Adsorption des protéines sur les nanomatériaux. Biochimie et physico-chimie d’un nouveau stress

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Adsorption des protéines sur les nanomatériaux.

Biochimie et physico-chimie d’un nouveau stress

Stéphanie Devineau

To cite this version:

Stéphanie Devineau. Adsorption des protéines sur les nanomatériaux. Biochimie et physico-chimie d’un nouveau stress. Autre. Université Paris Sud - Paris XI, 2013. Français. �NNT : 2013PA112215�. �tel-00903842v2�

UNIVERSITE PARIS-SUD

ÉCOLE DOCTORALE Chimie Paris Sud

Laboratoire de Radiolyse, UMR CEA-CNRS 3299

DISCIPLINE CHIMIE

THÈSE DE DOCTORAT soutenue le 4 Octobre 2013 par

Stéphanie DEVINEAU

Adsorption des protéines sur les nanomatériaux

Biochimie et physico-chimie d’un nouveau stress

Directeurs de thèse : Serge PIN Directeur de Recherche CNRS, CEA Saclay Jean Philippe RENAULT Chercheur, CEA Saclay

Composition du jury :

Président du jury : Claire SMADJA Professeur, Université Paris Sud

Rapporteurs : Jean-Michel BETTON Directeur de Recherche CNRS, Institut Pasteur Emmanuel PAUTHE Professeur, Université de Cergy-Pontoise

Examinateurs : Michel DESMADRIL Directeur de Recherche CNRS, Université Paris Sud Francelyne MARANO Professeur, Université Paris Diderot

Remerciements

Je remercie très chaleureusement mes directeurs de thèse, Serge Pin et Jean Philippe Renault, qui ont développé ce projet au sein du Laboratoire de Radiolyse et m’ont invitée à les rejoindre. Ce fut un réel plaisir de travailler et d’échanger avec eux au cours de ces trois années, avec une grande liberté et de nombreuses collaborations qui ont rendu cette thèse très enrichissante. Merci !

Je remercie également chaleureusement Jean-Michel Betton, Michel Desmadril, Francelyne Marano, Emmanuel Pauthe et Claire Smadja, qui ont accepté de faire parti de ce jury et de s’atteler à la lecture de ce manuscrit. J’ai beaucoup apprécié la justesse de leurs questions, leur amabilité et les nouvelles pistes de réflexion qu’ils m’ont proposées.

Je remercie Géraldine Klein et Christelle Mathé, qui nous ont rejoints sur ce projet au cours de leur post-doctorat, pour leur compétence, leur gentillesse et leur soutien. Je remercie également toutes les personnes avec qui nous avons pu collaborer lors de ce projet, pour leur accueil, leur ouverture et la possibilité de partager points de vue et réflexions avec des approches différentes et enrichissantes, en chimie, en biologie ou en physique. Je remercie Frédéric Galactéros du CHU Henri Mondor ainsi que Véronique Baudin-Creuza, Laurent Kiger et Michael Marden du CHU du Kremlin-Bicêtre pour la mise à disposition de l’hémoglobine humaine et de l’hémoglobine S, pour leur accueil au sein du laboratoire Inserm U779 et pour des discussions toujours intéressantes.

Je remercie Jean-Christophe Aude, Yves Boulard et Jean Labarre de l’iBiTec-S au CEA avec qui nous avons travaillé dans le cadre du Programme Transversal de Toxicologie du CEA, ce qui nous a permis de développer une nouvelle approche associant protéomique et physico-chimie. Je remercie également Gilles Lagniel qui a réalisé les électrophorèses bidimensionnelles.

Je tiens à remercier tout particulièrement les personnes qui m’ont accompagnée lors des mesures sur grands instruments, à Saclay et à Grenoble, pour des nuits de manips toujours surprenantes et enthousiasmantes. Un grand merci à Gérard Baldacchino et Mickaël Bouhier du Laboratoire de Radiolyse, ainsi qu’à Serge et Jean Philippe. Je remercie également Jean-Louis Hazemann, Olivier Proux, Vincent Ranieri et Denis Testemale pour leur accueil et leur aide lors des mesures sur la ligne FAME à l’ESRF, ainsi que Marie-Hélène Mathon et Jean-Marc Zanotti pour leur accueil et leur aide sur les spectromètres PAXY et MIBEMOL du LLB au CEA.

Je remercie Loussiné Zargarian du LBPA à l’Ecole Normale Supérieure de Cachan, ainsi que Serge Fermadjian, pour la formation et la mise à disposition du dichrographe. Je remercie Camille

Loupiac de PAPC à l’Université de Bourgogne pour la formation et la mise à disposition du microcalorimètre DSC, ainsi que Fabrice Neiers du CSGA à l’INRA de Dijon pour l’acquisition des données de microcalorimétrie ITC. Je remercie également Thomas Gustavsson du SPAM au CEA pour les mesures de fluorescence ultrarapide.

Je remercie Régis Daniel, Florence Gonnet et Véronique Legros du LAMBE à l’Université d’Evry où nous avons pu réaliser les mesures par spectrométrie de masse, dans le cadre du Programme C’Nano Ile-de-France, malgré une forte demande sur ce type d’appareil.

Je remercie chaleureusement Claire Boulogne du centre Imagif du CNRS à Gif-sur-Yvette et Pierre-Eugène Coulomb du LSI à l’Ecole Polytechnique pour la formation à la microscopie électronique à transmission.

Je remercie tous les membres du Laboratoire de Radiolyse pour leur sympathie, Hugues Badet, Imène Boughattas, Stéphane Esnouf, Charles Klett, Sophie Le Caër, Sandrine Moreau, Daniel Ortiz, Eleonora Pellizzi et un merci sportif à notre équipe de coureurs, Anna Balcerzyk, Gérard Baldacchino et Georges Vigneron. Je remercie également Jules Bussières et Yoann Gasnier pour leur aide lors de leur stage d’IUT sur ce projet, en espérant qu’ils en garderont un bon souvenir.

Un grand merci enfin à mes amis et à ma famille pour qui la thèse est aussi une drôle d’aventure, qui en présage de nouvelles encore plus enthousiasmantes ! Merci aux cavalières toujours pleines de ressources, Albane, Aurélie, Alexandra et Stéphanie, à Bénédicte toujours entre deux peintures, à Philippe, fin cuisinier et coureur de haut vol, et à Sylvain et Sophie, pour leur bonne humeur et leur patience.

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OMMAIRE

Chapitre 1 – Introduction

1

1. Pourquoi étudier l’adsorption des protéines sur les surfaces ? ...1

1.1 Les premières études ...1

1.2 Les enjeux en biotechnologies ...2

1.3 De nouvelles questions sur les nanomatériaux : quelle toxicité ? ...7

1.4 Un risque de toxicité par adsorption des protéines ... 15

2. Etat d’une protéine adsorbée ... 18

2.1 Structure ... 18

2.2 Activité ... 19

2.3 De nombreuses inconnues... 19

3. Les modèles d’adsorption des protéines ... 20

4. Choix des protéines et des nanomatériaux étudiés ... 27

5. Approche expérimentale ... 30

Bibliographie... 32

Chapitre 2 – Matériels & Méthodes

38

1. Tampons et produits chimiques ... 38

2. Nanomatériaux ... 39

2.1 Microscopie électronique à transmission ... 39

2.2 Isotherme de sorption d’azote (BET) ... 40

2.3 Zétamétrie ... 40

2.4 Diffusion de neutrons aux petits angles ... 42

2.5 Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier ... 43

3. Purification des protéines ... 43

4. Adsorption des protéines ... 45

4.1 Spectroscopie UV-visible ... 45

4.2 Microcalorimétrie ITC ... 46

4.3 Cartographie de surface par irradiation ... 49

4.4 Analyse des protéines d’un extrait cellulaire de levure ... 52

5.1 Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier ... 55

5.2 Dichroïsme circulaire ... 55

5.3 Spectroscopie de fluorescence ... 56

5.4 Spectroscopie d’absorption X ... 56

5.5 Microcalorimétrie DSC ... 56

6. Activité des hémoprotéines adsorbées ... 57

6.1 Fixation de ligands de la metmyoglobine ... 57

6.2 Oxygénation de l’hémoglobine ... 59

7. Dynamique des protéines adsorbées ... 62

7.1 Diffusion incohérente élastique de neutrons ... 63

7.2 Diffusion incohérente inélastique de neutrons ... 63

Bibliographie... 65

Chapitre 3 – Caractérisation des nanomatériaux

67

1. Quels critères pour caractériser les nanomatériaux ? ... 68

2. Nanoparticules de silice... 70

2.1 Chimie de la silice colloïdale ... 70

2.2 Taille des particules et agrégation ... 75

2.3 Surface spécifique ... 79

2.4 Charge de surface ... 80

3. Verres de silice nanoporeux ... 81

Les points clés ... 85

Bibliographie... 86

Chapitre 4 – Mécanismes d’adsorption des protéines

88

1. Isothermes d’adsorption ... 90

2. Modèles d’isothermes appliqués à l’adsorption des protéines ... 95

3. Caractérisation de l’adsorption des protéines sur la silice nanostructurée ... 104

3.1 Effet du matériau ... 106

3.2 Effet de la protéine ... 107

3.3 Effet du pH et du tampon ... 109

3.4 Comparaison avec d’autres systèmes de la littérature ... 112

5. Energie d’adsorption de la myoglobine sur les nanoparticules de silice ... 117

6. Echelle d’affinité des protéines pour les nanoparticules de silice ... 123

6.1 Compétition entre hémoglobine et sérum albumine ... 124

6.2 Adsorption de protéines à partir d’un extrait cellulaire de levure ... 125

6.3 Identification des protéines de levure adsorbées et non adsorbées ... 127

7. Critères structuraux d’adsorption des protéines de levure sur les nanoparticules de silice ... 133

7.1 Analyse statistique de la séquence primaire ... 134

7.2 Interprétation des critères identifiés ... 136

7.3 Flexibilité des protéines adsorbées et non adsorbées ... 139

8. Comparaison de l’adsorption des protéines de levure et des protéines modèles ... 142

8.1 Discussion des critères structuraux d’adsorption des protéines ... 142

8.2 Modèle d’adsorption des protéines sur une surface de silice ... 145

Les points clés ... 147

Bibliographie... 148

Chapitre 5 – Structure des protéines adsorbées

152

1. Surface occupée par la myoglobine et l’hémoglobine sur les nanoparticules de silice ... 153

2. Structure secondaire des protéines adsorbées sur la silice ... 156

2.1 Hémoglobine et nanoparticules de silice 20 nm... 157

2.2 Myoglobine et nanoparticules de silice 7 nm ... 162

2.3 Comparaison avec d’autres systèmes d’adsorption protéine-silice ... 169

2.4 Quel lien entre résidus basiques, adsorption et perte d’hélicité ? ... 170

3. Stabilité de la myoglobine adsorbée sur la silice ... 172

3.1 Température et enthalpie de dénaturation ... 172

3.2 Quelle relation entre adsorption, perte de structure et dénaturation ? ... 176

4. L’hème, site actif de la myoglobine et de l’hémoglobine ... 180

4.1 Hémoglobine et nanoparticules de silice 20 nm... 181

4.2 Myoglobine et nanoparticules de silice 7 nm ... 184

4.3 Application de la spectroscopie d’absorption X aux hémoprotéines adsorbées... 188

5. Environnement des résidus tryptophane de l’apomyoglobine adsorbée sur la silice ... 196

6. Cartographie des surfaces d’interaction entre myoglobine et silice par irradiation ... 200

Les points clés ... 208

Chapitre 6 – Dynamique des protéines adsorbées

215

1. Introduction à la diffusion incohérente de neutrons ... 219

2. Mobilité de la myoglobine adsorbée... 221

3. Densité d’états vibrationnels de la myoglobine adsorbée ... 223

4. Discussion ... 228

Les points clés ... 231

Bibliographie... 232

Chapitre 7 – Activité des protéines adsorbées

234

1. Fixation de ligands de la metmyoglobine ... 235

1.1 Azoture ... 236

1.2 Imidazole ... 238

2. Oxygénation de notre protéine modèle, l’hémoglobine de porc ... 241

2.1 Oxygénation de l’hémoglobine adsorbée ... 241

2.2 Effet des protons ... 243

2.3 Effet du DPG et de l’IHP ... 246

2.4 Effet de la température ... 251

2.5 Oxygénation de l’hémoglobine désorbée ... 254

3. Ouverture sur l’hémoglobine humaine ... 255

3.1 Adsorption et oxygénation de l’hémoglobine A ... 255

3.2 Oxygénation d’un hémolysat ... 260

3.3 Oxygénation de l’hémoglobine pontée DCL ... 264

3.4 Oxygénation de l’hémoglobine S ... 266

4. Discussion des modifications d’activité de l’hémoglobine adsorbée... 269

4.1 Modèles de coopérativité ... 270

4.2 Un effet global et reproductible ... 275

Les points clés ... 279

Bibliographie... 280

Tableau récapitulatif : affinité et coopérativité de l’hémoglobine libre et adsorbée sur les nanoparticules de silice ... 284

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