNpolymérase ont été analysées

* justifiant même la rédaction d'un épais volume qui lui est entiè- rement consacré (Chamberlin et Losick, éditeurs, 1976).

(31)

génétiquement. En particulier, des mutations conditionnelles qui affectent spécifiquement certains aspects du développement de virus infectant la bactérie mutée se sont avérées spécialement

instructives.

L'étude de telles mutations a suggéré l'existence d'interactions, directes ou indirectes, entre 1'ARNpolymerase et certains facteurs viraux. Nous y reviendrons par la suite.

(32)

27.

0.3. INTRODUCTION A \ : UN PETIT PARASITE QUI S'ADAPTE EFFICACEMENT AUX CIRCONSTANCES.

0.3.1. X est un virus.

Les virus sont de petits "organismes" généralement constitués uniquement d'un acide nucléique (ADN ou ARN) qu'entoure une coque protéique. Etant dépourvus de la machinerie enzymatique responsable des différentes synthèses (et dégradations) et du transfert d'énergie propres à la vie, les virus sont inertes au point de vue métabolique et ne peuvent se développer que comme parasites internes obligatoires d'une cellule soit animale, soit végétale, soit bactérienne.

la bactérie E.CO-tL (Lederberg, 195J; Lederberg et Lederberg, 1953).

Son ADN bicaténaire, d'un poids moléculaire de 3,1. 10^ daltons, contient l'information génétique correspondant à la synthèse de

produits intervenant spécifiquement dans son développement : au moins 18 protéines différentes impliquées dans la formation de sa coque, les 2 protéines responsables de la lyse de la cellule hôte et les diverses protéines contribuant à sa régulation, à sa réplication et à sa recombinaison.

dont l'hôte habituel est

* bactériophage, ou, en abrégé, phage : virus de bactérie.

(33)

0.3.2. A est un phage tempéré.

Les phages appelés tempérés (Jacob et Wollman, 1953;

Lwoff, 1953) présentent la particularité de pouvoir établir, avec leur hôte une relation de parasitisme différente suivant les circons- tances. En effet, lors de l'infection d'une bactérie sensible, un phage tempéré peut s'engager dans un des deux comportements suivants :

l'un, appelé cycle lytique, conduit à la production de nombreuses particules phagiques et à la destruction de l'hôte; l'autre, appelé

lysogénie, est un cycle non productif respectant l'intégrité de

l'hôte et permettant la propagation simultanée des deux espèces. Dans une population de phages, la fréquence du choix de l'un ou l'autre de

ces comportements dépend de l'état physiologique des cellules hôtes et peut être modifié par des mutations soit bactériennes (références rassemblées dans : Lecocq et al., 1976) soit phagiques (Kaiser,

1957; Eisen et al., 1970; Garcia et al., 1976...).

Voyons comment se déroulent ces processus dans le cas de l'infection de la bactérie E.coti par le phage k

1°) L_e_cyc_le_l_yti_qu_e. Dans le cas du cycle lytique, le génome du phage, une fois injecté dans la bactérie, exprime certaines de ses fonctions (fonctions précoces, voir § 0.4.2.2.) en utilisant à son profit la machinerie de transcription et de traduction de l'hôte*.

Certaines de ces fonctions virales et de nombreuses enzymes bacté- riennes (machinerie de réplication, de transcription, de traduction) coopèrent ensuite pour mener à bien les autres étapes du développement du phage : celui-ci se réplique, donnant naissance à une centaine de

copies d'ADN; réalise la maturation de ces ADN en les emballant dans une coque protéique; puis lyse la bactérie hôte.

« Cohen et Chang (1970) ont montré de plus que le développement de entraîne une inhibition partielle de la synthèse des macromolécules de son hôte.

(34)

29.

Lors de ce cycle, l'espèce virale bénéficie d'une large dissémination puisque chaque bactérie lysée libère, dans le milieu extérieur, une centaine de particules phagiques. Celles-ci, à leur tour, seront à nouveau capables d'infecter d'autres bactéries sensi- bles et ainsi de se perpétuer.

2") La_ly^so_géni_e. Dans le cas de la lysogénie, une fois les protéines précoces synthétisées, le phage s'intègre dans la continui- té du chromosome bactérien par recombinaison entre un site phagique et un site bactérien particuliers (Campbell, 1962 et 1971). Le

génome phagique, appelé dès lors prophage, perd toute autonomie : la plupart de ses gènes restent inexprimés et il est incapable de se répliquer par lui-même. Ce propage peut néanmoins se perpétuer : il est répliqué passivement par la bactérie qui transmet ainsi le génome phagique à toute sa descendance.

Une telle bactérie est appelée lysogène. Sa propriété prin- cipale est d'être immune vis-à-vis d'un phage surinfectant de même type que le prophage (phage homoimmun) alors qu'elle reste sensible à un phage surinfectant d'un autre type (phage hétéroimmun).

Le mécanisme responsable à la fois de cette immunité et de la répres- sion de la plupart des gènes prophagiques est un mécanisme de régula- tion négative qui sera expliqué plus loin (§ 0.4.2.) .

La lysogénie est un type de relation hôte-virus qui a l'avan tage de permettre la survie de la bactérie hôte, indispensable à la perpétuation de l'espèce virale. De plus, les phages, étant intégrés sont transmis directement aux générations successives de l'hôte et sont disséminés dans le milieu en même temps que lui.

Par l'action de certains agents physiques (UV) ou chimiques

(35)

(mitomycine C) appelés agents inducteurs et, à basse fréquence (10 ^), spontanément, le prophage X d'une bactérie lysogène retrouve son autonomie et entame un cycle lytique. La lysogénie apparaît donc comme une phase transitoire pendant laquelle le phage est propagé passivement, en attendant de pouvoir s'exprimer. Dove (1969, 1971) a suggéré que cet aspect de la lysogénie favorise la variation de l'es- pèce virale : le phage, temporairement à l'abri de la pression sélec- tive, peut accumuler des mutations qui permettent son évolution.

De ce qui précède, il ressort qu'un phage tempéré retire de nombreux avantages de son association avec la bactérie hôte, et ce, d'autant plus qu'il présente la remarquable adaptation de pouvoir moduler son comportement parasitaire suivant les circonstances.

Du côté de la bactérie, quel est le bilan de la relation avec un phage tempéré ? A première vue, la présence du phage lui est essentiellement nuisible, surtout lors du cycle lytique. Néanmoins la présence du phage, à l'état prophage, peut, grâce à certains phéno- mènes liés à la lysogénie, être parfois bénéfique à l'espèce bacté- rienne . Ainsi :

1°) Divers phages tempérés peuvent, dans certaines conditions, provoquer la translocation de segments d'ADN, soit à l'intérieur d'une même bactérie, soit entre bactéries différentes. Citons, par exemple,

le phénomène de transduction, tout d'abord mis en évidence chez le

* Ces agents physiques et chimiques endommagent la bactérie. Une

interprétation, peut-être trop finaliste, du phénomène d'induction serait qu'il représente une adaptation, de la part du phage, lui permettant de quitter une bactérie en danger.

3t* Certains plasmides - facteurs sexuels, facteurs colicinogënes, facteurs de résistance aux antibiotiques - peuvent octroyer aux bactéries qui les hébergent les mêmes types d'avantages.

(36)

31.

phage P22 de SalmomZla 6p. (Zinder et Lederberg, 1952)puis chez \ (Morse et al., 1956) et PI (Ikeda et Tomizawa, 1965; et la revue de Ozaki et Ikeda, 1968); et le phénomène de transposition par le phage M u - 1 (Faelen et Toussaint, 1976).

Ces phénomènes, en permettant la réorganisation de différents pools géniques, peuvent constituer un facteur d'évolution pour l'es- pèce bactérienne (Campbell, 1961b).

2°) Divers prophages rendent la bactérie qui les héberge rëfractaire au développement lytique soit d'un phage du même type

(voir le phénomène d'immunité décrit plus haut), soit d'un phage dif- férent, même non apparenté (voir, par exemple, les phénomènes d'inter- férence P 2 - ^ : §0.4.5.; de restriction de X par PI : Lederberg,

1957; Arber, 1965 et 1971; et d'exclusion du mutant rll de T4 par Xl Howard, 1967)*.

3") Une bactérie lysogène possède, en la "personne" du pro- phage, un segment d'ADN non indispensable et donc susceptible d'évo- luer librement, éventuellement à son bénéfice.**

4°) Certains phages sont responsables de l'apparition de nouvelles caractéristiques chez la bactérie qu'ils parasitent : par

X La présence de tels phages hétérologues étant sans doute peu fré- quente dans l'environnement naturel des phages tempérés, il est possible que ces phénomènes ne soient que des effets subsidiaires de fonctions plus importantes.

»* Un phénomène comparable, détecté notamment chez les organismes supérieurs, est la duplication d'un segment d'ADN. Dans ce cas, un des deux exemplaires du segment considéré est libre d'évoluer en dehors de toute pression sélective.

(37)

exemple, la toxine diphtérique, que l'on croyait synthétisée par la bactérie Co^ynzbdcXeAiam (iiph-t2AÂ.ae. est en fait produite lors du développement lytique d'un phage que cette bactérie héberge* (cité par Cooksey, 1971 et Stanier et al. 1971). Il en est de même pour la sjmthëse de la toxine cristalline de BacJJÂwb thiOvinQ-iZYlii-Ui qui pourrait dépendre de la présence d'un phage tempéré (Aizawa et Fujiyoshi, 1967; Colasito etRogoff, 1969).

0.3.3. Les phages lambdoîdes.

Le phage \ est le représentant le mieux connu d'un groupe de phages tempérés, comprenant, en outre, les phages 21, 434, 80, etc., et appelés phages lambdoîdes. Ce groupe est caractérisé par les

propriétés suivantes :

1°) A l'état prophage, ils sont inductibles aux UV (Lwoff, 1950; Lederberg, 1951).

2°) Les extrémités d'ADN, appelées "bouts collants" ont la même séquence chez tous les phages lamboïdes (Yamagishi et al., 1965;

Baldwin et al. 1966). Ces bouts collants sont constitués de séquences monocaténaires de douze nucléotides complémentaires (Wu , 1970; Wu et

Taylor, 1971) générées par l'action d'une fonction phagique appelée Ter (Kousset et Thomas, 1968).

En se rejoignant, ces structures permettent à l'ADN linéaire de la particule phagique de se circulariser lors de son entrée dans la bactérie hôte (Young et Sinsheimer, 1964; Bode et Kaiser, 1965).

* Néanmoins, il n'est pas toujours évident que la synthèse d'une toxine représente un avantage sélectif pour l'espèce bactérienne.

(38)

33.

3°) Ils sont capables de se recombiner entre eux.

Tirant parti de cette dernière propriété, divers auteurs (Kaiser et Jacob, 1957; Liedke-Kulke et Kaiser, 1967; Szpirer et al., 1969; Botstein et Herskowitz, 1974,...) ont construit, par croisement entre X et d'autres lambdoïdes, des recombinants dont les différents gènes proviennent de l'un ou l'autre parent (voir schéma). De tels pkages sont appelés hybrides. Citons, en particulier les phages 21 hybride (21 hy) et 434 hybride (434 hy) dont la structure est la sui- vante :

X ^ N J do? as^^ _ Segment d'origine X *

21 hy > 1 —\ ^ c=n Segment d'origine 21

434 hy ) y//j/>A ^ ezZ2 Segment d'origine 434

> - — ^ symbolise les bouts collants (voir aussi fig. 0.1.)

* Ces conventions seront utilisées pour tous les schémas, dans la suite du travail.

(39)

0.4. L A R E G U L A T I O N D E

Les différents gènes du phage A sont groupés en quatre opérons (Szybalski et al., 1970; Thomas, 1971). Deux de ceux-ci, Ll et L2 (voir figure O.l.c.) sont transcrits vers la gauche, sur

la fibre 1 de l'ADN, alors que les deux autres, RI et R2, sont trans- crits vers la droite, sur la fibre r. Leur expression est soumise à un ensemble de mécanismes de régulation négative et positive (voir

§ 0.2.3.1.) qui agissent au niveau de la transcription.

Dans cette introduction, nous ne mentionnerons que l'essen- tiel des mécanismes de contrôle du phage X , sans analyser le rôle joué par tous les éléments qui interviennent pour assurer la régula- tion, mais en citant les faits dont la connaissance est indispensable à la compréhension de l'exposé des résultats expérimentaux.

0.4.1. Le contrôle négatif.

Nous avons vu que, lorsque le phage \ est intégré sous forme de prophage, la plupart de ses gènes restent inexprimés; en fait, seul

l'opéron Ll (voir figure O.l.c.) est transcrit et traduit (Taylor et al., 1967; Cohen et Hurwitz, 1968; Gros et al., 1969). Le mécanisme de régulation responsable de cette inhibition est actuellement bien connu (revue : Ptashne, 1971). Il s'agit d'un mécanisme de régulation négative.

Le gène CI (présent dans l'opéron Ll) code pour un répresseur (Jacob et Monod, 1961) qui, en se fixant au niveau de deux sites opé- rateurs 01 et Or (Ptashne, 1967; Pirotta, 1975) situés de part et d'autre du gène cl (Ptashne et Hopkins, 1968; Hopkins et al. 1971) empêche 1'ARNpolymérase bactérienne ( Takeda et al., 1969)

(40)

35.

d'initier la transcription au niveau des deux promoteurs PI et Pr (Chadwick et al. 1970; Steinberg et Ptashne, 1971; Wu et al. 1971) localisés dans la même région.

Cette interaction répresseur-opérateur est hautement spéci- fique et rend compte également du phénomène d'immunité (Kaiser et Jacob, 1957). En effet, lorsqu'un phage homoimmun (c'est-à-dire un phage de même spécificité que le prophage) surinfecte une bactérie lysogène, le répresseur synthétisé par le prophage se fixe, non seulement aux deux opérateurs du prophage, mais également à ceux du phage surinfectant homoimmun, empêchant de cette manière son dévelop- pement .

Par contre, lorsque le phage surinfectant est hétéroimmun au prophage, ses opérateurs ont une autre spécificité. Le répresseur ne peut donc s'y fixer, et ce surinfectant est capable de se déve- lopper.

De ce qui précède, il ressort que le répresseur codé par le gène cl joue un rôle essentiel dans le contrôle négatif. Des recher- ches ultérieures ont montré que sa propre synthèse est soumise à une régulation complexe (Eisen et al., 1968; revue Eisen et Ptashne, 1971) où interviennent comme régulateurs le répresseur lui-même (Heinemann et Spiegelman, 1970; Spiegelman et al., 1970; Reichardt et Kaiser,

1971); un autre régulateur négatif appelé cro (Calef et Neubauer, 1968;

Neubauer et Calef, 1970 et surtout Eisen et al., 1970) et les régula- teurs positifs cll et cIII (Eisen et al., 1970; Reichardt et Kaiser, 1971; Echols et Green, 1971; Reichardt, 1975), et indirectement N.

Grâce à sa possibilité de choix entre la lyse et la lysogênie, le phage X ^ comme tous les phages tempérés, forme des plages de lyse troubles dans un tapis bactérien. En effet, au sein de la plage en

(41)

fonnation, certains phages realisent le cycle lytique alors que

d'autres s'etablissent comme prophage. L'aspect trouble des plages provient de la multiplication des bacteries immunes (ou reside un prophage).

Connne le represseur est necessaire au maintien de l'etat

prophage, tousles mutants du gene cl (gene de structure du represseur) et de certains autres genes tels ell et clII (genes de structure de proteines qui, comme nous venons de le voir, sont necessaires

a

l'ex-

pression du gene cl) fonnent, dans un tapis bacterien, des plages de lyse plus ou moins claires suivant le gene affecte (Kaiser, 1957).

0.4.2. Le controle positif.

L'existence d'un controle positif chez _le bacteriophage

A

a ete initialement mise en evidence par Thomas (1966). Ses experiences, appelees experience~ de transactivation, montrent que lorsqu'on surin- fecte une bacterie lysogene pour

A

par un phage possedant la plupart des genes de

A

mais une immunite differente (par exemple, le 434 hybride, voir § 0.3.3.), certains genes prophagiques s'expriment, et ce, malgre la presence de l'immunite. Des experiences ulterieures ont montre qu'il s'agit bien d'une expression prophagique enclenchee par le phage surinfectant. Celui-ci a done fourni, en se developpant, un produit diffusible appele activateur~, necessaire

a

l'expression de certains genes du prophage.

~ Un tel activateur, agissant, dans ces experiences, en trans, est egalement appele transactivateur: il realise la transactivation de certains genes.

(42)

Fig: 0.1. CARTES DE

A

A

coque

,,.- _ _..A._ l

t e t e queue ?

integr.

excision recombin.

actpre c. repression

regul11tion rep Ii c .

ec t i v.t ard . reg u I a t, 1rs e

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R 1 fibre r

Wlll7ftff &./Jl/lffffl$M#ll1YP~

R2

(43)

Légende de la figure 0.1. Cartes de

Remarque : Ces cartes ne respectent que grossièrement les distances relatives entre gênes, sites, e t c . .

A : Carte des fonctions.

Intégr. = intégration recombin. = recombinaison act. préc.= activateur précoce act. tard.= activateur tardif régulât. = régulation

B : Carte des gènes, sites et régions (non exhaustive).

a) carte végétative b) carte prophagique

Guéries : Les gènes essentiels au développement lytique sont désignés par une lettre majuscule".

Les gènes non essentiels au développement lytique sont désignés par trois lettres minuscules ou par une lettre minuscule + un

-nombre.

S_i_tes : en rouge x site origine de la réplication : ori

^ terminateurs ( tL; tRl; tR2)

• promoteurs (pL; pR; Prm; Pre) ta extrémités du prophage

» > ^ bouts collants Rég^ions :en vert x; y; b2

(44)

Carte des principales ondes de transcription.

.y : ultraprêcoce : précoce ,'\ : tardive

Carte des principales régulations transcriptionnelles,

action positive

action négative

(45)

Le fait que l'expression de certains gènes puisse être enclenchée de cette manière montre clairement qu'il existe des gènes qui ne sont bloqués qu'indirectement par l'immunité, leur expression étant sous le contrôle d'activateurs qui sont, eux, directement bloqués par l'immunité.

Chez X , deux protéines - le produit des gènes N et Q - ont été identifiées comme activateurs du développement lytique grâce aux propriétés des mutations qui les affectent (revue : Thomas,1971).

0.4.2.1. Le produit Q.

Le produit Q est nécessaire à l'expression massive* des gênes S et R, responsables de la lyse de la bactérie hôte; et des gènes A à J, impliqués dans la maturation de la particule phagique

(Dove, 1966), (voir figure 0.1.). Il intervient au niveau de la

transcription de ces gènes (Joyner et al., 1966; Skalka et al., 1967;

Szybalski et al., 1970) en agissant en un site unique localisé au début de l'opéron R2, entre les gènes Q et S (Toussaint, 1969;

Herskowitz et Signer, 1970b; Szpirer et Brachet, 1970).

0.4.2.2. Le produit N.

a) Son rôle :

Le produit N s'est révélé nécessaire à l'expression de la plupart des gènes de \ . Divers auteurs (nombreuses références dans

X II existe en fait deux mécanismes d'expression des gènes S et J : l'un, massif, dépendant du produit Q; et l'autre, beaucoup plus faible, indépendant du produit Q mais dépendant du produit N et de l'absence de répresseur (Dambly et Couturier, 1971).

(46)

40.

Echols, 1971) ont, en effet, montré que les mutants N sont hautement défectifs. Ce caractère pléiotrope s'explique de la façon suivante : au début du cycle lytique (étape ultraprécoce), seuls les produits N et cro* sont exprimés. Une fois synthétisé, le produit N enclen- che l'expression d'un groupe de gènes appelés précoces et comprenant, entre autres, le gène Q. Le produit Q, à son tour, permet l'expres- sion des différents gènes appelés tardifs (S à J).

Une telle relation entre les régulateurs positifs permet au phage, d'une part de moduler le taux d'expression de ses différentes fonctions; et, d'autre part, de les exprimer de manière séquentielle

(Thomas, 1966; Dove, 1966) et seulement au moment où il en a besoin.

Etapes *36 ultraprécoce précoce tardive

Fonctions exprimées

cro N

(activateur^

précoce)

cil et réplication

(activateur tardif)

lyse et maturation

1 cIII,recombinaison, intégration-excision

b) Son mode d'action.

L'activateur précoce N est nécessaire à la transcription des gènes phagiques (Kourilsky et al., 1968; Kumar et al., 1969).

En effet, en absence du produit N, on observe que les ondes de trans- cription, initiées de part et d'autre du gène cl, sont bloquées au

* Nous ne dirons que quelques mots du produit cro. Ce régulateur négatif module le taux d'expression de l'ensemble des gènes de X en agissant au niveau de sites situés de part et d'autre du gène cl (voir aussi § 0.4.1. et carte 0.1.D.)(Eisen et al., 1966;

Pero, 1970).

«* Ces étapes ont été mises en évidence, entre autres, au niveau de la synthèse des ARN, simultanément à 1'élucidation des mécanismes de régulation positive (voir, par ex. Naono et Gros,1965;Echols,1971).

Figure

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Références

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