IV Conclusion et Perspectives
Au cours de ce travail de doctorat, nous avons mené une étude à grande échelle sur l’expression génique de différentes tumeurs thyroïdiennes, les adénomes autonomes hyperfonctionnels et les carcinomes papillaires par la technique des microarrays et tenté de relier ces profils d’expression à la physiopathologie de ces tumeurs. Nous avons également recherché l’expression d’une signature d’expression génique permettant de distinguer d’une part, les carcinomes papillaires sporadiques et ceux issus de la région de Tchernobyl et d’autre part, les carcinomes papillaires et les adénomes autonomes hyperfonctionnels. Nos données montrent que les PTCs sporadiques et post-Tchernobyl ne peuvent pas être différenciés sur base d’un clustering hiérarchique comportant 2400 cDNA. De même, la comparaison entre l’expression génique des mélanges de plusieurs PTCs sporadiques et post-Tchernobyl indique une corrélation considérable. Nos résultats suggèrent donc une absence d’empreinte génique liée aux radiations dans les PTCs post-Tchernobyl malgré leurs différences dans les altérations géniques à l’origine de la tumeur (B-Raf, RET/PTC1, RET/PTC3). Ceci signifierait que l’événement initiateur de la tumeur, impliquant des protéines dans la même voie de signalisation (la voie des MAPKs), n’influencerait pas significativement le phénotype final de ces cancers papillaires. Ces résultats ont été confirmés par une étude ultérieure réalisée sur un nombre de gènes et de tumeurs plus important, à savoir que globalement, les phénotypes moléculaires des PTCs sporadiques et post-Tchernobyl ne peuvent être distingués (Detours et al., soumis). Plusieurs études ont en effet suggéré que les PTCs induits par des altérations génétiques différentes (c’est à dire impliquant B-Raf, Ras et RET/PTC) avaient un profil d’expression génique différent et seraient également associés à certaines caractéristiques histologiques, cliniques et biologiques distinctes.
Etonnamment, les carcinomes folliculaires (FTC), plus agressifs que les PTCs, sont principalement induits suite à des mutations de Ras, se trouvant en aval de la cascade induite par RET/PTC (figure IV.1.). Ras est capable d’induire d’autres voies que celle des MAPKs, notamment la voie PI3K/AKT (importante dans la croissance cellulaire et l’inhibition de l’apoptose dans la thyroïde). RET/PTC, en amont de Ras, devrait donc également être capable d’induire la voie PI3K, bien que l’expression d’AKT2 soit diminuée dans les PTCs selon nos données. On peut se poser la question et savoir pourquoi une activation constitutive de RET/PTC, et pas celle de Ras en aval, active la voie des MAPKs. Récemment, il a été montré que l’internalisation de RET est nécessaire pour une activation complète de la voie ERK1/2, mais pas pour l’activation d’AKT (Richardson et al., 2006). Ceci suggère que ces deux voies pourraient être activées de manières différentes par Ras. Il est possible que Sos (une RasGEF) (et/ou une autre protéine liée) active préférentiellement la voie Ras-BRaf-MAPK et que Ras mutée et constitutivement active n’ait plus besoin de Sos pour être activée. Dans ce cas, Sos ne peut plus forcer l’activation de la voie Ras-BRaf-MAPK. Ras pourrait alors lier préférentiellement la p110 (sous-unité catalytique de la PI3K). Un reploiement conformationnel différent de Ras suite à la mutation pourrait également être à l’origine de l’activation différente des deux voies. Alternativement, on pourrait imaginer que Ras active d’avantage la cascade de la PI3K que celle des MAPKs dans les FTCs et inversement dans les PTCs. Donc, si la voie des MAPKs mène à la formation de PTCs, il se pourrait que les FTCs surviennent principalement suite à l’activation de la voie PI3K, expliquant les différences entre ces deux cancers. Cette hypothèse a également été formulée récemment, suite à la découverte de mutations dans la voie PI3K principalement dans les carcinomes les plus agressifs, les FTCs et les ATCs, ainsi que de mutations BRaf, impliquées dans la voie des MAPKs, uniquement dans les PTCs et ATCs (figure IV.2.) (Hou et al., 2007). De plus, une surexpression d’AKT2 est observée dans les FTCs et non dans les PTCs (Ringel, 2001). Il a été décrit qu’AKT pouvait inactiver la protéine Raf par phosphorylation (McCubrey et al., 2006). Il serait donc possible qu’une surexpression d’AKT2 dans les FTCs inhiberait la voie
des MAPKs. Une mutation activatrice de B-Raf peut uniquement activer la voie des MAPKs car BRaf n’est pas impliquée dans la voie de la PI3K. Il est évident que ces explications a posteriori devraient être validées expérimentalement.
L’analyse du clustering hiérarchique obtenu sur les données microarray dans les adénomes autonomes nous a permis de confirmer l’homogénéité de ces tumeurs bénignes. Les tumeurs les plus hyperactives, et donc exprimant le plus fortement le gène NIS, codant pour le symporteur d’iodure, sont les plus semblables au niveau de l’expression génique. Ceci explique le regroupement de ces tumeurs dans le clustering hiérarchique. Les tumeurs les plus éloignées sont celles ne montrant pas de différences d’expression de NIS, comme par exemple les tumeurs traitées au méthimazole, inhibant la synthèse des hormones thyroïdiennes et donc stimulant la sécrétion de TSH et rétablissant la stimulation du tissu contrôle.
La comparaison des clusterings hiérarchiques des deux pathologies thyroïdiennes étudiées (PTCs et AAs) nous montre une séparation nette de ces deux types de tumeurs. Une comparaison plus approfondie nous a également permis d’identifier une signature de six gènes permettant de distinguer ces deux pathologies au niveau de leur expression génique. Trois d’entre eux (ANXA1, clu et timp1) sont surexprimés dans les carcinomes papillaires et diminués (ANXA1, clu) dans les adénomes autonomes ou non régulés (timp1). Les trois autres (FcGBP, CKB et MT1X) sont diminués dans les carcinomes papillaires et augmentés dans les adénomes autonomes. Les protéines codées pour ceux-ci sont spécifiques à la fonction thyroïdienne et reflètent donc en partie l’état de différenciation des thyrocytes. Leur surexpression dans les adénomes autonomes est donc compatible avec le caractère différencié et hyperactif de ces tumeurs.
L’étude immunohistochimique sur des tissus-arrays nous a permis de confirmer la diminution de CKB dans les carcinomes papillaires et d’ANXA1 dans les adénomes autonomes au niveau protéique, mais surtout d’identifier une augmentation de CKB spécifiquement dans les adénomes autonomes et d’ANXA1 spécifiquement dans les carcinomes papillaires.
L’augmentation n’est pourtant pas systématique dans toutes les tumeurs concernées, surtout pour la CKB dans les adénomes autonomes. Néanmoins, la pathologie de la plupart des adénomes atypiques a pu être précisée (7/8 adénomes) grâce à l’immunomarquage de ces deux protéines, ce qui suggère que l’étude simultanée de l’expression d’ANXA1 et de CKB peut aider à identifier la majorité des adénomes atypiques. Les données histologiques aident également dans la confirmation de la pathologie. Une étude plus extensive, sur un plus grand nombre de tumeurs, est cependant encore nécessaire pour confirmer ces données.
Les modifications d’expression génique des tumeurs étudiées par microarray et confirmées par RT-PCR en temps réel pour plusieurs gènes, nous ont permis de mieux comprendre la physiopathologie des tumeurs:
La physiopathologie des adénomes autonomes hyperfonctionnels:
Certaines caractéristiques avaient déjà été décrites précédemment comme l’hyperactivité, l’hypertrophie, la diminution de l’apoptose, l’augmentation de la prolifération et de la vascularisation, ou encore l’induction de phosphodiestérases par l’AMPc. Elles sont étayées et expliquées, au moins en partie, par le phénotype d’expression des mRNA. L’homogénéité de ces tumeurs, décrite précédemment, est probablement due à leurs mécanismes initiateurs communs, c’est-à-dire l’activation constitutive de la cascade de l’AMPc, qui en fin de compte
modifie peu l’expression génique. Ceci est en accord avec la dénomination de ‘tumeurs à déviation minimale’ qui leur est attribuée. Malgré le peu de gènes différentiellement exprimés, on observe un nombre plus important de gènes sous-exprimés. Ceci peut être expliqué par la diminution de la population de lymphocytes et/ou par une simplification de la transduction de signaux dans la cellule tumorale. Les caractéristiques nouvellement identifiées des adénomes autonomes sont principalement le changement de population cellulaire dans ces tumeurs, l’augmentation de l’expression de la N-cadhérine et d’autres protéines impliquées dans l’adhésion cellule-cellule, la diminution d’expression de la cavéoline1 et de protéines du cytosquelette ainsi que l’altération de l’adhésion cellule-matrice. Le changement de population cellulaire consiste en une diminution du taux de lymphocytes et de cellules sanguines et une augmentation de la quantité de cellules endothéliales et donc de la vascularisation. Cette vascularisation accrue concorde avec l’augmentation de N-cadhérine qui serait impliquée dans l’adhésion des thyrocytes aux cellules endothéliales. Elle se traduit par une augmentation du flux sanguin dans les adénomes détectée par les techniques échographiques. L’augmentation de l’expression de la N-cadhérine, ainsi que la diminution de celle de la cavéoline1 dans ces tumeurs bénignes, nuancent leur désignation respectivement comme marqueur de malignité et comme suppresseur de tumeur. Ce seraient des facteurs permissifs mais non suffisants. Des altérations supplémentaires seraient donc recquises pour induire l’invasion cellulaire dans les tumeurs.
In vitro, dans les thyrocytes humains normaux en culture primaire, la stimulation de la cascade de l’AMPc par la TSH induit la prolifération cellulaire et en même temps stimule la synthèse de protéines impliquées dans l’inhibition de cette cascade : RGS2, DUSP5, DUSP2, JunB, CREM, PDE,… Ce système de rétrocontrôles négatifs assure un arrêt rapide de la prolifération en cas de stimulation prolongée. Dans les adénomes autonomes, l’expression de ces protéines est diminuée ou non régulée. La suppression de ces rétrocontrôles négatifs couplée à la stimulation constitutive de la cascade AMPc permettrait alors le développement de ces tumeurs.
La physiopathologie des carcinomes papillaires
Si on compare la physiopathologie des carcinomes papillaires avec celle des adénomes autonomes, on remarque certaines similitudes comme l’augmentation de la prolifération et de l’angiogénèse, des caractéristiques propres aux tumeurs en général.
Comme pour les adénomes autonomes, on observe ici également un changement dans la population cellulaire, ainsi traduit par une augmentation du nombre de cellules endothéliales probablement due au phénomène de vascularisation, une diminution du nombre de cellules sanguines résultant probablement d’une perte sanguine pendant l’opération et, contrairement aux adénomes autonomes, une augmentation du nombre de cellules inflammatoires, déjà observée dans les PTCs et dans d’autres tumeurs malignes. Cette augmentation peut être la conséquence de l’expression nouvelle d’antigènes de surface dans les cellules tumorales et de chimiokines pouvant attirer les cellules inflammatoires dans le tissu tumoral.
Enfin, on observe également une diminution généralisée de l’expression des ‘immediate early genes’, comme dans les adénomes autonomes. Ces gènes ont une expression biphasique dans les thyrocytes en culture stimulés par la TSH (van Staveren et al., 2006) et l’EGF (Hébrant, 2006, soumis) où l’on détecte d’abord une augmentation de leur expression suivie d’une diminution, suggérant leur rôle dans l’initiation des tumeurs mais pas dans leur progression.
Caractéristiques uniques aux tumeurs malignes
Deux phénomènes majeurs que l’on ne retrouve pas dans nos tumeurs bénignes sont la capacité d’envahir les cellules voisines, en accord avec un remodelage de la matrice extracellulaire et du cytosquelette, et la dédifférenciation cellulaire reflétée notamment par la diminution de gènes ‘thyroïde-spécifiques’. Une diminution de gènes impliqués dans l’adhésion cellulaire peut aboutir à une perte de contact entre les cellules, favorisant leur capacité à métastasier. Leur augmentation peut, par contre, mener à une modification du comportement cellulaire (au niveau signalétique ou celui du cytosquelette, un changement de ce dernier pouvant aider à la migration cellulaire de cellules tumorales ou endothéliales), mais elle peut également attirer d’autres cellules, comme les cellules inflammatoires, ou aider à la formation des néovaisseaux (ex : CDH2). L’augmentation du nombre de cellules inflammatoires contribue également à cette invasivité accrue. Afin que les cellules tumorales puissent quitter la tumeur primaire et envahir d’autres tissus et que les vaisseaux existants puissent atteindre la tumeur pour l’irriguer plus facilement, il faut impérativement traverser la matrice extracellulaire et donc la dégrader et la remodeler. Pour cela, l’expression de récepteurs de surface, de protéases activatrices ou inhibitrices et le changement d’expression des composants matriciels sont nécessaires, déterminant le comportement des cellules tumorales.
On retrouve également des changements au niveau métabolique. Globalement, on observe une augmentation de la lipogénèse, produisant des réserves d’énergie et de composants membranaires (cholestérol et phospholipides) utiles pour des cellules en prolifération.
L’importation de triglycérides est probablement également augmentée. L’augmentation de sphingolipides peut par ailleurs altérer la signalisation cellulaire, la différenciation, la prolifération et l’adhésion cellulaire, modifiant le comportement des cellules cancéreuses.
L’augmentation de leukotriènes (médiateurs fonctionnels), produits à partir des acides gras, pourrait également contribuer à ce changement de comportement. Une augmentation globale de la production énergétique est également observée.
L’augmentation de l’annexine A1, limitée aux carcinomes papillaires, est une découverte intéressante. Son rôle dans ces tumeurs pourrait concerner la protection des composants cellulaires, grâce à la présence d’une séquence HSP potentielle, d’une activité chaperone et de sa capacité à lier beaucoup de protéines différentes. Il est possible que cette protection, absente dans les carcinomes thyroïdiens plus agressifs, permette aux PTCs de maintenir l’intégrité du génome, en minimisant la formation de nouvelles mutations et parallèlement la progression vers un état plus agressif. La perte d’expression d’ANXA1 dans les carcinomes anaplasiques et folliculaires pourrait éventuellement être responsable de la disparition de la protection contre cette instabilité génomique. L’annexine A1 pourrait éventuellement aussi être responsable de la morphologie spécifique des PTCs suite à ses interactions avec le cytosquelette.
Enfin, nous pouvons dire que la cascade des MAPKs semble étroitement contrôlée dans les PTCs grâce à un jeu de phosphorylations et de déphosphorylations activatrices ou inhibitrices de la cascade. Cette régulation permet un contrôle plus fin du comportement mitogène de la cellule cancéreuse. Cette régulation et le changement d’expression génique observé, sont également reflétés dans l’expression accrue de plusieurs facteurs de transcription.
Perspectives
Nous avons donc effectué une étude menant à une meilleure compréhension de deux pathologies thyroïdiennes (les adénomes autonomes hyperfonctionnels bénins et les carcinomes papillaires malins). Il reste malgré tout encore beaucoup de choses à découvrir. En effet, tous les gènes n’ont pas été étudiés et toutes les caractéristiques physiopathologiques spécifiques aux tumeurs n’ont pas été identifiées. Dans le laboratoire, nous recherchons encore d’autres caractéristiques physiopathologiques liés aux PTCs, ainsi qu’une signature permettant de distinguer leurs différents sous-types. L’étude s’est également étendue à d’autres pathologies thyroïdiennes comme les FTCs, les ATCs ou les adénomes folliculaires, dans le but de mieux les comprendre et de mieux pouvoir les distinguer au niveau génique et protéique par la découverte de marqueurs spécifiques. Mis à part la comparaison des PTCs et des AAs (adénomes autonomes) avec d’autres pathologies thyroïdiennes, la recherche peut également s’élargir par la comparaison avec des modèles in vitro. Dans le laboratoire nous avons étudié l’expression génique de cellules en culture stimulées par la TSH et l’EGF/sérum, comme modèle respectivement des adénomes autonomes et des carcinomes papillaires, pour les comparer aux pathologies correspondantes in vivo. Des lignées cellulaires tumorales dérivées de tumeurs thyroïdiennes sont également disponibles et pourraient être utilisées comme modèles expérimentaux pour la thérapeutique.
Le projet d’article sur l’étude immunohistochimique doit être complété. Il nous reste encore à confirmer la présence de l’annexine A1 et de la créatine kinase B dans les noyaux par Western blot. Nous étendrons également la recherche par immunohistochimie à un plus grand nombre de carcinomes folliculaires et d’adénomes folliculaires, toxiques et atypiques. Nous comparerons aussi nos données immunohistochimiques sur des TMA correspondants étudiés avec 4 marqueurs spécifiques utilisés pour le diagnostic de cancer (LGALS3, TPO, HBME-1 et CK-19) et ferons une étude statistique plus approfondie sur toutes ces données. Il est également prévu de comparer certains échantillons, dont on a des données microarray, RT- PCR et immunohistochimiques, au cas par cas afin de vérifier leur fiabilité et de voir éventuellement une différence entre l’expression génique et protéique. Étant donné que la voie ERK1/2 est constitutivement activée dans les carcinomes papillaires, il serait intéressant de vérifier si l’annexine A1 est induite par cette voie (stimulation de cellules thyroïdiennes en culture par l’EGF/serum). Les perspectives à long terme seraient de déterminer la fonction exacte de l’annexine A1 dans les carcinomes papillaires.
V. Annexes
Annexe 1 : Matériel et Méthodes
1.1. Solutions :
Electrophorèse
- RNA Loading buffer : TBE 2x pH8.3 Ficoll 13%
Bleu de bromophénol 0.01%
Urée 7M - TBE 1x: Tris-Borate 0.09M
EDTA 0.002M - TAE 1x: Tris-Acetate 10mM
EDTA 1mM - Bleu stop: Ficoll 200mg/ml
Bleu de bromophénol 0.5mM EDTA 33.33mM pH7.5 Extraction de protéines
- Tampon de lyse (Laëmmli 1x) : Tris-HCl 0.06M pH9.5 SDS (2%)
DTT 100mM Glycérol 10%
- Inhibiteurs de phosphatases : Vanadate 100mM pH10 NaF 0.5M
- Inhibiteurs de protéases : Pefabloc 60mg/ml Leupeptine 0.5mg/ml - Solution standard pour dosage protéique : BSA 20mg/ml - Solution de coloration : 0.5% de bleu de Coomassie G
7% d’acide acétique 99-100%
- Solution de décoloration : 7% acide acétique 99-100%
- Solution d’extraction : méthanol 66%
NH4OH 1%
Western blotting
- Gel de séparation : 8-12% polyacrylamide (Acrylamide/Bis 30% de Bio Rad) Tris-HCl 375mM pH8.8
SDS 0.1%
APS (persulphate d’ammonium) 0.05%
Temed (tétraméthyléthylènediamine) 0.05%
- Gel de concentration : polyacrylamide (Bio Rad) 4%
Tris-HCl 125mM pH6.8 SDS 0.1%
APS 0.05%
Temed 0.2%
- Tampon de lyse (Laëmmli 1x) : Tris-HCl 0.06M pH9.5 SDS (2%)
DTT 100mM Glycérol 10%
Bleu de bromophénol 0.1%
- Tampon d’électrophorèse 1x : Tris 25mM Glycine 192mM SDS 0.1%
- Tampon de transfert : Tris 20mM Glycine 154mM Méthanol 20%
- PBS 1x : NaCl 150mM KH2PO4 2mM Na2HPO4 8mM KCL 3mM pH7.4 - TBST : Tris 50mM
NaCl 150mM
Tween20 0.1% pH7.5 Tissu microarray:
- TBS-TC : Tris 20mM NaCl 50mM Tween20 0.05%
casein bovin, 0.5% pH 7.2
Anticorps :
- anti-cav1 (western blot) : anticorps polyclonal de lapin (BD Biosciences, CA, USA), dilution 1/5000
- anti-cav1 (tissu-array) : anticorps polyclonal de lapin (N-20, sc-894 ; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), dilution 1/400
- anti-CDH2 : anticorps monoclonale de souris (Zymed Laboratories Inc., CA, USA),
dilution 1/500 (western blot et tissu-array)
- anti-adaptine β : anticorps monoclonal de souris (BD Biosciences, CA, USA), dilution 1/2000
- anti-annexine A1 : anticorps monoclonal de souris (BD Biosciences, CA, USA), dilution 1/500
- anti-CKB : anticorps monoclonal de souris (21E10, Prof. Be Wieringa, département de Biologie Cellulaire, Université de Nimègue, Nimègue, Pays-Bas), dilution 1/400
- anti-FasN : anticorps monoclonale de souris (Swinnen, Gent), dilution 1/20
- anticorps secondaires : immunoglobulines anti-souris et anti-lapin couplées à la peroxidase de raifort
1.2. Méthodologie :
1.2.1. Extraction de l’ARN total
Les échantillons de cancers thyroïdiens sporadiques proviennent principalement de l’Hôpital Erasme ou de l’Hôpital Ambroise Paré à Paris (collaboration avec le Dr. Brigitte Franc). Ils ont été conservés à –80°C. Les tissus (100-200mg) ont été broyés en fine poudre à l’aide d’un mortier en présence d’azote liquide, puis homogénéisés à 4°C dans 1ml de Trizol (Invitrogen) à l’aide d’un homogéniseur teflon-verre. Les échantillons homogénéisés ont ensuite été incubés pendant 5 minutes à température ambiante. Après centifugation (10000g, pendant 10min à 4°C), 200µl de chloroforme ont été ajoutés au surnageant suivi d’une autre centrifugation (10000g, pendant 15min à 4°C), pour séparer la phase aqueuse contenant les ARN de la phase organique (phénol-chloroforme) inférieure. Les ARN ont été purifiés en déposant la phase aqueuse mélangée à 600µl d’éthanol 70% sur une membrane de silica-gel (RNeasy Mini Kit, Qiagen) sur laquelle les ARN se lient, et les contaminants ont été éliminés par des lavages successifs par centrifugation (8000g). L’éthanol permet la fixation des ARN sur la membrane. Les ARN ont été élués dans 30µl d’H2O. Leur quantité a été déterminée par dosage spectrophotométrique (Eppendorf BioPhotometer) et leur qualité évaluée après dénaturation des ARN dans du ‘RNA loading buffer’, et migration sur gel d’agarose ou sur le bioanalyseur d’Agilent. La présence des deux bandes d’ARN ribosomial (18S et 28S) intactes indique que l’ARN est de bonne qualité.
Dans le cas des cancers de Tchernobyl, les patients ont été opérés à l’Institute of Endocrinology and Metabolism de Kiev. Les cancers ainsi que du tissu collatéral ont été prélevés, gelés immédiatement à –80°C, puis étudiés au point de vue anatomo-pathologique à l’Université de Cambridge, où le diagnostic ukrainien a été confirmé. Une banque de tumeurs thyroïdiennes y a été créée par l’équipe de G. Thomas, avec qui nous collaborons, et qui centralise l’ensemble des données obtenues (http://nisctb.swan.ac.uk); les ARN y sont purifiés puis nous sont envoyés (collaboration avec les Dr. G. Thomas et E. D. Williams).
1.2.2. La technique des microarrays
Les puces à ADN sont généralement des lames de verre sur lesquelles des milliers d'ADNc sont déposés à l'aide d'un micropipetteur robotisé: chaque gène (de fonction connue ou inconnue) est représenté par un seul point sur la lame (figure I.18. p30). Plus d’information sur les gènes présents sur les lames VIB et PE est donnée dans la figure ci-contre (figure V.1.). 2,3 fmol de cDNA double brin est déposé sur les lames de verres. Chaque spot d’un diamètre de 230 microns représente un gène (densité des spots sur l’array = 740/cm2). Deux échantillons d'ARN (extraits au Trizol (Invitrogen), purifiés avec le kit RNeasy (Qiagen), quantité et qualité évaluées par spectrophotométrie et par gel électrophorèse), l'un issu d'une population cellulaire contrôle et l'autre de la population à étudier, ont été rétrotranscrits en ADNc, et marqués par des fluorophores différents (cyanine-5, rouge et cyanine-3, vert). Les deux échantillons ont ensuite été déposés simultanément sur le microarray de manière à s’hybrider avec les séquences complémentaires présentes sur la lame. Après incubation et lavage, l’intensité du signal lumineux a été mesurée aux deux longueurs d’ondes (532 nm et 635 nm) correspondant aux différents fluorophores (Cy-3 et Cy-5) à l’aide d’un microscope confocal. Pour les lames de la VIB, le scanner Generation III a été employé (Amersham Pharmacia Biotech) et l’analyse des images a été effectuée avec le programme ArrayVision
(Imaging Research, Inc. St. Catharines, Ontario, Canada). Les lames de PerkinElmer ont été analysées avec le scanner GMS418 et les programmes d’analyse Imagene (Biodiscovery, Inc) et ceux développés au laboratoire par nos informaticiens. L’intensité de chaque spot a été corrigée par rapport au bruit de fond. Le rapport des fluorescences rouge/vert a ainsi été déterminé pour chaque spot, et a permis de comparer les taux d'expression relatifs de chacun des gènes pour les deux échantillons de départ. Chaque gène a ainsi reçu une couleur verte, rouge, jaune ou noire, selon qu’il était respectivement sous-exprimé, surexprimé, exprimé de manière égale dans les deux conditions ou pas exprimé. Cette méthode de marquage qui consiste à incorporer directement les fluorophores lors de la rétrotranscription présente l’avantage d’être sensible, précise et hautement reproductible. Par contre, elle nécessite une quantité importante d’ARN de départ (80-100 µg d’ARN total), qu’il est rarement possible d’obtenir au départ de tissus tumoraux. Afin de palier à cet inconvénient, diverses méthodes alternatives consommant moins d’ARN ont été proposées.
Parmi celles-ci, citons la méthode d’amplification TSA (Tyramide Signal Amplification), développée par la firme PerkinElmer (figure V.2.). Cette méthode permet d’amplifier très largement le signal fluorescent, et ne nécessite que 1 µg d’ARN de départ. Cette méthode a été employée dans l’étude sur les lames à 2400 cDNA (déposés en double) venant de la firme PerkinElmer. Dans cette méthode la tyramide (un composant phénolique) couplée au fluorophore est activée par l’enzyme HRP (Horseradisch Peroxidase) attachée aux cDNA hybridés en présence d’une faible quantité de peroxyde d’hydrogène. Cette activation, forte et de courte durée, permet de réagir rapidement avec des régions protéiques environnantes riches en électrons. Le signal des différents fluorophores est ainsi amplifié localement et successivement. Pour l’hybridation des lames de la VIB et contenant 17000 cDNA (déposés en double), une amplification des ARN messagers a été effectuée préalablement par transcription in vitro (Puskas et al., 2005; Van Gelder et al., 1990) (figure V.3.).
Les protocoles de synthèse des cDNA, du marquage des fluorophores, de l’hybridation sur lames microarray, mais également l’information sur la détection et l’analyse des données sont décrits plus en détail dans le ‘Matériel et Méthodes’ des articles. L’article ‘Post-Chernobyl and sporadic PTC have the same phenotype’ décrit les protocoles concernant l’hybridation sur lame Micromax (Perkin-Elmer), ainsi que les classifications supervisées et non supervisées des données. La description de l’hybridation sur les lames de la VIB est reprise dans l’article
‘Gene expression in thyroid autonomous adenoma provides insight into their physiopathology’ ou celui de Puskas en 2002 (Puskas et al., 2005).
La comparaison des résultats issus de plusieurs expériences requiert le développement de méthodes d’analyse facilitant l’organisation et l’exploitation des données. La méthode de regroupement (ou ‘clustering’ en anglais) des gènes présentant des profils d’expression similaires dans les expériences analysées permet de visualiser les données. On peut également établir des groupes (‘clusters’) de gènes co-régulés dans les conditions étudiées sans préjuger de leur fonction. Il existe plusieurs méthodes de regroupement comme le regroupement hiérarchique, le ‘Multidimensional Scaling’ ou le ‘k-means clustering’. Le traitement informatique de nos données microarray a été effectué par des bioinformaticiens qualifiés.
Le programme ‘Treeview’ permet d’afficher les profils d’expression des gènes sous forme d’une ‘carte d’expression’ colorée. Chaque ligne représente un gène et chaque colonne une expérience (voir figures 1 articles ‘BR. J. CANCER’ et ‘Oncogene’). La valeur du logarithme du ratio d’expression est reportée en rouge lorsqu’elle est positive, et en vert lorsqu’elle est
négative. L’intensité de la couleur est proportionnelle à l’amplitude de la variation. Le dendrogramme reflète la similitude des échantillons et des gènes, ordonnés d’une manière hiérarchique. Les gènes/échantillons présentant les profils d’expression les plus proches sont groupés sous un nœud qui est ensuite lui-même comparé à un autre gène/patient ou un autre nœud (Eisen et al., 1998). Le dendrogramme forme une sorte d’embranchement où la longueur des branches représente la distance entre chaque nœud. Les gènes ou les patients les plus éloignés dans le dendrogramme sont donc les plus différents d’un point de vue expression. Les branches des arbres peuvent être permutées sans détruire la structure de la hiérarchie.
1.2.3. La RT-PCR en temps réel ou Taqman
La PCR est une amplification exponentielle d’un fragment d’ADN spécifique délimité par des amorces. La quantité de produit PCR obtenue à chaque moment est proportionnelle au nombre de copies initiales du fragment amplifié, sauf quand un ou plusieurs réactifs de la PCR sont épuisés et que l’on atteint un plateau où l’amplification est ralentie.
Dans la PCR quantitative, la quantification des échantillons se fait relativement à une référence. Si le nombre de molécules de la référence est connu, il est possible de déterminer la quantité absolue de chaque échantillon, dans le cas contraire on attribuera une valeur arbitraire à la référence et des valeurs relatives à cette référence pour les échantillons (PCR semi-quantitative).
Le mot ‘Taqman’ est dérivé des mots ‘Taq polymérase’ et ‘Pacman’ suite à la capacité de la Taq polymérase de dégrader les oligonucléotides par son activité exonucléase 5’→ 3’. Le Taqman est une PCR quantitative utilisant, entre les deux amorces, une sonde spécifique possédant deux fluorophores dont l’un est ‘quenché’ par la proximité de l’autre (figure V.4.).
Les séquences oligonucléotidiques des amorces et de la sonde ont été dessinées par le programme ‘Primer Express’ (Applied Biosystems, CA) (table V.1.). La dégradation de la sonde par la Taq polymérase à chaque cycle de PCR met fin à l’absorption de la fluorescence du raporteur (5’-FAM) par le quencheur (Dabcyl-3’) suite à leur éloignement. A chaque cycle de PCR, il est donc possible de mesurer une augmentation de fluorescence proportionnelle au nombre de copies, d’où le nom ‘PCR en temps réel’. Le ‘Sequence Detector System 7700’
(Perkin Elmer) est une machine PCR permettant d’effectuer des PCR sur 96 puits, de lire la fluorescence émanant des tubes suite à l’émission d’un signal lumineux de 480nm et d’enregistrer les données en temps réel. Etant donné que c’est la phase exponentielle qui est proportionnelle au nombre de copies initiales, seules les données concernant cette phase sont intéressantes. Le Ct (Threshold Cycle) représente le cycle où la courbe d’amplification de la PCR croise la barre de seuil, définie machinalement ou manuellement comme étant assez basse pour être dans la phase exponentielle de la courbe d’amplification et suffisamment élevée pour être au dessus du bruit de fond (figure V.5.). La différence de Ct de deux échantillons différents (ex : normal et tumoral) est proportionnelle au logarithme du rapport des quantités initiales (c’est-à-dire que la différence d’un Ct représente une amplification d’un facteur 2).
Les gènes de référence que nous avons employés pour la normalisation des données RT-PCR sont le PBGD (porphobilinogen deaminase) et CNAP1 (chromosome condensation-related SMC-associated protein 1). PBGD, impliqué dans la biosynthèse de l’hème, a été observé
dans le laboratoire comme ayant une expression similaire dans les adénomes autonomes et les tissus normaux adjacents et comme n’étant pas régulé par la TSH dans les thyrocytes en culture (Van Vooren, données non publiées). Quant au gène CNAP1, il sort non-régulé entre les différents tissus tumoraux et normaux en microarray sur les lames Micromax de Perkin- Elmer (2400 cDNA) et confirme les données normalisées avec PBGD.
Préalablement à la RT, nous avons traité l’ARN à la DNAse I (Life Technologies) (1µl par µg d’ARN) pour éliminer toute contamination par l’ADN génomique. Nous avons ensuite fait la reverse transcription en présence de Superscript II en suivant le protocole de la firme (Life Technologies) pour obtenir de l’ADN complémentaire (0.05µg cDNA/100µl). Les quantités requises pour chaque réaction PCR sont les suivantes : 300nM de chaque amorce, 100nM de sonde, 2µl de cDNA dilué 5x et 50% du volume final de mastermix contenant l’enzyme
‘hotstart’ activée après 10 min à 95°C (Eurogentec, Liège, Belgium). La machine effectue 40 cycles d’amplification et chaque cycle est composé d’une hybridation/élongation pendant 60s à 60°C et d’une dénaturation pendant 60s à 95°C. Pour calculer le niveau d’expression d’un gène dans le tissu tumoral comparé au tissu normal, il faut déterminer le Ct de ce gène, ainsi que le Ct du gène de référence, dans les deux tissus. Il est également nécessaire de déterminer l’efficacité de l’amplification pour chaque gène. L’efficacité est obtenue avec la formule suivante, après avoir calculé la pente de la droite résultant des Ct obtenus pour les différentes concentrations de cDNA engagées dans la réaction : E = 10(-1/pente).
Le ratio est calculé selon la methode de Pfaffl (Pfaffl, 2001)
= (Egène d’intérêt)∆CT gène d’intérêt (tissu normal - tissu tumoral)
(Egène de référence)∆CT gène de référence(tissu normal - tissu tumoral)
1.2.4. Les tissu-microarrays ou TMA
L’utilisation des tissu-microarrays permet l’étude simultanée d’un très grand nombre de tissus. Cette technique consiste à déposer une centaine de coupes tissulaires différentes d’environ 0,6 mm de diamètre et de 3 µm d’épaisseur espacées de 0,8 mm sur une même lame de verre silanisée et à les analyser simultanément au niveau de l’ADN et de l’ARN par hybridation in situ et au niveau protéique par immunohistochimie, à l’aide d’un anticorps spécifique dirigé contre la protéine d’intérêt (Kallioniemi et al., 2001; Kononen et al., 1998) (figure V.6.). La différence avec les microarrays traditionnels est que ceux-ci détectent des milliers de gènes simultanément dans un seul échantillon alors que les TMA permettent l’analyse de la distribution tissulaire d’une seule cible (gène, ARNm ou protéine) dans différents tissus (figure V.7.). L’avantage des TMA est que les différentes coupes de tissus sur une même lame sont traitées dans les mêmes conditions. Ceci permet d'éliminer les facteurs de variation classiques comme la variabilité inter-lame, la variabilité inter-coloration (bain, machine...) ou la variabilité inter-opérateur. La quantité de produits utilisés est considérablement réduite, ainsi que le temps nécessaire pour avoir cette quantité d’informations. Un autre avantage est que des tissus archivés dans des blocs de paraffine peuvent être employés pour la construction des TMA pour les études d’immunohistochimie, ce qui permet la récupération de matériel archivé. Théoriquement, il est possible de fabriquer 300 lames représentant des coupes successives, ce qui permet la comparaison de plusieurs anticorps différents sur des coupes histologiques virtuellement identiques (figure V.6.).
Les applications sont multiples et incluent l’analyse du nombre d’altérations moléculaires, de la progression tumorale, l’identification de facteurs pronostiques et prédictifs ou la validation de gènes ARNm ou protéines nouvellement identifiés.
Les TMA utilisés ont été fabriqués dans le laboratoire du professeur B. Franc (Hôpital Ambroise Paré, Paris) selon la technique de fabrication mise au point par Kononen et al. en 1998. Ces TMAs contiennent des coupes de tumeurs thyroïdiennes, principalement des carcinomes papillaires et des adénomes atypiques sur les lames (M38 et M25). Chaque tissu, tumoral et normal adjacent, est représenté en triple exemplaire sur la lame, ce qui permet de visualiser l’hétérogénéité des tissus et de s’assurer qu’au moins un exemplaire sera interprétable. Ceci correspond à 6 coupes par patient. D’autres lames contiennent des adénomes autonomes (M26) ou des carcinomes folliculaires (M33). Ces TMAs sont utilisés exclusivement pour la détection de protéines en immunohistochimie et le marquage est visualisé sous un microscope conventionnel.
1.2.4.1. L’immunohistochimie
Avant de procéder au marquage avec l’anticorps, les lames ont été déparaffinées dans des bains successifs de toluène (3x 10 min) et d’alcool absolu (3x 5 min) et réhydratées à l’eau courante. Afin de démasquer les sites antigéniques, les lames ont été prétraitées dans un bain- marie entre 90 et 95°C à un pH spécifique dépendant de l’anticorps pendant 40 minutes.
Plusieurs conditions de pH ont donc été testées : pH6, pH7 ou pH neutre. Les peroxydases endogènes, pouvant interférer avec les réactifs ultérieurs de détection, ont été bloquées pendant 10 minutes avec de l’H2O2 3 %. Les lames ont ensuite été rincées dans du PBS puis dans du TBS-TC et incubées avec différentes concentrations d’anticorps pendant 2 heures (les dilutions testées étaient généralement 1/50 ; 1/100 ; 1/200). Après rinçage dans du TBS-TC pendant 10 minutes, l’anticorps secondaire Dako Link (Dako LSAB2 kit, Envision system, Carpinteria, CA) a été appliqué sur la lame pendant 30 minutes, puis rincé dans du TBS-TC pendant 5 minutes. Un rinçage supplémentaire de 5 minutes dans du TBS-TC a été effectué suite à l’incubation pendant 30 minutes avec la streptavidine couplée à la peroxydase de raifort (Dako Label, LSAB2kit) qui lie l’anticorps secondaire pour permettre la visualisation de l’immunoréactivité. Cette visualisation a été faite, après rinçage de l’excès de streptavidine/peroxidase pendant 5 minutes dans du TBS-TC, avec du DAB (3,3'- diaminobenzidine) en présence de peroxyde d’hydrogène (H2O2) pendant 5-10 minutes dans l’obscurité. Les lames ont ensuite été rincées à l’eau distillée et contre-colorées dans de l’Hémalun de Mayer (hematoxyline) pendant 1-2 minutes. Avant montage, les lames ont été rincées 5 minutes à l’eau, puis passées à l’alcool et au toluène. Toutes ces étapes ont été effectuées à température ambiante.
1.2.5. Le Western blot
1.2.5.1. Extraction et dosage des protéines
Les tissus congelés ont été broyés et homogénéisés dans 200µl de tampon de lyse (tampon dénaturant Laëmmli) à l’aide d’un homogéniseur Teflon-verre, puis incubés à 100°C pendant 5 minutes avant d’être conservés sur glace. Le tampon de lyse contient des inhibiteurs de
protéases et de phosphatases (0.5M NaF, 100mM Vanadate pH10, 0.5mg/ml Leupeptine et 60mg/ml Pefabloc), ainsi que du SDS (2%) réduisant les ponts disulphures (voir solutions p62).
Le dosage des protéines a été effectué sur papier filtre Wattman n°1 où 4µl d’échantillon protéique ont été déposés sur des carrés de 1,5cm de côté. Parallèlement ont été déposés 4µl de tampon de lyse sur 8 carrés, représentant les blancs, et 8 solutions standards constituées de BSA (à raison de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 et 12 µg de protéines) pour l’obtention de la courbe étalon.
Après séchage et rinçage dans du méthanol pendant 30 secondes, le papier a à nouveau été séché et déposé dans une solution de coloration au bleu de Coomassie, se fixant aux liens peptidiques des protéines, pendant 30 minutes à température ambiante. Le papier a été décoloré dans une solution à base d’acide acétique (7%), 3 fois 30 minutes. Seules les protéines restent colorées. Après séchage, les carrés ont été découpés puis placés dans des tubes Eppendorf contenant 1 ml de solution d’extraction à base de méthanol (66%) et d’ammoniaque (1%) (voir solutions p62). Après 5 minutes d’incubation et d’agitation, 300µl de chaque échantillon ont été extraits et déposés dans une plaque multi-puits. La densité optique a été mesurée par spectrophotométrie à 620 nm à l’aide du ‘Titertek Multiscan MCC/340’ (IGN). Pour pouvoir déterminer le titrage protéique d’un échantillon dans la courbe étalon, les densités optiques des standards ont été mises en graphique en fonction de leur concentration respective.
1.2.5.2. Séparation des protéines par SDS-PAGE
La migration des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide permet leur séparation en fonction de leur taille et donc de leur poids moléculaire. Les protéines, chargées négativement, sont dénaturées et uniformément recouvertes de charges négatives en présence de SDS, un détergent anionique, leur donnant une densité de charge identique. Ceci permet une migration plus rapide des petits fragments. Pour remédier aux problèmes liés aux faibles quantités de protéines et aux volumes trop restreints déposés dans les puits, deux types de gels sont utilisés. Les échantillons (10 à 20 µg de protéines dans du tampon Laëmmli 1x et dénaturés pendant 10 minutes à 100°C) se concentrent dans le gel de concentration avant d’être séparés en fonction de leur taille dans le gel de séparation, différant en pH (pH=8.8, le gel de concentration étant à 6.8) et en concentration d’acrylamide (6 à 12% au lieu de 4%
pour le gel de concentration). Pour mieux visualiser la migration, le tampon Laëmmli est complété par du bleu de bromophénol. Il contient également du glycérol pour alourdir les échantillons et leur permettre de bien se déposer au fond des puits. Le marqueur de poids moléculaire employé est le ‘Precision Plus ProteinTM Dual Color Standards’ (Bio Rad). La migration électrophorétique a été effectuée dans un courant continu de 25mA par gel pendant 1 heure dans un tampon d’électrophorèse 1x.
1.2.5.3. Transfert des protéines
Les protéines ont été transférées du gel sur une membrane de nitrocellulose (Protran BA 79 Cellulose nitrate, Schleicher & Schuell). Un montage a été effectué prenant en sandwich le gel et la membrane entourés de papiers-filtres, imbibés de tampon de transfert (voir solutions p63) en évitant les bulles d’air et les plis pouvant interférer dans le transfert. Les protéines, toujours entourées de SDS, migrent de l'anode vers la cathode sous un champ électrique de 98V de part et d'autre du gel pendant 1 heure et demie (ou toute la nuit à 26V). Le méthanol
contenu dans la solution de transfert favorise l'adsorption des protéines sur la membrane chargée négativement et stabilise leur interaction en exposant les domaines hydrophobes de celles-ci par élimination du SDS.
1.2.5.4. Immunodétection
La membrane a été bloquée pendant 1 heure avec du TBST-5%lait pour éliminer le bruit de fond généré par la fixation de l'anticorps primaire sur des sites aspécifiques. La membrane a ensuite été incubée pendant 1-2 heures sous agitation avec l’anticorps primaire, qui interagit spécifiquement avec la protéine cible. Après un lavage de 3 fois 10 minutes avec une solution TBST sans le lait, on a ajouté l’anticorps secondaire couplé à l'enzyme HorseRadish Peroxidase (HRP) pendant 45 minutes. L'activité enzymatique de la HRP a été détectée par la méthode de chimiluminescence améliorée. La membrane a été lavée 3 fois 10 minutes avec du TBST avant d’être mise en présence de la solution ECL (Enhanced Chemiluminescence) pendant 1 minute, qui contient des sels de peroxyde et du luminol. Sous l’effet de la peroxydase (HRP) couplée à l’anticorps secondaire, le luminol est oxydé en présence d’H2O2. Le produit ainsi formé émet de la lumière au niveau de la bande protéique d’intérêt qui peut être détectée par autoradiographie.
Annexe 2 : Gènes différentiellement régulés dans les carcinomes papillaires (lames VIB)
Table III.3. Gènes surexprimés ou sous-exprimés dans les PTC selon les données microarray (VIB). Les gènes représentés ont un ratio (tumeur/normal) > 1.8 et une intensité > 25%, ou ont été confirmés dans d’autres études.
Fonction biologique Gènes surexprimés (intensité >
25% ; rapport d’expression T/N >
1,8x ou confirmés par d’autres études)
ratio Gènes sousexprimés (intensité >
25% ; rapport d’expression T/N >
1,8x ou confirmés par d’autres études)
ratio
Régulation de l'angiogénèse Positive
Négative
AMOT angiomotin
RUNX1 runt-related transcription factor 1 (acute myeloid leukemia 1; aml1 oncogene) S100A2 S100 calcium binding protein A2 THBS2 thrombospondin 2
1.8 2.6 2.1
1.9 NPR1 natriuretic peptide receptor A/guanylate cyclase A
(atrionatriuretic peptide receptor A) 1.7
Prolifération et Division cellulaire Stimulateurs
Inhibiteurs
MDK midkine (neurite growth-promoting factor 2) CCND2 cyclin D2
ANXA1 annexin A1
PTK2B PTK2B protein tyrosine kinase 2 beta Tacstd tumor-associated calcium signal transducer
QSCN6 quiescin Q6
CDKN1A cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1) RASA1 RAS p21 protein activator (GTPase activating protein)
2.3 1.8 2.2 1.9 6.3
1.8 2.2 1.9
BMP2 bone morphogenetic protein 2
TOB1 transducer of ERBB2, 1 1.9 1.6
Apoptose Pro-apoptose
Anti-apoptose
EMP3 epithelial membrane protein 3 BID BH3 interacting domain death agonist DAPK2 death-associated protein kinase 2
TNFSF13 tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 13
MAP3K5 mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5 STAT1 signal transducer and activator of transcription 1, 91kDa
PPP2R1A protein phosphatase 2 (formerly 2A), regulatory subunit A (PR 65), alpha isoform
TPD52L1 tumor protein D52-like 1
CLU clusterin (complement lysis inhibitor, SP-40,40, sulfated glycoprotein 2, testosterone-repressed prostate message 2, apolipoprotein J)
1.8 2.3 2.0 1.8 1.8 2.0 2.4 1.9
1.6
TNFRSF11B tumor necrosis factor receptor super- family, member 11b (osteoprotegerin)
BCL2 B-cell CLL/lymphoma 2 SFRP1 secreted frizzled-related protein 1
2.1 2.1
1.8 2.0
Transduction de signal Stimulateurs
Inhibiteurs
Facteurs de transcription
MUC1 mucin 1, transmembrane
TYROBP TYRO protein tyrosine kinase binding protein
NMB neuromedin B
ECM1 extracellular matrix protein 1 ADORA1 adenosine A1 receptor NELL2 NEL-like 2 (chicken) EPHA4 EphA4
MARCO macrophage receptor with collagenous structure APLP2 amyloid beta (A4) precursor-like protein 2 GRB7 growth factor receptor-bound protein 7 PASK PAS domain containing serine/threonine kinase PROS1 protein S (alpha)
TACSTD2 tumor-associated calcium signal transducer 2 PLAB prostate diferentiation factor
ABR active BCR-related gene ARNTL aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like
DUSP6 dual specificity phosphatase 6 DUSP5 dual specificity phosphatase 5
BHLHB2 basic helix-loop-helix domain contain- ing, class B, 2 (represseur)
TRAP240 thyroid hormone receptor-associated protein, 240 kDa subunit
2.3 1.9 2.8 4.5 2.5 3.7 1.9 2.1 1.8 1.9 1.7 4.8 6.3 5.8 1.9 2.3
3.6 2.9
2.1 1.8
ITPR1 inositol 1,4,5-triphosphate receptor, type 1 CTGF connective tissue growth factor EDN3 endothelin 3
KIT v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcomaviral oncogene homolog
IRS1 insulin receptor substrate 1 RAP1GAP RAP1 GTPase activating protein
TBC1D4 TBC1 domain family, member 4 DUSP1 dual specificity phosphatase 1 RGS16 regulator of G-protein signalling 16
ENPP1 ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase GNAI1 guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha inhibiting activity polypeptide 1
ID4 inhibitor of DNA binding 4, dominant negative helix-loop- 2.0 1.8 1.8 2.3 2.1 2.2 (PE)
1.9 2.8 2.3 1.8 1.9
TRIM22 tripartite motif-containing 22 PBX3 pre-B-cell leukemia transcription factor3 ELF3 E74-like factor 3 (ets domain transcription factor, epithelial-specific )
ETV5 ets variant gene 5 (ets-related molecule) CITED1 Cbp/p300-interacting transactivator, with Glu/Asp- rich carboxy-terminal domain, 1
RXRG retinoid X receptor, gamma TSC22 domain family
2.0 1.7 1.9 2.8 11.4 8.7 2.2 (PE)
helix protein (co-represseur)
FOSB FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog B FOS v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog EGR1 early growth response 1
EGR2 early growth response 2 (Krox-20 homolog, Drosophila) SRF serum response factor (c-fos serum response element- binding transcription factor)
NR4A1 nuclear receptor subfamily 4, group A, member 1 ATF3 activating transcription factor 3
2.2 3.2 2.2 1.6 2.4 1.8 1.7 1.5
Métabolisme
métabolisme du glucose
métabolisme des nucleotides biosynthèse
catabolisme
métabolisme du cholestérol et des lipides
RDH5 retinol dehydrogenase 5 (11-cis and 9-cis) CYP1B1 cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1
CHST2 carbohydrate (N-acetylglucosamine-6-O) sulfotransferase 2
GALE UDP-galactose-4-epimerase ACO1 aconitase 1, soluble
IDH1 isocitrate dehydrogenase 1 (NADP+), soluble HK2 hexokinase 2
AK1 adenylate kinase 1
ENTPD1 ectonucleoside triphosphate diphospho-hydrolase 1 DPYSL3 dihydropyrimidinase-like 3
UP uridine phosphorylase
NT5E 5'-nucleotidase, ecto (CD73) NP nucleoside phosphorylase
DHCR7 7-dehydrocholesterol reductase (cholesterol biosynthesis)
LRP4 low density lipoprotein receptor-related protein 4 APOC1 apolipoprotein C-I
APOE apolipoprotein E LPL lipoprotein lipase
LDLR low density lipoprotein receptor (familial hypercholesterolemia)
PAPSS1 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 1 SFTPB surfactant, pulmonary-associated protein B PLD3 phospholipase D3 (lipid catabolism)
2.0 4.0 3.0
3.4 1.5 1.4 1.6 1.8 3.0 2.0 2.4
2.2 2.3
1.6 11.1 3.7 3.7 2.2 1.9 1.6 16.5 2.0
GATM glycine amidinotransferase (L-arginine:glycine amidinotransferase)
ADH1B alcohol dehydrogenase IB (class I), beta polypeptide HGD homogentisate 1,2-dioxygenase (homogentisate oxidase) CA4 carbonic anhydrase IV
ALDH1A1 aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1 CKB creatine kinase, Brain
PHYH phytanoyl-CoA hydroxylase (Refsum disease) VLDLR very low density lipoprotein receptor APOD apolipoprotein D
CRABP1 cellular retinoic acid binding protein 1
2.2 3.5 3.1 2.7 1.9 2.2
1.5 1.8 1.8 2.9
Adhésion cellulaire
Antigènes de surface
Composants matriciels et
extracellulaires
PLXNC1 plexin C1
CDH2 cadherin 2, type 1, N-cadherin (neuronal) NRCAM neuronal cell adhesion molecule ICAM1 intercellular adhesion molecule 1 (CD54), human rhinovirus receptor MFGE8 milk fat globule-EGF factor 8 protein SDR1 short-chain dehydrogenase/reductase 1 SDC3 syndecan 3 (N-syndecan) SDC4 syndecan 4 (amphiglycan, ryudocan)
CD44 CD44 antigen (homing function and Indian blood group system)
EVA1 epithelial V-like antigen 1
ITGA3 integrin, alpha 3 (antigen CD49C, alpha 3 subunit of VLA-3 receptor)
CD151 CD151 antigen CD163 CD163 antigen
DPP4 dipeptidylpeptidase 4 (CD26, adenosine deaminase complexing protein 2) FN1 Fibronectin 1
COL8A1 collagen, type VIII, alpha 1 COMP cartilage oligomeric matrix protein
(pseudoachondroplasia, epiphyseal dysplasia 1, multiple) TNC tenascin C (hexabrachion)
CSPG2 chondroitin sulfate proteoglycan 2 (versican)
3.3 3.6 1.9 1.7 2.6 2.2 1.8 4.9
1.6 3.2 2.2 1.8 1.7 6.1 15.5 2.8 2.7 2.9 2.4
SDC2 syndecan 2 (heparan sulfate proteoglycan 1, cell surface- associated, Fibroglycan)
CYR61 cysteine-rich, angiogenic inducer, 61 CDH16 cadherin 16, KSP-cadherin
DPT dermatopontin
1.8 2.9 2.3
3.4
Structure
Composants matriciels et
extracellulaires
Organisation cellulaire et biogénèse
COL1A1 collagen, type I, alpha 1 COL1A2 collagen, type I, alpha 2
CHI3L1 chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39) (catabolisme)
P4HA2 procollagen-proline, 2-oxoglutarate 4-dioxygenase (proline 4-hydroxylase), alpha polypeptide II
SPOCK2 sparc/osteonectin, cwcv and kazal-likedomains proteoglycan (testican) 2 (biosynthèse)
LGALS3 lectin, galactoside-binding, soluble, 3 (galectin 3)
CAPG capping protein (actin Filament), gelsolin-like KRT19 keratin 19
KRT17 keratin 17
DMD dystrophin (muscular dystrophy, Duchenne and Becker types)
3.0 2.6 16.1
3.4 2.8 3.7
1.7 4.9 1.8 2.6
FBLN1 Fibulin 1
COL9A3 collagen, type IX, alpha 3
FBLN5 Fibulin 5 MATN2 matrilin 2 FMOD Fibromodulin
EFEMP1 EGF-containing Fibulin-like extracellular matrix protein 1
FHL1 four and a half LIM domains 1 LMOD1 leiomodin 1 (smooth muscle) ARGBP2 Arg/Abl-interacting protein ArgBP2 ELMO1 engulfment and cell motility 1 (ced-12 homolog, C. elegans)
2.4 2.7
1.9 3.9 1.9 2.1
2.6 1.9 2.4 2.5
Protéases et inhibiteurs Protéases
CTSD cathepsin D (lysosomal aspartyl protease) PCSK2 proprotein convertase subtilisin/kexin type 2 PLAUR plasminogen activator, urokinase receptor SPUVE protease, serine, 23
Inhibiteurs de protéases
SPOCK sparc/osteonectin, cwcv and kazal-like domains proteoglycan (testican)
SERPINA1 serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 1 SLPI secretory leukocyte protease inhibitor (antileukoproteinase)
CST6 cystatin E/M
TIMP1 metallopeptidase inhibitor 1
1.9 3.2 2.3 4.2
2.0 6.6 4.3 4.7 2.4 (PE)
IQGAP2 IQ motif containing GTPase activating protein 2
p25 brain-specific protein p25 alpha
= TPPP tubulin polymerization promoting protein
1.7 2.1
Réponse inflammatoire IGSF1 immunoglobulin superfamily, member 1 BF B-factor, properdin
LY6E lymphocyte antigen 6 complex, locus E TRD@ T cell receptor delta locus CRLF1 cytokine receptor-like factor 1 IF I factor (complement)
C1QB complement component 1, q subcomponent, beta polypeptide
IFI30 interferon, gamma-inducible protein 30 SPP1 secreted phosphoprotein 1 (osteopontin,bone sialoprotein I, early T-lymphocyte activation 1) ALOX5 arachidonate 5-lipoxygenase IGSF3 immunoglobulin superfamily, member 3 FCGR3A Fc fragment of IgG, low a±nity IIIa, receptor for (CD16)
HLA-DPA1 major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1
CCL18 chemokine (C-C motif) ligand 18 (pulmonary and activation-regulated)
6.9 3.4 2.1 2.4 3.0 2.7 2.0 2.2 2.2 2.1 1.9 2.6 1.8 2.8
FCGBP Fc fragment of IgG binding protein
CCL14 chemokine (C-C motif) ligand 14 3.1 1.5
Varia
transport
transmembrannaire
différentiation
MRC1 mannose receptor, C type 1 MRC2 mannose receptor, C type 2 MVP major vault protein EGFL5 EGF-like-domain, multiple 5 AQP5 aquaporin 5
CBLN1 cerebellin 1 precursor
SGNE1 secretory granule, neuroendocrine protein 1 (7B2 protein)
FMR1 fragile X mental retardation 1 CTSH cathepsin H
GPX1 glutathione peroxidase 1 RTP801 HIF-1 responsive RTP801
ABCC3 ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP), member 3
KCNJ2 potassium inwardly-rectifying channel, subfamily J, member 2
ATP11A ATPase, Class VI, type 11A SLC1A5 solute carrier family 1 (neutral aminoacid transporter), member 5
SLC34A2 solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2
2.4 2.6 2.2 2.2 1.9 2.1 2.4 1.9 2.9 1.8 1.8
3.6 3.3 1.7 1.7
FGL2 Fibrinogen-like 2
LRRN3 leucine-rich repeat protein, neuronal 3 TFF3 trefoil factor 3 (intestinal)
NRLN1 likely ortholog of mouse neuralin 1 ITM2A integral membrane protein 2A X123 Friedreich ataxia region gene X123
DNAJB4 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B,member 4 DPP6 dipeptidylpeptidase 6
DSCR1 Down syndrome critical region gene 1 HBB hemoglobin, beta
HBD hemoglobin, delta
GSTM3 glutathione S-transferase M3 (brain) PIP3-E phosphoinositide-binding protein PIP3-E MT1F metallothionein 1F (functional)
GRIN2C glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 2C
SLC26A4 solute carrier family 26, member 4 SLC39A14 zinc transporter
SLC4A4 solute carrier family 4, sodium bicarbon- ate cotransporter, member 4
SQV7L nucleotide-sugar transporter similar to C. elegans sqv-7 (SLC35D2)
DIO1 deiodinase, iodothyronine, type I DIO2 deiodinase, iodothyronine, type II TPO thyroid peroxidase
1.8 2.1 5.4 2.5 1.9 1.8 1.7 3.4 1.9 3.8 2.4 1.9 2.7 2.2
1.8 2.6 1.8 1.9 2.0
2.9 2.3 2.8
2.1. Quelques gènes sous-exprimés dans les PTCs (table III.4.)
Dusp1 est une protéine qui inactive spécifiquement les MAPKs et qui pourrait jouer un rôle dans la réponse au stress environnant et dans la régulation négative de la prolifération cellulaire. Son association avec la p38 MAPK augmente son activité catalytique, ce qui suggère un rétrocontrôle négatif de la voie des MAPKs (Hutter et al., 2000). Sa diminution d’expression correspond donc à une levée de ce rétrocontrôle négatif. Son expression est également diminuée dans les tumeurs épithéliales ovariennes (Manzano et al., 2002).
CTGF (Connective Tissue Growth Factor, IGFBP8, CCN2) est une protéine multifonctionnelle de la matrice extracellulaire induite par le TGFβ via les ERKs, SMAD ou la PKC (Hishikawa et al., 1999) permettant l’interaction coordonnée de différents récepteurs et co-facteurs (Planque et Perbal, 2003). En liant ainsi le VEGF à la matrice extracellulaire (Burgess, 2005), une surexpression de CTGF peut augmenter l’invasion tumorale et l’angiogénèse en remodelant la matrice. Suite à sa liaison à son récepteur (LRP2), CTGF serait internalisée dans les endosomes, transloquée dans le cytosol où elle serait phosphorylée par la PKC et transportée vers le noyau pour stimuler la production d’ARNm (Wahab et al., 2001).
CTGF, dont l’expression est diminuée dans les AAs et les PTCs, est généralement augmentée parallèlement au TGFβ dans les conditions pathologiques, surtout dans les conditions inflammatoires et diminue quand la cicatrisation se déroule bien. Son expression est élevée dans les lignées cellulaires thyroïdiennes dérivées de carcinomes anaplasiques (ARO) et folliculaires (FTC133) où CTGF pourrait jouer un rôle dans la croissance tumorale.
CTGF inhibe l’invasion et la formation de métastases dans les cancers colorectaux où il est un marqueur de bon pronostic (Lin et al., 2005) et dans les adenocarcinomes pulmonaires où sa diminution est associée à un mauvais pronostic (Chang et al., 2004). Dans les cancers du sein avec un mauvais pronostic, l’expression de CTGF est également diminuée, suggérant que CTGF pourait être un suppresseur de tumeur (Jhiang, 2000). Il a été décrit que la protéine complète aurait une activité anti-proliférative, tandis que l’isoforme codant pour une protéine tronquée se comporterait comme un oncogène en stimulant la prolifération (Planque et Perbal, 2003). Selon le type de tumeur CTGF est donc sur- ou sous-exprimé, pour ou contre la migration et l’invasion. Les différentes isoformes peuvent avoir des effets biologiques opposés suite à une structure conformationnelle altérée ou une localisation subcellulaire différente. Les propriétés biologiques de la famile de protéines, dont fait partie CTGF, dépendent de leur contexte cellulaire et leur capacité à interagir avec des partenaires impliqués dans la signalisation (Planque et Perbal, 2003). Une diminution de CTGF dans les PTCs pourrait donc avoir un rôle dans la formation tumorale.
TOB1 : TOB1 (transducer of ERBB2,1) est une protéine anti-proliférative pouvant réguler négativement la croissance cellulaire. Elle inhibe la transcription de cytokines et de cyclines et est un substrat des MAPKs. Sa phosphorylation, rare dans les thyrocytes normaux, inactive la protéine. Sa phosphorylation dans les PTCs, plus fréquente que dans les FTCs, est liée à la taille de la tumeur, à la présence de métastases et de lésions dédifférenciées (Ito et al., 2005).
Dans les ATCs elle n’est pas exprimée. L’inactivation de TOB1 dans les PTCs contribue à leur progression vers un état plus agressif par perte de sa fonction anti-proliférative. Il serait
