Etude de l’effet antimicrobien des biomolécules

(1)

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université Akli Mohand Oulhadj (Bouira)

Faculté des Sciences et des Sciences Appliquées

Département de Génie des Procédés

MEMOIRE

Présenté pour l’obtention du Diplôme de Master par

GHELLAL Naoual

TEMZI Souad

Spécialité : Génie des procédés pharmaceutiques

THEME

Soutenu le 08/10/20183

Devant le jury composé de :

Mme. S. ZIANI MCB UAMO Bouira Présidente Mme. L. MANSOURI MCB UAMO Bouira Examinatrice Mme. R. GHERNOUS MCB UAMO Bouira Examinatrice Mme. L. ARBIA MCB UAMO Bouira Promotrice

Etude de l’effet antimicrobien des biomolécules

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Remerciements

Alhamdo li Allah, qui nous a éclairé les voies de la science et de la connaissance et qui nous a aidés à compléter cette recherche modeste. Premièrement, nous remercierons Madame ARBIA LEILA pour avoir acceptéde nous encadrer et de nous diriger, pour son soutien, ses

encouragements ainsi que pour la confiance qu’il nous a accordée en réalisant ce travail, nous la remercions profondément pour son compréhension, sa patience et sa politesse incomparables.

Comme nous ne pouvons pas oublier de remercier les membres de jury pour avoir accepté d’évaluer ce travail

Nos remerciements vont également à toutes les personnes qui ont

contribué de près ou de loin à la réalisation de ce travail,notamment à : Tous les ingénieurs qui travaillent dans le laboratoire de génie des

procédés au département des sciences et technologies Aussi au directeur SAYAH, chef de laboratoire Privé d’analyse médicale

A Madame CHAABANE NOURA, biologiste dans le laboratoire de SAYAH

A Madame Dr N.BENAMROUCHE chef de laboratoire des Entérobactéries de l’institut Pasteur d’Alger à Dely Brahim

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Dédicaces

Grâce à DIEU qui m'a donné le pouvoir et le courage à accomplir notre

travail.

Avec un énorme plaisir, je dédie ce modeste travail à mes très chers

parents, source de tendresse, de noblesse et d’amour, qui ont toujours été

là pour moi, et qui m’ont donné un magnifique modele de labeur et de

persévérance. J’espère qu’ils trouveront dans ce travailToute ma

reconnaissance et tout mon amour.

A mes chères sœurs MARIEM et LINDA, IMEN pour leur soutien

moral, et leurs sacrifices le long de ma formation et aussi mon très cher

frère RIDA et mon fiancéHAMZA.Je vous souhaite beaucoup de

réussite et de bonheur.

Je dédie particulièrement à tous mes oncles et tantes, cousines et

cousins et toute la famille GHELLAL.

Enfin je le dédie à tous mes amis que je n’ai pas cités, et

à tous ceux qui me connaissent.

A tous ceux que j’aime

(4)

Afin d’être reconnaissante envers ceux qui m’ont appuyé et encouragé à

effectuer ce travail de recherche, je dédie ce mémoire,

A ma chère mère LILOUNA, pour ses précieux conseils, ses

encouragements et son aide inestimable.

A mon cher père YOUCEF, qui a été le premier à m’encourager pour aller

aussi loin dans mes études.

J’aimerai bien que vous trouverez dans ce travail l'expression de mes

sentiments de reconnaissance les plus sincères, car c’est grâce à votre aide,

votre compréhension et votre patience que ce travail a pu voir le jour.

A mes sœurs, mes frères……

À tous l mes amis, sans aucune exception.

Et enfin, à tous ceux que ma réussite leur tient à cœur.

(5)

Sommaire

Liste des abréviations Liste des tableaux Liste des figures

Introduction………..……….1

Chapitre N° I :Rappels bibliographiques I : Généralités………..………3

I-1 : Définition des plantes médicinales………...………...3

I-2 : Définition des principes actifs………...………...3

I-3 : Etude botanique de la plante sapindus………..3

I-3-1 : La définition de sapindus………...3

I-3-2 : Description botanique……….4

I-3-3 : Classification taxonomique……….5

I-3-4 : Espèces………...6

I-3-5 : Les caractéristiques physiques………8

I-3-6 : Les utilisations de sapindus (noix de lavage)……….…...9

I-4 : Généralités sur les saponosides (saponines)………...9

I-4-1 : Définition………9

I-4-2 : Structure des saponines………...9

I-4-2-1 : Structure des génines………...10

I-5 : Les activités biologiques de la plante Sapindus mukoross………...11

Chapitre N° II :Bactéries et biomolécules II : Généralité………..13

II-1 : Les bactéries………..13

II-2 : Les levures……….13

II-3 : Les antibiotiques………14

II-4 : Les souches microbiennes utilisées………....14

II-4-1 : Escherichia coli………..14

II-4-2 : Pseudomonas aeruginosa………...16

II-4-3 :Staphylococcus aureus………17

II-4-4: Candida albicans……….18

II-5 : Généralités sur les biomolécules………....18

II-6 : Définition de la phytochimie……….….19

II-7 : Le rôle de la phytochimie………...…19

II-8 : Screening phytochimique………...…20

II-8-1 : Alcaloïdes………...20

II-8-2 : Composés polyphénoliques……….20

II-8-3 : Dérivées anthracéniques……….22

II-8-4 : Les glucosides……… ..……….22

II-8-5 :Saponosides………....23

II-8-6 : Mucilages………23

(6)

Sommaire

Chapitre N° III : Matériels et Méthodes 1ére partie : Etude de l’activité antimicrobienne

III-1 : Matériel……….25

III-1-1 : Matériel biologique………25

III-1-2 : Les milieux de culture utilisée………...25

III-1-3 : Les antibiotiques………26

III-1-4 : Réactif chimique et autre matériel……….26

III-2 : Méthode………27

III-2-1 : Préparation des extraits………..27

III-2-2 : La coloration de Gram………28

III-2-3 : Préparation des milieux de culture……….29

III-2-4 : Conservation des souches………...29

III-2-5 : Repiquage (isolement) des souches bactériennes………...29

III-2-6 : Antibiogramme………...29

III-3 : Tests d’activités antimicrobiennes de l’extrait sapindus ………..30

III-3-1 : Test antibactériens………..30

III-3-2 : Test antifongique sur la levure ……….……….32

III-4 : La lecture………...32

2éme Partie : Etude phytochimique III-5 : Matériel……….34

III-5-1 : Matériel végétale………...34

III-5-2 : Produits chimiques et autre matériel……….34

III-6 : Méthode………...34

III-6-1 : Analyses phytochimiques……….34

III-6-1-1 : Recherche des alcaloïdes……….…..34

III-6-1-2 : Recherche des composés polyphénoliques………35

III-6-1-3 : Recherche des flavonoïdes………35

III-6-1-4 : Recherche des dérivés anthracéniques………...36

III-6-1-5 : Détermination des glucosides……….36

III-6-1-6 : Détermination des saponines………....36

III-6-1-7 : Détermination des éléments réducteurs………..37

III-6-1-8 : Détermination des mucilages………..37

III-6-1-9 : Coumarines……….37

3émepartie : formulation de savonnette antifongique III-7 : Matériels et produits……….37

III-7-1 : Protocole de l’expérience………...38

1er étape : Préparation des extraits………...38

2éme étape : Préparation de la savonnette……….38

Chapitre N° IV : Résultats et discussion 1ére partie : Etude de l’activité antimicrobienne………...39

IV-1 : Réalisation de l’antibiogramme………...40

2éme partie : Etude phytochimique………....46

(7)

Sommaire

Liste des références………...52 Annexe

(8)

Liste des abréviations

BN : Bouillon nutritif M-H : Muller Hinton GN : Gélose nutritif ATB : Antibiotique

ORL : Oto- Rhino- Laryngologie IPA : Institut Pasteur d’Alger UFC : Unité formant colonie

ATCC : American type culture collection UV : Ultra-violet

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Liste des tableaux

Tableau 01 :Classification botanique de Sapindus………...6

Tableau 02 : Les différentes espèces de l’arbre Sapindus…………...……….6

Tableau 03 : La liste des antibiotiques testés………...26

Tableau 04 : Observations microscopique des différentes souches étudiées………..39

Tableau 05 : Diamètres (Φ) des zones d’inhibitions des bactéries, après 24h d’incubation à 37°C……….40

Tableau 06 : Diamètres (Φ) des zones d’inhibitions de levure Candida albicans, après 48h d’incubation à 30°C……….43

Tableau _{07 :} _Résultats _du _screening _{phytochimiquedu} _fruit _de _la _plante S.mukorossi………47

(10)

Liste des figures

Figure 01 : Les fruits et les graines de Sapindus mukorossi………..4

Figure 02 : Arbre de Sapindus mukorossi………..5

Figure 03 : Structures des 11 principales classes de saponines et leurs derives………..11

Figure 04 : Photo de la cellule bactérienne………..13

Figure 05 :Cellule de levure se divise par bourgeonnement……….14

Figure 06 : Représente la coquille et la poudre de Sapindus mukorossi………27

Figure 07 : L’extrait de Sapindus mukorossi……….27

Figure 08 : La coloration de Gram……….28

Figure 09: L’isolement des souches microbiennes……….29

Figure 10 : Protocole de l’activité antimicrobienne……….30

Figure 11 : Les étapes du de l’activité antibactérienne de l’extrait aqueux de Sapindusmukorossi……… …….31

Figure 12 : Les étapes de test l’activité antifongique de l’extrait de Sapindus mukorossisur les levures………...33

Figure 13 : Les étapes de la préparation d’une savonnette antifongique……….38

Figure 14 : Photo de l’observation microscopique des différentes souches utilisées……….39

Figure 15 : Influence de l’extrait Sapindus mukorossi sur la croissance de Staphylococcus aureus………41

Figure 16 : Influence de l’extrait Sapindus mukorossi sur la croissance d’Escherichia coli.41 Figure 17: Influence de l’extrait Sapindus mukorossi sur la croissance de Pseudomonas aeruginosa………42

Figure 18 : Les zones d’inhibition d’extrait aqueux sur les souches étudiées………42

Figure 19 : Les zones d’inhibition d’extrait d’éthanol sur les souches étudiées………43

Figure 20 : Influence de l’extrait Sapindus mukorossi sur la croissance de Candida albicans……….44

Figure 21 : Les zones d’inhibition d’extrait aqueux sur la levure Candida albicans…………44

Figure 22 : Résultats de l’antibiogramme ATB……….45

(11)

(12)

Introduction

1

Les plantes médicinales et leurs extraits ont été utilisés en médecine traditionnelle pendant des siècles pour traiter les maladies humaines. Elles constituent une source naturelle de molécules chimiques appelées « métabolites secondaires » [1].L’histoire des peuples montre que ces plantes ont toujours occupé une place importante en médecine, dans la composition des parfums et dans les préparations culinaires.La valorisation de ces ressources naturelles végétales passe essentiellement par l’extraction de leurs huiles essentielles (HE). Ces dernières sont des produits à fort valeur ajoutée, utilisées dans les industries pharmaceutiques, cosmétiques et agroalimentaires [1, 2].

Aujourd’hui, plusieurs populations se retournant à la médecine traditionnelle en utilisant les plantes pour se soigner soit par inaccessibilité aux médicaments prescrits pas la médecine moderne, soit parce que ces plantes ont donné des résultats thérapeutique très encourageants et à moindres effets secondaires remarqués lors de leur utilisation[3].

De nombreux médicaments renferment des principes actifs extraits des plantes. En effet environ 40% des médicaments en contiennent par exemple en chine, les préparations traditionnelles à base de plante [4].

Les études de l’activité antimicrobienne des extraits des plantes ont montré que ces dernières représentant une source potentielle de nouveaux agents anti-infection[4]. Pour cela, il est jugé utile de contribuer à l’étude de l’activité antimicrobienne de l’extrait de Sapindus mukorossi. Notre travaille, exposé dans ce mémoire, et partagé en quatre (4) chapitres :

Le premier chapitre : est consacré à l’étude bibliographique sur la planteSapindus

mukorossi

Le deuxième chapitre : se répartit en trois parties

• Le 1ere partie : l’étude de l’activité antimicrobienne • La 2eme partie : l’étude phytochimique

• La 3eme partie : préparation de savon

Le troisième chapitre : illustre le matériel et les méthodes utilisés dans les différentes manipulations employées au niveau de laboratoire.

Le quatrième chapitre est consacré aux résultats obtenus accompagnés d’une discussion et ponctués d’une conclusion.

(13)

(14)

Chapitre I Rappels bibliographiques

3 I: GENERALITES

I-1 : Définition des plantes médicinales

Définie par la pharmacopée par une plante dont au moins une partie possède des propriétés médicamenteuses, également appelée « drogue végétale » [5]

Les plantes ont été employées pendant des siècles comme remèdes pour les maladies humaines parce qu’elles contiennent des composants de valeur thérapeutiques. Le pouvoir de guérison des plantes provient des effets de leurs métabolites secondaires. Ces métabolites interviennent dans la défense contre les parasites pathogènes. On distingue plusieurs groupes de métabolites notamment les phénols, les alcaloïdes, les terpénoïdes et polypeptides [6].Deplus, les effets secondaires causés par les plantes sont minimes voire absents, au contraire des médicaments semi-synthétiques ou synthétiques [6,7].

I-2:Définition des principes actifs :

Le principe actif c’est une molécule contenu dans une drogue végétale ou dans une préparation à base drogue végétale et utilisé pour la fabrication des médicaments [7], cette molécule présentant un intérêt thérapeutique curatif ou préventif pour l’homme ou l’animale, elle est issue de plantes fraiches ou des sèches, nous pouvons citer comme des parties utilisées : les racines, écorces, sommités, fleuries, feuilles, fleurs, fruits, ou encore les graines.

Les plantes contiennent des métabolites secondaires peuvent être considérées comme des substances indirectement essentiels à la vie des plantes par contre aux métabolites primaires qu’ils sont les principales dans le développement et la croissance de la plante, les métabolites secondaires participent à l’adaptation de la plante avec l’environnement, ainsi à la tolérance contre les chocs (lumière UV, les insectes nocifs, variation de la température…..) [8].

I-3 : Etude botanique de la plante Sapindus I-3-1 : La définition de Sapindus

Sapindus est un arbre de la famille des sapindacées qui porte le nom scientifiques

Sapindusmukorossi. On le trouve dans toutes les régions tempérées chaudes et tropicales de la

planète, en particulier en Asie[9]. Le nom générique et dérivé des mots latin sapo signifiant « savon » et indus signifiant « de l’inde ». Ces fruits sont communément connus sons le nom reetha en Népal ou la noix de lavage [10].

(15)

Figure 01 :L I-3-2 :Description botanique

C'est un petit arbre au tronc court, dépassant rarement une douzaine de hauteur, et dont le feuillage alterne

dotées de 14 à 30 folioles, et dont la foliole terminale est souvent absente.Ses apparaissent à la fin du printemps, forment de larges

de diamètre composées de petites fleurs de couleur crème.Ses

réunis en grappes de drupes translucides de 1 à 2 cm de diamètre et dotés d'une fine peau, de couleur jaune-orangé au début, puis jaune

contenant de 1 à 3 graines[11].

Figure

Les fruits et les graines deSapindus mukorossi

:Description botanique

C'est un petit arbre au tronc court, dépassant rarement une douzaine de alterne et de forme arrondie est constitué de tiges , et dont la foliole terminale est souvent absente.Ses

apparaissent à la fin du printemps, forment de larges panicules d'une quinzaine de centimètres composées de petites fleurs de couleur crème.Ses fruits, mûrs en automne, sont translucides de 1 à 2 cm de diamètre et dotés d'une fine peau, de orangé au début, puis jaune-marronné de plus en plus foncée en mûrissant, et

].

Figure 02 :Arbre deSapindus mukorossi

Sapindus mukorossi

C'est un petit arbre au tronc court, dépassant rarement une douzaine de mètres de tiges de 15 à 40 cm , et dont la foliole terminale est souvent absente.Ses fleurs, qui d'une quinzaine de centimètres , mûrs en automne, sont translucides de 1 à 2 cm de diamètre et dotés d'une fine peau, de foncée en mûrissant, et

(16)

5 I-3-3 : Classification taxonomique [12]

Nom scientifique

:

Sapindus mukorossi

Nom communs : Sapindus,savonnier,arbre au savon, bois de panama, bois mousseux,fausse saponaire, noix de lavage, savonnette.

Nom communs (en hindi) : ritha, reetha, aritha, dodan, doadni, kanma,et thali Nom anglais : wingleaf soapberry, soapberry ouest, jaboncillo

Nom arabe : sajrette essaboun

La classification taxonomique de la plante et donnée par le tableau01.

Tableau 01 : classification taxonomique de Sapindus

Règne Plantae

Sous- régne Tracheobionta

Division Magnoliopsida

Classe Magnoliopsida

Sous – classe Rosidae

Ordre Sapindales

Famille Sapindaceae

Genre Sapindus, L, 1753

Espèces Sapindus mukorossi geartn

I-3-4 : Espèces

Tableau02 représente les différentes espèces de la plante.Le nombre d’espèces de Sapindus est sujet à controverse, particulièrement en Amérique deNord ou seulement 3 espèces sont reconnues [13].

I-3-5 : Les caractéristiques physiques

Type de terre: Sapindus mukorossi a besoin d'une terre à pH acide ou terre de bruyère. Mélange 90% de terre de bruyère pour 10% de perlite au fond du pot.

L’humidité : Sapindus mukorossi doit pousser dans un environnement si possible humide et pas trop froid. Dans les régions à hiver doux, il peut être planté en pleine terre.

(17)

Tableau 02 : Les différentes espèces de l’arbre Sapindus

Les espèces Pays Feuille Fruit Arbre

Sapindus delavoly Chine Sapindus drummondii Mexique Etat –unis Sapindus Marginatus Floride a la coroline de sud Sapindus Emarginatus Asie du sud Sapindus Mukorossi Du sud de la chine a himalaya

(18)

Chapitre I Rappels bibliographiques 7 Sapindus Rarak Au sud est du l’Asie Sapindaus saponari L’archipel de florid key Antilles Amérique Sapindus Trifoliotus Ou sud l’inde Pakistane Sapindus Oahuensis Hawaii

La lumière : La plante de noix de lavages ‘acclimate a toutes sorte de lumière, elle aime aussi bien la lumière indirecte du soleil que les rayons directs. En ce qui concerne les lumières artificielles pour une culture intérieure, préférer des néons ou MH.

La température : Sapindus mukorossi pousse très bien lorsque la température varie de 10 à 30°c, en dessous, la plante pousse beaucoup moins vite, et au-dessus, la plante peut pousser très vite mais il lui faut en compensation beaucoup d’humidité. Durant les trois premières années, cultiver Sapindus en pot avant de le transplanter à l'extérieur.

(19)

Le semi : Les graines de noix de lavage (Sapindus mukorossi) vendues sont d'excellente qualité quand l'enracinement est proche de 70%.

La méthode infaillible : Semer vos graines sous 1cm de tourbe très humide, la partie avec le point vers le bas (départ de la racine). Ensuite, placervotre pot sous mini-serre, et à température très élevée (40/50°C) au soleil par exemple. Laisser germer durant environs 20 à 40 jours. Plus la température de la mini-serre sera chaude, plus les graines germeront vite [14].

I-3-6 : Les utilisations de Sapindus (noix de lavage)[15]

L’utilisation des noix de lavage est particulièrement recommandée aux • Nettoyage des bijoux

• Shampoing

• Toilette des animaux de compagnie • Nettoyant universel ménager

• Détergent

• Savon liquide pour les mains • Produit phytosanitaire

I-4 : Généralités sur les saponosides (saponines) I-4-1 : Définition

Les saponines sont des métabolites secondaires non volatils, et tensioactifs, produits principalement par les végétaux supérieurs. Le terme saponine dérive du latin sapo qui signifie « savon », à cause de la capacité de la plupart des saponines à former une mousse stable en milieu aqueux [16,17].Cette propriété vient du caractère amphiphile de ce type de molécules, constituées d’une génine terpénoïdique hydrophobe liée à un ou plusieurs oses hydrophiles, plusieurs plantes comme la saponaire (Saponaria officinalis), la noix de lavage (Sapindus mukorossi, Sapindus saponaria), ou le bois de Panama (Quillaja saponaria), historiquement utilisées comme savon/détergent, doivent en fait leur propriété moussante à la présence de saponines [18].

Les saponines, présentes dans un grand nombre de plantes utilisées en médecine traditionnelle, sont de plus en plus étudiées, aussi bien au niveau de leur structure particulière

(20)

9

qu’au niveau des nombreuses propriétés biologiques et pharmacologiques que ce type de structure leur confère[18].

I-4-2 : Structure des saponines

Les saponines sont constituées d’une génine terpénoïdique liée par une ou plusieurs liaisons O-glycosidiques à un ou plusieurs oses. Les différents types de génines seront tout d’abord décrits puis la structure de la partie osidique sera abordée.

I-4-2-1 : Structure des génines

Les saponines peuvent être classées en deux groupes : les saponines triterpéniques et les saponines stéroidiques. Cette différentiation est basée sur la structure et la biosynthèse de leurs génines[19].

I-4-2-1-1 : Les saponines à génines triterpéniques

Les saponines à génines triterpéniques sont les plus courantes. Elles possèdent un squelette à 30 carbones et peuvent être classées en 10 sous- groupes selon la structure du Tritérpénes : les dammaranes, tricullanes, cucurbitanes et lanostanes sont tétracycliques, tandis que les lupanes,hopanes, oléananes, taraxastéranes, ursanes et cycloartanes sont pentacycliques (Figure 03).Structure de type oléanane est de loin la plus rencontrée[19,20].

I-4-2-1-2 : Les saponines à géninesstéroïdique

Les saponines à génine stéroïdiquede sont moins courantes. Ellespossèdent un squelette à 27 carbones (figure 03) qui comporte habituellement six cycles, appelés spirostane. Quand l’hydroxy en C-26 est engagé dans une liaison avec un ose, la structure reste alors pentacyclique et est appelés furostane. Ce type de structure ne peut exister qu’à l’état hétérosidique (son hydrolyse conduit spontanément à un dérivé spirostanique)[20]. Il existe également des saponines qui possèdent un squelette tétracyclique cholestane[21].

Chaque squelette, triterpénique ou stéroïdique, étant décliné en une série de dérivés, la structure de la génines est un facteur important dans la variabilité des saponines existantes.

(21)

Figure 03 : _{Structures des 11 principales} I-5 : Les activités biologiques de la plante

Les applications médic

nombreuses études biologiques. Plusieurs extraits d’espèces de sapindus et de composés isolés ont été évalués pour leurs propriétés antimicrobienne, ins

anticancéreuse, hépatoprotectrice, a

inflammatoire, antiagrégation plaquettaire, anti système nerveux central,

anti-trichomonas, molluscicide et piscicide Lupanes

Oléananes

Taraxastéranes

tructures des 11 principales classes de saponines et leurs de

Les activités biologiques de la plante Sapindus mukorossi[22]

Les applications médicinales traditionnelles de sapindusspecies

nombreuses études biologiques. Plusieurs extraits d’espèces de sapindus et de composés isolés ont été évalués pour leurs propriétés antimicrobienne, insecticide, spermicide, anticancéreuse, hépatoprotectrice, anxiolytique, tyrosinase, et antiradicalaire libre, anti inflammatoire, antiagrégation plaquettaire, anti-hyperlipidémique, anti-migraine, activité du

-diabétique, anti-ulcérogène, analgésique, anti trichomonas, molluscicide et piscicide.

Darmmarne Tricullaness Cucurbit Hopanes Cycloartanes Lanostanes es Ursanes Cholestanes Spirostaniques Stéroides

classes de saponines et leurs derives

species ont inspiré de nombreuses études biologiques. Plusieurs extraits d’espèces de sapindus et de composés cticide, spermicide, tiradicalaire libre,

anti-migraine, activité du ulcérogène, analgésique, asthmatique,

anti-Cucurbitane

Lanostanes

(22)

(23)

Chapitre II

II : Généralités II-1 : Les bactéries

Les bactéries ce sont des micro

quelques dizaines de microns, ce sont des organismes procaryotes qui ne noyau mais un ADN chromosomique circulaire situé dans le cytoplasme capables de se développer dans un environnement adapté

les synthèses cellulaires nécessai

Figure

II.2 : Les levures

Une levure est un champignon unicellulaire possèdent un seul noyau et se reproduisant soit de façon asexuée par bourgeonnement et division transversale, soit de façon sexuée avec formation de spores. Généralement, les cellules de levure sont plus grandes

[25],notamment par la présence de noyau et d’organites divers.Elles se trouvent

paires, en chaînes ou en petits amas; leur taille est trèsvariable suivant les espèces: 2,5 10,5µm de largeur contre 4,5

fréquemment des conditions de culture et l’âge des cellules

Bactéries et biomolécules

Les bactéries ce sont des micro-organismes unicellulaire, d’une taille de l’ordre de un à quelques dizaines de microns, ce sont des organismes procaryotes qui ne

noyau mais un ADN chromosomique circulaire situé dans le cytoplasme de se développer dans un environnement adapté : elles effectuent

cellulaires nécessaires à leur croissance et à leurmultiplication

Figure 04 :Photo de la cellule bactérienne

Une levure est un champignon unicellulaire possèdent un seul noyau et se reproduisant soit de façon asexuée par bourgeonnement et division transversale, soit de façon sexuée avec formation de spores. Généralement, les cellules de levure sont plus grandes

notamment par la présence de noyau et d’organites divers.Elles se trouvent

paires, en chaînes ou en petits amas; leur taille est trèsvariable suivant les espèces: 2,5 m de largeur contre 4,5-21µm de longueur. Cesdimensions et aspects dépendent fréquemment des conditions de culture et l’âge des cellules [26].

biomolécules

organismes unicellulaire, d’une taille de l’ordre de un à quelques dizaines de microns, ce sont des organismes procaryotes qui ne possèdent pas de noyau mais un ADN chromosomique circulaire situé dans le cytoplasme.Les bactéries sont : elles effectuent pour leur compte

multiplication[23, 24].

Une levure est un champignon unicellulaire possèdent un seul noyau et se reproduisant soit de façon asexuée par bourgeonnement et division transversale, soit de façon sexuée avec formation de spores. Généralement, les cellules de levure sont plus grandes que les bactéries notamment par la présence de noyau et d’organites divers.Elles se trouvent isolées, en paires, en chaînes ou en petits amas; leur taille est trèsvariable suivant les espèces:

(24)

Chapitre II Bactéries et biomolécules

14

Figure 05: Cellule de levure se divise par bourgeonnement

II.3 :Les antibiotiques

On appelle « antibiotique » toute substance naturelle d’origine biologique élaborée par un organisme vivant, substance chimique produite par synthèse ou substance semi synthétique obtenue par modification chimique d’une molécule de base naturelle ayant les propriétés suivantes :

Activité antibactérienne Activité en milieu organique

Une bonne absorption et bonne diffusion dans l’organisme [27].

Les antibiotiques ont montré des inconvénients et des limites d’utilisation : effets secondaires, toxicité des molécules antimicrobiennes pour l’organisme traité et difficultés rencontrées dans le traitement des maladies exigeant la destruction des germes pathogènes indépendamment des facultés de défense du malade [28].

II-4 :Les souches microbiennes utilisées II-4-1 :Escherichia coli

• Classification Domaine: Eubacteria. Phylum: proteobacteria. Classe: Gammaproteobacteria. Ordre: Enterobacterieles. Famille: Enterobacteriaceae. Genre: Escherichia.

(25)

Chapitre II Bactéries et biomolécules

• Caractères morphologiques

Escherichia coli ou colibacille est une entérobactérie mesurant 2 à 4 µ de long sur 0,4 à 0,6 µ

de large. C’est une bactérie fine et allongée à extrémités arrondies, mobile grâce à une ciliature péritriche [29].

• Caractères culturaux

Escherichia coli pousse facilement sur les milieux ordinaires en 24h à 37°C en aérobiose et en

anaérobiose. Ces exigences nutritionnelles sont en général réduites et la bactérie se multiplie en milieu synthétique avec source de carbone simple comme le glucose. Sur milieu gélosé les colonies sont lisses, brillantes, de structure homogène [30].

• Caractères biochimiques

E.coli possède une catalase mais est dépourvu d’oxydase.L’étude de l’activité enzymatique et

de la fermentation des sucres est réalisée à l’aide de micro-méthodes validées disponibles dans le commerce sous forme de galeries[30].

• Pouvoir pathogène

Infection urinaire:En fait l’origine de l’infection est intestinale (infection par voie ascendante) favorisée chez la femme par l’anatomie du bas appareil urinaire (urètre court) par la présence, qui favorisent les rapports sexuels, d’Escherichia coli dans l’urètre féminin et le vagin [23], chez l'hommel'infection est généralement secondaire à un obstacle sur les voies urinaires[31].

Infection intestinale: responsable de gastro-entérites.

Infection néonatale: peut se traduire par une méningite ou une septicémie.

Infection diverses: Escherichia coli est impliqué dans de nombreuses infections à point dedépart digestif ou urinaire: suppurations localisées ou septicémies, il peut s'agir d'infectionscommunautaires ou nosocomiales[32].

• Sensibilité aux antibiotiques

La bactérie était initialement sensible à beaucoup d'antibiotiques, mais l'acquisitionde résistances est fréquente, surtout en milieu hospitalier [32].

(26)

Chapitre II Bactéries et biomolécules

16 II-4-2 :Pseudomonas aeruginosa

• Classification Domaine: Bacteria Phylum: Proteobacteria. Classe: Gammaproteobacteria. Ordre: pseudomonadales. Famille: pseudomonadaceae. Genre: Pseudomonas.

Espèce: Pseudomonas aeruginosa,[33].

• Habitat

Ce sont des bacilles à Gram négatif non fermentaires, ubiquitaires et saprophytes très répandues dans l’environnement, en particulier dans le milieu hydrique[31].

• Caractères morphologiques

Bacilles fins et longs de 1-3 um de long sur 0.5-1 um de large. Pseudomonas aeruginosa est anciennement appelé pyocyanique du fait de sa capacité à donner un pigment de couleur bleu-vert. Il est mobile polaire avec ciliature de type monotriche[31].

• Caractères culturaux

Le genre Pseudomonas est facile à cultiver sur de nombreux milieux de culture en aérobiose à 37°C ou 30°C. Les colonies larges isolées, grandes, au centre bombées et à bord irrégulier (œuf sur le plat), dégagent une odeur aromatique[31].

La bactérie peut provoquer des infections parfois sèvres chez les sujets dont lesdéfenses sont amoindries. Elle peut provoquer des infections urinaires, bronchiques. Responsable d’infections cutanées, (impétigo, furoncles…), d’infection de la sphère ORL (sinusites, otites…) et d'infection divers [33].

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie généralement multirésistante, lesantibiotiques

pouvant avoir une bonne activité sont: la ticarcilline, la pipéracilline,l'azolocilline, la ceftazidime, la cefusulodime, le cefépime, l'imipenème et les aminosides.Les souches résistantes à la colistine sont très rares. La ciprofloxacine est la plusactive des

(27)

Chapitre II Bactéries et biomolécules

quinolones.L'activité de tous ces antibiotiques n'est pas régulière et doittoujours être précisée par antibiogramme[34].

II-4-3 :Staphylococcus aureus

• Classification Domaine: Bacteria. Phylum: Firmicutes. Classe: Bacilli. Ordre: Bacillales. Famille: Staphylococcaceas. Genre: Staphylococcus.

Espèce: Staphylococcus aureus[33].

• Habitat

C’est un germe ubiquitaire, retrouvé dans le sol, l'air. C'est un commensal de lapeau et des muqueuses de l'homme.On le trouve à l'état normal dans l'oropharynx, les fosses nasales, dans les selles, auniveau du périnée ou des aisselles[33].

Les manifestations pathologiques dues à Staphylococcus aureus sont trèsnombreuses, elles sont suppurations, nécrotiques ou entériques :

Les suppurations localisées,

Les septicémies et les endocardites, Les manifestations digestives, Le syndrome de choc toxique[34]. • Sensibilité aux antibiotiques

Les souches communautaires sont généralement résistantes aux pénicillines G et A,mais sensibles aux pénicillines M. Elles sont souvent sensibles aux macrolides, auxsynergistines, aux fluoroquinolones. Les Staphylococcus aureusdéveloppe rapidement des résistances aux antibiotiques et les souches hospitalières ne sontsouvent sensibles qu'aux glycopeptides[34].

(28)

Chapitre II Bactéries et biomolécules

18

C’est un organisme vivant à l'état normal dans la bouche, le vagin et le tube digestifde l'être humain [34].

• Caractères principaux

Candida albicans est l'espèce de levure la plus importante et la plus connue. Aulaboratoire

médical, la culture en boite de pétri donne des colonies qui sont grandes,rondes, de couleur blanche ou crème, elles poussent bien sur milieu de sabouraud ou surgélose au sang[34].

• Pouvoir pathogène Candidose

Les candidoses sont très graves voir mortelles si elles deviennent systématiques et s’attaquent aux systèmes respiratoire, circulaire et nerveux [24].

Le taux de mortalité des candidémies s’est élevé de 57% à 72% chez l’adulte et de 20% chez l’enfant [24].

Mycoses systémiques

La plupart de ces infections résultent de spores, bien que Candida albicansprovienne plutôt du tube digestif ou de dispositifs intra vasculaire[34].

Candida pathogène sont devenues résistantes à tous les antifongiques actuellementutilisés[34].

II-5 :Généralités sur les biomolécules

Une biomolécule est une molécule qui participe auprocessus métabolique et à l'entretien d’unorganisme vivant végétal ou animal, par exemple lesglucides, les lipides, les protéines, l'eau et les acidesnucléiques [35]. On parle aussi de biomoléculespour des molécules dites

métabolites secondaires,elles sont trouvées dans les différentes parties d’unêtre vivant, par

exemple chez les plantes on lesretrouve dans ses différentes parties (racine, feuille,tige…), mais obtenues par des techniques debiotechnologie (Extraction par solvant,chromatographies sur colonne[35].Elles peuvent être macromolécules et classées en tantque biopolymères (lignine, cellulose,...) ou en tant quemacromolécules naturelles, tels que les protéines, lesglucides, ou encore les hétérosides. Cesmacromolécules peuvent avoir une structure primaire, secondaire, tertiaire, quaternaire [35].

(29)

Chapitre II Bactéries et biomolécules

II-6 : Définition de la phytochimie [36,37, 38,39]

La phytochimie dérivé de la chimie avec le préfix PHYTOS « plante », est la science qui étudie la structure, le métabolisme et la fonction ainsi que les méthodes d’analyses, de purification et d’extraction des substances naturelles issues des plantes. Elle est indissociable d’autres disciplines telles que la pharmacognosie.Autrement, on peut définie la phytochimie comme un ensemble des méthodes et techniques de préparation et d’analyse des substances organiques naturelles de la plante.

II-7 : Le rôle de la phytochimie [36, 37, 38, 39]

Le but final de l'étude des plantes médicinales est souvent d'isoler un ou plusieurs constituants responsables de l'activité particulière de la plante. De ce point de vue, les techniques générales de screening phytochimique peuvent être d'un grand secours. Ces techniques permettent de détecter, dans la plante, la présence des produits appartenant à des classes de composés chimiques ordinairement physiologiquement actifs. Le nombre de ces classes est important et il ne peut être vérifié la présence de chacune. Il faut choisir et il est retenu les classes reconnues comme les plus actives, mais aussi les plus faciles à détecter compte tenu des ressources techniques disponibles.

Les méthodes d’extractions utilisées dans cette étude sont les suivants : L’infusion :

C’est une méthode d'extraction des principes actifs ou des arômes d'unvégétal par dissolution dans un liquide initialement porté à ébullition que l'on laisse refroidir.Le terme désigne aussi les boissons préparées par cette méthode, comme les tisanes et le thé. Cet infusé est utilisé pour la caractérisation des tanins et les flavonoïdes.

La macération :

C’est une méthode d’extraction solide-liquide similaire à l’infusionqui s’effectue à température ambiante. Elle est généralement utilisée pour l’extraction decomposés sensibles à la chaleur.

La décoction :

Elle consiste à réaliser l’extraction à température d’ébullition dusolvant. Cette opération s’oppose à la macération dans laquelle le solvant d’extraction est àtempérature ambiante [40].

(30)

Chapitre II Bactéries et biomolécules

20 II-8 :Screening phytochimique

II-8-1 :Alcaloïdes

Définition

Un alcaloïde est un composé organique azoté, plus ou moins basique, d’origine naturelle le plus souvent végétale, de distribution restreinte, donnant des réactions de précipitation avec certains réactifs (réactifs généraux des alcaloïdes) ; beaucoup d’alcaloïdes présentent, à faible dose, des propriétés pharmacologiques marquées[5].

Action pharmacologique et emplois

Les alcaloïdes sont des substances très intéressantes par leurs activités pharmacologiques des plus variées :

Sur le système nerveux central comme antidépresseur : codéine, morphine ….. Sur le système nerveux autonome excitant du sympathique : hordéine, ephédine… Sur les vaisseaux hypertenseurs : hydrastine….

Sur la circulation sanguine : vincamine…

Ce sont pour la plus part des poisons végétaux très actifs, dotés d’une action spécifique. La médecine les emploie le plus souvent à l’état pur. Il est à noter que les alcaloïdes jouent, à faible doses, le role d’anesthésiques locaux (cocaïne), d’analgésique (morphine), d’antibiotique, d’antiparasitaires, d’antipaludiques (quinine)….[4].

II-8-2 :Composés polyphénoliques II-8-2-1 :Tanins

Définition

Les tanins sont des composés poly phénoliques, hydrosolubles, ayant la propriété de tanner la peau, c'est-à-dire de la rendre imputrescible. Cette propriété est liée à leur aptitude à se combiner à des macromolécules (protéines, polysaccharides…) [5].

Tanins catéchiques

Ce sont des dérivés non hétérosidiques, n’ayant pas tous des propriétés tannantes, résultant de la polymérisation d’un nombre variable d’unités « flavone » (de même squelette que les flavonoïdes et les anthocyanes mais à un degré d’oxydation plus faible) [5].

Propriétés pharmacologiques

La plupart des propriétés des tanins découlent de leur capacité à former des complexes avec les macromolécules, en particulier les protéines. Les tanins présentent des propriétés astringentes, anti-diarrhéiques, antibactériennes et antifongiques. Certains

(31)

Chapitre II Bactéries et biomolécules

présententégalement des propriétés vitaminiques P. Les tanins hydrolysables sont des piégeurs de radicaux libres et de l’ion super-oxyde [5].

Emplois pharmaceutiques

Les tanins sont utilisées en thérapeutique, dans le traitement des maladies du système veineux et capillaire, comme antidiarrhéiques, comme contrepoisons en cas d’intoxication par les alcaloïdes ou les métaux lourds et, en dermopharmacie, comme toniques astringents [5].

II-8-2-1 : Flavonoïde

Définition

Les flavonoïdes sont des pigments quasi universels des végétaux, souvent responsables de la coloration des fleurs, et des fruits. Ils dérivent tous de la flavone (ou 2-phénylchromone) et existent le plus souvent à l’état naturel sous forme d’hétérosides [5].

Propriétés pharmacologique

Les flavonoïdes sont essentiellement des médicaments de l’insuffisance veineuse par action sur la microcirculation. Ils diminuent la perméabilité des capillaires sanguins et augmentent leur résistance. Cette action est appelée « vitaminique P », à coté de cette action principale « vitaminique P », certains flavonoïdes présentent des activités particulières : diurétiques, anti-inflammatoires, antispasmodiques… [5]

Emplois en thérapeutique

Les flavonoïdes, seuls ou associés, sont prescrits dans les indications suivantes :

Traitement de troubles en rapport avec une insuffisance veineuse : jambes lourdes, crampes, œdèmes, varices, lymphoedème du membre supérieur après traitement radio chirurgical du cancer de sein…

Traitement de la crise hémorroïdaire ;

En ophtalmologie lors de baisse d’acuité visuelle et de troubles du champ visuel, présumés d’origine vasculaire ;

Métrorragies liées à la contraception par des micro-progestatifs ou induites par la présence d’un dispositif intra-utérin.

Traitement symptomatique de la fragilité capillaire au niveau de la peau et des muqueuses… [5]

(32)

Chapitre II Bactéries et biomolécules

22 II-8-3 : Dérivées anthracéniques

II-8-3-1 :Quinone

Définition

Les quinones sont des composés souvent rencontrés dans les systèmes biologiques tels que les systèmes photosynthétiques ou enzymatiques, et en chimie (oxydation, polymères conducteurs). Ces molécules possèdent un même motif de base de type cyclohexadiène comportant des doubles liaisons exocycliques, leur procurant un grand nombre de propriétés physico-chimiques.Les quinones sont des molécules organiques d’une grande importance dans la chimie et la biologie[41].

II-8-4 : Les glucosides[36, 37, 38, 39]

On peut classer comme suit : Les glucosides cardiaques

Présents dans de nombreuses plantes médicinales telles que les digitales laineuses et pourprées (Digitalislanata et D. purpurea, cultivées en Europe) et lemuguet (Convallariamajalis), les glucosides cardiaques comme la digitoxine, la digoxine et la convallotoxine ont une action directe et puissante sur le cœur. Ils l'aident à maintenir le rythme cardiaque en cas d'affaiblissement. Ces glucosides sont également diurétiques et contribuent à transférer les liquides des tissus et du système circulatoire vers les conduits urinaires.

Les glucosides cyanogéniques

Bien que ces substances soient à base de cyanure, poison très violent, elles ont, prises à petites doses, un effet sédatif el relaxant sur le cœur et les muscles. L'écorce du cerisier sauvage (et les feuilles du sureau noir (qui en contiennent toutes les deux, permettent de supprimer ou de calmer les toux sèches et irritantes. De nombreux noyaux de fruits contiennent de fortes quantités de glucosides cyanogéniques (par exemple ceux de l'abricotier).

II-8-5 : Saponosides

Définition

Les saponosides (ou saponines) sont des hétérosides à génine stéroidique ou triterpénique, caractérisés principalement par leurs propriétés tensioactives. Ces propriétés se traduisentnotamment par la formation de mousse par agitation dans l’eau. De plus, la plupart

(33)

Chapitre II Bactéries et biomolécules

des saponosides présentent des propriétés hémolytiques [5].Les saponosides sont très largement répandus dans le règne végétal.

Propriétés biologiques

Les saponosides présentent des propriétés antivirales, antifongiques, antibactériennes et sont toxiques pour les animaux à sang froid.

Ils provoquent une irritation cellulaire à l’origine de propriétés diurétiques, expectorantes, laxatives….

Par ailleurs, ce sont des protecteurs veineux et capillaires et ils présentent une activité anti-œdémateuse [5].

Emplois pharmaceutiques Emplois thérapeutiques

Les saponosides et les drogues qui en renferment, sont utilisés en thérapeutique pour leurs propriétés anti-inflammatoires, cicatrisantes, expectorantes, antispasmodiques et diurétiques et en tant que protecteurs veineux.

Emplois industriels

Certains saponosides stéroidiques (extraits de dioscoreas et d’agaves), servent de matière première pour l’hémisynthèse d’hormones stéroidiques [5].

II-8-6 : Mucilages

Définition

Ce sont des polymères ramifiés, souvent à ramification courtes, soit acides (acide galacturonique), soit neutres (galactose+ mannose).A l’inverse des gommes, les mucilages sont des constituants cellulaires normaux des végétaux. Ils sont largement répandus dans le règne végétal et si tous les organes végétaux peuvent en renfermer, ils sont surtout abondants dans les graines [5].

Propriétés et emplois en pharmaceutique

La propriété de tous les polysaccharides hétérogènes est leur très grande hydrophilie. En présence d’eau, ils forment soit des solutions visqueuses, soit des gels.Ils sont très utilisés, de même que les drogues qui en renferment :

(34)

Chapitre II Bactéries et biomolécules

24

En thérapeutique en tant que :

-Protecteurs des muqueuses digestives intestinales et gastriques et dans le traitement du reflux gastro-œsophagien ;

-Emollients, adoucissants de la peau et des muqueuses irritées ;

En pharmacie galénique, comme excipients dans la fabrication des comprimés (liants ou délitant), dans la fabrication des formes dermiques (épaississants, gélifiants, agents de stabilisation) [5].

II-8-7 : Coumarines

Définition

Le nom coumarine vient de « cumaru », ces composés sont très importants et diversifiés car, beaucoup d’entre eux, existent à l’état naturel. En effet, aujourd’hui, près d’un millier de coumarines ont été décrites dans plus de 800 espèces de plantes et dans des micro-organismes [42].

Propriétés pharmacologique

Les coumarines ont de nombreuses propriétés biochimiques et pharmacologiques. L’activité de ces molécules dépend de la structure et de la nature des substituant. La majorité des coumarines et leurs dérivées ont été soumises à de profondes investigations afin d’évaluer leurs effets sur la santé humaine. Les recherches ont montré qu’elles peuvent être des agents anti HIV, anti tumoraux, anticancéreux, antimicrobiens, anti inflammatoires antifongiques anti oxydants et même vasodilatateurs.Ces composés peuvent aussi manifester des effets ostrogéniques, antinéoplasiques. Elles inhibent l’agrégation plaquettaire ainsi que l’activité d’acétylcholinestérase [42].

(35)

(36)

Chapitre III Matériel et méthodes

25 1ére partie : Etude de l’activité antimicrobienne

III-1 : Matériel

III-1-1 : Matériel biologique a- Les souchespathogènes

Les germes qui ont été testés pour déceler l’activité antibactérienne des extraits de Sapindus

mukorossi sont les suivants :

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Escherichia coli ATCC 25922

Candida albicans(souche clinique)

Ces souches de collection internationale ATCC (American type culture collection) ont toutes été fournis par le laboratoire d’analyse médicale SAYAH Bouira, et le laboratoire des entérobactéries de l’institut Pasteur d’Alger (IPA).

b- l’extrait

Nous avons testé l’activité antibactérienne et antifongique par l’extrait aqueux préparé à partir des fruits de l’arbre Sapindus mukorossi (la coquille).

III-1-2 : les milieux de culture utilisés Milieux liquides

• Bouillon nutritif

Milieux solides

• Gélose nutritive (GN) : milieu d’isolement et de conservation

• Gélose Muller Hinton (MH) : milieu pour l’étude de la sensibilité des bactéries aux différents extraits de plante.

• Gélose sabouraud : pour l’isolement et l’entretien de la levure et l’étude de sa sensibilité aux extraits

(37)

Chapitre III Matériel et méthodes

III-1-3 : Les Antibiotiques En disque

Tableau 03 : La liste des antibiotiques testés

Antibiotique Single Concentration

Sulfamide COT 25 µg Perfloxacine PF 5 µg Céfalexine CN 30 µg Céftazidine CAZ 30 µg Céfotaxime CX 30 µg Gentamicine GEN 10 µg

III-1-4 : Réactifs chimiques et autre matériel a - Réactifs chimiques

Les colorants de coloration de Gram violet de gentiane lugol fuchsine bleu méthylique Alcool L’eau distillée

Eau physiologique stériles b- Matériel

- Boite de Pétri - Bec bunsen - L’incubateur - La lame

- Pipette pasteur - Ecouvillons stériles - Les tubes à essais - Microscope optique - Autoclave - Papier filtre stérile - Pince stérile - Plaque de chauffage - L’entonnoir - Pied à coulisse

(38)

Chapitre III Matériel et méthodes

III-2 : Méthodes

III-2-1 : Préparation des extraits

Les fruits (la coquille) sont broyés à l’aide d’un mixeur jusqu'à leur réduction en poudre. Après broyage de la matière végétale

Figure 06 : L

Les pourcentages massiques20%, 30% jusqu'à la température d’ébullition. filtration sur papier filtre.

On a suivi le même protocole avec l’éthanol sans chauffage.

Figure 07: L’extrait

Chapitre III Matériel et méthodes

réparation des extraits

sont broyés à l’aide d’un mixeur jusqu'à leur réduction en poudre. matière végétale, nous avons procédé à un type de décoction

: La coquille et la poudre de Sapindus mukorossi

20%, 30%,et 40%ont été mis à décoction

température d’ébullition. Laisser refroidir, ensuite l’extrait a été récupéré

On a suivi le même protocole avec l’éthanol sans chauffage.

aqueux et l’extrait éthanolique de Sapindus muko

Chapitre III Matériel et méthodes

27

sont broyés à l’aide d’un mixeur jusqu'à leur réduction en poudre. un type de décoction.

rossi

dans l’eau distillée a été récupéré par

(39)

Chapitre III Matériel et méthodes

III-2-2 : La coloration de Gram a) Principe

La coloration de Gram est une technique qui permet de mettre en évidence les propriétés de la Paroi bactérienne. Elle permet de colorer les bactéries et de

violet de gentiane (Gram+) ou la fuchsine (Gram

b) Mise en œuvre pratique

Prélever à l’aide d’une anse de platine stérile une à deux colonies a partir du milieu contenant de la gélose nutritive.

Déposé aseptiquement sur une lame les colonies et ajouter quelques goutte de l’eau physiologique, puis frottis sur la lame

Procéder à la fixation du frottis en faisant passer la lame trois fois dans la flamme du bec bunsen.

Recouvrir le frottis avec l le rince avec l’eau distillée. Verse le lugol et laiss

stabiliser la coloration violette

On rince la lame inclinée avec l’alcool filet doit être clair à la fin de la décoloration. On recouvre la lame avec la solution

lavé doucement à l’eau buvard.

Observer la lame au microscope photonique, au grossissement x 100

Observation microscopique des souches fongiques par coloration au bleu méthylique [43, 44].

Figure 08

Chapitre III Matériel et méthodes

ram

La coloration de Gram est une technique qui permet de mettre en évidence les propriétés de la Paroi bactérienne. Elle permet de colorer les bactéries et de distinguer leur aptitude à fixer le violet de gentiane (Gram+) ou la fuchsine (Gram-). Cette opération se déroule en neuf

Prélever à l’aide d’une anse de platine stérile une à deux colonies a partir du milieu de la gélose nutritive.

Déposé aseptiquement sur une lame les colonies et ajouter quelques goutte de l’eau physiologique, puis frottis sur la lame

Procéder à la fixation du frottis en faisant passer la lame trois fois dans la flamme du

Recouvrir le frottis avec le violet de gentiane et on laisse agir pendant le rince avec l’eau distillée.

le lugol et laisser agir une minute puis rincer à l’eau. Cette étape a pour but de stabiliser la coloration violette.

la lame inclinée avec l’alcool. Surveiller lacoloration (15 à 30 secondes). Le filet doit être clair à la fin de la décoloration. Rinceravec de l’eau.

On recouvre la lame avec la solution fuchsine : laisser agir 30 secondes à uneminute, l’eau déminéralisée. Sécher la lame entre 2 feuilles depapier

Observer la lame au microscope photonique, au grossissement x 100

Observation microscopique des souches fongiques par coloration au bleu méthylique

Figure 08 : La coloration de Gram

Chapitre III Matériel et méthodes

La coloration de Gram est une technique qui permet de mettre en évidence les propriétés de la distinguer leur aptitude à fixer le tte opération se déroule en neuf étapes.

Prélever à l’aide d’une anse de platine stérile une à deux colonies a partir du milieu

Déposé aseptiquement sur une lame les colonies et ajouter quelques goutte de l’eau

Procéder à la fixation du frottis en faisant passer la lame trois fois dans la flamme du

e violet de gentiane et on laisse agir pendant 1 min, puis on

l’eau. Cette étape a pour but de

coloration (15 à 30 secondes). Le

fuchsine : laisser agir 30 secondes à uneminute, Sécher la lame entre 2 feuilles depapier

Observer la lame au microscope photonique, au grossissement x 100.

(40)

Chapitre III Matériel et méthodes

c) Observation des bactéries

Les bactéries à Gram positif apparaissent sont colorées en rose.

III-2-3 : Préparation des milieux de culture

La gélose de Muller Hinton est coulée et

dernières sont séchées pendant 30 min à une température ambiante avant leur emploi.

III-2-4 : Conservation des souches

La conservation des souches ba inclinée à une température de 4°C. trois mois

La conservation les souches levuriformes se fait sur des tubes contenant du milieu Sabouraud à 4°C.

III-2-5 : Repiquage (isolement

Les souches bactériennes à tester ont été repiquées par la méthode des stries dans des boites de pétri contenant de la gélose nutritive, puis incubées

et 30°C pour les levures afin d'obtenir

Figure 09

III-2-6 : Antibiogramme A) Principe

L’antibiogramme permet de mesurer la capacité d’un antibiotique à inhiber la croissance bactérienne in vitro et de catégoriser une souche

(sensible, intermédiaire, ou résistante). Il est basé sur l’observation de la croissance bactérienne en présence d’un gradient de concentration obtenu par la méthode de diffusion à partir de disques dans un milieu

l’antibiogramme de société française de microbiologie

Chapitre III Matériel et méthodes

apparaissent colorées en violet foncé et celle

paration des milieux de culture

La gélose de Muller Hinton est coulée et répartie dans des boites de pétri stériles. Ces dernières sont séchées pendant 30 min à une température ambiante avant leur emploi.

onservation des souches

La conservation des souches bactériennes se fait dans des tubesde gélose nutritive inclinée à une température de 4°C. Elles sont repiquées sur un nouveau milieu tous les

La conservation les souches levuriformes se fait sur des tubes contenant du milieu

epiquage (isolement) des souches bactériennes

Les souches bactériennes à tester ont été repiquées par la méthode des stries dans des boites de pétri contenant de la gélose nutritive, puis incubées à 37°C pendant 24 h

afin d'obtenir des colonies isolées.

09 : L’isolement des souches microbiennes

L’antibiogramme permet de mesurer la capacité d’un antibiotique à inhiber la croissance bactérienne in vitro et de catégoriser une souche bactérienne en classes semi

(sensible, intermédiaire, ou résistante). Il est basé sur l’observation de la croissance bactérienne en présence d’un gradient de concentration obtenu par la méthode de diffusion à partir de disques dans un milieu gélosé selon les recommandations du comité de

été française de microbiologie [43, 44].

Chapitre III Matériel et méthodes

29

en violet foncé et celles à Gram négative

répartie dans des boites de pétri stériles. Ces dernières sont séchées pendant 30 min à une température ambiante avant leur emploi.

tubesde gélose nutritive sur un nouveau milieu tous les

La conservation les souches levuriformes se fait sur des tubes contenant du milieu

Les souches bactériennes à tester ont été repiquées par la méthode des stries dans des boites à 37°C pendant 24 h pour les bactéries

L’antibiogramme permet de mesurer la capacité d’un antibiotique à inhiber la croissance bactérienne en classes semi- quantitatives (sensible, intermédiaire, ou résistante). Il est basé sur l’observation de la croissance bactérienne en présence d’un gradient de concentration obtenu par la méthode de diffusion à gélosé selon les recommandations du comité de

(41)

Chapitre III Matériel et méthodes

III-3 : Tests d’activités antimicrobiennes III-3-1 : Test antibactériens

III-3-1-1 : Préparation de l’inoculum

Chaque culture microbienne doit être ensemencée par épuisement sur une gélose nutritive pour les bactéries, pour obtenir des colonies isolées. Après une incubation à 37°C pendant 24h, choisir 4 à 5 colonies bien isolées du même type morphologique et transf

croissance dans un tube contenant du bouillon nutritif (ou e

bouillon jusqu’à ce qu’il devienne trouble et ensuite ajuster la turbidité à la standard Mc Farland 0.5 A l’aide d’un spectrophotomèt

0,1 lue à 625nm correspond à une suspension contenant environ 1 à 2 x 10 8 UFC les bactéries [45].

III-3-1-2 : Ensemencement des milieux de culture en boite et dépôts des disques

Dans des boites de pétri, le milieu de culture gélosé MH en surfusion est à raison de 20 ml par boite. Après la solidification,

éliminé l’excès de liquide en tournant l’écouvillon sur les parois du tube. Ensemencer toute surface de milieu (3 passage à orientation décalée de 60° pour la boite et l’écouvillon)

Des disques de papier filtre stérilisés de 6 mm de diamètre sont déposés à la surface de la gélose à l’aide d’une pince bactériologique stérile puis imprégn

aqueux de Sapindus mukorossi

-Les disques d’antibiotiques sont déposés à la surface de la gélose à l’aide d’une pince bactériologique stérile, l’antibiotique est utilisé comme contrôle positif.

le séchage, incuber à 37°C pendant 24h pour les bactéries.

Figure 10

Chapitre III Matériel et méthodes

Tests d’activités antimicrobiennes de l’extrait de Sapindus

: Préparation de l’inoculum

Chaque culture microbienne doit être ensemencée par épuisement sur une gélose nutritive pour les bactéries, pour obtenir des colonies isolées. Après une incubation à 37°C pendant

colonies bien isolées du même type morphologique et transf croissance dans un tube contenant du bouillon nutritif (ou eau physiologique 0,9 %). Agiter

jusqu’à ce qu’il devienne trouble et ensuite ajuster la turbidité à la

l’aide d’un spectrophotomètre une densité optique entre 0,08 à 0,1 lue à 625nm correspond à une suspension contenant environ 1 à 2 x 10 8 UFC

des milieux de culture en boite et dépôts des disques

milieu de culture gélosé MH en surfusion est coulé aseptiquement ml par boite. Après la solidification, plonger l’écouvillon dans la suspension est éliminé l’excès de liquide en tournant l’écouvillon sur les parois du tube. Ensemencer toute surface de milieu (3 passage à orientation décalée de 60° pour la boite et l’écouvillon)

Des disques de papier filtre stérilisés de 6 mm de diamètre sont déposés à la surface de la gélose à l’aide d’une pince bactériologique stérile puis imprégnés d’un volume de l

rossi sur les 3 bactéries.

Les disques d’antibiotiques sont déposés à la surface de la gélose à l’aide d’une pince bactériologique stérile, l’antibiotique est utilisé comme contrôle positif. Après la diffusion et le séchage, incuber à 37°C pendant 24h pour les bactéries.

10 : Protocole de l’activité antimicrobienne

Chapitre III Matériel et méthodes

Chaque culture microbienne doit être ensemencée par épuisement sur une gélose nutritive pour les bactéries, pour obtenir des colonies isolées. Après une incubation à 37°C pendant colonies bien isolées du même type morphologique et transférer la au physiologique 0,9 %). Agiter le jusqu’à ce qu’il devienne trouble et ensuite ajuster la turbidité à la bonne densité au une densité optique entre 0,08 à 0,1 lue à 625nm correspond à une suspension contenant environ 1 à 2 x 10 8 UFC I ml pour

des milieux de culture en boite et dépôts des disques

coulé aseptiquement plonger l’écouvillon dans la suspension est éliminé l’excès de liquide en tournant l’écouvillon sur les parois du tube. Ensemencer toute la surface de milieu (3 passage à orientation décalée de 60° pour la boite et l’écouvillon) [46]. Des disques de papier filtre stérilisés de 6 mm de diamètre sont déposés à la surface de la

és d’un volume de l’extrait

Les disques d’antibiotiques sont déposés à la surface de la gélose à l’aide d’une pince Après la diffusion et