eprinted from "Radioisotopes in Scientific Research" Vol III.
'roc. Ist UNESCO !n:. Conf.. Paris, 1957). Pergamon Press:
>ndon, N e w York & Paris, 1958.
La pénétration de la ribonucléase dans certaines cellules vivantes
pai J . BRACHET, M. BRIERS, L. LÉDOUX, A. PILERI. V. SCHUMAKER, Y. THOMAS et P . VANDERHAEGHE
Université' Libre de Bruxelles, Belgique présenté par L. LEDOUX
Résumé
Des amibes, des cellules du carcinome d'Ehrlich et des cellules de la moelle osseuse ont été traitées in vitro par de la rihonucléase (RNase) cristallisée.
Des déterminations d'activité enzymatique et des mesures de la radioactivité des cel
lules soumises à l'action de la RNase marquée à l'iodel"^ ont permis de démontrer que cet enzyme (PM = 13000) pénètre rapidement dans les cellules étudiées.
En 5 à 10 minutes, la teneur en RNase des cellules de la moelle osseuse double, celle des amibes augmente de 3 à 4 fois et celle des cellules d'Ehrlich augmente de 20 à 100 fois. Dans tous les cas étudiés, la pénétration de la RNase est relativement peu affectée par la température (4" ou 25"); elle dépend directement de la concentration de l'enzyme dans le milieu extracellulaire.
Le lavage prolongé d'amibes traitées par la RNaselne modifie que lentement la teneur en enzyme des cellules (50% de la RNase sont extraits en trois heures). Dans les amibes également, l'autoradiographie montre qu'une grande partie de la RNase marquée se fixe sur la périphérie des cellules.
Il semble exister une relation entre la variation relative de la teneur en RNase des cellules étudiées et les modifications métaboliques provoquées par l'enzyme (3, 4, 6, 8, 11).
A. INTRODUCTION
L'action de l a ribonucléase ^RNase) sur le métabolisme des cellules vivantes a d é j à fait l'objet de plusieurs études. On a étudié, notamment, l'action de cet enzyme sur:
1) d e s cellules embryonnaires: oeufs d'amphibiens (1,2).
2) d e s c e l l u l e s normales en croissance: amibes (3,4), racines d'oignon (5,6), f i b r o b l a s t e s (1), moelle o s s e u s e (8.9),
3) des c e l l u l e s néoplastigues: carcinomes d'Elhrlich (10), de Landschiitz (11,12).
Dans c e s différents cas, on a supposé que l e s modifications du métabolisme d e s a c i d e s nucléiques et d e s protéines, qui ont été observées en présence de ribonucléase, sont d u e s à la pénétration de l'enzyme dans les cellules.
C ' e s t seulement d a n s le c a s des oeufs d'ampliibiens que l'étude cytochimique et auto- radiographique a montré que l a RN'ase, marquée à l'iode 131, pénètre réellement d a n s l e s cellules u t i l i s é e s (2).
L e présent travail a pour but de démontrer que la RNase pénètre également dans l e s amibes, l e s c e l l u l e s de la moelle o s s e u s e et c e l l e s du carcinome de Landschiitz.
L a pénétration de l'enzyme à été suivie à l ' a i d e de RNase marquée à l'iode 131 et par d e s mesures de l'activité enzymatique.
B. METHODES ( a ) RNase /«"
L a RNase radioactive a été préparée par l a méthode de Wormall et al.f 13) à partir de ribonucléase P.E.V.Y.A. purifiée par chromatographie; la fraction A a été atilisée < 14).
285
286 La pénétration de la ribonuclease dans certairie^ cellules vivantes.
fh) A ndbes
L e s amibes u t i l i s é e s sont à jeun depuis 2-4 jours, "^lles sont incubées, dans du milieu de Chalkley, en présence de quantités différentes de RNase G3I ou de R'^îase I"*.
L e s amibes sont l a v é e s pUsieurs fois dans du milieu frais, puis elles sont utilisées pour l e s dosages.
1. Activité enzymatique: les amibes sont homogénéisées dans du tampon acétique 0,2H de pH 5, puis elles sont incubées en présence d'acide ribonucléique fortement polymérisé d i s s o u s d a n s le même tampon. Des prélèvements sont effectués après 2 min. et 20 min.;
i l s sont précifités par de l ' a c é t a t e d'uranyle 0,25% dissous dans de l'acide perchlorique a 109f>. Après une heure à 0° C, les échantillons sont centrifugés. Le surnageant est décanté, dilué 15 fois et son absorption U.V. est mesurée à 260 et à 300 m^. ^^a différence entre c e s deux valeurs constitue la mesure de l'activité ensa^matique.
2. Mesures de radioactivité: les amibes sont mises sur des plaquettes de verre, conçjtées.
Bâchées et leur radioactivité est mesurée. On en déduit l a teneur en RNase I ' " . f c ) Cellules du Carcinome d'Ehrlich et de la Moelle Osseuse
L e s cellules sont incubées in vitro ^dans du plasma ascitique ou dans du tampon au phosphate glucosé de plî 7.4) en présence de RNase I ' " .
E l l e s sont lavées plusieurs fois avec du NaCl à 0,9% puis utilisées pour les dosages.
1. Activité enzymatique: l e s cellules sont incubées une heure à 0° C dans H , S 0 4 N / 1 5 . Une partie aliquote est prélevée et la teneur en protéines est déterminée a l'aide de la méthode de Lowry et al. (15).
L ' e x t r a i t sulfurique est centrifugé, décanté et neutralisé. Il est ajouté à une solution d'ARN d i s s o u s dans du tampon acétique 0,2 M de pH 5. Des prélèvements sont effectués après 3, 12 et 22 minutes; ils sont précipités par un mélange d'éthanol-acide perchlorique a 10% glacé. Après 15 minutes, l e s suspensions sont centrifugées et le surnageant est décanté n est analysé au.moyen d'un spectrophotomètre U.V. L a pente de l a courbe obtenue est utilisée comme mesure de l'activité en2ymatique.
2. Mesures de radioactivité: les cellules l a v é e s sont resuspendues dans H p et d é p o s é e s sur d e s plaquettes de verre. EHles sont s é c h é e s . Après mesure de la radioactivité, l a plaquette est plongée dans un volume connu de NaOH 0,1 N. Après dissolution complète du matériel cellulaire, l a teneur en protéines est estimée par l a méthode de Lowry et al. (15).
( d ) Dosage des acides nucléiques
L a méthode de Schneider ( l 6 ) a été utilisée dans tous l e s cas.
O 10 2 0 3 0
t incubation min Figure 1
La pénétration de la ribonuclease dans certaines cellules vivantes. 287 C. RESULTATS
1. AMIBES
(a) Mesure de l'activité enzymatique
L a figure montre les r é s u l t a t s des dosages en RNase d'amibes traitées par 0,2 mg de RNase/ml de milieu. L'incubation a eu lieu à 70°C ou a 25''C. On voit que la péné- tration est très rapide, et que la température n ' a p a s d ' e f f e t sur la v i t e s s e de pénétration.
(b) Mesures de radioactivité
L a figure 2 montre les résultats obtenus pour des concentrations différentes en RNase- f " . incubée à 2 5 ' C .
On voit que l'enzyme pénètre rapidement dans l e s c e l l u l e s et que la quantité qui pénètre dépend fortement de l a quantité présente dans l e milieu extracellulaire. On voit également
^u'il semble y avoir une limite de saturation d e s amibes (7-8 y / 1 000 amibes).
L e s r é s u l t a t s obtenus à 4° et à 25° C sont semblables: l a température n'a donc que peu d'Influence sur l a pénétration de l'enzyme dans l e s amibes.
L a figure 3 exprime la teneur en RNase d'amibes t r a i t é e s pendant 15 minutes par des concentrations différentes d'enzyme.
.û E o O O o
in o z ce s.
1 r. 0 - 2 ( D m g / m L c h
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1 u / / ^ ^ - - ^ • 0 1 m g/mL
f incubation
Figure 3
288 La pénétration de la ribonuclease dans certaines cellules
Afin de vérifier que la radioactivité observée est réellement due à l a ribonuclease et non à un constituant quelconque de l a solution utilisée ( I " ' libre, p.ex.), l'expérience décrite dans l a table I a.été effectuée.
Table I
Solution ml Solution ml Solution ml milieu Concen- R.S.
RNase I ' " RNase tration RNase
0.2 mg/ml 0.2 m/ ml RNase
A 1 3 0 0,10 1/4
B 2 2 0 0.10 1 / 2
C 3 1 0 0,10 3 / 4
D 3 0 0 0,20 1
E 1 0 3 0,0.5 1
P 2 0 2 0,10 1
G 3 0 1 0.15 1
Figure 4
L e graphique 4 montre que c ' e s t réellement l a RNase qui est responsable de la radio- activité trouvée dans l e s amibes traitées. Dans le c a s contraire, en effet, l e s points E, F et G devraient se confondre avec l e s points A, B et C.
(c) Dosage de la teneur en ARN des amibes traitées par la RNase
La figure 5 montre la variation de la teneur en ARN des amibes traitées par la RNase (0,2 mg/tnl de milieu.)
On voit que l'ARN n ' e s t pas dégradé immédiatement; il se peut qu'il y ait une faible synthèse initiale, mais l e s exp.ériences ne sont p a s a s s e z nombreuses pour qu'on p u i s s e l'affirmer avec certitude.
La pénétration de la ribonucléase dans certaines cellules vivantes. 2 8 9
2 4 6 8 10
/ Incubation min Figurp 5
(d) Pénétration de l'ARN P " dans les amibes
Afin de déterminer si un traitement à l a RNase peut modifier l a perméabilité cellulaire, d e s amibes ont été incubées en présence d'ARN marqué au phosphore 32. L a figure fi montre l e s r é s u l t a t s obtenus.
E o O O
\ E o
) — RNase
-<
»—— . ^
^ Contrôles
—
- ^ ^ — ^
t incubation Figure 6
L e traitement à l a RNase provoque donc une diminution induite de l a perméabilité cellulaire aux acides ribonucleiques. Mais il s'accumule à l a longue plus d'ARN dans l e s amibes t r a i t é e s à la RNase que dans l e s autres.
2. CARCINOME DE LANDSCHUTZ (a) Mesures de l'activité enzymatique
L a figure 7 montre l e s résultats obtenus en dosant la RNase des cellules a s c i t l q u e s au cours de l'incubation en présence d'un mélange composé de 50y de RNase I " ' et de 2 ou 10 mg/ml de R N a s e non marquée.
L a pénétration, on le voit, est rapide.
(b) Mesures de radioactivité'
L a figure & montre l e s résultats obtenus en mesurant l a radioactivité des mêmes cellules d ' a s c i t e s Ccf. 2,a). On constate que l a v i t e s s e de pénétration de l a R N a s e I " ' e s t semblable à celle de la RNase. L ' I " ' ne modifie donc p a s l a pénétration de la protéine.
2 9 0 La pénétration de la ribonuclease dans certaines cellules vivantes.
4 , 0 0 — c
i* 3 , 0 0 o 1.
Q.
I 2 , 0 0 z o 1 l' O O
0
5 15 3 0
Minutes
Figure 7
Minutes Figure 8
L a figure 9 exprime l a teneur en R N a s e de cellules ascitiques traitées pendant 5
• minutes par d e s solutions d'enzyme plus ou moins c o n c e n t r é e s .
L e s incubations ont été e f f e c t u é e s à 0° ou 2^° C. On voit que, j u s q u ' à une concen- tration du milieu voisine de 10 mg/ml, la température n ' a p a s d'influence sur l a v i t e s s e di pénétration. Notons a u s s i que la cellule d ' a s c i t e ne se sature pas aisément en RNase. C(
fait, qui s e r a discuté plus loin, est s a n s doute l a conséquence de l a faible teneur .en RNase de la cellule.
(c) Dosage de la teneur en ARN des cellules ascitiques traitées par la RNase
L e s r é s u l t a t s sont exprimée dans le la figure 10. On voit que l a pénétration de l a RNase provoque une augmentation considérable et transitoire de l a teneur en ARN.
3. MOELLE OSSEUSE (a) Mesure de l'activité enzymatique
L a figure 11. montre l e s résultats obtenus en incubant d e s cellules de moelle o s s e u s e en présence de 2 ou in mg de RNase (+ SOy RNase I"*'). On voit que la quantité de RNase qui pénètre est élevée. Cependant, elle ne représente qu'une fois, au maximum la teneur initiale de la cellule. Comme le montre la figure 11, les cellules de la moelle o s s e u s e sont rapidement s a t u r é e s par l a RNase extracellulaire.
pénétration de la ribonuclease dans certaines cellules vivantes.
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z X
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+ • 0 A 0 3 7
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6 8 10 12 14 15 (RNase)/ml mg Figure 9
û I ce <
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Contrôle1 1
3 0 6 0
i incubation 9 0 120
min Figure 10
« c
•>*
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I.a.
i M I o:
a.
1
2 m g / m l
Controles'omgAnI 1 1 [ 1
1 1
i incubation Figure 11
292 La pénétration de la ribonucléase dans certaines cellules vivantes.
(b) Mesures de radioactivité
L a figure 12 représente l e s résultats obtenus en mesurant, au cours des expériences décrites au paragraphe pre'cédent, l a radioactivité des cellules traitées par l a RNase l ' " . Dans ce c a s aussi, l e s résultats indiquent que la présence de 1' I " ' ne m o d i f i e pas l a
pénétration de l a RNase.
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2e a
i 1 o z
lOmgAnL
2mg/rT U / >
U
15 2 5 t incubation min Figure 12
(e) Dosage de la teneur en ARN des cellules de la moelle osseuse traitées par la RNase
L a figure 13 montre que l a RNase ne provoque aucune modification de l a teneur en ARN d e s c e l l u l e s t r a i t é e s .
<
1
h -
-o-
5 10 15 2 0 2 5
•
t incubation min Figure 13
D. DISCUSSION
Nos r é s u l t a t s démontrent que la ribonucléase (PM-13 000) est capable de pénétrer dans certaines c e l l u l e s vivantes, normales ou cancéreuses.
L ' u t i l i s a t i o n de R N a s e marquée à l ' I " * a rendu p o s s i b l e l'étude systématique et com- parée de l a pénétration de l'enzyme dans l e s amibes, l e s cellules de la moelle o s s e u s e et c e l l e s du carcinome d'FJirlich
Dans c e s trois t y p e s de cellules, la RNase pénètre rapidement. L e s amibes et l e s cellules de la moelle o s s e u s e s e saturent rapidement de RNase; au contraire l e s cellules d ' a s c i t e s semblent ne p a s pouvoir être saturées Cmême en présence de 15 mg/ml).
A saturation, et par rapport à la quantité présente initialement, l a teneur en UNase double dans l e s c e î i u l e s de la moelle osseuse; eUe quintuple dans l e s amibes, t a n d i s qu'elle est mtdtipliée par 30'(au minimum) dans l e s c e l l u l e s ascitiques.
La pénétration de la ribonucléase dans certaines cellules vivantes 2 9 3
Il est curieux de constater que l a teneur en ARN des organismes traités à l a R N a s e semble varier en fonction de l a pénétration de la RNase;alors qu'il n'y a p a s de modifi- cation visible dans l a moelle o s s e u s e et une augmentation si faible qu'elle demeure dou- teuse chez l e s amibes, on observe une grosse synthèse dans l e s cellules ascltiques.
Remarquons qu'outre sa capacité'de provoquer une synth"fese d'ARN, la RNase semble posséder d e s propriétés complexantes qui lui permettent de s'unir aux ribonucléoprotéides cellulaires. En effet, bien que leur teneur en ARN n'ait p a s diminué, l e s amibes perdent déjà leur basophilie cytoplasmique après 2-4 minutes; la basophilie d e s nucléoles dis- paraît après 4-6 minutes. Ce phénomène est vraisemblablement du à l a formation d'un com- plexe RNase-ARN qui supprime l ' a f f i n i t é de l'ARN pour l e s colorants basiques.
L e c a s de la moelle o s s e u s e nous apprend également que la pénétration d'une quantité importante de RNase dans une cellule ne provoque p a s ne'cessairement des-modifications du métabolisme cellulaire. I.e facteur déterminant pourrait bien être l'importance de la variation de l a teneur en enzyme.
n est intéressant a u s s i de constater que l a pénétration de la ribonucléase est largement indépendante de la température d'incubation. Ce phénomène est difficilement explicable au point de vue physico-chimique: en effet, on s'attendrait à observer une augmentation rapide de la v i t e s s e de pénétration de l'enzyme en augmentant la température.
Il faut donc peut-être faire appel à d e s mécanismes autres que ceux de la diffusion; à l a pinocytose, par exemple, qui est peu influencée par. l a température. Ce phénomène, qui permet aux cellules d'absorber des gouttelettes du milieu extérieur grâce à l a formation de pseudopodes microscopiques dans la membrane cytoplasmique, a été étudié en détail c h e z l'amibe par Chapman-Andresen (17). Cet auteur a montré qu'il existe de nombreux induc- teurs de l a pinocytose et que l a ribonucléase est l'un d'entre eux. Rasty et al. (18) ont
également observé des phénomènes de pinocytose dans l e s cellules du carcinome d'^^hrlich traitées par l a RNase.
Il est donc vraisemblable que dans c e s deux types de cellules,la RNase p u i s s e pénétrer autrement que par diffusion. Une preuve supplémentaire de l a complexité des phénomènes de perméabilité à la RNase est donnée par l e g r ^ h i q u e 9, qui montre que, pour l e s c e l l u l e s d ' a s c i t e s , l a v i t e s s e de pénétration est la même à 0° C et à 25° C p o u r des concentrations de l a RNase extracellulaire inférieures à « mg/ml. A partir de cette valeur, cependant, de nombreux phénomènes apparaissent, qui rendent l e s cellules beaucoiçi plus perméables à 25° C qu'à 0° C.
En résumé, l a ribonucléase pénètre dans certaines cellules vivantes et elle y produit des modifications qui semblent dépendre de l a variation de la teneur en RNase plutôt que de l a quantité absolue qui a pénétré dans l a cellule.
R E F E R E N C E S
1. Ledoux, L., Le Clerc, J . et Vanderhaeghe, P . , "Influence of ribonucléase on t h e div- ision of amphibian e g g s . " . Nature 174 Y1954) 793.
2. Brachet, J. et Ledoux, L., "L'action de l a ribonucléase sur le division d e s o e u f s
d'amphibiens. 2. Etude cytologique et cytsChlmique des effets de la ribonucléase c h e z le pleurodèle." Experim. Cell Res., suppl.3 (1955) 27-39.
3. Brachet, J. "Action of ribonucléase and ribonucleic acid on living amoebae." Nature 175 (1955) 851.
4. Brachet, J. "Purther observations on the action of ribonucléase on living amoebae."
Experim. Cell Res. 10 (1955) 255-256.
5. Brachet, J., " E f f e c t s of ribonucléase on the metabolism of living root-tip c e l l s . Nature 174 (1954) 876.
6. Brachet, J., "The mode of action of ribonucléase on living root-tips."ïBiocAjro.
Biophys. Acta. 19 ( 1 9 5 6 ) 5 8 3 .
2 9 4 La pénétration de la Hbonucléase dans certaines cellules vivantes
7. Pirket, H., Chèvremont-Comhaire, S. et Chèvremont, M., 'Action of ribonuclease on living c e l l s in vitro and synthesis of deoxyribonucleic acid." Nature 176 (1955)
1075-1076.
8. I.edoux, L. et Pileri, A., "Action of ribonuclease on rat bone marrow and mouse a s c i t e s tumour c e l l s " . Biochem. J. (sous presse).
9. Pileri, A., Ledoux, L. et Vanderhaeehe. P . , ' R f f e t de l a ribonuclease sur l e s cellules de la moelle o s s e u s e et sur les cellules d ' a s c i t e s du carcinome de Landschîîtz t r a i t é e s in vitro." Riochim. Hiophys. 4 c e a ( s o u s p r e s s e ) .
10. Ledoux, L. et Baltus, E., 'Action de la ribonuclease sur l e s cellules du carcinome d ' E h r l i c h . " Experientia 10 (1954) 500.
11. Ledoux, L., ' A c t i o n of ribonuclease on neoplastic growth. II. Action on Landschutz a s c i t e s c e l l s in vitro." Iliochim. Biophys. Acta 20 (1956) 369-377.
12. Ledoux, L. et Vanderhaeghe, P., 'Action de la ribonuclease sur la croissance néo- p l a s t i q u e . II. A s p e c t s m é t a b o l i q u e s de l ' e f f e t c a n c é r o s t a t i q u e . " Biochim. Biophys.
Acta 24 (1957) 340-353.
13. Mulliger, P.G.G. et V,rormall, A., ' L a b e l l i n g of proteins with iodine-131, sulphur-35 and phosphorus-32.'' Nature 167 (1951) 748-751.
14. Hirs, C.H.W. et Stein, v/.M., "A chromatographic investigation of pancreatic ribo- n u c l e a s e . - y. Biol. Chem. 200 (1953) 493-506.
15 Lowry, O.K., Rosebrough. N.J.. Parr, L. et Randall, R . J . , ' P r o t e i n measurements with t h e P o l i n p h é n o l r e a g e n t . » / . Biol. Chem. 193 (1951) 265-271.
16. Schneider, W.C., "Phosphorus compounds in animal t i s s u e s . I. Extraction and estima- tion of desoxypentose nucleic acids and pentose nucleic acids.", / . Biol. Ghem. 161 (1945) 293.
17. C h ^ m a n - A n d r e s e n , C. et Prescott, D.M., "Studies on pinocytosis in the amoebae C h a o s and Amoeba p r o t e u s . " C.R. Trav. Labor. Carlsberg., sér. chim. 30 (1956) 57-78.
18. Easty, D.M., Ledoux, L. et Ambrose, E . J . , "Action of ribonuclease on neoplastic growth. III. S t u d i e s by i n t e r f é r e n c e m i c r o s c o p y . Biochim. Biophys. Acta 20 (1956) 528- 537.
ABSTRACT
Treatment has been mode in vitro of amoebae, cells of Ehrlich's carcinoma and bone marrow cells with crystallized ribonuclease (RNaseJ.
Déterminations of the enzyme activity and measurement of the radioactivity in cells subjected to the action of RNase labelled with lodine-I"^ show that this enzyme (Mol.
wt. 13,000) pénétrâtes rapidly into the cells under observation.
In 5 -10 minutes the content of RNase doubles in cells of the bone marrow, in amoebae it increases 3 to 4 times and in the Ehrlich cells il increases 20 to 100 limes. In ail the cases sludied pénétration of RNase is relatively unaffected by température ('f or 23'C);
it dépends directly on the concentration of the enzyme in the extra cellular médium.
Prolonged washing of amoebae treated by RNase - changes the content of enzyme in the cells only slowly (50% of RNase is removed in 3 hours). In amoebae autoradiography likewise shows that a large part of the labelled RNase becomes fixed in the periphery of the cells.
A relation seems to exist bclween the relative variation of RNase content in the cells sludied and metabolic changes caused by the enzyme.
RESUMEN
Mediante la ribonucleasa cristalizada, se han Iratado, in vitro, amebas, células del carcinoma de Ehrlich y células de la médula osea.
La determinacion de la actividad enzimâtica y el câlculo de la radiactividad de las
La pénétration de la ribonuclease dans certaines cellules vivantes 295
cclulas sometides a la accion de la ribonucleasa marcada con ha permitido dcmostrar que la mencionada enzima (peso molecular: 13.000), pénétra con rapidez en las células estudiadas.
A las 5 a 10 minutas la canlidad de ribonucleasa de las celulas de la me'dula ôsea se duplica; ta de las amcbas aumenta 3 a 4 veces, y la de las células del tumor de Ehrlich aumenta 20 a 100 veces. La penetracion de la ribonucleasa se ve efectada relativamente poco por la tempcratura ('f a 25°^ en todos los casos estudiados. Dépende directamente de la concentraciôn de la enzima en el medio exlracelular.
El lavado prolongado de las amebas tratados por la ribonucleasa marcada con /"', modifica solo lentamente la cantidad de enzima de las células (se puede extraer 50% de la ribonucleasa en 3 horas). La autorradiografîa mueslra también en las amebas que gran parte de la ribonucleasa marcada se fija sobre la perifcria de las celulas.
Parecc existir una relacion entre la variaciôn relativa de la cantidad de ribonucleasa contenida en las células estudiadas y las modificaciones metabolicas causadas por la enzima.
DISCUSSION
C L . COMAR (U.S.A.): The technique of autoradiographs as described is most important beeause it enables one to observe individual cells from among many. Have you been able by this technique to observe permeabilities in various types of c e l l s in the a s c i t e s tumour?
REPONSE: L e s suspension de cellules d'ascite sont a s s e z hétérogènes. Parmi c e s cellules, les unes sont grandes, a s s e z inertes du point de vue métabolique, tandis que u'autres sont très petites, se divisent rapidement et forment la partie active du cancer. Sur l e s frottis et l e s préparations histologiques, on voit que, pendant les premiers i n s t a n t s de l'incubation, ce sont l e s p e t i t e s c e l l u l e s qui absorbent le plus de RNase. C'est seulement après un temps très long que l e s grandes cellules absorbent l'enzyme. C'est peut-être la ribonuclease, injectée à un animal porteur d'une tumeur solide, provoque un arrêt immédiat de la croissance de cette dernière mais qu'après un délai variable suivant sa nature (six semaines dans le c a s tumeurs spontanées) elle se développe a nouveau. Il s'agit peut-être d'une sélection opérée par la RNase dans les t i s s u s nébplastiques.
A. KASSENAAR (Pays-Bas): Could you comment on the mechanism of the process where such a large molécule a s RNase p a s s e s easily through the cell membrane, of carcinoma c e l l s for example? You say that this process bas an extremely low Qio, therefore one might think the process to be one of diffusion. On the other hand you describe this transport of RNase a s strongly decreased by 2.4 dinitrophenol or KCN, which makes an enzymatically controlled p r o c e s s more likely.
REPONSE: Je pense que la RNase ne pénètre pas dans les cellules par un mécanisme de diffusion simple mais par un phénomène qui requiert une participation de la membrane cellulaire. Il s'agirait plutôt d'une pinocytose. Lorsqu'on traite les cellules par le dinitro- phénol, le cyanure, ou qu'on l e s soumet a un choc énergique, choc thermique par exemple, l'intégrité de leurs mouvements n'est plus préservée, la membrane n'a plus les mêmes possi- bilités.
J.A.V. BUTLER (U.K.):
1. Il would be of interest if you would tell us how the radioactive BNase was prepared?
2. Wçre you salisfied that the RNase did not contain other enzymes?
2 9 6 i,a pénétration de la ribonucléase dans certaines cellules vivantes REPONSE :
1. Nous mettons en contact pendant 15 minutes à pH alcalin la RNase et un mélange d'iode et d'iodure de potassium contenant de l'iodure marqué'. L'iode se fixe sur la tyrosine.
Puis nous faisons une dialyse très poussée. Nous avons vérifié par différentes méthodes, l'électrophorèse par exemple, qu'il n'y a plus d'iode libre ou bien que s'il y en a, il existe a l'état de trace infime. C'est donc bien la protéine iodée qui est responsable des résultats obtenus.
2. Nous utilisons une RNase du commerce qui est déjà relativement pure mais que nous purifions encore par chromatographie sur amberlite. Nous utilisons toujours la même fraction qui est, je crois, la plus pure que l'on puisse obtenir.
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AJiHTejibHoe npoMUBaHHe a M e ô , oÔpaÔOTaHHUX P H- a s o H J l ^ ^ , JiHmb MOAJieHHO H3MeHAeT c o A e p x a H H e jjepMCHTa B x j i e T x a x ( f O ^ P H- a s u 9 K C - T p a r H p y e T C H B TeqeHHA T p e x ^ a c o s ) . ABTopaAHorpattHH aMe6 Teixxe n o K a a u B a e r , «ITO 3Ha<iHTejibHaH HacTi> Me^ieHott P H- a s u cBflsuBaeTCH n e - PRi]>epHeii KJieTOK.
C y m e o T B y e T , noBHAHMOMy, n a B e o T H o e OTHomeHHe MexAy OTHOORTejifc- HUM HaMeHeHHBM COAepxaHHfl P H - a 3 u B H3y<ieHHUx x j i e T x a x H H3MeHeHH- flMR o â M e n a , BusuBaeMUMH ^epuemou ( E p a m e , 1 9 5 5 , 1 9 5 6 a , B; J l e A y , 1 9 5 6 ; JleAy R IlHJiepR, 1 9 5 7 ) .
