MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE DE JIJEL
FACULTE DES SCIENCES EXACTES ET INFORMATIQUES
DEPARTEMENT DE CHIMIE
MEMOIRE
EN VUE DE L’OBTENTION DU DIPLOME DE MAGISTER EN CHIMIE OPTION: CHIMIE PHYSIQUE
INTITULÉ: MÉTHODES PHYSIQUES D’ANALYSE THEME
ETUDE PAR GC-MS DES HUILES ESSENTIELLES DE: NIGELLA SATIVA, PISTACIA LENTISCUS, ET PUNICA GRANATUM
Présenté par : Beloucifa Moufida Devant le Jury:
2013-2014
Mr. KHELILI S. Pr. UNIVERSITE DE JIJEL PRESIDENT
Mme. MERABET N. MCA UNIVERSITE DE JIJEL RAPPORTEUR
Mr. RIDA K. MCA UNIVERSITE DE JIJEL EXAMINATEUR Mme. BOUREMMAD F. MCB UNIVERSITE DE JIJEL EXAMINATEUR
Remerciements
Je remercie mon Dieu pour m'avoir donné la force et le courage pour mener ce travail à bout.
Mes remerciements vont à:
Dr. Merabet N. pour m'avoir proposé le sujet de ce mémoire.
Pr. Khelili S. d'avoir bien voulu accepter de présider le jury de soutenance.
Dr. Rida K. et Dr. Bouremmad F. d'avoir bien voulu accepter d'examiner ce travail.
Merci également à tout mon entourage, mes parents, mes sœurs, ma famille et mes amis pour leur soutien affectif et moral.
Merci à tous.
Dédicace
Je dédie mon mémoire de magistère
A ma mère;
A mon père;
A mes chers frères: Mohamed, Walid, Fateh et Sami;
A mes sœurs: Salma, Hanane, et Widad;
A toute ma famille;
A tous mes amis de la promotion;
A mes collègues de magistère.
Introduction générale………... 1
Chapitre I: Les technique CPG, SM, GC-MS, et domaines d'application
3 A- Les techniques: CPG, SM et GC-MS
I-Généralités sur la chromatographie en phase gazeuse………... 3
3 I.1-Introduction et Historique………...
3 I.2-Classification des chromatographies………...
3 I.2.1- Classification fondée sur les phénomènes physicochimiques à la base de la
separation………...
I.2.2- Classification fondée sur la nature de la phase mobile……… 4
4 I.2.3- Classification selon la forme que prend la phase stationnaire……….
4 I.3- Grandeurs utilisées en chromatographie……….…
4 I.3.1- Principales variables intervenant dans une analyse chromatographique type CPG……
5 I.3.2- Paramètre fondamentaux caractérisant la rétention……….
6 II.3.3- Paramètres fondamentaux caractérisant la séparation………...
6 II.3.4- Efficacité d'une colonne N………..
7 II- La chromatographie en phase gazeuse (CPG)………..
7
II.1- Definition………...
7 II.2- Principe………..
II.3- Organes d’un appareillage CPG……….... 8
9 II.3.1- Gaz vecteur……….
9 II.3.2- Injecteur………..
II.3.3- Colonne, support et four………. 10
10 II.3.3.1- Classification des types de colonne……….
12
II.3.3.2- Le four……….
II.3.5- Les détecteurs………... 15
. 16
III- Préparation et traitement de l’échantillon avant injection en CPG……….
17 III.1- Les réactions de dérivatisation……….…
18 VI- La spectrométrie de masse (SM)……….
18 VI.1- Définition……….
18
VI.2- Principe de la SM……….
19 VI.3- Organes d'un spectromètre de masse (SM)………..
19
VI.3.1- La source………...
20 VI.3.2- L’analyseur………...
22
VI.3.3- Le détecteur………..
22
V- Les couplages GC-MS……….
23 VI-Analyse qualitative et quantitative………...
23 VII- Conclusion……….…
B- Domaines d'applications de la GC-MS 24
24 I- Industrie pharmaceutique……….………..
II- Domaine médico-légal: Recherche de drogues……….…... 25
25 III- Industrie agroalimentaire………....
26 III.1- Recherche des produits cancérigènes……….……..
26 III.2- Dosage des constituants alimentaires……….………..
28 IV- Domaine de l'environnement……….
V- Domaine de pétrole………. 29
VI- Domaine des cosmétiques……….. 31
31 VII- La GC-MS en synthèse organique……….
32 VIII.1- L’Analyse des huiles essentielles par couplage GC-MS………...
33 VIII.1.1- Les huiles essentielles………...
33
VIII.1.1.1- Définition………...
33
VIII.1.1.2- Composition chimique………
34 VIII.1.1.3- Méthodes d’extraction………
35 VIII.1.1.4- Localisation des huiles essentielles dans la plante………..
36 VIII.1.2- Identification et analyses chromatographiques………..
VIII.1.3- Domaine d’utilisation des huiles essentielles………. 36 C- Problématique et choix des plantes à étudier 37
37 I- Huile essentielle des parties aériennes de la plante de Nigella sativa L: Etude bibliographique……
.
37
I.1- Généralité………....
39
………...
I.2- Huiles essentielles des graines de Nigella Sativa L………..
41 II- Huile essentielle des parties aériennes de la plante de Pistacia Lentiscus L: Etude bibliographique ……….
41
II.1- Généralité………..
42 II.2- Huiles essentielles de Pistacia Lentiscus L………...
II.2.1- Huiles essentielles des feuilles de Pistacia Lentiscus L…... 42
43 II.2.2- Huiles essentielles des fruits de Pistacia Lentiscus L………
III- Huile essentielle des parties aériennes de la plante de grenadier (Punica granatum L): 44 Etude bibliographique………...
………...
III.1- Généralité………. 44
45 III.2- Huiles essentielles des graines de grenadier………....
45 III.3- Huiles essentielles d'écorce de grenadier……….
IV- Conclusion……….. 46
Chapitre II: Travail réalisé, résultats et discussions
47 I.1- Extraction de l'huile essentielle de Nigella sativa L………...
47 I.2- Analyse par GC-MS………...
48 I.3- Résultats et discussions………...
………..……… 53
II- Huile essentielle de Pistacia lentiscus L……
53 II.1- Huile essentielle des feuilles de Pistacia lentiscus L………...………….
53 II.1.1- Extraction de l'huile essentielle des feuilles de Pistacia lentiscus L…………...……...
53 II.1.2- L'analyse par GC-MS……….
53 II.1.3- Résultats et discussions………..
60 II.2- Huile essentielle des fruits de Pistacia lentiscus L………...
60 II.2.1- Extraction de l'huile essentielle des fruits de Pistacia lentiscus L……….…
61
II.2.2- Analyse par GC-MS………...
61 II.2.3- Résultats et discussions………..
67 III- Huile essentielle de grenadier……….
67 III.1- Huile essentielle des graines de grenadier………...
67 III.1.1- Extraction de l'huile essentielle des graines de grenadier……….
67
III.1.2- Analyse par GC-MS……….
68 III.1.3- Résultats et discussions……….
III.2- Huile essentielle des écorces de grenadier………... 70
70 III.2.1- Extraction de l'huile essentielle des écorces de grenadier……….
70 III.2.2- Analyse par GC-MS………..
70 III.2.3- Résultats et discussions……….
74 III.3- L'huile essentielle des feuilles de grenadier………...
74 III.3.1- Extraction de l'huile essentielle des feuilles de grenadier……….
III.3.3- Résultats et discussions………. 75
77 IV- Conclusion………..
Conclusion générale………. 78
Référence bibliographique……….. 80
Figure 1 Schéma de principe d’un appareillage CPG ………... 8 Figure 2 Injecteur à vaporisation directe……….. 9 Figure 3 Injecteur posséder une chambre d'injection avec diviseur………… 10 Figure 4 Représentation schématique d’une colonne capillaire………... 12 Figure 5 Schéma du couplage d’un chromatographe à tube capillaire à un
spectromètre de masse………...
16 Figure 6 Schéma de différentes parties d’un spectromètre de masse………... 19 Figure 7 Représentation simplifiée d’un quadripôle……… 21 Figure 8 Aspect morphologique de la plante Nigella sativa L…….………… 38 Figure 9 Image de branche, des fruits, et feuilles de Pistacia lentiscus L….. 41 Figure 10 Photographie et dessins des fruits et des feuilles du grenadier ……. 45 Figure 11 Chromatogramme de l’huile essentielle de Nigella sativa L obtenu
par GC-MS...……….
49 Figure 12 Les produits majoritaires de l’huile essentielle de Nigella sativa L…... 51 Figure 13 Chromatogramme de l’huile essentielle des feuilles de Pistacia
lentiscus L obtenu par GC-MS... 57 Figure 14 Les produits majoritaires de l’huile essentielle des feuilles de
Pistacia lentiscus L………
58 Figure 15 Chromatogramme de l’huile essentielle des fruits de Pistacia
lentiscus L obtenu par GC-MS... 62 Figure 16 Les produits majoritaires de l’huile essentielle de fruit de Pistacia
lentiscus L...
64 Figure 17 Chromatogramme de l’huile essentielle des graines du grenadier
obtenu par GC-MS……….
68
69 Figure 19 Chromatogramme de l’huile essentielle d’écorce de grenadier
obtenu par GC-MS... 72 Figure 20 Les principaux constituants de l’huile essentielle d'écorce de
grenadier... 73 Figure 21 Chromatogramme de l’huile essentielle des feuilles du grenadier
obtenu par GC-MS...
76
Tableau 1 Exemples des phases stationnaires liquides utilisées en CPG……. 15 Tableau 2 Composition chimique de l’huile essentielle de Nigella sativa... 48 Tableau 3 Structure des composés majoritaires de l'huile essentielle de
Nigella sativa L...
51 Tableau 4 La composition des huiles de différentes régions... 52 Tableau 5 Composition chimique de l’huile essentielle de feuille de Pistacia
lentiscus L ……..………... 54 Tableau 6 Structure des composés majoritaires de l'huile essentielle de
feuille de Pistacia lentiscus L de Jijel…... 59 Tableau 7 Les principaux constituants de l’huile essentielle feuille de
Pistacia lentiscus L de différentes régions... 60 Tableau 8 Les principaux composés d'extraits d'huile essentielle de fruit de
Pistacia lentiscus L analysé par GC-MS ………...……….
62 Tableau 9 Structure des composés majoritaires de l'huile essentielle de fruit
de Pistacia lentiscus L (Jijel)... 64 Tableau10 Les principaux constituants de l’huile essentielle de fruit de
Pistacia lentiscus L de différentes régions... 65 Tableau11 Composition chimique de trois huiles essentielles: Nigella saitiva
L, fruit et feuille de Pistacia lentiscus L…... 66 Tableau12 Les principaux composés d'extraits d'huile essentielle de la graine de
grenadier...
68 Tableau13 Structure des composés majoritaires de l'huile essentielle de la
graine de grenadier...
69 Tableau14 Les principaux composés d'extraits d'huile essentielle d’écorce de
grenadier... 71
74 Tableau16 Les principaux composés d'extraits d'huile essentielle de feuille de
grenadier... 75
GC-MS: Gas chromatography – Mass spectroscopy.
GV: Gaz vecteur HE: Huile Essentielle.
IE: Ionisation Electronique.
IC: Ionisation Chimique.
CPG : Chromatographie en phase gazeuse.
°C: Degré Celsius.
Min: minute.
Na2SO4: Sulfate de sodium anhydre.
S: Sativa . P: Pistacia.
PL: Pistacia Lentiscus.
MS: Masse spectroscopy.
GC: Gaz chromatographie.
HCl: Acide Chlorhydrique.
FID: Flame Ionization Detector.
ppm : Partie Par Million.
ppb : Partie Par billion.
h: heure.
He: Hélium.
N: normale.
IR: Infrarouge.
eV: électron Volt.
m/z: masse/charge d’un ion.
p: para.
o: ortho.
KPa: Kilo Pascale.
Tr: Temps de rétention.
s: seconde.
LC/MS: Liquid Chromatography Mass Spectrometry ou GC/MS pour Gas Chromatography Mass Spectrometry.
CP 624 CB: 6 % cyanopropylephényle / 94 % diméthyle polysiloxane.
PAS1701: cyanopropylphényle (14 %)- diméthylsiloxane (86 %).
BPX-10: diphényle (5%), diméthyl polysiloxane (95 %).
WCOT: Wall Coated Open Tubular.
SCOT: Support. Coated Open Tubular.
PLOT: Porous Layer Open Tubular.
OV225: 50 % cyanopropyl- 50 % phénylmethylpolysiloxane.
OV17: 50 % trifluoropropyl- 50 % méthylpolysiloxane.
DB5: 5 % méthylphénylpolysiloxane.
SE-30, OV1, OV101: polydiméthylsiloxane.
HP5-MS: 5 % phényle, méthylsiloxane.
Introduction générale
Introduction générale
La chimie analytique englobe l'ensemble des méthodes utilisées pour déterminer la composition chimique d'échantillons de matière. Les méthodes qualitatives fournissent des informations relatives à la nature des espèces atomiques ou moléculaires ou encore des groupes fonctionnels présents dans l'échantillon. Les méthodes quantitatives quant à elles, fournissent des informations numériques telles que la quantité relative d'un ou de plusieurs composants [1].
Les méthodes d'analyse physiques sont diverses, il y a des techniques chromatographiques:
la Chromatographie sur Couche Mince (CCM), la Chromatographie liquide sur Colonne (CC), la Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP) ou encore la Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) permettant d’obtenir une quantité suffisante de produit pur afin de réaliser une étude spectroscopique complète par Spectrométrie de Masse (SM), l'Infrarouge par Transformée de Fourier (IRTF), l'Ultra-Violet (UV) et la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN 1H et 13C mono et bidimensionnelle). La combinaison entre une de ces méthodes et une technique chromatographique, généralement la CPG, est réalisable. A partir de ce type de combinaisons, il est possible d’établir avec une certitude suffisante la composition d'un mélange. Le couplage de la chromatographie en phase gazeuse et la spectrométrie de masse est désigné par ses utilisateurs sous le terme abrégé de
"GC-MS" pour "Gaz Chromathography-Mass Spectrometry".
Les applications de la chromatographie en phase gazeuse seule sont limitées à l'analyse qualitative de composés relativement volatils et thermiquement stables, on ne peut identifier avec certitude les composés sans utiliser une technique annexe ou disposer du corps pur. Actuellement la chromatographie en phase gazeuse, associée à un spectromètre de masse (GC-MS) connait un important développement dans le domaine de l'analyse qualitative.
Le couplage de la chromatographie en phase gazeuse avec la spectrométrie de masse (CPG/SM) permet d’effectuer simultanément la séparation et l’analyse des différents constituants d’un mélange complexe. Deux modes d’ionisation sont possibles: l’ionisation par impact électronique (IE) et l’ionisation chimique (IC). La chromatographie en phase gazeuse (CPG), sépare et identifie des composés dans des mélanges complexes, et la spectrométrie de masse (SM), détermine le poids moléculaire et les composants ioniques des composés individuels.
Un système GC-MS comprend une alimentation en gaz porteur, une entrée pour l'introduction des échantillons, une colonne capillaire recouverte d'un liquide stationnaire ou solide, et une sortie pour le système de détection, dans ce cas un spectromètre de masse. Il existe différents types de détecteurs mais le spectromètre de masse est l'un des meilleurs à fournir des informations structurales sur les composés séparés par chromatographie [2].
2
Le couplage GC-MS a trouvé de nombreuses applications dans les domaines de l’agroalimentaire, des produits pétroliers (carburants, matières synthétiques), des produits naturels (parfumerie, cosmétique) ... Les applications industrielles de GC-MS incluent aussi la découverte de médicaments, la médecine légale, le domaine militaire, et les sciences de l'environnement [3].
L’objectif de ce travail est d’expliquer les principes de la chromatographie en phase gazeuse couplé à la spectrométrie de masse, de montrer comment l’association de ces techniques fournit un instrument d’analyse particulièrement performant. Et ensuite de monter leur application dans la détermination de la composition chimique des huiles essentielle de trois plantes Nigella Sativa, Pistacia Leniscus L et Punica Granatum L.
Ce travail est divisé en deux chapitres dont le premier comporte une étude bibliographique dans laquelle sont présentés la théorie de la chromatographie en phase gazeuse, la théorie de la spectrométrie de masse, ainsi que le couplage de ces deux méthodes. Il y sera également présenté les différents domaines d'utilisation de la GC-MS en mettant l’accent sur les conditions opératoires mises au point dans chaque domaine.
Dans le deuxième chapitre, nous développerons l’utilisation de la GC-MS comme outil d’analyse pour l'étude de la composition chimique des huiles essentielles de trois plantes: Nigella Sativa L, Pistacia Lentiscus L et Punica Granatum L et nous y présenterons les résultats obtenus et les discussions qui en découlent.
Chapitre I
Les techniques CPG, SM, GC-MS et
domaines
d'application
3
A- Les techniques: CPG, SM et GC-MS
I- Généralités sur la chromatographie en phase gazeuse I.1- Introduction et Historique
En 1906, un botaniste russe Mikhail Tswett purifie des pigments végétaux, comme la chlorophylle, sur une colonne de craie. Il donne alors à ce phénomène de séparation le nom de chromatographie (du grec khrôma, couleur et graphein, écrire) qu'il définit comme l'enregistrement graphique des couleurs. On assiste alors à la naissance de la chromatographie, dont la définition a fortement évolué [1].
Les techniques chromatographiques telles qu’on les connaît aujourd’hui ont été développées en 1952 pour la chromatographie en phase gazeuse par Martin et James, les méthodes chromatographiques sont les méthodes les plus importantes de l’analyse immédiate. Elles permettent de séparer les constituants d’un mélange plus ou moins complexe [4]. Le principe de base repose sur les équilibres de concentration qui apparaissent l’orsqu'un composé est mis en présence de deux phases non miscibles, l’une dite stationnaire, est emprisonnée dans une colonne ou fixée sur un support et l’autre, dite mobile, se déplaçant au contact de la phase stationnaire. Si plusieurs composés sont présents, ils se trouvent entraînés à des vitesses différentes, provoquant leur séparation [5].
L'objectif d’une méthode chromatographique est triple: obtenir des pics chromatographiques les plus fins possible (grande efficacité), les mieux séparés possibles (bonne résolution), en un temps d’analyse minimum. La notion de résolution est directement liée à celle d'efficacité et de séparation.
De l'efficacité de la colonne dépend la dispersion de l’ensemble des molécules d'un soluté autour de son temps de rétention: meilleure est l'efficacité et plus fins sont les pics chromatographiques.
La qualité de la séparation dépend également des rétentions relatives des différents analytes en mélange. La résolution augmente avec la longueur de la colonne, au détriment du temps d’analyse et de l'efficacité.
I.2- Classification des chromatographies
I.2.1- Classification fondée sur les phénomènes physicochimiques à la base de la séparation Il existe deux phénomènes physicochimiques:
4 1- Le partage
Ce phénomène est dû au greffage de la phase stationnaire liquide sur les particules du support, le phénomène repose sur le fait qu’en principe deux corps différents ne se partagent pas de façon identique entre deux phases. En effet, après équilibre les rapports de leurs solubilités dans les deux phases c’est-à-dire leurs coefficients de partage ne sont pas égaux.
2- L’adsorption
Ce phénomène constitue l’accumulation de substance à la surface d’une des phases en présence. Par exemple, la fixation d’un corps en solution sur la surface d’un solide en suspension.
I.2.2- Classification fondée sur la nature de la phase mobile
Il existe deux grands types de chromatographie, en fonction de la phase mobile utilisée: la chromatographie en phase gazeuse (CPG) et la chromatographie en phase liquide (CPL), ce dernier regroupe la chromatographie sur colonne à pression atmosphérique, ou sous pression (communément nommée HPLC pour High Performance Liquid Chromatography), la chromatographie d’échange d’ions, d’exclusion stérique et la chromatographie sur couche mince [3].
I.2.3- Classification selon la forme que prend la phase stationnaire
Il existe deux types de chromatographie, la chromatographie sur colonne par exemple:
l'échange d'ion, l'exclusion et la chromatographie planaire par exemple: la CCM.
I.3- Grandeurs utilisées en chromatographie
Quel que soit la méthode chromatographique utilisée, elle est régit par les mêmes grandeurs fondamentales. Cependant, certaines analyses ne nécessitent pas d'aboutir à des séparations parfaites. La mise en évidence de certaines substances est parfois suffisante. Les grandeurs utilisées en chromatographie pour caractériser une méthode de séparation concernent essentiellement la colonne.
I.3.1- Principales variables intervenant dans une analyse chromatographique de type CPG Lors d'une analyse chromatographique, les principales variables qui effectuent la séparation peuvent être regroupées en trois catégories:
celle concernant la phase stationnaire (Cœfficient de distribution K, Temps de rétention Tr),
celles découlant de la configuration de la colonne (Efficacité d'une colonne N),
celles provenant des conditions d'élution (Temps de rétention Tr, Volume de rétention).
5
I.3.2- Paramètre fondamentaux caractérisant la rétention II.3.2.1- Cœfficient de distribution K
La première grandeur fondamentale dépend du phénomène physicochimique qui est à l'origine du coefficient de distribution K [6], défini par:
K= Cs/Cm Cs: concentration soluté dans la phase stationnaire Cm: concentration soluté dans la phase mobile.
II.3.2.2- Temps de rétention Tr
C'est le temps qui s’écoule entre l’injection du soluté et l’apparition du sommet du pic (supposé symétrique), le temps de rétention dépend :
Du couple analyte / phase stationnaire.
De l’importance des volumes morts de la colonne.
De la masse de la phase liquide stationnaire dans la colonne.
De la température dans la colonne.
Du débit de la phase mobile Il est indépendant de:
De la quantité injectée si elle demeure faible.
De la nature et de l’abondance des autres composés.
II.3.2.3- Temps de rétention réduit T'r
Le temps de rétention réduit représente la durée que passe un composé sur la phase stationnaire. Il est défini par: T'r =Tr - Tm.
Il tient compte du temps (Tm) mis pour parcourir les vides ou interstices de la colonne (balayage de l’injecteur, du détecteur, des tuyaux) c’est aussi le temps mis par une substance non retenue par la phase stationnaire pour traverser la colonne.
II.3.2.4- Volume de rétention (VR)
C'est le volume de la phase mobile nécessaire à l’élution de l’analyte. Sur le chromatogramme, il correspond au volume de phase mobile écoulé entre l’injection et le sommet du pic, il dépend du débit D de la phase mobile. Il est définit par la relation suivante: Vr =Tr x D II.3.2.5- Facteur de rétention k' (ou de capacité k')
6
Ce facteur s’apparente au coefficient de partage puisqu’il exprime le rapport de la quantité de soluté dans la phase stationnaire à la quantité de soluté dans la phase mobile. Plus k’ est grand, plus le composé ne sera pas retenu longtemps dans la colonne [7].
k' = (Tr-Tm) / Tm
k' est un paramètre indépendant du débit ou de la longueur de la colonne, varie avec les conditions opératoires, ce n'est pas une constante, c'est le paramètre le plus important en chromatographie pour définir le comportement des colonnes [6].
II.3.3- Paramètres fondamentaux caractérisant la séparation II.3.3.1- Facteur de sélectivité
Le facteur de sélectivité est la mesure de la rétention relative entre deux substances composant d'un mélange. Il est fonction du choix de la colonne et des conditions. Il dépend donc des interactions spécifiques auxquelles les composés sont soumis de la part de la phase stationnaire.
Donc la sélectivité α est une grandeur qui permet de caractériser la distance qui sépare le sommet de deux pics chromatographiques consécutifs 1 et 2 [6].
α = T'r2/T'r1
II.3.3.2- Facteur de résolution
Pour traduire numériquement la plus ou moins bonne séparation entre deux composés, on utilise le facteur de résolution R qui est calculé à partir du chromatogramme. Plus R est grand, meilleure est la séparation [5].
R= 2. (T'r2 - T'r1) / (w1 + w2) w: représente la largeur du pic à la base II.3.4- Efficacité d'une colonne N
L'efficacité d'une colonne est traditionnellement représentée par le nombre de plateaux théoriques N. Elle mesure l'aptitude de la colonne à donner des pics fins. Elle est fonction de la nature du soluté injecté. Le nombre des plateaux est une mesure estimant non pas l'efficacité réelle de la colonne, mais l'ensemble du système.
II.3.4.1- Nombre de Plateaux Théorique N (efficacité théorique) Il est donné par la formule suivante: N = 16 (Tr- Tm) 2/w2 II.3.4.2- Hauteur Equivalente à un Plateau Théorique (HEPT)
7
Afin de pouvoir comparer les efficacités de séparation de colonnes de longueurs L différentes, on définit la hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT).
HEPT = L/N
Plus une colonne à de plateaux théoriques, meilleure est la séparation.
On compare souvent l'efficacité de deux colonnes de taille identiques, en revanche, la comparaison directe de deux colonnes de dimensions différentes est impossible. On est alors obligé de comparer N/L. Plus ce rapport est important, meilleure sera l'efficacité de la colonne, une colonne est d'autant plus efficace que la valeur HEPT est petite.
II.3.4.3- Indice de rétention
Le grand nombre de colonnes disponibles sur le marché rend quelque fois difficile le choix de celle qui sera la mieux adaptée au problème à résoudre.
La nature chimique des phases et leur polarité, ne permettent pas, à elles seules, de prévoir leurs réelles aptitudes séparatrices. Un système de repérage a donc été imaginé, connu sous le nom de système des indices de rétention, il repose sur l'utilisation de composés témoins dont les facteurs de rétention diffèrent suivant la phase stationnaire. Par ailleurs, à partir des indices de rétention d’un composé déterminé sur des colonnes dont les phases stationnaires sont différentes, il est possible de l'identifier avec plus de certitude [6].
II- La chromatographie en phase gazeuse (CPG) II.1- Définition
La chromatographie en phase gazeuse est une méthode d’analyse par séparation qui s’applique aux composés gazeux ou susceptibles d’être vaporisés par chauffage sans décomposition. Elle permet ainsi l’analyse de mélanges éventuellement très complexes de natures et de volatilités très diverses [8].
II.2- Principe
La CPG s'applique donc à des échantillons gazeux ou susceptibles d'être vaporisés sans décomposition dans l'injecteur. La phase mobile est alors un gaz (hélium, azote, argon ou hydrogène), appelé gaz vecteur, qui balaie en permanence la colonne. Cette dernière, placée dans un four thermostaté, est un tube de faible section enroulé sur lui-même et contenant la phase stationnaire. Un grand choix de détecteurs permet l'analyse sélective et parfois l'identification des mélanges très complexes. Si la phase stationnaire est un liquide non ou peu volatil, possédant des propriétés de solvant vis-à-vis des composés à séparer, on parle de chromatographie gaz liquide ou chromatographie de partage. Si la phase stationnaire est un solide absorbant (silice, alumine,
8
zéolites ou autres polymères adsorbants), c'est de la chromatographie gaz-solide ou chromatographie d'adsorption [9].
Donc il existe deux modes de chromatographie en phase gazeuse (CPG): la chromatographie de partage ou chromatographie gaz liquide (CGL) et la chromatographie d’adsorption ou chromatographie gaz solide (CGS).
La première méthode est de très loin la plus utilisée. Dans ce cas, les différences de partage des solutés à séparer entre une phase gazeuse et une phase liquide sont mises à profit. La phase liquide stationnaire est le plus souvent déposée sur un support poreux inactif réparti dans une colonne traversée par un gaz inerte constituant la phase mobile (gaz vecteur). Les composés à séparer, injectés au début du circuit à faibles ou très faibles concentration sont entrainés progressivement en fonction de certaines caractéristiques physiques. Ils apparaissent les uns après les autres à la sortie de la colonne ou ils sont détectés. [4].
Figure 1: Schéma d’un appareillage CPG II.3- Organes d'un appareillage CPG
Un appareil de CPG réunit dans un bâti unique; outre les trois modèles classiques, injecteur, colonne, et détecteur, un four thermostaté qui permet de porter, si nécessaire, la colonne à une température élevée. La phase mobile qui entraîne l’échantillon dans la colonne est un gaz appelé gaz vecteur. Les débits, contrôlés avec précision, permettent une grande répétabilité des temps de rétention [5].
9 II.3.1- Gaz vecteur
Le gaz vecteur (ou gaz porteur) servant de phase mobile doit répondre aux conditions suivantes: être compatible avec le détecteur; être inerte vis-à-vis de l'échantillon, du support et la phase stationnaire, avoir une pureté compatible avec la sensibilité exigée du détecteur, être sec. Le choix du gaz servant de phase mobile est en grande partie lié au choix du détecteur utilisé, les principaux gaz utilisés sont l'azote, l'hélium et l'hydrogène. Ce sont les plus faciles à employer et les plus inertes [6].
II.3.2- Injecteur
L'injecteur est la porte d’entrée de l’échantillon dans le chromatographe. Il a deux autres fonctions: vaporiser et entraîner en tête de colonne l’échantillon mélangé au gaz vecteur. Les caractéristiques des injecteurs, ainsi que les modes d’injection, diffèrent suivant les types des colonnes auxquels ils sont reliés. La qualité des séparations dépend de cette phase de l’analyse [5].
II.3.2.1- Les injecteurs à vaporisation directe
Les échantillons sont introduits à l'aide d'une seringue à travers un septum dans le flux de gaz vecteur au niveau de la chambre de vaporisation en tête de colonne. Les chambres de vaporisation sont portées à une température supérieure à celle de la colonne pour que l’échantillon soit volatilisé immédiatement pour être introduit le plus rapidement possible, ces systèmes sont utilisés avec les colonnes remplies. Le volume injecté varie de 1 à 10 µl et la totalité de l’échantillon est introduite sur la colonne.
Figure 2: Injecteur à vaporisation directe II.3.2.2- Les injecteurs avec ou sans division « split-splitless »
Les colonnes capillaires nécessitent des volumes plus faibles d’échantillons de l’ordre 0.1 à 1 µl. Il devient alors nécessaire d’utiliser un système de dérivation de flux dans lequel une partie de
10
l’échantillon est éliminée avant d’entrer dans la colonne (mode split) l’inconvénient de ce mode d’injection est la vaporisation sélective des composés les plus volatiles avec une modification de la composition réelle de l’échantillon injecté. Le mode splitless sur les colonnes capillaires est réservé à l'échantillon en solution très diluée.
Figure 3 : Injecteur avec un diviseur II.3.2.3- L’injecteur à température programmée
La chambre d’injection est chauffée progressivement. Il est possible avec ce système d’injecter l’échantillon avec ou sans division, à froid ou à température élevée, de plus, ils permettent d’injecter de plus grands volumes de solution dans la colonne que l’injecteur à température fixe [4].
II.3.3- Colonne, support et four
Comme toute méthode d'analyse, la chromatographie en phase gazeuse a pour but de séparer, d’identifier puis de doser des composés. La chromatographie gaz-liquide ou gaz-solide s'appuie sur l'efficacité des colonnes et la sélectivité des phases stationnaires. La colonne est le cerveau du chromatographe car c’est d’elle que dépend le succès des séparations [6].
II.3.3.1- Classification des types de colonne
On distingue deux types de colonne: les colonnes remplies, et les colonnes capillaires.
II.3.3.1.1- Les colonnes remplies
Les colonnes remplies contiennent un matériau granulé procurant une grande surface d’échange avec la phase mobile [8]. A ce jour, les colonnes remplies sont des tubes en verre, en
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métal (acier inoxydable, cuivre, aluminium) ou en téflon qui ont généralement 2 à 3 m de long et 2 à 4 mm de diamètre intérieur [10].
A la différence des colonnes capillaires, il n'a pas de support introduit dans la colonne. Ce type de colonne est abandonné au profit des colonnes capillaires afin de profiter de l'efficacité bien supérieure de ces dernières. Elles contiennent un support poreux, inerte physiquement et chimiquement, de très grande stabilité thermique, permettent le greffage ou l'imprégnation de la phase stationnaire. Pour obtenir une bonne efficacité, la surface du support doit être grande ce qui dépend de sa granulométrie et de sa porosité éventuelle.
Les sites actifs du support (groupements hydroxyles) entraînent trois types d'artéfacts sur les chromatogrammes:
traînées pour les composés polaires.
adsorption d'une certaine quantité des composés les plus polaires.
décomposition partielle de certains composés thermolabiles.
Il est souvent nécessaire de désactiver ce support avant emploi (par lavage acide, ou enrobage avec un agent de silylation afin de minimiser les effets d'adsorption sur le support solide et permettre au phénomène chromatographique de dépendre au maximum du partage entre la phase liquide retenue par ce support et le courant de gaz qui la traverse [6].
II.3.3.1.2- Les colonnes capillaires
Elles sont généralement en silice fondue de grande pureté, obtenue par combustion de tétrachlorosilane (SiCl4) dans une atmosphère de dioxygène. Le diamètre interne de ces colonnes varie de 0.1 à 0.53 mm (la précision est de quelques %), et la longueur entre 15 et 100 m. La technologie est particulièrement délicate pour obtenir des colonnes parfaitement cylindriques, dont la longueur peut aller jusqu’à 100 m pour une paroi d’environ 5 mm.
La phase stationnaire recouvre la paroi interne sur une épaisseur régulière pouvant aller de 0,05 à 5 µm. Elle est simplement déposée ou mieux greffée par des liaisons covalentes éventuellement suivie d’une polymérisation avec réticulation sur la paroi [4].
Ce type de colonne ne se prête qu’aux opérations de chromatographie gaz/liquide, elles sont plus résolutives que les autres mais plus difficiles à manipuler.
Les colonnes capillaires, se différencient entre elles par les caractéristiques de la phase stationnaire qui tapisse leur paroi interne, soit sous forme d’un film (WCOT (Wall Coated Open Tubular), soit
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sous forme de fines particules poreuses adhérentes (SCOT (Support Coated Open Tubular) ou PLOT (Porous Layer Open Tubular).
Les colonnes WCOT sont de simples capillaires recouverts d’une couche mince de la phase stationnaire. Dans les colonnes SCOT, la surface interne du capillaire est tapissée d’un film mince d’un matériau support. En général, l’efficacité d’une colonne SCOT est inférieure à celle d’une colonne WCOT, mais nettement supérieure à celle d’une colonne remplie [11].
Figure 4: Représentation schématique d’une colonne capillaire.
II.3.3.2- Le four
Il doit posséder une excellente stabilité thermique. L’homogénéité de la température est assurée par un système de diffusion sous le contrôle d’un organisateur de température permettant de définir les températures initiales et finales ainsi que les durées de chaque palier de température. Les analyses se font en mode isotherme ou en programmation de température [4].
II.3.4- Les phases stationnaires
La phase stationnaire est un liquide, ou un polymère réticulé, ou réparti en film, sur un support dans les colonnes remplies, ou sur la paroi interne d’une colonne capillaire.
Elle doit avoir une stabilité thermique, avoir une tension de vapeur faible et ne pas donner d’association irréversible avec l’un des solutés. Leur choix dépend de la température d’utilisation et
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de la polarité des substances à séparer, le succès d’une séparation en chromatographie en phase gazeuse dépend pour une grande part du choix de la phase stationnaire [8].
II.3.4.1- Choix des phases stationnaires
Il dépend essentiellement de la nature chimique des molécules à séparer. La rétention des substances étant la conséquence de leur interaction avec la phase stationnaire (liaison hydrogène, force de cohésion de Van der Waals, forces électrostatiques et inductives, etc.). Cette phase stationnaire doit donc se comporter comme un bon solvant vis-à- vis des molécules pour assurer leur fixation qui ne doit pas être irréversible pour que la migration chromatographique puisse se réaliser. La connaissance de la structure chimique des molécules à séparer et celles des phases stationnaires donne les possibilités de faire un choix préliminaire basé sur la polarité [11].
Toutes ces phases sont utilisables entre deux températures, l'une minimale au-dessous de laquelle les équilibres de concentrations sont trop lents à se faire, l’autre qui définit la limite supérieure d’utilisation sans dégradation, qui dépend de la nature et de l’épaisseur du film [5].
Pour les colonnes remplies, maintenant en voie d’abandon, la technique d’imprégnation, et de mise en œuvre est très simple. Les qualités exigées d’une phase stationnaire liquide sont les suivantes :
être stable à la température d’utilisation,
ne pas être volatile,
être inerte vis à vis de l’échantillon,
être un solvant sélectif pour les différents constituants de l’échantillon,
être soluble dans les solvants usuels [6].
Le choix de la phase stationnaire se fait en fonction de sa sélectivité vis -à-vis de l’échantillon, c’est-à-dire en fonction des forces qui s’exercent entre molécules de solutés et de phase stationnaire.
Il existe un grand nombre de phases stationnaires, mais on peut par simplification, envisager quatre groupes.
II.3.4.1.1- Polyester de glycols
L’estérification des glycols par des diacides à chaînes courtes tels les acides succinique, adipique, constitue des polymères utilisés comme phases stationnaires polaires. Ces phases permettent de séparer des composés polaires comme les dérivés carboxyliques, les amides et les esters.
14 II.3.4.1.2- Polyéthers de glycols
Ce sont des dérivés de glycols : polyéthylène glycols (PEG, Carbowax)
Carbowax 20M T= 65 à 250 °C Poly éthylène glycol 50 à 200 °C
Ces phases stationnaires possèdent de nombreux oxygène sont classées parmi les phases stationnaires les plus polaires et sont utilisées pour séparer les molécules de forte polarité comme celles possèdent des fonctions alcool, aldéhyde ou cétone.
La température d'utilisation de chaque phase est compagne de nature des substances à séparés.
II.3.4.1.3- Les silicones
Ils répondent à la formule générale:
Utilisable jusqu'à 375 °C avec:
50 % cyanopropyl- 50 % phénylmethylpolysiloxane (polaire) (OV225). La température maximum d’utilisation est 300 °C.
50 % trifluoropropyl- 50 % méthylpolysiloxane (polaire intermédiaire) (OV17). La température maximum d’utilisation est 250 °C.
5 % méthylphénylpolysiloxane (légèrement polaire) (DB5). La température maximum d’utilisation est 350 °C.
polydiméthylsiloxane (apolaire) (SE-30, OV1, OV101). La température maximum d’utilisation est 300 °C- 350 °C.
OV225, OV17, DB5, SE-30, OV1, OV101 sont designation de phases stationnaires.
II.3.4.1.4- Les carbures saturés
Les carbures saturés de formule générale CnH2n+2 comme le squalane ou différent autre paraffines (Apiezone) sont utilisés comme phase stationnaire apolaire. Ils séparent les composés non ou peu polaires qui dans une même série sortent dans l’ordre croissant de leur point d’ébullition. [11].
Le tableau suivant résumé les différentes phases stationnaires utilisables.
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Tableau1: Exemples de phases stationnaires liquides utilisées en CPG
Nature de la phase stationnaire liquide
Température d'utilisation
Nature des substances séparées
Hydrocarbure (n-octadécéne) 0 à 40 °C Hydrocarbures volatils Hydrocarbure (squalane) 0 à 150 °C Hydrocarbures volatils
Silicone (huile ou graisse) 0 à 250 °C Hydrocarbure à nombre élevé de carbone, stéroïdes, esters d'acide gras à longue chaine
pesticides
Polyester (exp.diméthyl phtalate) 30 à 130 °C Carbure aromatique ou paraffinique à longue chaine, ester d'acides gras à longue chaine Polyéthylène glycol 50 à 200 °C Alcools, aldéhydes, cétones, ester d'acide gras Polyalcool (Exe. Polyéthylène
glycol)
0 à 200 °C Alcool
Polyamides 0 à 350 °C Amines
Diméthylsiloxane (non polaire):SE 30, OV1
280 à 320 °C Solvants, Produits pétroliers, Esters d'acide gras
OV17 250 à 280 °C Produits actifs, Produits chlorés, Phénoles Carbowax PEG 20M, BP-20, BP-
wax
200 à 240 °C Esters d'acide gras
II.3.5- Les détecteurs
Les détecteurs sont placés immédiatement à la sortie de la colonne et sont traversés par la phase mobile contenant éventuellement les solutés. Certains détecteurs sont universels, (sensibles à la majorité des composes élués), d’autres sont beaucoup plus spécifiques à un type de molécule. On peut répartir les détecteurs en deux groupes. Ceux qui conduisent aux seuls temps de rétention, et ceux qui donnent en plus des informations structurales sur les composés détectés. Tous les
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détecteurs donnent une réponse qui dépend, soit de la concentration molaire, soit de la concentration massique du soluté dans la phase stationnaire [6].
II.3.5.1- Caractéristique du détecteur idéal
Le détecteur idéal doit présenter les caractéristiques suivantes: sensibilité appropriée (en général, les sensibilités des détecteurs actuels sont comprises entre 10-8 et 10-15 g/s), bonne stabilité et bonne reproductibilité; réponse linéaire qui s'étend sur plusieurs puissances de dix, domaine de température de fonctionnement compris entre la température ambiante et au moins 400 °C, temps de réponse rapide qui soit indépendant de la vitesse d'écoulement, réponse uniforme à tous les solutés ou, au contraire, réponse sélective limitée à une ou plusieurs classes de solutés [10].
II.3.5.2- Différents type de détecteurs en CPG
En CPG, on trouve les détecteurs suivants: Détecteur à conductibilité thermique (TCD), détecteur à ionisation de flamme (FID), détecteur thermo-ionique (NPD) (c'est un détecteur concernant nitrogène et phosphore), détecteur à capture d’électrons (ECD), et détecteur à photo- ionisation (PID).
Détection par spectrométrie de masse GC-MS
Les appareils GC-MS ont été utilisés pour identifier certains des composés présents dans les systèmes naturels et biologiques, par exemple, ces techniques ont permis de caractériser et identifier de nombreux polluants de l’eau, et l’étude des métabolites de nombreux médicaments.
Figure 5: Schéma du couplage d’un chromatographe à tube capillaire à un spectromètre de masse III- Préparation et traitement de l’échantillon avant injection en CPG
La CPG est une méthode sensible, utilisant de très faibles volumes d’échantillon et permettant de mesurer des concentrations de l’ordre du nano et du picogramme. Le traitement de l’échantillon varie selon la nature du produit à analyser.
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La substance est directement volatilisable à la température du chromatographe. Un solvant organique convenable permet d’extraire les molécules à séparer et sert à leur injection dans la colonne. Si l’échantillon est gazeux, le transfert de l’échantillon dans la colonne s’effectue avec une seringue spéciale étanche aux gaz.
La substance peut, se dégrader plus ou moins complètement à la température du chromatographe. Il faut, au préalable à la chromatographie, transformer ces molécules en dérivés volatiles stables à haute température.
III.1- Les réactions de dérivatisation
Il est parfois nécessaire de recourir à la transformation de certaines substances afin d’obtenir des dérivés séparables plus facilement. Ce procédé est utilisé dans plusieurs cas: pour modifier la polarité des composés trop polaires, pour augmenter la volatilité des molécules, pour différencier deux ou plusieurs molécules dont les masses moléculaires, à l’état libre, sont très voisines mais qui, souvent, différent par le nombre des fonctions qui peut être substituées ou trouvées sur la molécule, et pour améliorer la sensibilité de la détection.
La dérivatisation des composants d’un échantillon consiste en l’adjonction d’un radical apolaire (conférant à la molécule une plus grande volatilité), en remplacement d’une fonction chimique plutôt polaire (hydroxyle, aldéhyde ou carboxyle…). De plus, cette dérivatisation à souvent comme autre avantage, de stabiliser les molécules dérivées au choc thermique qu’elles vont subir lors de l’injection dans la colonne.
III.1.1- Les réactions de silylation
La silylation est un processus au cours duquel un atome d’hydrogène actif (-OH, -NH2,- NHR, -SH) est remplacé dans une molécule par un groupement trialkylsilyl. Le plus courant est un groupement triméthyle silice (TMS). Les éthers ou esters de trimethylsilyl obtenus remplacent les fonctions de type hydroxyle ou carboxyle. Ces dérivés augmentent la volatilité, la stabilité thermique et la symétrie en chromatographie gazeuse du composé parent.
III.1.2- Les réactions d’alcoylation
L’alcoylation remplace un hydrogène actif (mobile) par un radical alcoyle et transforme les alcools en éthers. Le remplacement d’hydrogène mobile par des radicaux méthyles, éthyle, propyle ou butyle est largement utilisé.
III.1.3- Les réactions d’estérification
Un cas particulier important est la méthylation qui peut être réalisée par différent réactifs, le diazom-éthane en milieu éthéré, estérifie rapidement les fonctions acides libres sous forme d’ester
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méthylique. La méthylation est instantanée et réalisée au moment même de la vaporisation du mélange dans l’injecteur.
III.1.4- Les réactions de transesterification
La transesterification par une solution méthanolique d’hydroxyde de (m- trifluorométhylphényl) en ester méthylique n’implique qu’une seule étape et à température ambiante (elle est plus rapide que la réaction au méthoxyde de sodium en solution méthalonique).
Cette réaction quantitative ne requiert pas d’extraction ou de transformation supplémentaire avant l’analyse CPG.
III.1.5- Les réactions d’acylation
L’acylation correspond à la réaction d’un groupement acyle (R-C=O) sur des alcools ou des amines en les transformant respectivement en esters ou amides. L'acylation des fonctions chimiques à hydrogène mobile est obtenue par un large choix de réactifs. L’anhydride acétique/pyridine est utilisé pour l’acétylation de groupements hydroxyles alcooliques et phénoliques et des groupements amines primaires et secondaires [6].
IV- La spectrométrie de masse (SM)
Aujourd’hui de nombreux laboratoires de chimie analytique sont équipés de spectromètres de masse couplés à un chromatographe en phase liquide ou gazeuse (LC/MS). Ces appareils trouvent des applications dans des domaines aussi variés que l’industrie agroalimentaire, l’environnement, la médecine, la pharmacologie ou le contrôle antidopage.
IV.1- Définition
La spectrométrie de masse est une méthode physico-chimique permettant d’identifier un principe. C’est une méthode de mesure des rapports masse/charge (m/z) des molécules individuelles et ionisées et de leurs produits de fragmentation. Pour cela, le spectromètre de masse doit assurer les opérations suivantes:
Volatiliser: les molécules en les faisant passer de l’état de matière condensée à un état gazeux.
Ioniser: Transformer les molécules en ions, grâce à des champs électriques.
Mesurer les rapports m/z: La masse moléculaire est calculée à partir du rapport masse (m)/
nombre de charges (z) [12].
IV.2- Principe de la SM
Le spectrographe de masse consiste à ioniser une molécule. Celle-ci va donc donner une entité ayant perdu un électron. Elle va pouvoir se scinder en plusieurs groupements plus petits
![[PDF] Documentation de cours d'initiation à la programmation web | Cours Informatique](data:image/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAP///wAAACH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAICRAEAOw==)